8. Manual de Prácticas Quimica Clinica II

BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLAVICERRECTORÍA DE DOCENCIA

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIORFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

AREA: ANÁLISIS CLÍNICOS

ASIGNATURA: LABORATORIO QUÍMICA CLÍNICA II

PROFESORA DEL CURSO:MC. MARTHA ALICIA SALGADO JUÁREZ

CÓDIGO:

CRÉDITOS: 2

FECHA: agosto de 2014

1

NIVEL EDUCATIVO: LicenciaturaNOMBRE DEL PROGRAMA EDUCATIVO:

Licenciatura en Químico Farmacobiólogo

MODALIDAD ACADÉMICA: PresencialNOMBRE DE LA ASIGNATURA: LABORATORIO QUÍMICA CLÍNICA IIUBICACIÓN: Nivel FormativoCORRELACIÓN:

– ASIGNATURAS PRECEDENTES:

QUIMICA CLINICA I

– ASIGNATURAS CONSECUENTES:

QUIMICA CLINICA III INTERPRETACION DIAGNOSTICA POR EL LABORATORIO

– CONOCIMIENTOS

FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS CONCEPTO ACIDO BASE VIAS METABOLICAS DE LIPIDOS

– HABILIDADES Y ACTITUDES

PIPETEO,MANEJO DE ESPECTROFOTOMETRO,TRABAJO EN EQUIPO Y COLABORATIVO

– VALORES PREVIOS:RESPETO, RESPONSABILIDAD,TOLERANCIA HONRRADES PUNTUALIDAD.

CARGA HORARIA DEL ESTUDIANTE

CONCEPTO

HORAS POR PERIODO

(PERIODO = 16 SEMANAS)

NÚMERO DE

CRÉDITOS

HORAS TEORIA Y PRÁCTICA.32

(2 HP/Semana = 32)

2

HORAS DE PRÁCTICA PROFESIONAL

CRÍTICA

0 0

HORAS DE TRABAJO INDEPENDIENTE 0 0

TOTAL 32 2

2

AUTORES:M.C. HILDA ALICIA CARRASCO PERAL M.C. GONZALO GARZON GARCIA M.C.JOSE MANUEL RODRIGUEZ LUNA

FECHA DE DISEÑO: OCTUBRE 2009

FECHA DE LA ÚLTIMA ACTUALIZACIÓN:REVISORES:SINOPSIS DE LA REVISIÓN Y/O ACTUALIZACIÓN

PERFIL DESEABLE DEL PROFESOR (A) PARA IMPARTIR LA ASIGNATURA:

DISCIPLINA PROFESIONAL: Q.F.B. QBP Y QC

NIVEL ACADÉMICO: MAESTRIA Y/O DOCTORADO

EXPERIENCIA DOCENTE: CINCO AÑOS

EXPERIENCIA

PROFESIONAL:CINCO AÑOS

3

PRESENTACIÓN GENERAL DEL PROGRAMA DE LABORATORIO:

a) El programa de laboratorio de Química Clínica II se encarga del

desarrollo y ejecución de los análisis químico biológicos, para el diagnóstico,

pronóstico y profilaxis de las enfermedades.

b) Se requiere de los conocimientos previos de las materias de biología,

histología, anatomía, bioquímica, química analítica, análisis instrumental,

fisiología, inmunología, estadística.

c) Durante este curso se abordarán las pruebas para valorar el metabolismo

de proteínas y lípidos, así como la enfermedad metabólica y padecimientos

cardiacos.

4

OBJETIVO GENERAL:

El objetivo del curso es que el alumno desarrolle las habilidades analíticas y

de interpretación de las diferentes pruebas del laboratorio para valorar el

metabolismo de proteínas, lípidos, enfermedad metabolica y funcionamiento

cardiaco.

EVALUACIÓN.-

La asistencia al laboratorio será del 100%

Participación en seminarios y prácticas 20 %

Reportes individuales 20 %

Reportes por equipo 20 %

Reporte de casos clínicos 20 %

Evaluación final práctica 20 %

Total 100 %

5

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Elaborada en forma conjunta por la Secretaria de Salud y de Medio Ambiente y

Recursos Naturales, la norma oficial mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-

2002, Protección Ambiental - Salud Ambiental - Residuos Peligrosos Biológico -

Infecciosos – Clasificación y Especificaciones de Manejo, fue publicada en el

Diario Oficial de la Federación el 17 de Febrero del 2003 y sustituye a la NOM-

087-ECOL-1995.

