Real-time PCRXiao Jin

Applied SpecialistMolecular & Cellular Biology

Real-time PCR 原理数学原理

化学原理

Real-time PCR 应用绝对定量

相对定量等位基因分型阴阳性判定microRNA

荧光定量PCR数学原理基线 阈值 Ct值 [DNA]0

同时扩增96的相同样品的结果

由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异

扩增曲线：四个阶段

线性

图谱

对数

图谱

平台期线性增长期

基线期

指数增长期

平台期

线性增长期

基线期指数增长期

什么是基线？基线就是扩增曲线中的水平部分。

对数图谱线性图谱

基线 阈值 Ct值 [DNA]0

1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。2. 偶然误差的结果满足对数分布。3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。

什么是阈值？基线 阈值 Ct值 [DNA]0

基线 阈值 Ct值 [DNA]0

什么是CT值？从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数

CT值

对数图谱

CT值

线性图谱

lg [DNA]

循环数

线性期

y = x(1+e)n指数期

为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？

N = N0 x (1+e)n N：产物分子数；N0：起始分子数e： 扩增效率； n: 循环次数

PCR理论方程只在指数期成立

为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？

第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分

子的荧光强度(即单位荧光强度，RS)与分子数目的乘积。

Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs

RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs

lg (RCT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs

CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT - RB) – lg Rs

设n=CT，则：

)1log(log)log(

)1log(log

X

SBT

X

OT E

RRRE

XC

+−−

++

−=

即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）

标准曲线：CT值对[DNA]0作图

CT值

lg [起始DNA]

CT = - k lgX0 + b

成功的定量PCR

荧光定量PCR化学原理

SYBR Green I作用机理

1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去

2. 染料一结合，就产生荧光信号

3. 信号强度与DNA分子总数目成正比

数量关系

TaqMan探针的FRET

TaqMan®

Probe

EE

R Q

E E

R Q

TaqMan作用机理

1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针

2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号

3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比

数量关系5’

TaqMan 探针上游引物

3’3’5’

下游引物

R Q

3’

5’3’

5’

Q

R

Real-time PCR 应用

• 绝对定量(Absolute Quantification，AQ)• 病原体检测

• 转基因食品检测

• 基因表达研究

• 相对定量(Relative Quantification，RQ)• 基因在不同组织中的表达差异

• 药物疗效考核

• 耐药性研究

• 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD)• 基因突变分析

• SNP研究

• 物种鉴定、菌株鉴定

• 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-)

实时PCR分析实时PCR分析

绝对定量绝对定量 相对定量相对定量

根据标准曲线

提供数量测量

提供精确的起始材料

相对数量差异

绝对定量与相对定量的定义

• 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。

• 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一个时程研究中处于零时的样本。

Log copy number

Ct v

alue

sCt‘s

0 1 2 3 4 5 6 7

The well contains 400 target copies

Y= mx+b

绝对定量：从荧光到拷贝数

相对定量：参照因子 Calibrator

t =0 t=12 t=24 t=48time

total RNA

cDNA

total RNA

cDNA

total RNA

cDNA

total RNA

cDNA

用以比较结果的基准

相对定量：内对照 Endogenous Control

t =0 t=12 t=24 t=48time

total RNA

cDNA

total RNA

cDNA

total RNA

cDNA

total RNA

cDNA

用以标准化样品操作

IL-2 18S ΔCt ΔΔCt 2-ΔΔCt

T=0 (calibrator) 24 9 15 0 1.0T=1hr 24 10 14 -1 2.0T=6hr 23 11 12 -3 8.0T=24hr 28 10 18 3 0.1

0

2

4

6

8

10

Rel

ativ

e Q

uan

tity

of E

xpre

ssio

n

2.0

8.0

1

t = 0

t = 1 h

t = 6 h

t = 24 h0.1

相对定量研究软件• 同时分析多达10块反应板的基因表达数据

– 多至960个数据点的单击分析

– 数据直观

• 通过ΔΔCT (比较 Ct)法完全自动分析数据

• 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出

终点检测终点检测

阴性阳性鉴定阴性阳性鉴定等位基因分型等位基因分型

目标序列的有无突变的存在形式

等位基因分型

• 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用

于检测某个核酸序列的变异。

• 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。

• 目标序列的实际量不确定。

正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测

基因分型检测

FAM

VIC

Homozygote for FAM-specific allele

FAM

VIC

Homozygote for VIC-specific allele

FAM

VIC

Heterozygote forboth alleles

等位基因自动识别软件

• 加速数据分析

• 等位基因分组识别

• 每一个孔的质量评分

• 用户自定义的质量评分标准

• 基于每一个标记的识别

• 限制用户的主观干扰

阴性阳性鉴定

• 定义：阳性/阴性实验是一种终点分析，它可以确定某个样本中是（阳

性，用加号表示）否（阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列。在终点分析中，数据是在PCR过程结束时获得的。

• 什么是IPC？IPC是一种阳性内对照，它被用在阳性/阴性实验中，用于监测PCR过程并确定阴性结果不是因为PCR失败而造成。，IPC包括一个模板、一组引物和一个荧光标记（VIC）的探针，被加到反应

