实验三 大肠埃希菌的生化反应、实验三 大肠埃希菌的生化反应、 沙门志贺菌的生化反应 沙门志贺菌的生化反应

一、 目的和要求：一、 目的和要求：

1.1. 掌握大肠埃希菌的生化反应和鉴定依据掌握大肠埃希菌的生化反应和鉴定依据 2.2. 掌握沙门菌属、志贺菌属细菌的生化反应掌握沙门菌属、志贺菌属细菌的生化反应

及鉴定意义及鉴定意义

发酵葡萄糖产酸，发酵葡萄糖产酸，乳糖发酵试验

O/FO/F 试验为发酵型 ，试验为发酵型 ， 氧化酶阴性，氧化酶阴性， 氧化酶试验

触酶阳性，触酶阳性，触酶试验

还原硝酸盐为亚硝酸盐。还原硝酸盐为亚硝酸盐。硝酸盐还原试验

二、肠杆菌科活泼的生化反应

三、其他生化反应三、其他生化反应

1.MIU1.MIU （动力、吲哚、脲酶）复合试验（动力、吲哚、脲酶）复合试验 方法：方法：于于 MIUMIU 培养基的中心处向下垂直穿刺接种细菌，培养基的中心处向下垂直穿刺接种细菌，

直至试管底部上方直至试管底部上方 5mm5mm 左右（不能穿刺管底），接种后左右（不能穿刺管底），接种后的接种针沿原穿刺线退出，的接种针沿原穿刺线退出， 37℃37℃ 培养培养 18-24h18-24h ，观察动，观察动力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。吲哚试验 吲哚试验

注：滴加吲哚试剂时需沿管壁徐徐滴入，稍待片刻即观注：滴加吲哚试剂时需沿管壁徐徐滴入，稍待片刻即观察液面上是否出现红色化合物，随时间的推移，红色化察液面上是否出现红色化合物，随时间的推移，红色化合物会扩散以至不清晰。合物会扩散以至不清晰。

实验结果实验结果

M I UM I U 动力 吲哚 脲酶 动力 吲哚 脲酶 大肠埃希菌 大肠埃希菌 + + -+ + -福氏志贺菌 福氏志贺菌 - +/- -- +/- -伤寒沙门菌 伤寒沙门菌 + - - + - - 甲副 甲副 + - - + - - 乙副 乙副 + - -+ - -

2.KIA 2.KIA （克氏双糖铁高层斜面）复合试验（克氏双糖铁高层斜面）复合试验 方法：方法：将待检菌于将待检菌于 KIAKIA 培养基底层穿刺，然后上培养基底层穿刺，然后上

提接种针，从斜面底部向上划一条直线，然后由提接种针，从斜面底部向上划一条直线，然后由斜面底部向上做曲线划线。标记，斜面底部向上做曲线划线。标记， 37℃37℃ 培养培养 24h24h 。。

原理：原理： GluGlu 、、 LacLac 之比为之比为 1∶101∶10 。。 ①① 细菌如发酵细菌如发酵 GluGlu 、、 LacLac 产酸产气，则斜面、底产酸产气，则斜面、底

层均呈黄色，且有气泡；层均呈黄色，且有气泡； ②② 如只发酵如只发酵 GluGlu 不发酵不发酵 LacLac ，因，因 GluGlu 含量少，斜含量少，斜

面生成的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而面生成的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色，底层相对缺氧，发使斜面部分保持原来的红色，底层相对缺氧，发酵酵 GluGlu 所生成的酸类不被氧化挥发仍呈黄色。所生成的酸类不被氧化挥发仍呈黄色。

③③ 细菌分解细菌分解 PrPr 产生产生 HH22S S ，则与硫化亚铁作用生，则与硫化亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。成黑色的硫化铁，使培养基变黑。硫化氢试验硫化氢试验

结果判断：结果判断： ①① 发酵发酵 GluGlu 、、 LacLac 产酸产气，上层、底层产酸产气，上层、底层

均呈黄色具有气泡 记为：均呈黄色具有气泡 记为： A/A A/A 产气产气 ②② 只发酵只发酵 GluGlu 不发酵不发酵 LacLac ，底层变黄，上，底层变黄，上

层仍为红色 记为：层仍为红色 记为： K/A K/A ③③ 培养基变黑，则产生培养基变黑，则产生 HH22SS ，产生黑色的，产生黑色的

硫化铁沉淀。硫化铁沉淀。

实验结果实验结果

KIA KIA 斜面 底面 产气 斜面 底面 产气 HH22SS大肠埃希菌 大肠埃希菌 A A + - A A + - 福氏志贺菌 福氏志贺菌 K A - - K A - - 伤寒沙门菌 伤寒沙门菌 K A - + K A - + 甲副 甲副 K A + - K A + - 乙副 乙副 K A + ++K A + ++

