Utilisation des mutations induites pour l’étude de ...

BASE Biotechnol. Agron. Soc. Environ.201115(1),195-205 Le Point sur :

Utilisationdesmutationsinduitespourl’étudedel’embryogenèsechezleharicotPhaseolus vulgaris L.etdeuxplantesmodèles,Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.etZea mays L.SouleymaneSilué(1),Jean-MarieJacquemin(2),Jean-PierreBaudoin(1)(1)Univ.Liège-GemblouxAgro-BioTech.UnitédePhytotechnietropicaleetd’Horticulture.PassagedesDéportés,2.B-5030Gembloux(Belgique).E-mail:[email protected](2)CentreWallondeRecherchesAgronomiques(CRA-W).DépartementdeBiotechnologie.ChausséedeCharleroi,234.B-5030Gembloux(Belgique).

Reçule22janvier2010,acceptéle24juin2010.

L’amélioration du haricot commun Phaseolus vulgaris L. par hybridations interspécifiques avec les espèces Phaseolus coccineus L.etPhaseolus polyanthusGreenm.utiliséescommeparentsfemellessesoldegénéralementparl’avortementdesembryonshybrides.L’identificationdesgènesintervenantdansledéveloppementnormaldesembryonspermettraitd’expliquerenpartiel’avortementdesembryonshybrides;lesmutationsinduitespourraientdoncêtreunealternativechezPhaseoluspouridentifierlesgènesclésdel’embryogenèse.Cetteétudeprésentequelquesexemplesd’utilisationdesmutationsinduitesdansl’identificationdesgènesindispensablesaubondéroulementdel’embryogenèsechezArabidopsis thaliana(L.)Heyhn.etZea mays L.,plantesmodèlesdel’étudedel’embryogenèsechezlesdicotylédonesetlesmonocotylédones,respectivement.Chezcesdeuxespèces,desmutantsdudéveloppementembryonnaireontétéidentifiésenutilisantlamutagenèseinsertionnelleetlamutagenèsechimiqueàl’ÉthylMéthaneSulfonate(EMS).ChezArabidopsis,lesmutantssontaffectésdanslapolaritéapico-basale,l’organisationradialeetlesétapespost-embryonnairesetcertainsembryonsmutantssontaffectésdanslasignalisationdel’auxine.Chezlemaïs,lesmutantsdefective kernel(dek),altérésauniveaudel’embryonetdel’albumen,etlesmutantsembpourlesquelsseull’embryonestaffecté,ontétéidentifiés.Chezleharicotcommun,desplantesdéficientesdanslaformationdesgrainesontétéidentifiéessuiteàlamutagenèseàl’EMS.Lesembryonsdesgrainesdecesplantesarrêtentdecroîtreàdifférentsstadesdedéveloppementetprésententdesanomaliesprincipalementauniveaudususpenseuretdescotylédons.Mots-clés.Phaseolus,hybridationinterspécifique,embryogenèse,Arabidopsis,Zea,mutagenèseinduite.

Use of induced mutations in embryogenesis study in bean Phaseolus vulgaris L. and two model plants, Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. and Zea mays L.Breedingofcommonbean,Phaseolusvulgaris L.,throughinterspecifichybridizationswith the species Phaseolus coccineus L. and Phaseolus polyanthus Greenm. as female parents leads to the abortion ofimmature embryos. Identification of genes required for embryo development could partly explain the abortion of hybridembryos;inducedmutationscouldthusbeanalternativetoidentifykeygenesinvolvedinPhaseolusembryogenesis.Thispaperisareviewwhichshowsafewexamplesoftheuseofinducedmutationsintheidentificationofessentialgenesforembryogenesis in twomodelplants,Arabidopsis thaliana (L.)Heyhn. fordicots andZea mays L. formonocots. In thesetwospecies,embryodevelopmentmutantshavebeenisolatedusinginsertionalmutagenesisandchemicalmutagenesiswithEthylMethaneSulfonate(EMS).Arabidopsisembryomutantsareaffectedinapical-basalaxispolarity,radialpatternandinpost-embryonicstages.SomeArabidopsisembryomutantsaredefectedinauxinsignalisation.Inmaize,defective kernel(dek)mutantsareaffectedintheembryoandtheendosperm,whileinembryo specific(emb)mutants,onlytheembryoisaffected.Incommonbean,plantsdeficientinseeddevelopmentwereisolatedusingEMSmutagenesis.Embryosinsidetheseedsfailtogrowthatdifferentstagesofdevelopmentandshowabnormalitiesmainlyinthesuspensorandthecotyledons.Keywords.Phaseolus,interspecifichybridization,embryogenesis,Arabidopsis,Zea,inducedmutagenesis.

196 Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 201115(1),195-205 SiluéS.,JacqueminJ.-M.&BaudoinJ.-P.