Los RPBI se consideran como residuos peligrosos y como tal se debe establecer

un plan integral para su manejo, almacenamiento, transporte, tratamiento y

disposición final.

PRINCIPALES MODIFICACIONES EFECTUADAS EN LA NOM-087-SEMARNAT-

SSA1-2002.

I. Criterios para considerar un residuo como RPBI

II. Nueva clasificación de los RPBI

III. Cantidad de sangre o fluido corporal en los RPBI

IV. Niveles de los establecimientos generadores

V. Periodo de almacenamiento temporal de los RPBI en los

establecimientos generadores.

VI. Atribución a la Secretaria de Salud, para la vigilancia de la

norma.

I. Los lugares que ofrecen atención médica y los centros de

investigación, son considerados establecimientos

generadores de materiales contaminados por agentes

biológico-infecciosos. Estos desechos se denominan

Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (RPBI´s), su

manejo y disposición inadecuados, representa un riesgo para

la salud del personal que labora en estos sitios, así como para

6

la salud de la población aledaña, ocasionando además, el

deterioro del medio ambiente. Los microorganismos

patógenos, virus, parásitos y priones (estructuras proteicas)

son ejemplos de agentes biológicos-infecciosos. Para que un

microorganismo sea capaz de producir enfermedad, es decir,

que sea un Agente Biológico-Infeccioso, debe ocurrir lo

siguiente: tener una concentración suficiente (inóculo), estar

en un ambiente propicio (supervivencia), en presencia de una

vía de entrada en un hospedero susceptible.

II. En la Nueva clasificación, los RPBI´s son:

1. La sangre y sus componentes únicamente en estado

líquido.

2. Los cultivos de agentes biológico-infecciosos generados

en:

a. Los procedimientos de diagnóstico e investigación.

b. La producción y el control de agentes biológico-

infecciosos.

3. Los utensilios desechables usados para contener,

transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biológico-

infecciosos.

4. Los tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven

durante las autopsias, las cirugías o algún otro tipo de

intervención quirúrgica que no estén conservados en

solución de formol.

7

5. Las muestras biológicas empleadas en los análisis clínicos

(excepto las muestras de orina y de excremento), y

aquellas usadas en los análisis patológicos.

6. En los centros de investigación, los cadáveres y las partes

de los animales que fueron inoculados con agentes entero

patógenos.

7. Los residuos no anatómicos:

a. Los recipientes desechables que contengan sangre

líquida.

b. Los materiales desechables que contengan fluidos y

secreciones corporales, provenientes de los

pacientes de quienes se sospechen o exista un

diagnóstico de una enfermedad infecto-contagiosa

como la tuberculosis.

c. Los materiales de curación empapados de sangre

líquida o de cualquier otra secreción o líquido

corporal.

d. Los materiales absorbentes utilizados en las jaulas

de los animales que hayan sido expuestos a agentes

entero patógenos.

8. Los materiales punzo cortantes desechables como las

hojas de bisturí, las agujas de sutura y los estériles de

catéter. El material de vidrio de laboratorio, que se haya

roto al momento de ser manipulado, se deberá desinfectar

o esterilizar y ya no se considerará como RPBI´s, por lo

que se podrá disponer posteriormente como residuo

municipal.

8

La disposición general para el desecho de RPBI´s en el laboratorio

queda de la siguiente manera:

TIPO DE RESIDUO

ESTADO FISICO

ENVASADO COLOR

Sangre LíquidosRecipientes herméticos

Rojo

Cultivos y cepas de agentes infecciosos

SólidosBolsas de polietileno

Rojo

Patológicos SólidosBolsas de polietileno

Amarillo

Residuos no anatómicos

SólidosBolsas de polietileno

Rojo

Objetos punzocortantes

SólidosRecipientes rígidos polipropileno

Rojo

III. Para que un material de curación se considere como RPBI´s,

debe ser desechable y estar goteando, chorreando o

escurriendo sangre o cualquier líquido corporal contemplado

en la norma.

IV. Niveles de los Establecimientos Generadores

NIVEL I NIVEL II NIVEL IIIEstablecimientos de atención médica hasta con 5 camas e instituciones de investigación con excepción de los señalados en el Nivel III.

Unidades hospitalarias de 6 hasta 60 camas.

Unidades hospitalarias de más de 60 camas.

Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis de 1 a 50 muestras al día.

Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis de 51 a 200 muestras al día.

