不同样品核酸提取、扩增、荧光定量 PCR 完美解决方案
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不不不不不不不不 不不不 不不不不 、、 不不不不不不不不 不不不 不不不不 、、 PCR PCR 不不不不不不 不不不不不不 不不不不不不不不不不不不不 不不不不不不不不不不不 （ 15 不） Fax ： 010-62951781 Tel ： 010-62951781 62983458 62979408 http://www.bioteke. com E-mail: [email protected]
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不同样品核酸提取、扩增、荧光定不同样品核酸提取、扩增、荧光定量量 PCRPCR完美解决方案完美解决方案
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不同样品核酸提取、扩增、荧光定不同样品核酸提取、扩增、荧光定量量 PCRPCR完美解决方案完美解决方案
---核酸提取攻略
北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路 15号）
不同样品 RNA提取最适方法RNA纯度与质量考察RNA提取常见问题及解决方案常见样品 DNA提取特殊样品 DNA提取DNA分离纯化中常见问题分析
内容概要内容概要
样品 裂解液
上层溶液
液氮研磨或其他方法处理 抽提
细胞裂解 干燥溶解或洗脱
离心洗涤
酒精沉淀或介质吸附
RNARNA 提取流程提取流程
沉淀法：异丙醇或乙醇 介质吸附法：
RNARNA 提取常用方法提取常用方法 ------ 沉淀方法沉淀方法
吸附材料 原理硅基质 高盐低 pH值结合核酸，低盐高 pH值洗
脱阴离子交换树脂 低盐高 pH值结合核酸，高盐低 pH值洗
脱磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附并携带 RNA
异硫氰酸胍 / 苯酚法在变性剂异硫氰酸胍的作用下，细胞被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的 DNA和 RNA由于在特定 pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净 RNA。
RNARNA 提取常用方法提取常用方法 ------ 裂解方式裂解方式
胍盐 /β-巯基乙醇盐酸胍裂解样本 ，抑制 RNase 的活性 ；β-巯基乙醇变性蛋白
BioTekeBioTeke 的的 RNARNA 提取试剂具有明显的优提取试剂具有明显的优势势
在经典试剂的基础上，不断升级。
多款高品质的 RNA 提取试剂：
Tri pure （ Trizol ）
RNApure （ Trizol 法的升级产品）
组织组织 // 细胞样品细胞样品 RNARNA 提取提取材料：材料： 小鼠肝脏组织方法：方法： BioTeke RNApure 高纯总 RNA
快速提取试剂盒 0.1g 样品组织结果：结果：
图：小鼠肝脏组织 RNA
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RNApure RNApure 高纯总高纯总 RNARNA 快速提取试剂快速提取试剂
1 2 3
图片说明：1 BioTeke RNAclean2 BioTeke TRIpure (TRIzol 法 )3 BioTeke RNApure 离心柱型(注：本图实验材料为植物叶片）
同一样品基因组 DNA 和 RNA 分提
原理：根据基因组 DNA 和RNA 在硅基质膜上的结合条件不同，用两根离心吸附柱分别提取基因组 DNA 和 RNA 。
特殊样品特殊样品 RNARNA 提取提取 ------ 血液血液图 1 全血样品溶解在TRI pure LS Reagent试剂后的状态图 2 泳道 1与 2 ，在 -80度保存一个月后的提取结果。M 泳道：标准的 Hela细胞RNA
材料：材料： 松针、冬青、香蕉、木菠萝和杨树方法：方法： 通用植物总 RNA 提取试剂盒（离心柱型） 0.1g 样品组织结果：结果： 得率：约 35-40μg 纯度： OD260/OD280＝ 1.82-1.95
图片说明： 1 、 2 杨树； 3 、 4 香蕉； 5 、 6 松针； 7 、 8 冬青； 9 、 10 木菠萝
多糖多酚植物样品多糖多酚植物样品 RNARNA 的提取的提取
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试剂盒适用范围：试剂盒适用范围： 水稻种子、小麦种子、玉米种子、高粱种子、拟南芥种子、大豆种子、苹果、葡萄、香蕉、棉花、龙眼、荔枝、各种草坪牧草植物、各种树木、各种花卉等绝大多数植物
图片说明： 1 、 2DNA和大 RNA ；3 、 4Micro RNA (材料为小鼠肝脏组织 )
Micro RNAMicro RNA 提取提取
1 2 3 4
提取原理：传统方法：先提取总 RNA然后跑胶回收或沉淀 Micro RNA。新方法：通过裂解液裂解和酸酚分层后过柱两次，一次去除基因组 DNA和大片段RNA，后一次吸附 Micro RNA，然后漂洗收集。新方法特点：高效分离小 RNA，同时分离总 RNA可用于 miRNA、 siRNA和 snRNA的分析适用各种来源的样品提取时间短，约 30分钟完成实验
生物大分子具有共轭双键，在 260和 280nm波长处有光吸收峰。
纯度：紫外分光光度计测定所提总 RNA在 260nm和280nm波长处的光吸收，以 A260/A280的比值来判断总RNA的纯度。
质量：甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定。
RNA纯度与质量考察
RNARNA 提取常见问题及解决方案提取常见问题及解决方案
RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳
