Real time PCR 扬州大学 生物科学与技术学院. 原理 聚合酶链式反应 ( PCR)...
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Real time PCR 扬扬扬扬 扬扬扬扬扬扬扬扬扬
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20-Dec-2015 -
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Real time PCR
扬州大学生物科学与技术学院
原理 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 ) 。
原理• 荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号
阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。
原理• CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的
CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
Real-Time PCR 使用的染料
Dye Excitation maximum (nm) Emission maximum (nm)
• Fluorescein 490 513• FAM 494 518 • SYBR Green I 494 521 • JOE 520 548 • VIC 538 552 • Cy®3 552 570 • TAMRA 560 582 • ROX 587 607 • Texas Red 596 615 • Cy5 643 667
Real-Time PCR 成功的关键因素
• Primer （引物）• No template control (NTC) （非模板对照）
• cDNA template （ cDNA 模板）• Endogenous reference gene （内参基因）• Reaction volume （反应体积）
引物设计原则
保持 %GC 在 : 20–80%
引物的 TM : 58–60 °C
在 3’末端的 5 个核苷酸中，只有 1 或 2 G + Cs
引物长度 : 9 – 30 mer
引物浓度 : 5μM
设计无重复序列的引物 ( 扩增产物的大小 : 50~150 bps)
如何优化引物浓度
50 100 150 200 250
50 50/50 100/50 150/50 200/50 250/50
100 50/100 100/100 150/100 200/100 250/100
150 50/150 100/150 150/150 200/150 250/150
200 50/200 100/200 150/200 200/200 250/200
250 50/250 100/250 150/250 200/250 250/250
Reverse Primerconcentration (nM)
Forward Primer Concentration (nM)
不同引物浓度的扩增图不同引物浓度的扩增图
解离曲线
Same detector at different stage
Same detector at different stage
Real-Time PCR 成功的关键因素
• Primer （引物）• No template control (NTC) （非模板对照）
• cDNA template （ cDNA 模板）• Endogenous reference gene （内参基因）• Reaction volume （反应体积）
如何避免污染• 用 1.5ml Microtube 分装小体积样品• 所有样品使用前必须离心• 使用八连排反应管• 用 70% 酒精擦拭所有器具及实验桌• 计划好实验样品表格（三个重复）• 耐心安静慢慢操作实验• 随时保持双手干净• 不可重复使用 tip• 不可使用八头 pipetman• 不可在八连排反应管上贴标签或写字
Real-Time PCR 成功的关键因素
• Primer （引物）• No template control (NTC) （非模板对照）
• cDNA template （ cDNA 模板）• Endogenous reference gene （内参基因）• Reaction volume （反应体积）
第一步 cDNA 模板的定量
• 250 μg total RNA 0.2 μg poly A+ RNA (DNase I) 1st cDNA (RNase H)
20 ng / μl
• 10 μg total RNA (DNase I) 1st cDNA (RNase H) 20 ng / μl
Real-Time PCR 成功的关键因素
• Primer （引物）• No template control (NTC) （非模板对照）
• cDNA template （ cDNA 模板）• Endogenous reference gene （内参基因）• Reaction volume （反应体积）
内参基因
• 拟南芥 : actin & ubiquitin
• 烟草 : actin & ubiquitin
• 水稻 : actin & ubiquitin
Actin Amplification Plot
Actin 系列稀释
Actin 系列稀释
靶基因系列稀释
相同 PCR 效率
相同 PCR 效率
Real-Time PCR 成功的关键因素
• Primer （引物）• No template control (NTC) （非模板对照）
• cDNA template （ cDNA 模板）• Endogenous reference gene （内参基因）• Reaction volume （反应体积）
Real-Time PCR reaction
• F Primer( 5 μM ) 200 nM 2 μl
• R Primer( 5 μM ) 200 nM 2 μl
• cDNA ( 20 ng / μl ) 100 ng 5 μl
• Water 16 μl • 2x SYBR Master Mix 1x 25 μl
50 μl
Final conc.
Real-Time PCR 条件
• 50 , 2min℃• 95 , 10 min℃• 95 , 15 sec ℃ 40 cycles
• 60 , 1min℃• 60 , melting curve analysis ℃
相对定量
• 设定相对定量的对照 : △ △Ct 分析
• DNA 或 RNA含有靶基因的数量可以通过相应的标准曲线来定量– 使添加的样品量标准化– 需靶基因的内部对照
tissue1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Lane
0.5 1 2 30 0.5 1 2 30 treatment (day)
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tive level o
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AK069096
Time (Day)
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Q-PCR primer for RT-PCR
Q-PCR product
RT-PCR
tissue1
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0.5 1 2 30 0.5 1 2 30treatment (day)
tissue2
谢谢