1. IntrodUctIon

DanslegenrePhaseolus,leharicotcommun(Phaseolusvulgaris L.) est l’espèce économiquement la plusimportanteavecplusde90%delaproductionmondialede haricot. Il constitue la principale légumineusealimentaire de plus de 300millions de personnes enAmérique latine et en Afrique centrale et de l’Est(Broughton et al., 2003). La production mondiale enharicot sec en 2007 était estimée à 19,29millions detonnes.La surface totale consacrée à cetteproductionreprésentait environ26,92millionsd’hectarespourunrendementmoyende0,72t.ha-1.Lerendementmoyenen Amérique du Nord et dans l’Union européenneétait de 1,63t.ha-1 et pour l’Afrique, il n’était que de0,59t.ha-1 (FAO, 2009). Ce faible rendement est dûd’une part, aux contraintes biotiques et abiotiquesde production auxquelles le haricot commun esttrès sensible et d’autre part, à l’absence de variétésrésistantesoutolérantesàcescontraintesauseindupoolgéniqueprimaireduharicotcommun.Eneffet,plusde200agentspathogènes(fongiques,bactériensetviraux)sontconnuschezleharicotcommunetcertainsd’entreeux causent des pertes économiques considérables(Caixetaetal.,2003).Lesfacteursabiotiquestelsqueleshautestempératuresetlasècheressecontribuentaussiàréduirelesrendementsduharicot(Raineyetal.,2005).

Dans les travaux d’amélioration variétale duharicot commun, les hybrides interspécifiques ontété exploitéspour introduiredesgènesutilesqui sontabsentsoufaiblementexpriméschezcettelégumineuse.Les croisements ont été réalisés surtout avec lesdeux espèces donneuses Phaseolus coccineusL. etPhaseoluspolyanthusGreenm.phylétiquementlesplusprochesdePhaseolusvulgaris.Cesdeuxespècessontutilisées comme parents maternels afin de favoriserl’introgression des gènes utiles de ces deux taxons.Malheureusement, ces croisements donnent lieu trèssouventàdesavortementstrèsprécocesdesembryonshybrides(Busogoroetal.,1999;Baudoinetal.,2004).

L’avortement des embryons hybrides est attribuéen partie à des raisons nutritionnelles: les mauvaisfonctionnements de l’albumen, du suspenseur et destissus maternels entraineraient une compétition entrel’albumenetl’embryond’unepart,etentrelesuspenseuret l’embryon d’autre part. Ces différentes anomaliesentraventl’alimentationnormaledel’embryonhybrideet le maintien d’un équilibre minéral et hormonalnécessaireaumétabolismede l’embryogenèse (Geertset al., 2002; Toussaint et al., 2004). L’utilisation del’embryoculture a permis la régénération de planteshybrides issues de ces différents croisements. Lesembryonshybridesmis enculture étaient âgésde7 à33joursetavaienttousatteintlestadecordiformetardifou cotylédonaire (Camarena et al., 1987; Kuboyamaetal.,1991).

Par ailleurs, l’identification des gènes majeursimpliqués dans l’embryogenèse de Phaseoluspermettrait d’avoir une meilleure compréhension duphénomèned’avortementdesembryons.

Comme cela s’est fait chez des plantes modèles(Devic, 1995; McElver et al., 2001; Tzafrir et al.,2004; Vernoud et al., 2005), les mutations induites(provoquées par des agents extérieurs et causant desmodificationsdanslegénome)pourraientêtreutiliséeschez Phaseolus pour identifier les gènes majeursintervenantdansl’embryogenèse.

L’objetdecetteétudeestdemontrerquel’utilisationdes mutations induites chez le haricot communpermettrait de mieux comprendre les mécanismesfondamentauxconduisantàl’avortementdesembryonsau cours du développement embryonnaire chezPhaseolus.Dansunpremiertemps,nousdécrironslesmutations induites au niveau de l’embryogenèse desplantesainsique les typesdemutationsutiliséschezles plantes modèles pour l’identification des gènesde l’embryogenèse. Ensuite, quelques cas d’étudesréalisées chez deux plantes modèles, Arabidopsis thaliana (L.) Heyhn. (dicotylédone) et Zea mays L.(monocotylédone), sont présentés. Nous faisonségalementunesynthèsedequelquesmutantsaffectésdans la signalisation de l’auxine chez Arabidopsis.Dans la dernière partie, nous présentons quelquesexemplesd’utilisationdesmutations induites chez leharicot commun et leur potentialité dans l’étude del’embryogenèse.

2. Les MUtatIons IndUItes et L’eMbryogenèse des PLantes ModèLes

2.1. Les mutations induites

Les mutations induites sont provoquées parl’action d’agents mutagènes ou d’éléments d’ADNtransposablesafindecréeretd’augmenterlavariabilitéau sein d’une population. D’une façon générale,les mutations entrainent des modifications dansn’importequellerégiondel’ADN.Cesmodificationsse caractérisent soit par des gains ou des pertes defonction.L’exploitationdesmutantspermetdelocaliseretd’identifierdesgènesaffectésetdedéterminerleurfonctionbiologique(Meunier,2005).

Lesagentsmutagènessontdesproduitschimiquesou des facteurs physiques dont les actions sontaléatoires;n’importequellepartiedugénomeougènepeut subir unemodification (Morère et al., 2003). Ilexiste une spécificité des agents mutagènes dans lamesure où, pour un agent mutagène donné, certainschangementsdeséquencesontprivilégiésparrapportauxautreschangementspossibles.Lamutagenèsepeutcependantseréaliserparinsertiond’élémentsétrangers

MutationsinduitesetembryogenèsechezP. vulgaris,A. thalianaetZ. mays 197

ounon(ADN-Toutransposons)danslegénomed’unorganisme, il s’agit de la mutagenèse insertionnelle(Parinovetal.,2000;McElveretal.,2001).