Centros de producción e investigación experimental en enfermedades infecciosas.

9

Unidades hospitalarias psiquiátricas.

Bioterios que se dediquen a la investigación con agentes biológico-infecciosos.

Laboratorios clínicos y bancos de sangre que realicen análisis a más de 200 muestras al día.

Centros de toma de muestras para análisis clínicos.

Establecimientos que generen de 25 a 100 kilogramos al mes de RPBI´s.

Establecimientos que generen más de 100 kilogramos al mes de RPBI´s

V. Período de almacenamiento temporal de los RPBI´s en los establecimientos generadores.

NIVEL I NIVEL II NIVEL III30 días máximos

de almacenamiento temporal.

15 días máximos de almacenamiento

temporal.

7 días máximos de almacenamiento

temporal.No requiere de área específica

para el almacenamiento

temporal.

Si requiere de área específica para el almacenamiento

temporal.

Si requiere de área específica para el almacenamiento

temporal.

Se podrán ubicar los contenedores

específicos para los RPBI´s* en el lugar

más apropiado dentro de sus

instalaciones, de manera tal que no obstruyan las vías

de acceso.

Deberá cumplir con las

especificaciones establecidas en la

NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, para el área


Deberá cumplir con las especificaciones establecidas en la

NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, para el área


*Los contenedores pueden ser plásticos o metálicos, con señalamiento del

símbolo universal de RPBI´s y no mezclarlos con la basura municipal.

VI. Atribución a la Secretaria de Salud. Corresponde a la Secretaria de

salud regular y vigilar el equipamiento, instalación y funcionamiento de

los servicios médicos que son los principales generadores de los RPBI

´s, por ello participa complementariamente con la SEMARNAT en la

regulación y vigilancia de la norma, para lo cual se estableció en el

10

cuerpo de la misma, la disposición de crear las Bases de

Colaboración que firmarán ambas dependencias y que serán

publicadas en el Diario Oficial de la Federación, en las que se

especificarán los puntos de la norma que vigilarán cada una

de ellas.

11

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DEL CURSO DE LABORATORIO

SEMANANo.

PRÁCTICA

NOMBRE DE LA PRÁCTICA PÁGINA

1 1 Presentación y NOM 087-SEMARNAT

2 2 Seminario de introducción al laboratorio de química clínica

3 3 Determinación de proteínas totales séricas 13

4 4 Determinación de albumina sérica 13

5 5 Seminario y resolución de casos clínicos de proteinograma

17

6 6 Determinación de a colesterol sérico 20

7 7 Determinación de triglicéridos séricos 20

8 8 Determinación de lípidos totales séricos 20

9 9 Determinación de colesterol HDL, LDL y VLDL 27

10 10 Determinación de glucosa, IMC, PC y TA 35

11 11 Determinación de LDL-col y fibrinógeno 44

12 12 Determinación de CK total sérica 51

13 13 Determinación de CK total sérica y CK-MB sérica 54

14 14 Seminario de troponinas y homocisteína

15 15 Resolución de casos clínicos

16 16 Evaluación final

12

PRACTICA 3 y 4

DETERMINACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y

ALBUMINA

INTRODUCCION:

La mayoría de proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado,

exceptuando a las inmunoglobulinas que se forman en las células plasmáticas del

bazo, los nódulos linfáticos y la médula ósea.

Las dos causas generales de alteraciones de la proteína total sérica son cambios

de volumen de agua plasmática y cambios en la concentración de una o varias

proteínas séricas.

La hiperproteinemia puede ser debida a deshidratación (aporte insuficiente de

agua, vómitos o diarreas severas, enfermedad de Addison, cetoacidosis diabética)

o a un aumento en la concentración de proteínas específicas (inmunoglobulinas en

infecciones, mieloma múltiple).

La hipoproteinemia se puede producir a causa de una hemodilución (síndromes de

retención salina y la infusión intravenosa masiva), por un defecto en la síntesis

proteica (malnutrición severa, enfermedad hepática crónica, malabsorción

intestinal) o por pérdidas excesivas debidas a enfermedad renal crónica o

quemaduras severas.

OBJETIVO GENERAL:

El alumno realizara la determinación de proteínas totales por el método de

Biuret, como prueba diagnóstica en la alteración de su síntesis y degradación, así

como la perdida por vía renal.

13

MATERIAL Y METODOS:

FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA PROTEINAS

La proteína presente en la muestra reacciona con los iones cobre (II) en medio alcalino, originando

un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.

