实时荧光定量 PCR 技术原理及其应用

杨文彬 2007

1. 原理及其应用

2. 应用 ABI 7000 sybrgreen 方法进行样品检测

Real-time quantitative PCR

• A method to measure the quantity of a nucleic acid target using the Polymerase Chain Reaction (PCR)

• The PCR amplification reaction is monitored in every cycle as it happens (i.e. “in real-time”)

• The target may be DNA or RNA （ CDNA)

1. 荧光扩增曲线分成三个阶段：荧光背景信号阶段荧光信号指数扩增阶段平台期

2. △Rn 一个反应管经 n 次热循环后，测得的荧光强度

3. Baseline是背景曲线的一段，范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是

还未，超出背景4.threshold 荧光阈值

荧光（ Rn ）超过本底时的临界数值 , 在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的

10 倍5. CT （ cycle of threshold ）

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数

• 荧光定量分绝对定量和相对定量

• 每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， CT 值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表 Ct

值因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲

线上计算出该样品的起始拷贝数。

绝对定量

• 主要针对样本间基因表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时，应用更广泛。

• 需要内标基因做归一化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。如GAPDH ， β-actin, β2-microglobulin 以及 rRNA 等。

• 在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因表达不会受实验处理的影响。

相对定量

内标基因的选择• 检测样品间表达一致

• 基因选择时应考虑组织，时期，以及处理方法引起的差异

• 多基因同时反应时内标基因表达量应高于目的基因

相对定量

相对定量的计算方法

相对定量的计算方法• 定量一般是在 PCR 扩增的指数期进行的PCR 指数扩增的公式是： Xn=X0×(1+EX)n

Xn 是第 n 个循环后目标分子数。X0 是初始目标分子数。Ex 是目标分子扩增效率。n 是循环数

相对定量的计算方法任一样本 q 目的基因 x 达到阈值时分子数Xqx=X0×(1+EX)ctx

任一样本 q 目的内标基因 r 达到阈值时分子数Xqr=R0×(1+ER)ctr

Xqx=Xqr

X0×(1+EX)ctx=R0×(1+ER)ctr

X0/R0=(1+ER)ctr/(1+EX)ctx

• 对于一个小于 150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+浓

度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于 1 。

目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因Y= 2 -ΔCt

ΔCt=Ct 目的基因－ Ct 内标基因

实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和

非探针类两种• 探针类是利用与靶序列特异杂交的探

针来指示扩增产物的增加，特异性高

• 非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加，简便易行。

SYBR Green I• SYBR Green I 是一种与双链 DNA结合发光的荧光染料。所以可以根据 SYBR Green I 的荧光信号强度检测出 PCR体系存在的双链 DNA 数量 SYBR Green I的最大吸收波长约为 497NM ，发射波长最大约为 520NM

• 优点：通用性较好，价格相对低廉，国内外科研中使用比较普遍。

• 缺点：由于 SYBR Green I 不能识别特异的双链，对 PCR 反应中的非特异性扩增及引物二聚体也会产生荧光，本底较高，临床应用时会有假阳性出现。

SYBR Green I

TaqMan 探针• TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它设计与目

标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。• 常用的荧光由 FAM,TET,VIC,HET ，荧光淬灭基团

如 TAMRA • 荧光基团连接在探针的 5’末端，而淬灭剂则在 3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

TaqMan 探针

TaqMan MGB 探针 • Taqman 探针检测的是积累荧光。当探针完整的

时候，由于 3′端的荧光淬灭基团在吸收 5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此 TaqMan 探针近来又有新的发展—— TaqMan MGB 探针。

• MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher) ，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有 MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的 Tm 值提高 10°C左右。因此为了获得同样的 Tm 值， MGB 探针可以比普通 TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的 DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明， TaqMan MGB 探针对于富含 A/T 的模板可以区分得更为理想。

TaqMan MGB 探针

实时荧光定量 PCR 技术的应用• 1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测 ,转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等

• 2. 基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 (如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证

• 3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等