RNARNA 的降解的降解新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源 RNase 的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 ( 如脾脏，胸腺等 ) ，
很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用
更多裂解液。
RNARNA 的降解的降解
冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至 -
70℃冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，
研磨过程中及时补充液氮。
RNARNA 的保护的保护采集样品的保护： 通常用液氮保存 样品保护剂 RNAfixer, 样品浸泡其中可以在 37℃保存一
天， 25℃一周， 4℃一个月， -20℃一年左右。环境中 RNase 的清除： DEPC 处理各种实验器具 RNAsafe 对溶液中 RNase 进行清除。 RNA 酶喷雾清除剂，可对固体表面的 RNase起到清除的
作用，更大程度上避免 RNase 的污染。
蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且
离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法 : 重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且
离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法 : 重新抽提一次，再沉淀，溶解。
OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏低比值偏低
OD260 /OD280 OD260 /OD280 比值偏低比值偏低抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA ，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法 : 再沉淀一次后，溶解。
设备限制： 测定 OD260 及 OD280 数值时，要使 OD260 读数在 0.10 -
0.50 之间。此范围线性最好。
用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris ， pH
7.5 。用水作为稀释液将导致比值的降低。
非变性电泳： 上样量超过 3μg ，电压超过 6V/cm ，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。
变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变
性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。
电泳条带异常电泳条带异常
抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤
样品中杂质的残留多糖等杂质，再次沉淀
DNA 污染 使用 RNase-Free 的 DNase I 消化抽提 RNA
下游实验效果不佳（下游实验效果不佳（ RNARNA 降解）降解）
不同样品基因组不同样品基因组 DNADNA 提取提取 常见样品基因组 DNA提取
细胞 / 组织 / 细菌 / 血液基因 DNA提取
植物材料 DNA提取
特殊样品基因组 DNA提取 大量血液样品 DNA提取
环境微生物 DNA提取
临床样本 DNA提取
DNA分离纯化中的常见问题分析
基因组基因组 DNADNA 提取流程提取流程
化学方法CTAB 法：适用于植物材料等。是一种阳离子去污剂，溶解细胞膜，与核酸结合。在高盐下溶解释放 DNA 。
SDS 法：适用于血液，细胞，动物组织，细菌，酵母等物理方法 机械剪切，超声波破碎，研磨匀浆等。易造成 DNA断裂。酶法 蛋白酶 K
BioTeke基因组 DNA提取系列试剂盒综合利用上述方法
基因组基因组 DNADNA 提取流程提取流程 -- 细胞裂细胞裂解解
特点：特点：不需要使用有毒的氯仿、苯酚等试剂多次柱漂洗确保高纯度；长度可达 30-50Kb
提取原理：提取原理：
组织组织 // 细胞细胞 // 细菌细菌 // 血液基因组血液基因组 DNADNA提取提取
玉米叶片基因组 DNA提取（使用新型快速植物基因组 DNA提取试剂
盒）
提取原理：提取原理：植物材料基因组植物材料基因组 DNADNA 提取提取
特殊样品基因组 DNA提取传统方法适用于所有材料基因组 DNA的提取？
比如大量血液？
比如土壤 / 粪便中的微生物基因组 DNA的提取？
比如病毒及其他微量样品 DNA的提取？
NO！
中量中量 // 大量血液基因组大量血液基因组 DNADNA 提提取取传统方法 消化后，用酚 /氯仿抽提， 时间长，损害操作人员健康
BioTeke 创新 不用蛋白酶消化 不用酚 /氯仿抽提结果： 得率：约 75-250μg /5mL 血样 纯度： OD260/OD280 ＝ 1.87-1.95
5ml全血基因组 DNA提取电泳结果
土壤土壤 // 粪便微生物基因组粪便微生物基因组 DNADNA 提取提取其他品牌试剂盒存在缺点：采用玻璃珠或钢珠破碎，导致基因组断裂严重；必须购买破碎专用设备，增加使用成本；采用包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式，导致DNA大量损失，得率很低，很难真实反映土壤微生物的多样性。BioTeke的技术创新：采用酶法破碎，保证基因组的完整性；用异丙醇沉淀 DNA， DNA无损失。
厂家 破碎方式
纯化方式
提取时间
是否需要专门设备
BioTeke
酶法破碎基因组完整 离心柱吸附杂质纯度高 1 小时内 不需要
Q 公司 钢珠破碎基因组断裂 玻璃奶同离心柱结合得率低 2 小时 需要M 公司 玻璃珠破碎基因组断裂 离心柱纯化得率较低 2 小时 需要