MUESTRAS

Suero y plasma heparinizado recogido mediante procedimientos estándar.

PROCEDIMIENTO

1. Pipetear en tubos de ensayo:

Blanco Patrón Muestra

Agua destilada 20 μL --------- ----------

Patrón Proteína -------- 20 μL ---------

Muestra -------- -------- 20 μL

Reactivo 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

2. Agitar bien y dejar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra frente al Blanco a 545 nm. El color es estable

durante al menos 2 horas.

CÁLCULOS

La concentración de proteína en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:

A Muestra

___________ x C Patrón = C Muestra

A Patrón

VALORES DE REFERENCIA

60-78 g/L

FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA ALBUMINA

14

La albúmina presente en la muestra reacciona con el verde de bromocresol en medio ácido,

originando un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometría.

MUESTRAS

Suero o plasma (EDTA, heparina o citrato) recogido mediante procedimientos estándar.

PROCEDIMIENTO



Patrón Albúmina -------- 10 μL --------

Muestra -------- -------- 10 μL

Reactivo 1,0 Ml 1,0 mL 1,0 mL

2. Agitar bien y dejar los tubos durante 1 minuto a temperatura ambiente.

3. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 630 nm frente al Blanco. El color es estable

durante al menos 30 minutos.

CÁLCULOS

La concentración de albúmina en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:

A Muestra


A Patrón


Recién nacidos, 2 a 4 dias 28-44 g/L

4 dias a 14 años 38-54 g/L

Adultos 35-50 g/L

> 60 años 34-48 g/L

15

BIBLIOGRAFÍA

1. Doumas BT, Watson WA and Biggs HG. Albumin standards and the measurement of serum

albumin with bromocresol green. Clin Chim Acta 1971: 31: 87-96.

2. Tietz NW. Clinical guide to laboratory tests, 2nd ed. Saunders Co, 1991.

3. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press, 1995.

4. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press, 1997.

16

PRACTICA 5

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

INTRODUCCION:

Se designa como electroforesis a la migración de una micela coloidal a

través de un medio de dispersión, cuando actúa una fuerza electromotriz. Si se

usa una solución buffer con un pH superior al punto isoeléctrico de las proteínas a

separar, puede obtenerse su fraccionamiento. El primitivo método de electroforesis

libre de Tiselius mostró que la movilidad de las fracciones proteicas dependen del

tamaño molecular y de la carga eléctrica. Así la albúmina de menor tamaño

molecular se mueve con más rapidez siguiendo en orden de velocidad las

globulinas, las alfas, betas, el fibrinógeno (en plasma) y las globulinas.

La electroforesis de zona, permitió la generalización de los métodos

electroforéticos y su aplicación en el laboratorio de análisis clínicos. En este tipo

de electroforesis se utiliza un medio estabilizado como soporte para el buffer.

Puede utilizarse como soporte el papel, el acetato de celulosa seco o gelatinizado,

el gel de agar, agarosa, almidón, gel de acrilamida, etc.

En la electroforesis de zona por lo común se observan 5 fracciones, la más

anódica es la albúmina, luego le siguen , siendo ésta la más catódica.

OBJETIVO:

Que el alumno aplique el método electroforético al estudio de las proteínas

plasmáticas.

MATERIAL Y MÉTODO

Reactivos.- Equipo.-

Sol’n buffer pH 8.6 Cámara de Electroforesis

17

Ponceau-S Fuente de Poder

Ac. Acético 5% Aplicador

Metanol Parrilla

Ac.acético glacial

Membranas de acetato de celulosa

MATERIAL POR SECCIÓN. MATERIAL POR EQUIPO:

1 probeta de 100 ml 1 tubo Vacutainer rojo

3 cajas Petri soporte, aguja y torniquete

20 tiras de papel filtro 4x10 cm 1 tubo 7X100

1 pip. Pasteur c/chuzo

TÉCNICA:

1) Se principia a remojar la membrana de acetato de celulosa en la sol’n buffer,

durante 15 – 60 min., deslizando el borde de la membrana debajo de la

superficie de la sol’n poco a poco y sin interrupción hasta que quede sumergida

completamente.

2) Verter 70 ml de sol’n buffer en cada electrodo de la cámara, y colocar una tira

de papel filtro en cada borde de los electrodos poniéndolas en contacto con la

sol’n buffer.