2.2. L’embryogenèse des plantes à fleurs

Chez les angiospermes (plantes à fleurs), l’embryo-genèseestconstituéedetroisétapesmajeures(Parketal.,2008).Lapremièreétapecomportelaformationdupatronde l’embryon.Cedernierpassepardifférentsstades de développement nommés en fonction de laforme de l’embryon: le zygote, une seule cellule,se divise activement pour former des embryonspréglobulaires(lequadrant,unembryonde4cellules;l’octant, un embryon de 8cellules, etc.). L’embryonpassera ensuite par les différents stades globulaires,triangulaires,cordiformes,torpillesetcotylédonaires.La formation du patron est achevée dans l’embryonaustadecordiformecorrespondantàl’embryogenèseprécoce. Les cellules qui donneront les différentsméristèmesettissussontalorspositionnées.Cepatronsertdebaseauxétapesultérieuresdel’embryogenèseetàlaformationdelaplanteadulte.Ladeuxièmephasecorrespondàuneétapedecroissanceetdematurationpendantlaquellel’embryonemmagasinedesréservespour assurer la germination après la dormance. Ladernièreétapecorrespondàladormancequiestunétatde repos végétatif permettant aux graines d’attendreles bonnes conditions climatiques pour germer. Cestrois étapes se déroulent de manière séquentielle etchaquephasededéveloppementnécessitel’expressionde différents groupes de gènes (Devic et al., 2001;McElver et al., 2001). La figure 1a représente lesdifférentesphasesdel’embryogenèsechezA.thalianaainsiquelesprincipauxgènesimpliqués.

Malgré des différences morphologiquesimportantes, les plans d’organisation et la séquencedesévènementsaboutissantàl’embryonmaturesontglobalement conservés pour l’ensemble des plantes,qu’elles soient monocotylédones ou dicotylédones.L’embryogenèse de ces deux classes de plantesest même parfaitement comparable jusqu’au stade8cellules. Ainsi, chez le maïs qui constitue laplante modèle pour l’étude de l’embryogenèsedes monocotylédones (Fontanet etal., 2008), ledéveloppement embryonnaire suit, dans l’ensemble,le même schéma que chez A.thaliana. Toutefois,quelquesdifférencesexistent:– ledéveloppementdumaïss’effectueselonunplan de division différent de celui d’Arabidopsis, l’embryonetlesuspenseurrésultanttousdeuxd’une sériededivisionsasymétriques,– chez le maïs, l’axe établi par les méristèmes caulinaireetracinairedel’embryonestobliquepar rapportà l’axeembryon-suspenseur,alorsqueces deuxaxessontconfonduschezArabidopsis,

– chezlemaïs,iln’yaqu’unseulcotylédon(appelé scutellum) sur l’axe duquel se situe leméristème apical; chez Arabidopsis, par contre, deux cotylédons sont positionnés de façon symétrique autourdel’axe,– danslecasdumaïs,leméristèmeapicalcommence à produire des feuilles durant le développement embryonnaire, l’entrée en dormance de la graine ayant lieu lorsque la plantule est constituée de 6primordiafoliaires;chezA.thaliana,lespremières feuillesn’apparaissentqu’aprèslagerminationdela graine,– enfin,chezlemaïs,lesréservessontaccumuléesau seindel’albumen,quiconstituelaplusgrandepartie dugrainàmaturité,d’oùladénominationdegrain albuminé.Enrevanche,lagrained’Arabidopsisoù les réserves sont contenues au sein même de l’embryonestunegraineexalbuminée,toutcomme pourleharicotcommun.

Chez cette dernière espèce, les études antérieuressurl’embryogenèseontmontréqueledéveloppementembryonnaire suivait le même plan d’exécution quecelui observé chezArabidopsis (Yeung et al., 1979;Geerts,2001;Nguemaetal.,2007).ChezP.vulgaris,le stade cordiforme correspondant à la formationdu patron de l’embryon est atteint 8jours aprèsl’anthèse.Lafigure 2montre lesdifférents stadesdel’embryogenèsechezlegénotypeBAT93deP.vulgaris,cultivé en chambre conditionnée à Gembloux(températuresjour/nuit:24/20°C,photopériodejour/nuit de 12h/12h, humidité relative: 75%). Cettereprésentation schématique a été faite à partir decoupes histologiques. Les graines en développementontétéfixéesdans2%deparaformaldéhydepréparédans 0,1M de tampon phosphate. Les échantillonssont ensuite déshydratés dans un gradient croissantd’éthanol et enrobés dans une résine méthacryliquehydrophile:le2-hydroxyethylmethacrylate(HEMA).Enfin,descoupesde5à7μmsonteffectuéesàl’aided’unmicrotomerotatif(Silué,2009).

L’embryogenèse précoce est une étape demorphogenèse qui aboutit à la formation de deuxaxes, un axe radial qui traduit la mise en place desdifférentstissus(l’épiderme,leparenchyme,lecortex,l’endoderme, lepéricycle et les tissusvasculaires) etun axe apico-basal correspondant à lamise en placedes différents organes [le méristème apical, le(s)cotylédon(s),l’hypocotylesituésouslescotylédons,laradiculeetleméristèmeracinaire](Figure 1b).C’estaucoursdupassagedustadeglobulaireàl’émergenceduoudescotylédon(s)qu’apparaitleplanapico-basaldel’embryon,bienquelespremierssignesdepolaritéselon cet axe soient observables dès la premièredivisionduzygote,tandisquel’axeradialn’estdéfiniqu’austadeglobulaire(Ravenetal.,2007).Auniveau


Figure 1. L’embryogenèsechezArabidopsis thalianaL.Heynh.adaptédeDucreux(2002),Vernoudetal.(2005),Ravenetal.(2007)—ArabidopsisthalianaL. Heynh. embryogenesis adapted from Ducreux (2002), Vernoud et al. (2005), Raven et al. (2007).

a:Représentationschématiquedesprincipalesphasesdudéveloppementdel’embryonetlesprincipauxgènesimpliquésdustadezygoteaustadecotylédonairematureà10joursaprèspollinisation(JAP)—Schematic drawing of key developmental stages of the embryo from zygote stage to the late cotyledonary stage at 10 days after pollination (DAP) ;b:Embryonaustadecordiforme(patrondel’embryon)avecprésentationdesdifférentespartiesdesaxesapico-basaletradial—Heart shape embryo (embryo body) with components of apical-basal and radial axis.

