การศกษาวงศวานววฒนาการของไมในสกล Hibiscus ของไทย และสกลใกลเคยงโดยใชขอมลดเอนเอในสวนของยนส nadhF

The phylogenetic analysis of Hibiscus (Malvaceae) of Thailand and allies genera using gene nadhF

นายสมบรณ เฉยสวสด สาขาวทยาศาสตรชวภาพปาไม ภาควชาชววทยาปาไม คณะวนศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

ทมารปภาพ : http://www.thaiarcheep.com

หวขอบรรยาย

อปกรณ สรปและขอเสนอแนะ

วตถประสงค

บทน า

ผลและวจารณ

วธการ

ดอก เกสร ใบและผล

บทน ำ บทน า ลกษณะทวไปของพรรณไมสกลชบา (Hibiscus)

ทมารปภาพ : http://www.thaiarcheep.com

บทน า(ตอ) แผนภมตนไม (Phylogenetic tree)

คอ แผนภมทแสดงถงสายววฒนาการซงมอยหลายลกษณะ โดยใชกง หรอแตละสาขาแทนสายยอยในการววฒนาการ

(ทมารปภาพ: http://imgkid.com/phylogenetic-tree-of-life.shtml)

วตถประสงค วตถประสงค

เพอศกษาวงศวานววฒนาการของไมในสกล Hibiscus และสกล ใกลเคยงโดย ใชขอมล ดเอนเอสวนของยนส nadhF

เพอตรวจสอบวงศวานสายเดยว (monophyletic) ของไมในสกล Hibiscus และสกลใกลเคยง

อปกรณ อปกรณ

3. เครองท าพซอาร

5. เครองปนเหวยง

2. โกรงบดยา 1. อปกรณเกบตวอยางพรรณไม

4. ชดอเลกโตรโฟรซส

6. อางน าควบคมอณหภม

ทมารปภาพ : http://www.b2bthai.com

1. การสกดดเอนเอ

1.1) จดหาตวอยางพรรณไม

1.2) น าตวอยางมาบดกบไนโตรเจนเหลวแลวน าใสหลอดขนาด 1.5 มลลลตร จ านวน 3 หลอด

วธการ วธการ

วธการ (ตอ)

1.4 เตม CTAB high salt ปรมาณ 600 ไมโครลตร และ sarkosyl ปรมาณ 50 ไมโครลตร แลวน าไปบมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส นาน 60 นาท แลวเขยาทกๆ 10 นาท

1.3 เตม sorbital buffer 1 มลลลตร ลงไปแลวน าไปปนเหวยง 10 นาท เทของเหลวใสทง ท าจนกวาตวอยางจะไมหนดเหนยว

วธการ(ตอ)

1.6) ท าขอ 1.4 และ 1.5 ซ าอกรอบ แตทงสวนทเปนตะกอนไปเกบไวแตสวนทเปนของเหลวใส

1.5) เตม CIA ปรมาณ 550 ไมโครลตร เขยาใหเขากน แลวน าไปปนเหวยง เปนเวลา 10 นาท ดดสวนทเปนของเหลวใสออกไปใสหลอดใหม

วธการ(ตอ)

1.7) น าหลอดทเปนของเหลวใสทไดจากขอ 1.6 มาเตม Isopropanal ปรมาณ 500-600 ไมโครลตร และ 3M Sodium Acetate ปรมาณ 30 ไมโครลตรน าไปปนเหวยง เปนเวลา 10 นาท แลวเทสวนใสออกจะไดสวนทเปนตะกอนของดเอนเอ

1.8) เตม 70% Ethanal ปรมาณ 500 ไมโครลตร เพอลางดเอนเอ น าไปปนเหวยง เปนเวลา 10 นาท แลวเทสวนทเปนของเหลวใสทง ท าซ า 2 รอบ

วธการ(ตอ)

1.9) คว าหลอดตวอยางลงบนกระดาษ ซบใหแหงแลวตากทงไว 1 คน แลวเตม TE buffer ปรมาณ 50 ไมโครลตร เกบไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอรอท าขนตอไป

วธการ(ตอ)

2. การตรวจคณภาพและปรมาณ ดเอนเอ

2.1) เตรยมเตรยมเจลอะกาโรสเขมขน 0.8%

2.2) หยดตวอยางดเอนเอทผสมส ลงในชองเจล

วธการ(ตอ)

2.3 เปดเครองแลวปรบกระแสไฟฟา 100 โวลต นาน 25-30 นาท ปดเครอง ยายแผนเจลลงในน ากลนทมเอธเดยมโบรไมด ความเขมขน 0.5 ไมโครกรม/มลลลตร นาน 10 นาท

2.4 ลางแผนเจลในน าไหลนาน 10 นาท แลวน าไปดภายใตแสงอลตราไวโอเลทโดยใชเครองเจลดอกคเมนทแลวตรวจสอบคณภาพดเอนเอทได

วธการ(ตอ)

3. การเพมปรมาณดเอนเอดวยวธพซอาร

3.1) น าดเอนเอทได มาผสมกบสารละลายทใชในการท า พซอาร

3.2) น าสารละลายทผสมกนแลว เขาเครอง พซอาร โดยใชโปรแกรม CP 65

วธการ(ตอ)