3) Colocar en los pozos de la base toma-muestras el suero, y alimentar el

aplicador descendiéndolo en los pozos 3 o 4 veces y eliminar esta primera

muestra. Volver a alimentar el aplicador y dejarlo preparado.

4) Quitar el exceso de buffer a la membrana de acetato de celulosa, con ayuda de

papel filtro, e inmediatamente aplicar la muestra manteniendo el aplicador

firmemente contra la membrana durante 10 seg.

18

5) Colocar la membrana en la cámara, fijándola con un portaobjetos a cada lado

del electrodo. Tapar la cámara y conectar a la fuente de poder 180 Voltios

durante 15 min.

6) Retirar la membrana de la cámara y proceder a colorearla con Ponceau-S

durante 10 min.

7) Llevar a la membrana a una serie de baños. Primeramente con ac. acético al

5% durante 5 min., para quitar el exceso de colorante.

8) Colocar en baño con metanol durante 5 min, para deshidratar la membrana.

9) Colocar en baño de sol’n aclaradora (metanol-ac. acético) durante 5 min.

10)Secar la membrana a temperatura ambiente o a 70º C por 2 min.

BIBLIOGRAFÍA:

1. Richterich R., Colombo J:P:, Química Clínica. Teoría, Práctica e interpretación,

Ed. Salvat. Barcelona.

19

PRACTICA 6, 7 y 8

DETERMINACION DE LIPIDOS TOTALES, COLESTEROL Y

TRIGLICERIDOS

INTRODUCCIÓN:

Los lípidos constituyen un grupo heterogéneo de sustancias insolubles o

poco solubles en agua, sí en solventes orgánicos como éter, cloroformo, benzal,

éter de petróleo, etc. En general los lípidos del organismo se distribuyen en: las

células en el citoplasma y material de reserva. En la sangre circulante están

unidos a las proteínas plasmáticas por lo que constituyen las lipoproteínas. Estas

lipoproteínas tienen como función principal posibilitar el desplazamiento de los

lípidos exógenos y endógenos entre el hígado, el tejido graso y otros órganos de

la economía.

Las lipoproteínas se estudiaron separándolas por métodos salinos,

precipitación con antisueros específicos, electroforesis, ultracentrifugación o

cromatografía. La clasificación más frecuente se basa en el procedimiento

electroforético, y reciben diferentes nombres: Quilomicrones (QM) constituídos a

partir de TG exógenos en su mayor proporción, y que transportan las grasas del

intestino hacia el corazón por medio de los vasos linfáticos. Las preLP (VLDL) se

constituyen predominantemente a partir de TG endógenos. Las LP (LDL)

transportan la mayor parte del colesterol, y abastecen a todas las membranas

celulares de los tejidos periféricos. Las LP (HDL) en cuya composición predominan

las proteínas y los fosfolípidos, y transportan el colesterol al hígado en donde es

metabolizado y excretado, de donde se considera un factor de protección contra el

acúmulo de colesterol.

Debido a lo anterior la cuantificación de lípidos totales, colesterol total, C-

HDL, CLDL, triglicéridos y una electroforesis son de gran ayuda para la

identificación de las diferentes dislipoproteinemias.

20

OBJETIVO:

Que el alumno efectúe diversas determinaciones de lípidos que le ayuden a

identificar la presencia de dislipoproteinemia.

MATERIAL Y MÉTODOS

REACTIVOS: EQUIPO:

Equipo para lípidos totales Centrífuga

Equipo para triglicéridos enzimáticos Espectrofotómetro

Equipo para colesterol enzimático Celdas de

espectrofotómetro Algodón y alcohol

Material por Sección: Material por Equipo:

3 pip. 10 ml 1 gradilla

2 pip. 5 ml 2 tubos de rosca grandes

1 pip. 2 ml 5 tubos 10X100 pyrex

7 pip. 1 ml 7 tubos de 10X100

7 pip. O.1 ml 1/100 2 tubos 16X150 pyrex

1 tubo Vacutainer rojo

soporte, aguja y torniquete

1 pip. Pasteur c/chuzo

FUNDAMENTO DEL METODO PARA LIPIDOS TOTALES:

Los lípidos insaturados reaccionan con el acido sulfúrico formando un ion

carbonio que reacciona con el carbonilo de la fosfovainillina produciendo un

complejo de color rosa, que es estabilizado por resonancia. La intensidad del color

del complejo es proporcional a la concentración de los lípidos en el suero.

MUESTRAS:

Suero, plasma (EDTA).