临床样品基因组临床样品基因组 DNADNA 提取提取
病毒基因组 DNA 提取酵母基因组 DNA 提取口腔拭子 DNA 提取微量样品 DNA 提取石蜡组织 DNA 提取头发 DNA 提取
一步法一步法 DNADNA 提取扩增提取扩增
原理：综合微量样品基因组 DNA提取和高效的 PCR扩增试剂。从毛发、石蜡组织等微量组织中高效提取足够浓度的 DNA，然后进行PCR扩增。操作简单、方便，可对大量样品同时进行操作。
保证基因组 DNA的完整性和纯度
提高 DNA的洗脱效率
DNA的储存
基因组基因组 DNADNA 分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事项
保证基因组 DNA的完整性和纯度
提高 DNA的洗脱效率
DNA的储存
基因组基因组 DNADNA 分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事项
•简化操作步骤，缩短操作时间•减少物理因素对 DNA的降解，震荡、搅拌等•减少化学物质对 DNA的降解，操作多在 pH4-10•防止基因组 DNA的生物降解： DNase
保证基因组 DNA的完整性和纯度
提高 DNA的洗脱效率
DNA的储存
基因组基因组 DNADNA 分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事项
•洗脱液 65度预热 10分钟•洗脱体积不小于 30μL•洗脱 2 次或者 3 次
保证基因组 DNA的完整性和纯度
提高 DNA的洗脱效率
DNA的储存
基因组基因组 DNADNA 分离纯化中的注意事项分离纯化中的注意事项
•可长期储存于 pH=7.0的 ddH2O或TE•不易制成干品储存•分装低温保存
如何提高微量核酸提取或回收后的浓度如何提高微量核酸提取或回收后的浓度
核酸助沉剂的应用微量吸附柱的应用 ---15μl 洗脱体系
质粒提取胶回收或 PCR产物回收微量细胞 / 组织 DNA/RNA 提取病毒 DNA/RNA 提取微量临床样本 DNA/RNA 提取
不同样品核酸提取、扩增、荧光不同样品核酸提取、扩增、荧光定量定量 PCRPCR 完美解决方案完美解决方案
---Real-time qPCR 攻略
北京百泰克生物技术有限公司（北京市海淀区上地信息路 15号）
RT-PCR 原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR 成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR 常见问题及解决方案
主要内容主要内容
中心法则与 RT、 PCR
RNA
DNA
RT
PCR
逆转录反应可以以随机引物、 oligo(dT)或基因特异性的引物（ GSP）起始。
提取 RNA的质量会影响到 RT的产量及 cDNA的完整性。
整个过程要求无 RNA酶操作。
反转录酶、 RNA酶抑制剂都会对产物的质量造成一定的影响。
反转录相关因素反转录相关因素
Super M-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无 RNaseH活性
Thermo M-MLV反转录酶高效的逆转录活性，且无 RNaseH活性适合合成长片段的 cDNA,有很强的模板兼容性，对高 GC含量（ 75%以上）和结构复杂的模板效果显著在 42 -60℃ ℃ 具有较好的热稳定性。
One step RT-PCROne step RT-PCR
模板模板：：使用 BioTeke公司的 RNApure 总 RNA提取试剂盒提取的鸡肝脏组织 RNA
目的片段：目的片段：管家基因 β-Actin反应体系：反应体系：
反应程序：反应程序：
RT-PCRRT-PCR 相关产品相关产品
Super M-MLV反转录酶， 10000u/198元Super RT Kit cDNA 第一链合成试剂盒 50次，特价 490元Super One-step RT-PCR Kit 一步法 RT-PCR试剂盒 50次，特价 880
元
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RT-PCR原理Real-time qPCR 原理及应用Real-time qPCR 成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR 常见问题及解决方案
实时荧光定量实时荧光定量 PCRPCR 技术的应用技术的应用
基因表达差异分析拷贝数分析SNP检测miRNA定量转基因成分定量分析临床诊断、疾病及药物研发等
Real-time qPCRReal-time qPCR 原理原理
•如何对初始模板定量•荧光信号如何产生？
Real-Time qPCRReal-Time qPCR 主要概念主要概念
实时定量 PCR
非探针
化学原理
探针
两个重要图形
扩增曲线
熔解曲线
Real-Time qPCR 曲线的意义
扩增曲线 熔解曲线
图片为：首都医科大学演示实验结果 材料：小鼠肝脏 基因： β-actin
实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。
非探针类则是利用荧光染料（如 SYBR Green I）或者特殊设计的引物 ( 如 LUX Primers)来指示扩增的增加。
探针类 (TaqMan探针和 分子信标 ) 是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。
荧光染料和荧光探针荧光染料和荧光探针
SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链 DNA结合染料，与双链 DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。 SYBR GreenI的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm。
