第一节 抗体的制备• 抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含 特异性抗体的血清。• 多克隆抗体 (PAb)： 多个抗原决定簇免疫机体

所产生的多种抗体的混合物。• 单克隆抗体（ monoclonal antibody ， MAb ） ：

• 只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。

第四章 抗原抗体反应及应用

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一、抗血清的制备

1 、免疫动物• 抗原• 佐剂• 免疫动物 2 、抗血清的纯化与保存• 采血• 纯化与保存 3 、抗血清的鉴定• 效价• 亲和力

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Affinity = attractive and repulsive forces

Ab

Ag

High Affinity

Ab

Ag

Low Affinity

Affinity

• Strength of the reaction between a single antigenic determinant and a single Ab combining site

Calculation of Affinity

Ag + Ab Ag-Ab

Keq = [Ag-Ab]

[Ag] x [Ab]

Applying the Law of Mass Action:

二、单抗的制备

1、单抗的制备原理

2、单抗的制备方法• 抗原提纯和动物免疫• 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备• 细胞融合 • 筛选阳性株• 单克隆抗体的制备和冻存• 单克隆抗体的纯化 GO

骨髓瘤细胞 脾脏淋巴细胞 （ HGPRT-TK- ) （ HGPRT+TK+ ） 在 HAT 中不能生长 体外培养过程中死亡 ↓←PEG 杂交瘤细胞 (HGPRT+ 、 TK+) ↓ 在 HAT 中大量长期繁殖 ↓ 克隆化 ↓

产生单抗

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三、单抗的应用 临床检测、抑制器官移植排斥、治疗自 身免疫疾病、生物导弹等。

第二节 抗原抗体反应的原理

一、抗原抗体反应的原理 1. 亲水胶体转化疏水胶体 2. 抗原抗体结合力• 电荷引力（静电引力）• 范登华引力 • 氢键结合力• 疏水作用力

二、抗原抗体反应的特性

Nature of Ag/Ab Reactions

Lock and Key Concept

• antibody combining site to react with only

one antigenic determinant.

• The ability of a population of antibody

molecules to react with only one antigen.

Specificity

Cross Reactivity• The ability of an individual Ab combining site

to react with more than one antigenic determinant.

• The ability of a population of Ab molecules to react with more than one Ag

Anti-A Ab

Ag A

Anti-A Ab

Ag B

Shared epitope

Anti-A Ab

Ag C

Similar epitope

Cross reactions

Non-covalent Bonds

– Hydrogen bonds– Electrostatic bonds– Van der Waal forces– Hydrophobic bonds

Reversible

• Multiple Bonds

Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J., Mariuzza, R. A., Biochemistry 39,

6296, 2000

http://www.med.sc.edu:85/chime2/lyso-

三、影响抗原抗体反应的因素Factors Affecting Measurement of Ag/Ab Reactions

• Affinity

• Ag:Ab ratio

• Physical form of Ag

Ab excess Ag excess

Equivalence – Lattice formation

• PH

• Temperament

• Electrolyte

第三节 常见的免疫分析方法

一、凝聚反应(Agglutination) 二、沉淀反应 1 、溶液中的沉淀反应 2 、凝胶扩散沉淀 3 、免疫电泳 血清免疫电泳 火箭电泳 对流免疫电泳 三、补体参与的反应 四、免疫标记的抗原抗体技术 酶联免疫吸附（ ELISA）

Agglutination/Hemagglutination

• Definition - tests that have as their endpoint the agglutination of a particulate antigen

+

• Qualitative agglutination test– Ag or Ab

Agglutination/Hemagglutination

• Quantitative agglutination test– Titer– Prozone

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/12

8

1/25

6

1/51

2

1/10

24

Pos

.

Neg

.

Titer

64

8

512

<2

32

128

32

4

Patient

1

2

3

4

5

6

7

8

Agglutination/Hemagglutination

• Definition • Qualitative test• Quantitative test

• Applications – Blood typing– Bacterial infections

–Fourfold rise in titer

• Practical considerations– Easy– Semi-quantitative

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/12

8

1/25

6

1/51

2

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Immunoelectrophoresis• Method

– Ags are separated by electrophoresis

• Interpretation• Precipitin arc represent individual antigens

Ag

Ag

Ab

Ag

Ab

– Ab is placed in trough cut in the agar

BACK

+

-

Countercurrent electrophoresis• Method

– Ag and Ab migrate toward each other by electrophoresis

– Used only when Ag and Ab have opposite charges

• Qualitative–Rapid

Ag Ab- +

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Complement Fixation– Ag mixed with test serum to be assayed for Ab– Standard amount of complement is added– Erythrocytes coated with Abs is added– Amount of erythrocyte lysis is determined

Ag

Patient’sserum

Ag No Ag

Ag

• Methodology

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酶标记抗体技术 免疫酶技术的基本程序：将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。 用于标记的酶： 1.辣根过氧化物酶 (Horsera

dish Peroxidase,HRP); 2. 碱性磷酸酶 (Alkaline phos

phatase,AP) 。

直接法－抗原包被

Ag

Labeled Ab

Tissue Section

间 接 法

Ag

Labeled Anti-Ig

Tissue Section

UnlabeledAb

夹 心 法－直 接 夹 心

SolidPhase

Ag

Immobilized

Ag in Patient’s

sample

LabeledAb

直接夹心法

直接夹心 法直接 法