Gènes agissant sur l’axe apico-basalGènes agissant sur l’axe radialGènes agissant sur la forme de la plantule

Gènes agissant sur la maturation de l’embryon

Zygote 2 cellules globulaire

Cotylédons

torpille cotylédonaire mature

Formation du patron de l’embryonavec établissement des axes

apico-basal et radial

Croissance et maturationde l’embryon

Axe radial Axe apico-basal

Méristème apical

Méristème racinaire

Hypocotyle

Protoderme

Parenchyme

Tissus vasculaires

Phase de dormancede l’embryon

LEAFY ABI FUSCA

0,7 mm

cordiforme

GNOM MONOPTErOS

rAPSBErrYKNOLLEKEULE FASS

KNOPFMICKEY

SHOOT-MErISTEMFACKEL GUrKE HOBBIT

a

b

0,5 1 3 4 5 10 JAP


del’évolutionetdelasélectionnaturelle,lesindividuslesplusaptesàsurvivreserontceuxquipourrontplusfacilement capter la lumière (seront donc plus hautsque leurs voisins) et qui sauront mieux coloniserle sol à la recherche de nutriments (possédant unsystèmeracinairemieuxadapté).Cescaractéristiquesfondamentales résultent d’un bon établissement del’axeapico-basalaucoursdel’embryogenèse(Devic,1995), soulignant ainsi l’intérêt de la compréhensiondesmécanismesgénétiquesdel’embryogenèse.

3. Les MUtants eMbryons cHez Les PLantes ModèLes

Au cours de l’embryogenèse, de nombreux gènesdoivent s’exprimer pour permettre au zygote dese diviser de manière régulière, de compléter samorphogenèse et de se différencier en un embryonmature capable de surmonter la dessiccation et deproduireuneplanteviable(McElveretal.,2001).

La majorité des connaissances actuelles sur leprogrammegénétiquedel’embryogenèsedesvégétauxsupérieurs provient de l’étude de mutants. De telsmutants affectant le développement embryonnaire àdifférents stades de développement ont été identifiés

chez les plantes modèles Arabidopsis thaliana L. etZea mays L.ayantsubidifférentstypesdemutagenèse:chimique, insertionnelle ou physique (Parinov et al.,2000;Tilletal.,2004).Lesagentsmutagèneslesplusutilisés sont l’ÉthyleMéthaneSulfonate (EMS)pourlamutagenèsechimique, l’ADN-Tet les transposonspour la mutagenèse insertionnelle, les rayonsX etgammapourlamutagenèsephysique(McElveretal.,2001;Vernoudetal.,2005).

3.1. Les mutants embryons chez Arabidopsis thaliana

Chez Arabidopsis, de nombreux mutants affectantdifférents évènements au cours de l’embryogenèseontétéisolésparmutagenèseinduite.Deuxstratégiescomplémentaires,baséessurlecriblagephénotypiquedesiliquesimmatures(Meinke,1985)etdeplantulesengermination(Jürgensetal.,1991),ontétéemployéesafind’isolerdesmutantsaltérésauniveaudelaphased’embryogenèse précoce. En fonction des donnéesissuesdecesdeuxapprochesdemutagenèse(chimiqueetinsertionnelle),lenombredegènesessentielsaubondéveloppementdelagraineafaitl’objetd’évaluations.Grâce à l’analyse d’un grand nombre de mutantsembryon-létaux, McElver et al. (2001) et Tzafrir

Figure 2. Développement embryonnaire chez le génotype BAT93 dePhaseolus vulgaris L.—Embryo development in Phaseolusvulgaris L. genotype BAT93.

Représentationschématiquedesprincipauxstadesdudéveloppementdel’embryondustade2cellulesàl’anthèseaustadecotylédonaireâgéà12joursaprèsanthèse(JAA).Lesbarresà0et3JAAreprésentent100µm,à5et8JAA500µmetà12JAA1000µm—Schematic drawing of key developmental stages of the embryo from the 2 cells stage at the anthesis to the late cotyledonary stage at 12 days after anthesis (DAA). Scale bars at 0 and 3 DAA represent 100 µm, at 5 and 8 DAA 500 µm, and at 12 DAA 1,000 µm.

Stade cotylédonaire âgéStade cordiformeStade globulaireStade globulairejeune

Stade 2 cellules

0,5 53 8 12 JAA


etal. (2003)ont estiméqu’environ750gènesétaientindispensablespourcoordonner lesdifférentsaspectsdu développement embryonnaire. Par contre, Tzafriretal.(2004)répertorientlenombrede250gènesdontla mutation entrainerait des phénotypes embryon-létauxchezArabidopsis.

