Real-Time PCR

原理及應用研究部黃欣儀

Real-Time PCR基本原理：

隨著PCR反應循環逐次增加時，目標DNA也隨之快速增幅，此時 PCR反應液反應中之特定的螢光物質可與目標DNA結合而產生螢 光，經由儀器偵測後即時將訊號資料呈現並計算。

基本原理：

目標 DNA 起始的量愈多，其螢光值愈早達到偵測之閥值 (Threshold)，此時所對應的循環數(cycle)稱之為Ct值。因此，目 標DNA的濃度與Ct值成反比關係。

依據連續稀釋標準樣品的Ct值及已知濃度，可得標準曲線，根據 此標準曲線可以推算樣品的起始濃度，達到定量測試之目的。

Real-Time PCR原理

Real-Time PCR應用

A.

螢光化學原理B.

螢光強度計算原理

C.

數據分析

A.

絕對定量Absolute QuantificationB.

相對定量Relative Quantification

C.

基因型鑑定SNP genotyping assayD.

微小RNA偵測 及定量

Real-Time PCR螢光化學原理

雙股DNA嵌合螢光染劑

SYBR Green dye

SYBR Green dyea highly specific, double-stranded DNA binding dye, to detect PCR product as it accumulates during PCR cycles.

優點：不需額外合成特殊引子，方法簡單成本低，可 作melting curve分析。

缺點：若PCR過程中有或有primer dimer或有非專一 性PCR產物均會影響判讀。

Real-Time PCR螢光化學原理

特定序列螢光探針TagMan®

probe dual

labeled probe –hydrolysis probe

Molecular beacons

FRET-Dual labeled probe- hybridization probe

TagMan®

probe dual labeled probe – hydrolysis probe 5’-end fluorophore:. FAM, TET

3’-end quencher: TAMRA, MGB• In Gene expression

assays

• Pharmacogenomics• Human Leukocyte Antigen

(HLA)

genotyping

• Determine the viral load in clinical specimens (HIV, tuberculosis, Hepatitis)

• Bacterial Identification assays• DNA

quantification

• SNP genotyping• microRNA

quantification

優點：專一性佳缺點：需額外合成特殊引

子，成本高，無法 作melting curve

http://en.m.wikipedia.org/wiki/Gene_expressionhttp://en.m.wikipedia.org/wiki/Pharmacogenomicshttp://en.m.wikipedia.org/wiki/Human_Leukocyte_Antigenhttp://en.m.wikipedia.org/wiki/HIVhttp://en.m.wikipedia.org/wiki/Tuberculosishttp://en.m.wikipedia.org/wiki/Hepatitishttp://en.m.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://en.m.wikipedia.org/wiki/SNP_genotypinghttp://en.m.wikipedia.org/wiki/Microarray

Molecular beaconsLoop部分為專一性序列

優點：專一性佳，可作 melting curve

缺點：需額外合成特殊引 子，成本高。

FRET-Dual labeled probe-hybridization probe 3-5bp

優點：專一性佳，可作melting curve缺點：需額外合成特殊引子，成本高。

Real-Time PCR螢光強度計算原理

Amplified curve: 4 phases

Basal phase

Exponential phase

linear phase

plateau phase

Exponential phase

Basal phase

linear phase

plateau phase

Ct

線性曲線 對數曲線

threshold

Xn

: 在n次循環下之產物分子數

X0

: 起始分子數

Ex

: 擴增效率

n: 循環數

數據分析: 如何定義閥值(Threshold)Sigmoidal

curve: 4 factors

Semi-log

Real-Time PCR應用絕對定量Absolute Quantification

Ct=-klogx+b

用於確定未知樣本中某個核酸序列的絕對量值，也就 是copy numbers

相對定量 Relative Quantification

用於測定樣本中之目標基因(target gene)在實驗組及 對照組中表達的相對變化。在比較之前，同一個樣本 中 的 目 標 基 因 需 用 內 部 對 照 基 因 (endogenous

control gene)先做校正(normalization)。

Ctref Cttarget實驗組

對照組

相對定量 Relative Quantification

(Control)

Targetgene

Endogenouscontrol

Ctsample- Ctcontrol

基因型鑑定Single nucleotide

polymorphisms genotyping assay

• 需用兩個帶有不同螢光物質，並針對單一鹼 基變異而能辨識之探針，在PCR反應完成時 收集數據，可用於檢測變異。

• 每個反應中需包括兩個引子和探針，可將序 列放大並偵測產物序列上單核苷酸多形性位 點上出現兩個可能的變異基因型

• 目標序列實際量不確定

Allele

Allele

T

A

G

A

G

C C

TQuencher

C/C A/A A/C

Allelic Discrimination plot

C/C

A/A

A/C

VIC

FAM

RT

30:00

48:00

Melting curve

One Step Real time PCR method

®

®

High Resolution Melt (HRM)• Novel, homogeneous, post-PCR method, enabling genomic

researchers to analyze genetic variations in PCR amplicons. • Beyond the power of classical melting curve analysis in

much more detail and with much higher information yield than ever before.

• Samples can be discriminated according to their sequence, length, GC content or strand complementarity. Even single base changes can be readily identified.

•Mutation discovery (gene scanning)

•Screening for loss of heterozygosity

•DNA fingerprinting •SNP genotyping •Characterization of haplotype

blocks

•DNA methylation

analysis

•DNA mapping

•Species identification •Somatic acquired mutation ratios

•HLA compatibility typing •Association (case/control) studies

•Allelic prevalence in a population

•Identification of candidate predisposition genes

HRM Applications

Homozygous WT Homozygous Mut HeterozygousBasic primer

Sequence specific probe

Genotyping assay

http://www.genengnews.com/Media/images/Article/block_5685.jpg

Tm

differences between homozygotes

are big

enough, these can be displayed by omitting the temperature-shift step.

微小RNA偵測 及定量

微小RNA偵測 及定量

目標模板(Template)選擇之原則

Design amplicon to be 75–200 bp. Shorter amplicons are typically amplified withhigher efficiency. An amplicon should be at least 75 bp to easily distinguish itfrom any primer-dimers that might form.

Avoid secondary structure if possible.

Avoid templates with long (>4) repeats of single base.

Maintain a GC content of 50–60%.

引子設計之原則

引子設計原則

Length in 20~40 bp

Design primers with a GC content of 50–60%

Maintain a melting temperature (Tm) between 50ºC and 65ºC.

Avoid secondary structure

Avoid repeats of Gs or Cs longer than three bases

Place Gs and Cs on ends of primers.

Number of Cs> Gs

Avoid primer dimer

& hairpin form (

ABI Primer Express 3.0

ABI 7900HTStepOnePlus™

Real-Time

PCR System

醫院現有之機型研究部八樓 子宮頸癌專題研究室

感謝聆聽

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