大肠埃希菌大肠埃希菌 KIAKIA （（ AAAA ＋－）＋－） MIUMIU （＋＋－）（＋＋－）

伤寒沙门菌伤寒沙门菌 KIAKIA （（ K AK A －＋）－＋） MIUMIU （＋－－）（＋－－）

志贺菌志贺菌 KIAKIA （（ K AK A －－）－－） MIUMIU （－－－）（－－－）

3.IMViC3.IMViC 试验 试验 吲哚试验吲哚试验 甲基红试验甲基红试验 V-PV-P 试验试验 枸橼酸盐试验枸橼酸盐试验

（（ 11 ）吲哚试验）吲哚试验 原理原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中

的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂 -- 柯氏试剂柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚

培养基培养基：蛋白胨水：蛋白胨水 方法方法：待测菌接种于培养基，：待测菌接种于培养基， 37 ℃37 ℃ 培养培养 24-48h24-48h ，，

沿试管壁缓慢加入吲哚试剂沿试管壁缓慢加入吲哚试剂 结果结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性 意义意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷

伯为阳性伯为阳性

（（ 22 ）甲基红试验）甲基红试验 原理原理：细菌分解葡萄糖产生：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸丙酮酸，后者进一步，后者进一步

生成生成甲酸、乙酸、乳酸甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的等，使培养基的 PHPH 降至降至 4.4.55 以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产酸量少，或进一步转化为其他物质，则培养基的酸量少，或进一步转化为其他物质，则培养基的PHPH 仍在仍在 6.26.2 以上，加入甲基红试剂后显黄色，为以上，加入甲基红试剂后显黄色，为阴性阴性

培养基培养基：葡萄糖蛋白胨水：葡萄糖蛋白胨水 方法方法：待测菌接种于培养基，：待测菌接种于培养基， 2-42-4天后，加入甲天后，加入甲

基红试剂，观察结果基红试剂，观察结果 结果结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色

为阴性为阴性 意义意义：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌、：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌、

等为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性等为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性

（（ 33 ）） V-PV-P 试验试验 原理原理：细菌分解葡萄糖产生：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸丙酮酸，后者脱羧产生，后者脱羧产生

乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在，乙酰甲基甲醇在碱性环境中碱性环境中被氧化被氧化为二乙酰，进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍为二乙酰，进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用，生成红色化合物，即为基作用，生成红色化合物，即为 V-PV-P 试验阳性。试验阳性。 αα奈酚可加速此反应奈酚可加速此反应

培养基培养基：葡萄糖蛋白胨水：葡萄糖蛋白胨水 方法方法：待测菌接种于培养基，：待测菌接种于培养基， 35 ℃48h35 ℃48h ，加入甲，加入甲

液（液（ 6%α6%α 奈酚酒精溶液）和乙液（奈酚酒精溶液）和乙液（ 40 %KOH40 %KOH溶液）溶液） 结果结果：： 20min20min 内出现红色为阳性，如无红色，且于内出现红色为阳性，如无红色，且于

35 ℃4h 35 ℃4h 后仍如故即为阴性后仍如故即为阴性 意义意义：本试验常与甲基红一起试验，前者阳性则后：本试验常与甲基红一起试验，前者阳性则后

者多阴性者多阴性

（（ 44 ）枸橼酸盐利用试验）枸橼酸盐利用试验

原理原理：某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸：某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱

培养基培养基：枸橼酸盐培养基：枸橼酸盐培养基方法方法：待测菌接种于培养基：待测菌接种于培养基 37℃37℃ 培养培养 18-24h18-24h ，观察结，观察结

果果结果：结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性蓝色为阳性，不变色为阴性

意义意义：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性

大肠埃希菌大肠埃希菌 IMViCIMViC 试验（＋＋－－） 试验（＋＋－－） 右侧为对照（右侧为对照（－－＋＋－－＋＋））

沙门菌沙门菌 IMViCIMViC 试验（－＋－－）试验（－＋－－）

志贺菌志贺菌 IMViCIMViC 试验（－＋－－） 试验（－＋－－）

大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌基本生化反应小结大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌基本生化反应小结 M I U KIAM I U KIA 动力 吲哚 脲酶 斜面 底面 产气 动力 吲哚 脲酶 斜面 底面 产气 HH22S S 氧化酶 触酶 枸橼酸氧化酶 触酶 枸橼酸

盐盐

大肠埃希菌 大肠埃希菌 + + - A A + - - + - + + - A A + - - + - 福氏志贺菌 福氏志贺菌 - +/- - K A - - - + - - +/- - K A - - - + - 伤寒沙门菌 伤寒沙门菌 + - - K A - + - + d+ - - K A - + - + d甲副 甲副 + - - K A + - - + -+ - - K A + - - + -乙副 乙副 + - - K A + ++ - + d + - - K A + ++ - + d