Récemment,lenombredemutantsembryon-létauxa été estimé à près de 550 dont plus de 88% sontissusdelamutagenèseinsertionnelle(principalementavec du T-DNA) et près de 10% sont issus de lamutagenèsechimiqueàl’EMS(www.seedgenes.org).Lesanomaliesrépertoriéeschezlesembryonsmutantssontdetroistypes,selonqu’ellestouchentlapolaritéapico-basale,l’organisationradialeoulesétapespost-embryonnaires(Ducreux,2002).

Les mutants de l’axe apico-basal.L’axeapico-basal,quiconstituel’axeprincipaldecroissancedesracineset des pousses végétatives après la germination, estleplusprécoceà s’établir.Lesaltérationsdecetaxedonnentdesplantulesincomplètes,dépourvuessoitdesracines,soitdel’hypocotyle,oudepartiesaériennes.

LesmutationsdanslegèneGNOM(EMB30)chezArabidopsis provoquent la disparition des partiesapicale et basale de l’embryon qui présente uneélongation réduite selon l’axe apico-basal (Jürgenset al., 1991; Shevell et al., 1994). Par la suite, cesembryons montrent des défauts le long de cet axe.Ainsi,lesplantulesgnomnepossèdentpasderacines,montrent un alignement des cellules vasculairesdéfectueuses et ont des structures apicales réduites.Le gène GNOM possède une forte similarité avecdeux gènes de la levure, Gea1p et Gea2p (Buschetal., 1996). Ces gènes codent pour des protéinesde type «membrane-associated guanine-nucleotide exchange factor »quiagissentsurl’ADP-ribosylationfactor1(ARF),uneprotéinenécessaireàlaformationdes vésicules membranaires. Ainsi, le gène GNOMpourrait intervenir dans le transport dirigé devésicules,notammentpourl’exportationdesmatériauxnécessairesà lacroissancede laparoicellulaire.Lesconstituants ainsi exportés pourraient stabiliser l’axeapico-basal(Shevelletal.,2000).

Chez les mutants gurke, la partie supérieure dela plantule est affectée, les mutants étant réduits àl’hypocotyleetàlaracinesanscotylédonsniméristèmeapical. Cela est dû à des divisions cellulaires nonorganisées(Torres-Ruizetal.,1996).LegèneGURKEjouedoncunrôleindispensabledanslamiseenplacedescotylédonsetduméristèmeapical.Cegènecodepouruneacetyl-CoAcarboxylase1(ACCase1)(Baudetal.,2004).

LesmutationsdansFACKELaffectentl’hypocotyleet donnent une plantule ayant les structures apicales(cotylédons)rattachéesauxstructuresbasales(racines)(Jürgensetal.,1991).CegènecodepourunestérolC-14

réductase(Schricketal.,2000).LesdéfautsobservésseraientinduitsparladiminutiondesstérolsenavaldelaréactionimpliquantlastérolC-14réductase.LegèneFACKELjoueraitunrôledanslastructurecellulaireoudanslasignalisationembryonnaire(Jangetal.,2000;Schricketal.,2000).

Les mutants de l’axe radial. Le patron radial del’embryon est composé de trois tissus de base: leprotoderme(précurseurdel’épiderme),leparenchymeetletissuvasculaire.Lesaltérationsdel’organisationradialesontdesmutationsquiaffectentladistributionetl’organisationdestroistissuscitésci-dessus.

Les gènes KNOLLE et KEULE d’Arabidopsis thaliana constituent deux gènes dont la mutationperturbe la différenciation tissulaire lors del’établissement du protoderme. Chez les mutantsknolle, la séparation cellulaire est perturbée, tandisque laformationde laplaquecellulaireestanormalechez les mutants keule, donnant ainsi des embryonsavecdescellulesmultinucléées(Assaadetal.,2001).Les produits de ces deux gènes sont respectivementune syntaxine et une protéine SEC1. La syntaxineest une protéine nécessaire pour la formation de laplaquedecellules,tandisquelaprotéineSEC1régulele fonctionnement de la syntaxine (Assaad et al.,2001;Hagaetal.,2007).LesdeuxgènesKNOLLEetKEULEinteragissententreeuxetsontindispensablesà la séquestration, au transport et à la fusion desvésicules golgiennes lors de la cytokinèse (Heeseetal.,2001).Auseindel’axeradialdel’embryon,unecytokinèse complète est nécessaire à la ségrégationphysique des déterminants définissant le devenir descellulesinternesetprotodermiques(Lauxetal.,1997).

Lacaractérisationphénotypiquedemutantsembryo-défectueux a aussi révélé que si la différenciationtissulaire pouvait se dérouler indépendamment de lamorphogenèse (par exemple, chez le mutant gnomou fackel), en revanche, la morphogenèse ne peutavoir lieu sans qu’il y ait différenciation cellulaire(Goldbergetal.,1994).Ainsi,alorsquelaperted’undomaine embryonnaire n’altère pas l’élaboration desdifférentescouchesdetissusdanslesautresrégionsdel’embryon,lebonétablissementdel’axeradialsembleindispensableàlaconstructioncorrectedel’axeapico-basal,lescellulesauseindel’axeradialinteragissantprobablemententreelleslelongdel’axeprincipaldel’embryon(Ben,2005).

Les mutations post-embryonnaires. Concernantles anomaliespost-embryonnaires, lesgènesLEAFYCOTYLEDON (LEC) sont en particulier impliquésdans lesprocessusdemise en réserve et d’entrée endormance(Kwongetal.,2003;Kagayaetal.,2005).Cesgènescodentpourdesfacteursdetranscriptionsetcontrôlentdifférentsaspectsdel’embryogenèselorsde


lamaturationdel’embryon(Kwongetal.,2003).Lesmutants lec ont des cotylédons en formede feuilles.Lesgrainesmaturesleccontiennentdelachlorophylleetnesedessèchentpas(Toetal.,2006).