วธการ(ตอ) No. Forward Primer Reward Primer

1 ndhF1F mal ndhF803R

2 ndhFd536F ndhFd1318R

3 ndhFd1201F ndhFd2110R

คไพรเมอรทเหมาะสมทใชในขนตอน พซอาร

ชอ โพธทะเลชอดอกตง(Thespecia populnea) หมายเลขตวอยางคอ H4

ชอ พดตาล (Hibiscus mutabilis) หมายเลขตวอยางคอ H3

ผลและวจารณ

ตวอยางพรรณไมแหงทเกบมาท าการศกษา

ชอ กระเจยบเขยว (Abelmoschus esculentus) หมายเลขตวอยางคอ H6

ชอ กระเจยบแดง (Hibiscus sadariffa) หมายเลขตวอยางคอ H5

ผลและวจารณ

ตวอยางพรรณไมแหงทเกบมาท าการศกษา

ชอ โพธทะเลชอดอกยอย (Thespesia populneoides) หมายเลขตวอยางคอ H7

ชอ ทองพนดล (Decaschistia parviflora) หมายเลขตวอยางคอ H8

ตวอยางพรรณไมแหงทเกบมาท าการศกษา

ผลและวจารณ

ชอ พนตะวน (Hibiscus grewiifolius) หมายเลขตวอยางคอ H9

ผลและวจารณ

ตวอยางพรรณไมแหงทเกบมาท าการศกษา

ผลการสกดดเอนเอของพรรณไมสกล Hibiscus และสกลใกลเคยงดวยวธ Modified CTAB พบวาดเอนเอมความสมบรณ ไมมการแตกหก

ผลและวจารณ H1

H3 H4

H5 H6 H7 H8 H9 H10

ปรมาณของดเอนเอทไดจากการท าพซอารดวยคไพรเมอรทง 3 ค สามารถเพมปรมาณไดทง 9 ตวอยาง

a b c

ผลและวจารณ (ตอ)

การวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรมของพรรณไม สกล Hibiscus และ สกลใกลเคยง เมอน ามาสรางเปนแผนภมตนไม (Phylogenetic tree) สามารถจดแบงออกไดทงหมด 10 เครด

ผลและวจารณ (ตอ)

เครด 1 มคา boostap support นอยกวา 50 จดอยในกลมท 5 มสมาชกอยในเครดน 13 ชนด

ผลและวจารณ (ตอ)

เครด 2 มคา boostap support นอยกวา 50 มสมาชกอยในเครดน 7 ชนด

ผลและวจารณ (ตอ)

เครด 3 มคา boostap support นอยกวา 50 จดอยในกลมท 4 มสมาชกอยในเครดน 17 ชนด ซงเปนเครดทมจ านวนสมาชกเยอะทสด

เครด 1, 2 และ 3 มความสมพนธทใกลเคยงกนเนองจากกงของความสมพนธเปนแบบแขนค (Binary)

ผลและวจารณ (ตอ)

ในเครด 4, 5, 6 และ7 นนมกงของความสมพนธแบบแขนเดยว (Mononary)

ผลและวจารณ (ตอ)

เครด 8-10 นนเปนเครดของพนธไมสกลอน ซงไมมสกล Hibiscus รวมอยในเครดเหลานดวย

ผลและวจารณ (ตอ)

สรป

ไมในสกลชบาและสกลใกลเคยงสามารถจดแบงออกไดทงหมด 10 เครด และ เครดท 1-7 เปนกลมของพวกสกลชบา ซงอยในเผา Hibisceae

โพธทะเลชอดอกตง (Thespecia populnea) และ โพธทะเลชอดอกยอย (Thespesia populneoides) ทถกจดอยในเครดท 9 นนอยในเผา Gossypieae ซงไมมสกล Hibiscus แทรกอย

สรป (ตอ) ไมในสกลชบามวงศวานววฒนาการเปนวงศวานคขนาน (Paraphyletic) เนองจากมสกลอนเขามาแทรกบางชนด คอสกล Decaschistia, สกล Malvaviscus,สกล Abelmoschus, สกล Pavonia, สกล Kosteletzkya และสกล Macrostelia

การปรากฏของลกษณะแบบนบงบอกวา อาจจะตองมการรวมทกสกล ใหเขามาอยในสกล Hibiscus หรอแบงแยกสกล Hibiscus ออกเปนสกลยอย ทงนกขนอยกบขอมลทางสณฐานวทยา (Morphology) หรอขอมลในสวนอนทเกยวของ

ขอเสนอแนะ

ตวอยางทท าการศกษาควรมจ านวนชนดมากกวาน เพอใหการวเคราะหหาความสมพนธมความสมบรณมากยงขน

ในระหวางการสกดดเอนเอควรระมดระวงเปนอยางมาก เนองจากตวอยางมาปนกนท าใหเกดความผดพลาดในการทดลอง

การแกไขขอมลของล าดบนวคลโอไทดตองใชความช านาญและรอบคอบ ควรมผเชยวชาญคอยใหค าปรกษาในระหวางการท าการแกไข

ขอขอบพระคณ

ขอขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.สธร ดวงใจ อาจารยทปรกษาโครงงานทคอยใหค าแนะน าตลอดการท าโครงงาน และอาจารยทกทาน เพอนๆ พๆ นองๆ ทกคนทคอยใหความชวยเหลอและใหค าปรกษา และขอขอบคณ

ครอบครวทเปนก าลงใจตลอดการท าโครงงานในครงน