板的每一个孔中。

阴性结果示例

阳性结果示例

microRNA• MicroRNA(miRNA)是一种

22个碱基左右的内源性单链小分子RNA

• 由带茎环结构的双链RNA前体剪切而成

• 具有高度保守性、时序性和组织特异性

• 通过与特异mRNA结合，抑

制目标基因表达或降解mRNA

miRNA Expression

1. Transcription

2. Hairpin release in the nucleus

3. Export to cytoplasm

4. Dicer processing

5. Strand selection by RISC

6. Translational repression

*mature active strand

Mechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation

为何研究miRNA？• miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参

与了细胞的发育、分化和联络

• 对miRNA功能的研究将有助于设计siRNA干扰

实验

• miRNA有可能成为新的生物分子标记

• 有重要的临床应用价值

miRNA 分析的技术挑战Northern Blot (杂交法)• Homegrown technology and easy to access (易于操作)• Large sample amount requirement (ug scale) (需大量样品)• Low dynamic range (two orders of magnitude) (可测范围低)• Mismatch hybridization often cannot distinguish well between miRNAs

that only have small sequence differences (错配杂交问题)

Microarrays (芯片法)• High throughput (高产出)• Improved dynamic range (可测范围较宽)• Large sample RNA requirement, approximately 5 µg per array (需大量样

品)• Difficult or impossible to distinguish between the Pre-miRNA and miRNA

(很难区分前体miRNA and 成熟miRNA)• Do not distinguish well between miRNAs that have only small differences

in sequence. (对类似结构的miRNA分辨率差)

Quantitative Real-Time PCR (实时定量PCR)• Dramatically less sample requirement (只需微量样品)• Significantly wide dynamic range (7 logs) (非常宽的可测范围)• High sensitivity and specificity (高灵敏度, 高特异性)• However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a ~22 base

polynucleotide fragment? (但是, 如何设计这样一个靶物只有22个碱基TaqMan real-time PCR?)

Solution: TaqMan® MicroRNA PCR Assays

Precursor miRNA

Mature miRNA

Workflow mirVana™ miRNA Isolation Kit

TaqMan® MicroRNA RT kit

TaqMan® MicroRNA Assays

TaqMan® Universal Master Mix,No UNG

Five Fully Integrated Systems for Real-Time PCR

Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System

Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System

Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems 7500

Real-Time PCR System

Applied Biosystems StepOne™Real-Time PCR System

mirVana™ miRNA Isolation Kit• 专业高效回收小分子RNA• 富集小于200 nt RNA，提高下游试验灵敏度

• 方便快捷，30分钟完成整个过程

• 理想的 miRNA, siRNA, shRNA, and snRNA 分析

试剂盒

• 适合各种组织和细胞材料

TaqMan®

MicroRNA AssaysmiRNA RT primer

Step 1:Stem-loop RT

Step 2:Real-time PCR

cDNA

Forward primer

Reverseprimer

FQTaqMan probe

Four oligos per miRNA1. RT primer 2. Forward primer3. Reverse primer4. TaqMan probe

Two enzymes required1. Reverse transcriptase2. AmpliTaq Gold® DNA

Polymerase

发夹状引物的反转录miRNA分析高度的重现性

4 miRNAs个样本，16 个重复，2名操作者的实

验中

平均标准方差: 0.1

定量结果偏差: 0.6%

let-7a miR-20

miR-324-5

miR-16

TaqMan® Universal Master Mix实验证明可以达到7个数量级的线性范围

New release

TaqMan® Array Human MicroRNA Panel

•快速，高效的miRNA分析方法

•同时检测多达365个miRNA

miRNA 定量PCR相关应用

• 转录后基因调控研究

• 细胞分化及神经信号传导

• 临床应用:– 疾病诊断及治疗

– 耐药性研究

– 基因疾病治疗

• 新生物标志的发现

Primer Express

• 目前世界上唯一专业用于设计定量引物和探针的软件

• 随机配送

TaqMan® Gene Expression Assays

A single tube contains•Forward Primer•Reverse Primer•TaqMan® probe•Optimized at a

20x concentrationOver 700,000 assays designed to • Human• Mouse• Rat• Canine

• Arabidopsis• Drosophila• C. elegans• Rhesus Macaque

代客设计合成TaqMan® 基因表达试剂盒

• 对于任何物种或生物体适用

• 用户确定目标序列

• 以方便的单管形式供货

• SNP基因分型分析试剂盒超过4,500,000个预先设计好的人和小鼠的全基因组试剂

盒 ，代客合成

• MicroRNA分析试剂盒人、小鼠、大鼠、拟南芥、果蝇和线虫

• 药物代谢分析试剂盒2,400个药物代谢相关的高多态性位点，涵盖220个药物代

谢酶转运蛋白基因

• 病原体检测试剂盒沙门氏杆菌、单核细胞增多性李斯特菌李斯特杆菌、大肠杆菌…

• 流感病毒检测试剂盒流感病毒A型/H5亚型检测试剂盒

• 转基因检测试剂盒

大豆和玉米的转基因检测试剂盒

谢 谢 ！

ABI Real-time PCR