3.2. Les mutants embryons chez Zea mays

Chezlemaïs,lesmutantsaffectantledéveloppementembryonnaire ont été obtenus soit parmutagenèse àl’EMS, soit par mutagenèse de transposition. Leséléments transposables actifs sont généralement detroistypes:Mutator(Mu),Activator(Ac)ouEnhancer(En) (Till et al., 2004;Vernoud et al., 2005). Deuxclassesprincipalesdemutantsontétéidentifiées:lesmutantsdek(defective-kernel :grainaltéré)altérésauniveaude l’embryonetde l’albumen (Neuffer et al.,1980)et lesmutantsemb (embryonic defective)pourlesquelsseull’embryonestaffecté(Clarketal.,1991).Parmi les mutants emb, les mutations concernentsoit lamiseenplacedupatronembryonnaire,soit lacroissancecellulaireoulemétabolisme.Lesmutationsdeksontrécessivesetconstituentlamajeurepartiedesmutants du développement embryonnaire (Vernoudetal.,2005).

Les mutants empty pericarp (emp) appartiennentà la classe des mutants dek et représentent environ10% de cesmutants.Chez ceux-ci, les graines sontcaractériséesparunvolumetrèsréduitdel’albumen,quin’estvisibleque12joursaprèspollinisation(JAP);ces graines sont également dépourvues de péricarpe.Une étude histologique révèle un développementpartiel des domaines de l’albumen et les embryonssemblentfreinésdansleurcroissance,tandisqueleurmorphogenèsen’estpasaffectée(Dolfinietal.,2007).LegèneEMPTYPERICARP2codepouruneprotéineayant une forte homologie avec la protéine HEATSHOCKBINDINGPROTEIN1(HSBP1),quiestunrégulateur négatif de la réponse au choc thermiquechezlemaïs(Fuetal.,2002).Lesmutantsemp2sontdoncissusd’unemodificationdanslegènecodantpourlaprotéineHSBP1.

Chez les mutants du groupe emb, les mutantsemb8516présententdesanomaliesdèslestadetransitionde l’embryon (6JAP).Les jeunes embryonsmutantssontcaractériséspardesprotubérances(semblablesàdesembryons)àl’extrémitédususpenseur,aboutissantfinalementàdesstructuresdeformeirrégulièreetdetaillevariable.L’absenceducotylédon(ouscutellum)témoignedel’absencedemorphogenèseàl’extrémitésupérieure de l’embryon. La caractérisation du gènemisencausemontrequ’ilcodepouruneprotéineayantunefortehomologieaveclaprotéineL35delagrandesous-unité des ribosomes plastidiaux. Cette protéineestcodéeparlegèneZmPRPL35-1dumaïs(Magnardet al., 2004) et lesmutants seraient donc issus d’undysfonctionnementdecegène.

3.3. Les mutants embryonnaires affectés dans la signalisation de l’auxine chez Arabidopsis

L’auxine (AIA: acide b-indolyl-acétique) est unehormone de croissance végétale impliquée dans denombreux aspects du développement des plantesdont l’embryogenèse et la formation de l’axe apico-basal (Friml et al., 2003). Cette molécule signal estimpliquéedanslamiseenplacededifférentesrégionsde l’embryon à différents stades du développement.Elleestenparticulierliéeàlaspécificationdelacelluleapicale issue de la première division zygotique et àl’établissementdelasymétriebilatérale(Al-Hammadietal.,2003).Lesétapescrucialesde l’embryogenèseprécoce coïncident avec l’accumulation dynamiquedel’hormoneàdesendroitsspécifiquesdel’embryon,liée à un transport localisé le long de l’axe apico-basal grâce à des protéines d’influx AUXINRESISTANT (AXR) (Kramer, 2004) et d’effluxPIN-FORMED (PIN) (Zažímalová et al., 2007) etPHOSPHOGLYCOPROTEIN (PGP) (Blakesleeet al., 2007). L’AIA peut aussi agir au niveau del’expression génétique en se liant à des protéinescytosoliquesARF (Auxin Response Factor). Ce sontdes facteurs de transcription qui se fixent à l’ADNsur une séquence spécifique ARE (Auxin Response Element).Cetteséquence(TGTC)seretrouvedanslesséquencespromotricesdesgènesdontlatranscriptionestinfluencéeparl’auxine(Okushimaetal.,2005).

Plusieurs gènes sont impliqués dans la réponse àl’auxineaucoursde l’embryogenèse.L’identificationde mutants embryo-défectueux affectés dans letransport ou la signalisation de l’auxine tels que lesmutants gnom, monopteros, pin-formed1 ou encorebodenlos,indiquequel’auxinejoueunrôlecapitaldanslacoordinationdel’organisationdel’embryon(Weijerset al., 2005).MONOPTEROS (MP) etBODENLOS(BDL)sontdesprotéinesindispensablesaufluxcorrectet à la localisation coordonnée de l’auxine pendantl’embryogenèse.AinsiMP,quicodepourlefacteurdetranscriptionARF5,estcapabledeselieràdesélémentsdepromoteursdegènesinductiblesparl’auxineetestimpliqué très précocement dans lamise en place duschémad’organisationdel’embryon(Ulmasovetal.,1999).BDLcodepourlaprotéineIAA12,uninhibiteurpotentieldeMPdontladégradationsuiteàunsignalauxinique intracellulaire induit l’activation par MPdegènesciblestelsquedesmembresdelafamilledeprotéines à homéodomaines du type HD-Zip requispour la formation du tissu vasculaire (Hamann etal.,2002).MPetBDLsontco-exprimésaucoursdel’embryogenèse:leursARNm,initialementaccumulésde manière homogène au sein de la cellule apicaleduproembryonetde sesdérivés, sontgraduellementlimitésauniveaudufuturtissuvasculaire,c’est-à-diredans les cellules internes du proembryon. Ces gènes