在 PCR反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3’ 端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
LUX LUX 引物工作原理 引物工作原理
TaqManTaqMan 探针工作原理探针工作原理
F QPrimer
F
QPrimer
Degradation of TaqMan probe by DNA polymerase
F
Q
Reporter
Quencher
Suppression of fluorescence
分子信标分子信标（（ molecular beaconmolecular beacon ））工作原理 工作原理 分子信标：一种在靶 DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图 5 ）。
荧光阈值荧光阈值 ((Threshold)Threshold)
Ct
Ct值是扩增 DNA的量达到阈值时候的循环次数。
Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
CtCt 值值
Real-time qPCRReal-time qPCR 流程流程
一步法 两步法优点 节省时间 稳定性好
减少污染灵敏度高 定量相对准确
缺点 灵敏度稍差稳定性稍差 操作稍复杂
一步法和两步法优缺点比较一步法和两步法优缺点比较
根据自己需求，选择合适的方法！
RT-PCR原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR 成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR 常见问题及解决方案
Real-time qPCRReal-time qPCR 成功因成功因素素引物设计： 3’末端尽量不是 A ； 18 － 24bp；扩增产物 80-150bp; 设计在基因保守区内 Taqman探针：尽量靠在上游引物；长度 30 － 45bp ， Tm比引物高至少 5℃； 5’端不要是 G ， G 会有淬灭作用，影响定量RNA 质量和定量 比较好， 2 条主带可见（ 28s 和 18s）；定量准确内标（ housekeeping gene ）正确选择 18s rRNA, ß-actin, GAPDH 等 标准曲线的准确制作 R2 ＝ 0.99
反应体系： 模板浓度不要太高，反转录最多 1µg 总 RNA， PCR一般 1µL 反转录产物； 引物浓度一般 100nM-1mM； 根据 kit要摸索最佳反应条件
小心操作： 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样，即使是混 合液！每个样品至少要做 3 个平行孔。每组实验最好有 3 个重复，做统计分析。
Real-time qPCRReal-time qPCR 成功因成功因素素
做 real-time qRT-PCR 前，做个普通的 PCR ，检测您的反应条件！
RT-PCR原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR 成功关键Real-time qPCR 数据分析Real-time qPCR 常见问题及解决方案
Real-time qPCRReal-time qPCR 数据分析数据分析基线（ baseline ）
•通常是 3 － 15个循环的荧光信号•同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值（ threshold)•自动设置是 3-15个循环的荧光信号的标准偏差的 10倍•手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。•同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，•但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值 : 与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取 Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。
统计分析方法统计分析方法绝对定量：此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的 RNA，或者是体外合成的 ssDNA。
相对定量：通过与内参基因 Ct值之间的相差来计算基因表达差异 , 一般是 2-Ct 。或者是考虑扩增效率的 Pfaffl 法。
绝对定量绝对定量
相对定量相对定量
Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005
相对定量相对定量
实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测
敏感性高 需要样品少 特异性高（ Taqman） 精确定量
Real-time qRT-PCRReal-time qRT-PCR 优优点点
RT-PCR原理Real-time qPCR原理及应用Real-time qPCR 成功关键Real-time qPCR数据分析Real-time qPCR 常见问题及解决方案
特异性 重复性 灵敏度其他问题
常见问题讨论常见问题讨论
扩增的特异性扩增的特异性引物？
Tm，重新设计引物，优化条件Tm
重复性重复性 ------ 判断实验优劣的重要指标判断实验优劣的重要指标
判断指标：主要为标准差（ SD）和变异系数（ CV）
影响重复性的因素： PCR 反应扩增的效率：优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 。
目的基因的初始浓度： 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。