21

METODO:

1.- Marcar tres tubos de ensayo con las letras MMA (mezcla, muestra, acida),

MPA (mezcla, patrón acida) y B (blanco) y proceder como sigue:

B MMA MPA

Muestra ----------- 0.1 ml -----------

Patron ----------- --------- 0.1 ml

Acido sulfúrico conc. ----------- 2.0 ml 2.0 ml

2.- Mezclar bien y poner en baño de agua hirviendo durante 10 minutos.

3.- Colocar 5 minutos en baño de agua fría. Proceder como sigue:

B Muestra Patron

MMA ----------- 0.1 ml -----------

MPA ----------- ----------- 0.1 ml

Acido sulfúrico conc. 0.1 ml ----------- -----------

Reactivo de color 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml

4.- Mezclar bien con Vortex e incubar a 37º C durante 15 minutos. Determinar las

absorbancias de la muestra y del patrón a 540 nm igualando a cero con el blanco.

El color es estable por 15 minutos.

CALCULOS:

A Muestra


A Patrón

LIMITES DE REFERENCIA:

En ayuno 400-1000 mg/dl

22

FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA TRIGLICERIDOS

Los triglicéridos presentes en la muestra originan, según las reacciones acopladas

descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por

espectrofotometría.

Triglicéridos + H2O Glicerol + Ácidos grasos

Glicerol + ATP Glicerol – 3 – P + ADP

Glicerol – 3 – P + O2 Dihidroxiacetona – P + H2O2

2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + 4 - Clorofenol Quinonaimina + 4 H2O

MUESTRAS

Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar.

PROCEDIMIENTO

1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.



Patrón Triglicéridos ----------- 10 μL -----------

Muestra ----------- ----------- 10 μL


3. Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16-

25ºC) o durante 5 minutos a 37ºC.

4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El

color es estable durante al menos 2 horas.

23

CÁLCULOS

La concentración de triglicéridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente

fórmula:

A Muestra


A Patrón


Hasta 150 mg/dL Bajo

150-199 mg/dL Dudoso

200-499 mg/dL Alto

> 500 mg/dL Muy alto

FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA COLESTEROL TOTAL

Tanto el colesterol libre como el esterificado presentes en la muestra originan,

según las reacciones acopladas descritas a continuación, un complejo coloreado

que se cuantifica por espectrofotometría.

Colesterol esterificado + H2O Colesterol + Ácido graso

Colesterol + ½ O2 + H2O Colestenona + H2O2

2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O

MUESTRAS


El colesterol en suero o plasma es estable 7 días a 2-8ºC. Pueden utilizarse como

anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.

24

PROCEDIMIENTO

1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.



Patrón Colesterol ----------- 10 Μl -----------

Muestra ----------- --------- 10 μL






CÁLCULOS

La concentración de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente

fórmula:

A Muestra


A Patrón


Los siguientes valores discriminantes universales han sido establecidos por el US

National Cholesterol Education Program y también aceptados en otros paises para

la evaluación del riesgo de enfermedad de las arterias coronarias.

Hasta 200 mg/dL = 5,2 mmol/L Optimo

200-239 mg/dL = 5,2-6,21 mmol/L Moderado

> 240 mg/dL = > 6,24 mmol/L Elevado

25

BIBLIOGRAFÍA

1. Allain CC, Poon LS, Chan CSG, Richmond W and Fu PC. Enzymatic

determination of total serum cholesterol. Clin Chem 1974; 20: 470-475.

2. Meiattini F, Prencipe L, Bardelli F, Giannini G and Tarli P. The 4-

hydroxybenzoate/4- aminophenazone chromogenic system used in the enzymic

determination of serum cholesterol. Clin Chem 1978; 24: 2161-2165.

3. National Cholesterol Educarion Program Expert Panel. Third report of the

National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection,

Evaluation, andTreatment of High Blood Cholesterol in Adults (ATP III). NIH

Publication. Bethesda: National Heart, Lung, and Blood Institute; 2001.

4. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 4th ed. AACC Press,

1995.


26

PRÁCTICA 9

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL, LDL y VLDL

INTRODUCCION:

Las HDL participan en la captación del colesterol de los tejidos y en su

transporte hacia el hígado donde se elimina en forma de ácidos biliares.

Existe una correlación positiva entre concentraciones bajas de HDL-colesterol en

plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y

accidentes cerebrovasculares.

Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con

niveles reducidos de HDL: enfermedades hepatocelulares agudas o crónicas,

hiperalimentación intravenosa, malnutrición severa, diabetes, anemia crónica,

alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier, analfalipoproteinemia,

estrés agudo, algunos medicamentos y el tabaco.

Las LDL son las principales lipoproteinas que transportan colesterol hepático hacia

los tejidos.

Existe una correlación positiva entre concentraciones elevadas de LDL-colesterol

en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y

accidentes cerebrovasculares.

Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con

niveles elevados de LDL: nefrosis, diabetes, obesidad, algunos medicamentos y el

tabaco.

27

OBJETIVO:

El alumno ejecutará la técnica para la determinación de colesterol HDL,

LDL y VLDL séricos y evaluará si se encuentras dentro o fuera de los límites

biológicos de referencia para un probable diagnóstico de dislipidemia.

MATERIAL Y REACTIVOS

FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA COLESTEROL HDL

Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y de baja densidad (LDL)

presentes en la muestra, precipitan en presencia de fosfotungstato y iones

magnesio. El sobrenadante contiene las lipoproteínas de elevada densidad (HDL),

cuyo colesterol se cuantifica espectrofotométricamente mediante las reacciones

acopladas descritas a continuación:

col. esterasa


col. oxidasa


peroxidasa


FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA COLESTEROL LDL

Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) presentes en la muestra, precipitan en

presencia de polivinil sulfato. La concentración de colesterol LDL se calcula por

diferencia entre los valores de colesterol en el suero y en el sobrenadante

28

obtenido tras la precipitación. El colesterol se cuantifica espectrofotométricamente

mediante las reacciones acopladas descritas a continuación.

col. esterasa


col. oxidasa


peroxidasa


PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Tanto el Reactivo como el Patrón están listos para su uso.

EQUIPO ADICIONAL

− Centrífuga de sobremesa

− Baño de agua a 37ºC (opcional)

− Analizador, espectrofotómetro o fotómetro para lecturas a 500 ± 20 nm

MUESTRAS


PROCEDIMIENTO

Precipitación

1. Pipetear en un tubo de centrífuga:

Muestra 0,2 mL

Reactivo (A) (kit de Colesterol HDL) 0,5 Ml

2. Agitar bien y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Centrifugar durante 10 minutos a un mínimo de 4.000 r.p.m.

29

4. Recoger con cuidado el sobrenadante.

Colorimetría

5. Atemperar el Reactivo (kit de Colesterol) a temperatura ambiente.



Agua destilada 100 μL ---------- ---------

Patrón Colesterol HDL (S) ----------- 100 μL -----------

Sobrenadante muestra ----------- ------------ 100 μL

Reactivo (A) (kit de Colesterol) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL




color es estable durante al menos 30 minutos.

CÁLCULOS

La concentración de colesterol HDL en la muestra se calcula a partir de la

siguiente fórmula general:

A Muestra

---------------- x C Patrón = C Muestra

A Patrón

Si se utiliza para calibrar el Patrón de Colesterol HDL suministrado:

x 52,5 = mg/dL colesterol HDL

x 1,36 = mmol/L colesterol HDL

30


Las concentraciones de colesterol de HDL varían considerablemente con la edad y

el sexo. El siguiente valor discriminante ha sido recomendado para identificar

indivíduos con elevado riesgo de enfermedad coronaria.

Hasta 35 mg/dL = 0,91 mmol/L Elevado

> 60 mg/dL = > 1,56 mmol/L Bajo

REACTIVOS ADICIONALES PARA COLESTEROL LDL

Este reactivo precipitante debe ser utilizado junto con el Reactivo de Colesterol

contenido en cualquiera de los kits de Colesterol


El Reactivo está listo para su uso.

EQUIPO ADICIONAL


− Baño de agua a 37ºC


MUESTRAS

Suero recogido mediante procedimientos estándar.

El Colesterol LDL en suero es estable 24 horas días a 2-8ºC.