四、本次实验内容四、本次实验内容 1.1. 氧化酶试验氧化酶试验 2.2. 触酶试验触酶试验 3.3. 硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验 4.MIU4.MIU 复合试验复合试验 5.KIA5.KIA 试验试验

初步鉴别肠道致病菌和肠道非致病菌

肠道致病菌

肠道非致病菌

不发酵乳糖

发酵乳糖

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乳糖发酵试验

氧化酶试验氧化酶试验原理原理：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶，具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素吸酶，具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素 CC氧化，氧化，再由氧化型细胞色素再由氧化型细胞色素 CC使对苯二胺氧化，生成有色的使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物醌类化合物

试剂试剂：： 1%1% 盐酸四甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺或 1%1% 盐酸二甲基对苯二盐酸二甲基对苯二胺胺

方法方法：用滤纸条沾取被检菌落，用滴管吸取氧化酶试剂，：用滤纸条沾取被检菌落，用滴管吸取氧化酶试剂，滴加于滤纸条菌落上。滴加于滤纸条菌落上。

结果结果：阳性者立即出现红色。：阳性者立即出现红色。氧化酶试验 阳性：红色 阴性：无色氧化酶试验 阳性：红色 阴性：无色

应用应用：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别。：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别。 前者阴性，后者多阳性前者阴性，后者多阳性 返回

触酶试验触酶试验 原理原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢

生成水和氧，出现气泡。生成水和氧，出现气泡。 试剂试剂：： 3%3% 过氧化氢溶液过氧化氢溶液 方法方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加

3%3% 过氧化氢数滴，观察结果过氧化氢数滴，观察结果 结果结果：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡的为：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡的为

阴性阴性 意义意义：常用于革兰阳性球菌的鉴别，葡萄球菌为：常用于革兰阳性球菌的鉴别，葡萄球菌为

阳性，链球菌为阴性。阳性，链球菌为阴性。 肠杆菌科细菌触酶阳性肠杆菌科细菌触酶阳性

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硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验原理原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐成生成亚硝酸盐、氨和氮：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐成生成亚硝酸盐、氨和氮

等，亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作等，亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，后者与用生成重氮苯磺酸，后者与 --萘酚结合为红色的萘酚结合为红色的 N-N---萘胺偶氮萘胺偶氮苯磺酸。苯磺酸。

培养基培养基：硝酸盐培养基：硝酸盐培养基试剂试剂：甲液（对氨基苯磺酸），乙液（：甲液（对氨基苯磺酸），乙液（ αα 奈胺）奈胺）方法方法：待测菌接种于培养基，：待测菌接种于培养基， 37 ℃37 ℃ 培养培养 18-24h18-24h ，将甲乙液分别，将甲乙液分别

加入培养基，立即观察结果加入培养基，立即观察结果结果结果：出现红色为阳性 ：出现红色为阳性 硝酸盐还原试验 阳性：红色 阴性：淡黄色硝酸盐还原试验 阳性：红色 阴性：淡黄色

注意注意：若加入试剂后无反应，可能是①硝酸盐没有被还原，试验阴：若加入试剂后无反应，可能是①硝酸盐没有被还原，试验阴性②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入性②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际为阳性为阳性

意义意义：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气。：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气。

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吲哚（靛基质）试验吲哚（靛基质）试验

原理原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂 -- 柯氏试剂（对柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚

培养基培养基：蛋白胨水：蛋白胨水方法方法：待测菌接种于培养基，：待测菌接种于培养基， 37 ℃37 ℃ 培养培养 24-48h24-48h ，沿，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂试管壁缓慢加入吲哚试剂

结果结果：于两者接触面出现：于两者接触面出现红色为阳性红色为阳性，无色为阴性，无色为阴性意义意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性为阳性

尿素分解试验尿素分解试验 原理原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生

大量的氨，使培养基呈碱性大量的氨，使培养基呈碱性 培养基培养基：尿素培养基：尿素培养基 方法方法：待测菌接种于培养基，：待测菌接种于培养基， 37 ℃37 ℃ 培养培养 18-24h18-24h ，，

观察结果观察结果 结果结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，

不变为阴性不变为阴性 意义意义：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷

伯氏为阳性伯氏为阳性 返回

硫化氢试验硫化氢试验原理原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。

培养基培养基：醋酸铅培养基：醋酸铅培养基方法方法：待测菌接种于醋酸铅培养基，：待测菌接种于醋酸铅培养基， 37℃37℃ 培养培养 24-48h24-48h观察结果观察结果

结果结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性：培养基变黑为阳性，不变为阴性意义：意义：沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌为阳性杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌为阳性

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氧化酶试验氧化酶试验阳性阳性：：紫红色紫红色 阴性：无色阴性：无色

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硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验阳性：红色 阴性：淡黄色阳性：红色 阴性：淡黄色

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