标准曲线的影响：不少于 5 个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围；理想的标准品应与样本具有高同源性，质粒 DNA 或是体外合成、转录的RNA 。
影响灵敏度的因素影响灵敏度的因素 反应体系中形成的引物二聚体的影响
可以用水解探针代替 SYBR Green I ，有文献报导使用水解探针的敏感性要比 SYBR Green I 高出 10倍。
可以使用热启动办法或使用特殊处理的 Taq 酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现 PCR 的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。
注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。
循环数 Mg2 ＋的浓度
Q1:Q1: 无无 CtCt 值（信号）出现值（信号）出现可能性不大
检测荧光信号的步骤有误 : 一般 SG 法采用 72℃延伸时采集， Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解 : 可通过 PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足 : 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解 : 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q2:CtQ2:Ct 值出现过晚（值出现过晚（ CtCt ＞＞ 3838 ））
扩增效率低 : 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR 产物太长 : 一般采用 80-150bp 的产物长度。
Q3:Q3: 标准曲线的线性关系不佳标准曲线的线性关系不佳
加样存在误差 : 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解 : 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准
品。 引物或探针不佳 : 重新设计更好的引物和探针 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
Q4:Q4: 阴性对照也出现明显的起飞阴性对照也出现明显的起飞
反应 mix 或水被污染。 引物二聚体的出现： 用 SG 法在 35cycles 以后阴性出现起飞属正常情况，
可配合熔解曲线进行分析。 反应过程中探针的降解：用 PAGE电泳对探针进行检测。 ROX 校正的问题：如果使用了，则可能是 ROX 的降解所造成。
Q5:Q5: 熔解曲线不止一个主峰熔解曲线不止一个主峰
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix试剂盒。 模板有基因组的污染： RNA提取过程中避免基因组 DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
Q6:Q6: 扩增效率扩增效率低低
反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 反应体系中有 PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
Q7:Q7: 同样的试剂在不同仪器上产生不同的同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲 线，如何比较？曲 线，如何比较？
判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性
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BioTeke Real-time qPCR 产品可用于各种仪器ABI: PRISM 7000/7700/7900HT,7300/7500
Bio-Rad: DNA Engine Option/DNA Engine Option2/Chromo4 Real time System,iCycler IQ/MyiQ/iQ5
Stratagene:Mx3000P/Mx3005P
Roche: Light cycler
Bioer: Line-Gene
其他各种 real- time qPCR扩增仪ROX参考染料：在荧光检测中标准化非 PCR相关的震荡； 在 qPCR中提供一个稳定的基线
BioTeke Real-time qPCR 产品反应程序两步扩增反应 Real-time qPCR:
循环数 Step 温度 时间 检测 说明1 1 95℃ 2min Off 起始模板预变性
35-45 1 95℃ 15sec Off 模板变性2 60-68℃ 20-60sec On 退火 /延伸
三步扩增反应 Real-time qPCR:
循环数 Step 温度 时间 检测 说明1 1 95℃ 2min Off 起始模板预变性
35-45 1 95℃ 10-20sec Off 模板变性2 55-65℃ 10-20sec Off 退火3 72℃ 20-60sec On 延伸
溶解程序：（ dissociation program),扩增反应完成后的最后一步，检测扩增反应的特异性。不同仪器要求的程序稍微不同。
ABI7000 的溶解程序：
BioTeke Real-time qPCR 产品反应程序
循环数 Step 温度 时间 检测1 End 55-65℃ 10-20sec On
End 95℃ 10-20sec Off
BioTeke 产品应用实例 --- 最权威的声音来源于实践
目前应用最广泛的主流仪器： ABI系列及 Bio-Rad系列。
来自 Bio-Rad系列的检验报告。
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