sont également exprimés dans la partie supérieurede l’hypophyse (zone située entre l’embryon et lesuspenseur) où ils participeraient au contrôle de ladifférenciationcellulaire.Lesgènesrégulésparl’auxineet à l’originededevenirs cellulaires particuliers dansl’embryonpourraient donc être desgènes activésparMPdefaçonBDL-dépendante.Auseindel’embryon,la réponse à l’auxine MP/BDL-dépendante pourraits’effectuersoitdirectementparmigrationdesprotéinesle longdel’axeprincipalduproembryoninduisant laspécification successive des différentes régions, soitgrâce à l’activationd’unmessager secondairemobileagissantauniveaudel’hypophyse(Weijersetal.,2005).

Lesembryonsmutantsmonopterossontanormauxdepuis le stade 8cellules et présentent des cellulescentrales et basales qui se divisent anormalement.La plantule n’a pas d’hypocotyle, ni de racine, nide méristème racinaire (Berleth et al., 1993). Ledéveloppement correct des structures basales seferait donc par un processus dépendant de l’auxine.Le phénotype des mutants pinoid, pin-formed etmonopteros, caractérisé par des malformations descotylédons ou leur fusion, témoigne du rôle joué parl’auxine lors de la transition de symétrie radiale àbilatérale. Ces gènes seraient nécessaires pour letransport correct et la localisation coordonnée del’auxine.

LegèneGNOMjoueunrôledanslalocalisationdutransporteurPIN1quiintervientdansl’effluxdel’auxinedans la partie basale des cellules.Ce gène est requispourletransportpolairedel’auxineetl’établissementdelapolaritéembryonnaire.LestransporteursPINquisontactuellementaunombredehuitsontlocalisésdemanièrepolariséesurunefacedescellulesetassurentuneffluxd’auxine(Wisniewskaetal.,2006).Lamutationdu gène GNOM perturbe la polarité du transport del’auxine enbloquant le recyclagedesprotéinesPIN1vers la membrane plasmique (Geldner et al., 2001).LegènePIN7estinitialementexprimédanslacellulebasale du zygote où son expression est limitée auniveau de la paroi cellulaire apicale. À ce niveau, ilassurelepassagedel’auxineverslacelluleapicaleoùunpicd’auxineestobservé.Chezlesmutantspin7,lesdivisions cellulaires sont aberrantes au niveau de lacelluleapicale,laparoicellulaireentrelacelluleapicaleetlacellulebasalen’estpasparfaitementdéfinie(Frimletal.,2003).

Le gène AUXIN RESISTANT6 (AXR6) codantpour une sous-unité de la ligase de l’ubiquitineSKP1/CULLIN/F-BOX pourrait être impliqué dansla dégradation de protéines IAA en réponse à lasignalisation auxinique (Hellmann et al., 2003). Lamutation de AXR6 entraine une réponse réduite àl’auxineetunphénotypesimilaireàceluiobservéchezles mutantsmp et bdl d’Arabidopsis (pas de racine,unseulcotylédon,défautsdanslestissusvasculaires).

Ilagiraitdeconcertaveccesdeuxgènesdanslavoiede la réponse à l’auxine au cours du développementembryonnaire.AXR6montrequel’auxineestégalementindispensablepourdesdivisionscellulairescorrectesetledevenircellulairedususpenseur(Souteretal.,2000).

4. aPPLIcatIon des MUtatIons IndUItes aU HarIcot coMMUn

Chez le haricot commun, lesmutations induites sontutiliséessoitdanslarecherchedevariétésperformantesau niveau du rendement et de la résistance et/ou dela tolérance aux contraintes biotiques et abiotiques,soitdans l’étudedeprocessusbiologiques telsque lanodulation, la floraison, la synthèse des acides gras,l’embryogenèse, etc. (Maluszynski et al., 2000;Parketal.,2006;Siluéetal.,2006;Chenetal.,2009).

Enraisonde l’impossibilitédemettreaupointunprotocole de transformation du haricot commun, lestechniquesdemutagenèseinsertionnellepartransposonou ADN-T ne peuvent être valorisées avec succèschez P. vulgaris. La mutagenèse chimique à l’EMSa été la plus fructueuse lors d’expériences menéesdans différents laboratoires (Pankhurst et al., 2004;Park et al., 2006). Le processus biologique le plusétudiéàtraverscesmutationsinduiteschezleharicotcommunestlanodulation.Eneffet,plusieursmutantsde ce caractère ont été isolés, allant desmutants quineformentpasdenodules,àceuxdontlesnodulesnesontpasfonctionnelsetdoncincapablesdefixerl’azoteatmosphérique(Pedalinoetal.,1992;Pankhurstetal.,2004;Parketal.,2006).

