Resul ÖZBİLGİÇİstanbul Üniversitesi

Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

• Moleküler Biyolojinin en temel

tekniklerinden biridir.

• Hücre membranını ve duvarını

yıkarak DNA’yı ayırma işlemidir.

DNA İZOLASYONU

Neden DNA İzolasyonu?

• DNA parmak izi (fingerprint) analizi

• PCR

Neden DNA İzolasyonu?

• Dizi Analizi, Fragment Analizi

Neden DNA İzolasyonu?

• Klonlama , Genomik DNA Kütüphanesi, RFLP

Neden DNA İzolasyonu?

DNA NEREDE?

• DNA hücre içerisinde,

-Çekirdek

-Mitokondri

-Kloroplastlarda bulunur.

• Bakteri ve Virüslerde DNA

DNA NEREDE?

DNA TİPLERİ

• Genomik (Kromozomal)

• Organel

• Plazmit (Ekstrakromozomal)

DNA’NIN TEMEL ÖZELLİKLERİ

• Adenin, Guanin, Sitozin

ve Timin bazlarını içerir.

• Dayanıklı bir yapısı vardır.

• Negatif yüklüdür.

• Suda çözünebilir ama

alkolde çözünmez.

İZOLASYON YÖNTEMİNİN BELİRLENMESİ

• DNA’sı izole edilecek hücre tipi

• İstenilen DNA miktarı

• İstenilen Saflık Derecesi

• İzolasyon Sonrası Kullanılacak Yöntemler

• Zaman

• Ekonomik Durum

DNA EKSTRAKSİYONU

• 1-Lysis

• 2-Purifikasyon

• 3-Presipitasyon

1-Lysis

• Tris

• EDTA

• Sodyum Dodesil Fosfat

• Proteinaz K

PÜRİFİKASYON

• Pürifikasyon yöntemleri,

1-Organik Ekstraksiyon

2-Tuzla Çöktürme

3-Sezyum Klorid Yoğunluk Gradiyenti

4-DNA’nın Katı Yüzeye Bağlanması

*Anyon Değişim Kromotografisi

*Silika Bazlı Kolonlar

*Manyetik Ekstraksiyon

ORGANİK EKSTRAKSİYON

Fenolle karıştırılır

Üst faz:DNA veya RNA

Orta faz: Proteinler

Alt faz:Fenol

Santrüfüjleme sonunda

Fenol;Kloroform;İzoamil Alkol Ekstraksiyonu

PRESİPİTASYON

• Absolut soğuk etanol ile presipitasyon yapılır.

• Ve DNA soğuk %70 lik etanol ile yıkanır.

• DNA Tris-Edta ile çözdürülür ve saklanır.

Sezyum Klorid Yoğunluk Gradienti

DNA’nın Katı Yüzeye Bağlanması1-Manyetik Ekstraksiyon

Silika Yöntemi

Anyon Değişim Kromotografisi

depo(tampon)

sabit faz(katı porlu matriks)

mobil faz(tampon)

elüent

Proteinkarışımı

Sıvı Kültürden DNA Ekstraksiyonu

• KAYNATMA PATLATMA YÖNTEMİ

İZOLASYON YÖNTEMLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI

DNA’NIN MİKTARI VE SAFLIĞI

DNA Miktarı=260nmODxSulandırma OranıxKatsayı

Katsayı;

Çift iplikçikli DNA=50

Tek iplikçikli DNA ve

RNA için=40

OD;

DNA=1,8

RNA=2

KAYNAKLAR

1-Dr. Zekiye BAKKALOĞLU DNA İZOLASYON YÖNTEMLERİ

RSHMB, SHAM, Moleküler Mikrobiyoloji Araştırma ve Uygulama Laboratuvarı

2-Genetik Mühendisliğine Giriş ,Doç.Dr.Nurettin Yörek

3-DNA Pürifikasyon Yöntemleri,Dr.Ayla Avcıkurt

4-DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırması,Gıda Örneklerinde GDO.M.SOMMA

5- 7.Prof. Dr. Rıza DURMAZ,UYGULAMALI MOLEKÜLER

MİKROBİYOLOJİ,İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi,Mikrobiyoloji ve Klinik

Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,MALATYA