Homojenizasyon (Parçalanma) ve Yöntemleri

Çalışılacak molekül grubunu (nükleik asit ya da protein) içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilmesine homojenizasyon denir. Cam homojenizatör kabında pistonun düzenli dönüşü ya da vuruşu ile sağlanan mekanik güçle, hücreler piston ve cam çeper arasında sıkıştırılır hücre zarı parçalanır, hücre içeriği tampona geçer, elde edilen süspansiyon, bütünlüğü bozulmamış birçok organeli içerir ki bu da HOMOJENAT olarak adlandırılır.

Hücreleri parçalayarak fraksiyonlara ayırma yöntemleri, temelde hücre sınırlarının çeşitli fiziksel ya da kimyasal tekniklerle yok edilmesini kapsar. Geliştirilen çeşitli teknikler sayesinde bir dokudaki farklı hücre tiplerini birbirinden ayırmak mümkün olduğu gibi dikkatli bir çalışma ile organeller de oldukça sağlam bir şekilde elde edilebilirler.Homojenizasyon(parçalanma) yöntemleri genel olarak 2 kısma ayrılmaktadırlar;

A)Fiziksel işlemler•Mekanik işlemler•Ultrasonikasyon•Ozmotik şok•Dondurma-çözme

B)Kimyasal işlemler•Çözücülerin kullanılması•Enzimlerin kullanılması

A)Fiziksel Yöntemler

1)Mekanik Yöntemler : Bu tip tekniklerin en basit ve ilkel olanı materyali bir havan içinde kum ile öğütlemektir. Ezme sırasında alumina, kum ya da cam tozu katılacak olursa parçalama etkinliği artar. Ezerek parçalamada daha gelişmiş şekilde doku veya hücrelerin (liquid N2) sıvı azotta (-196 °C) ya da -20 --- -70°C’da dondurulan soğuk havanlarda yapılır. Donmuş hale gelen dokular toz hale gelene kadar kolaylıkla parçalanabilmektedir fakat dokularda çözünme olmadan kısa sürede bitirilmelidir.

HAVAN

Günümüzde mekanik olarak parçalama da farklı tipte amaca uygun homojenizatör adı verilen aletler kullanılmaktadır.

KARIŞTIRICILI HOMOJENİZATÖR(“Waring Blender”)

MİLLİHOMOJENİZATÖR

(“ultra turrax)

BASINÇ HÜCRESİ

BALİSTİK HOMOJENİZATÖR

PİSTONLU HOMOJENİZATÖR

2)Ultrasonikasyon :

Hücre süspansiyonuna daldırılan sonikatör, titreşim yaparak ve yüksek ses dalgalarıyla hücre bütünlüğünü bozar. Bu amaçla kullanılan aletler (ultrasonikatör) elektrik enerjisini kesikli karakterde mekanik enerjiye çevirerek, titanyumdan yapılmış bir sonda yardımıyla ultrases dalgalarını solüsyon içindeki materyale iletir. Bu tür parçalama işlemleri sırasında açığa çıkan ısıyı yok etmek için uygun soğutmaların yapılması gerekmektedir.

Sonikatör

3)Ozmotik Şok: Hücre duvarı (çeperi) bulunmayan ya da yok edilmiş hücreler için uygun olan ve hücrelerin yüksek ozmotik basınçlı bir çözeltiden, hipotonik bir ortama geçirilmesi durumunda, suyun hücrelerin içine girmesi ile zarlarda patlamaya yol açması durumunda meydana gelen homojenizasyondur.

4)Dondurma – Çözdürme: Hücrelerin çok düşük sıcaklık derecelerinde (örneğin, -20°C ) tutulup sonra yeniden ısıtılarak çözündürülmesi ve bu işlemin birkaç kez tekrarlanması parçalanmaya yol açar.

Soğuk-Sıcak-Soğuk-Sıcak

B)Kimyasal Yöntemler

1)Çözücülerin Kullanılması: Hücre zarında bulunan bileşiklerin çözündüğü uygun bir solvent (çözücü) yardımıyla zar yapısının eritilmesidir. Bu amaçla kullanılan organik çözücüler (örneğin, etil asetat, toluen vb.) zardaki lipitleri, deterjanlar (SDS) ise uygun şartlarda protein ve lipoprotein ile etkileşime girer ve uzaklaştırır.

2)Enzimlerin Kullanılması: Bu amaçla kullanılan litik enzimler özellikle mikroorganizmalar için uygundur. Gram (+) ‘lerde bakteri duvarının yıkılması için lizozim enzimi kullanılırken Gram(-) ‘lerde ise EDTA(kimyasal) uygulamasına tabi tutulması gerekmektedir.

Kimyasal parçalama yöntemleri ısı, yüksek basınç, gürültü gibi olumsuz faktörlerin ortaya çıkmaması gibi nedenlerle fiziksel yöntemlere göre üstünlükler taşır

Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı Çeşitli materyallere uygulanabilecek bazı parçalama yöntemleriparçalama yöntemleri

Teknik Materyal tipiNazikOzmotik şok EritrositlerEnzim uygulaması Bakteriler, mayalarDeterjan uygulaması Doku kültürü hücreleriHavan veya pistonlu homojenizatör Karaciğer vb. yumuşak dokularDiğer aletlerle parçalama Kas vb. Dokular

Orta şiddetteMilli homojenizatörle par. Hayvansal ve bitkisel dokularKum, alumina vb. ile ezme Bitkisel dokular, bakteriler

SertFransız basınç hücresi Bitkisel dokular, bakterilerUltrasonikasyon Hücre süspansiyonlarıBalistik parçalama Hücre süspansiyonları

Kaynaklar *Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler,

Prof. Dr. Güler Temizkan ve Doç.Dr.Nazlı Arda, 2004, Nobel Tıp Kitabevi.

*Proteinlerin Saflaştırılması, Prof. Dr. Kader Köse, Tıp Fakültesi Ders Notları

*Ayırma ve Saflaştırma İşlemleri, Prof.Dr. D.LaleZor, Açık Öğretim Fakültesi Ders Notları

*Laboratuvarda Uygulanan Temel İşlemler, Açık Öğretim Fakültesi Ders Notları