UnprojetdeTILLINGaétéinitiéchezP. vulgarissur la base de la mutagenèse à l’EMS; c’est unecollaboration entre l’Université de Genève (Suisse)et les structuresde recherchede l’USDA/ARS/TARS(United States Departement of Agriculture/Agricultural Research Service/Tropical Agriculture Research Station,Mayagüez, PuertoRico) et duCIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical,Cali,Colombia).Le génotype BAT93 d’origine mésoaméricaine etrésistantàplusieursmaladies(Broughtonetal.,2003)aservidematérielbiologique.Sur labasedesétudesmenéeschezl’espèceLotus japonicus L.(Perryetal.,2003), il faudraitenviron5000lignéesmutantespourarriver à la saturation du génome de BAT93 avec lamutagenèseàl’EMS.Àcejour,prèsde1500famillesM2ontétéproduites;aprèsanalysede348famillesM2,10%desmutantsétaientdéficientsdans laformationdesnodules(Geptsetal.,2008).

Une autre étude a étémenée sur une partie de lapopulationdeplantesdeBAT93issuesdelamutagenèse.Cetravailestlefruitd’unecollaborationentrel’UnitédePhytotechnietropicaleetd’Horticulturedel’UniversitédeLiège-GemblouxAgro-BioTechetduLaboratoire


de Biologie moléculaire des Plantes supérieures del’UniversitédeGenève.Cetteétudeavaitpourobjetdesélectionnerdesplantesdéficientesdans la formationde graines matures, afin d’isoler des embryons quiavortentavantlamaturité.Suruntotalde365plantesM2 issues de 60familles, 2plantes d’une mêmefamilleontprésenté cette anomalie recherchée: leursembryons n’arrivent pas à maturité. Les phénotypesprésentés par les embryons sont les mêmes chez lesdeux plantes. Ces embryons présentent un retard decroissance et se caractérisent par des anomalies auniveaudescotylédonsetdususpenseur.Lesanomaliescotylédonaires se manifestent de différentes façons:cotylédons fusionnés, surnuméraires, ou de taillesdifférentes. Les suspenseurs de ces embryons étaientdeplusgrandetaillequeceuxdesembryonsnormaux,entrainantainsiunretarddecroissancedecesembryonsetleuravortement(Siluéetal.,2006).Cesplantesquiproduisent des graines avortant avant maturité sontactuellement maintenues en chambre conditionnée àGembloux grâce à des hybridations avec des plantesnormales nonmutagénisées de la variété BAT93. Ledéterminisme génétique du caractère «avortementdesembryons»aétéévaluésurdeshybridesF2issusdescroisementsentrelesplantesd’intérêtissuesdelamutagenèseetdesplantesnonmutagéniséesdugénotypeBAT93deP. vulgaris.L’analysedelaF1montrequelatransmission de ce caractère estmaternelle. En effet,lorsquelesplantesmutéessontutiliséescommeparentsfemelles,touteslesgrainesF1produitesavortentavantlamaturité,commec’estlecaschezlesplantesmutées.Par contre, lorsque ces plantes sont utilisées commeparentsmâles,touteslesgrainesF1produitesarriventàmaturité,germentetdonnentdesplantesF1fertiles.LesgrainesF2produitessontégalementfertilesetuntotalde96plantesF2ontétéobservéespourdéterminerlaproportiondeplantesnormalesetdeplantesanormales.Cette analyse préliminaire a révélé une ségrégationmendélienne 3:1 de plantes normales et anormales,montrant ainsi que ce caractère serait gouverné parun allèle récessif.DesADNc différemment exprimésdans lesgraines envoied’avortementont étémis enévidence en utilisant la technique de l’HybridationSoustractiveSuppressive(HSS).DixprotéinesontétéidentifiéesdontlesprincipalessontlecytochromeP450,la myo-inositol 1-phosphate synthase, la peroxidasecationique, le voltage-dependent anion channel et lasucrosesynthase(Silué,2009).

5. concLUsIon et PersPectIves

La mutagenèse induite est utilisée chez plusieursespècesvégétalespourl’étudedeprocessusbiologiquestels que la formation des nodules, la floraison, lasynthèse des acides gras, l’embryogenèse, etc. Chez

lesplantesmodèlesArabidopsis thalianaetZea mays,lamutagenèse insertionnelle (ADN-Tou transposon)etlamutagenèsechimiqueàl’EMSontpermisd’isolerdesmutantsembryon-létaux.Cestechniquescoupléesàlagénétiquedirecteetlagénétiqueinverseontpermisd’identifierdenombreuxgènesindispensablesaubondéroulementdel’embryogenèsechezlesplantes.Lespremières études de l’embryogenèse menées chezleharicot communpar l’utilisationde lamutagenèsechimiqueontpermisd’isolerdesplantesmutagéniséesqui produisent des embryons qui avortent avant lamaturité.Nouspouvonsdoncdirequelamutagenèseàl’EMSestunbonoutilpourl’inductiondemutationdans lesgénomesdesorganismesvivants.À l’imagedes espèces A. thaliana et Z. mays, pour lesquelleslamutagenèse à l’EMSest utilisée avec succèsdansl’étude de l’embryogenèse, cette technique peut êtreexploitéedanslamiseenévidencedesgènesimportantspour le développement normal de l’embryon chezPhaseolus.Chezcesdeuxplantesmodèles,lesmutantsemb,oùseull’embryonestaffecté,ontétéidentifiés.Cecimontrequ’ilyauraitconservationduprocessusamenant aux mutants emb chez ces deux espèces.Ces exemples d’études faites chez ces deux espècespourraientêtretransposéschezleharicotcommun.

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