PROCEDIMIENTO

Precipitación


Muestra 0,4 mL

31

Reactivo (A) (kit de Colesterol LDL) 0,2 Ml




Colorimetría












32

CÁLCULOS

La concentración de colesterol en el sobrenadante se calcula a partir de la

siguiente fórmula

general:

A Muestra


A Patrón

Si se utiliza para calibrar el Patrón de Colesterol, incluido en el Kit de Colesterol:

x 200 x 1,5 = mg/dL colesterol en sobrenadante

x 5,18 x 1,5 = mmol/L colesterol en sobrenadante

La concentración de colesterol LDL en la muestra se calcula:

colesterol LDL = colesterol total – colesterol en sobrenadante



100-129 mg/dL = 2,59-3,34 mmol/L Casi óptimo


160-189 mg/dL = 4,14 -4,90-mmol/L Elevado

> 190 mg/dL = 4,92 mmol/L Muy elevado

33

BIBLIOGRAFÍA

1. Grove TH. Effect of reagent pH on determination of high-density lipoprotein

cholesterol by precipitation with sodium phosphotungstate-magnesium. Clin Chem

1979; 25: 560-564.

2. Burstein M, Scholnick HR and Morfin R. Rapid method for the isolation of

lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. Scand J Clin Lab

Invest 1980; 40: 583-595.



Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (ATP III). NIH



1995.


6. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th ed.

AACC Press, 1997.

34

PRACTICA 10

INDICADORES DE SINDROME METABOLICO

INTRODUCCION

Aunque la medida de la presión arterial es hoy dia una exploración rutinaria,

siguen siendo los resultados de la misma los que permiten diagnosticar la

hipertensión, independientemente de otras exámenes o tests de laboratorio. Su

correcta determinación reviste, por tanto, gran importancia ya que una

sobrestimación de la misma puede inducir un diagnóstico erróneo en un enfermo

sano con la probable aplicación de un tratamiento innecesario.

La medida de la presión arterial deberá ser, por tanto, realizada con un equipo

adecuado que garantice su exactitud y reproducibilidad tanto individual como

interindividual.

OBJETIVO

El alumno realizarà la determinación de Marcadores para determinar enfermedad

metabolica o no

Técnica

La técnica utilizada para la determinación de la presión arterial se basa en la

interrupción del flujo de sangre de la arterial braquial mediante la aplicación de una

presión uniforme con un manguito inflable. Cuando la presión aplicada es mayor

que la presión arterial, el vaso se colapsa y el flujo se detiene no auscultándose

ningún ruido.

35

Al ir diminuyendo la presión del manguito, el flujo en el vaso se restaura originando

unos ruidos característicos del flujo turbulento que progresivamente pasa a flujo

laminar y que permiten el cálculo de las presiones arteriales diastólica y sistólica.

Los ruidos que permiten dichos cálculos se conocen como fases de Korotkoff:

Fase I: Indica que la presión del vaso ha soprepasado la presión externa.

Es un sonido abrupto, alto y progresivamente intenso.

Fase II: El sonido es más claro, intenso y prolongado.

Fase III: el sonido continua alto y claro aunque empieza a percibirse un

murmullo que indica su próxima desaparición

Fase IV: hay un pérdida brusca de la intensidad del sonido que se hace

marcadamente apagado con un murmullo continuo. En ocasiones es lo

último que se escucha

Fase V: Desaparición total del sonido al restablecerse el flujo laminar.

Para la correcta medida de la presión arterial se deberán tomar las siguientes

precauciones:

el manguito inflable deberá ser de las dimensiones adecuadas para rodear

el perimetro del brazo exactamente. Existen multitud de "tallas" de

manguitos de tal forma que puede elegirse el más apropiado para cada

enfermo. Incluso existen manguitos de un solo uso para uso enfermos

infecciosos. El estetoscopio se colocará en la parte inferior

el manguito será inflado rápidamente hasta que su presión sobrepase la

PAS estimada, lo que se puede comprobar por la desaparición del pulso

radial.

Desde este nivel de presión se comienza a desinflar el manguito de forma

lenta y progresiva.

Cuando la presión arterial y la del manguito se igualan, en cada sístole la

presión es capaz de superar ligeramente la presión externa. Esto se

traduce en la aparición del pulso y de un sonido intenso que accompaña

cada onda de pulso.

36

A medida que se desinfla el manguito van apareciendo las distintas fases

de Korotkoff hasta desaparecer en la fase V.

Factores que influyen

Para que las medidas de la presión arterial sean reproducibles por otro

observador, es necesario estandarizar el procedimiento, teniendo en cuenta los

factores que influyen:

Ambiente: el local donde se realice la medida deberá ser lo más tranquilo

posible, sin ruidos y con una temperatura e iluminación agradables.

Paciente: el paciente deberá permanecer en reposo durante 5 minutos

antes de efectuar la medida de la presión, sentado confortablemente en un

sillón adecuado con el brazo a explorar relajado y apoyado, con la palma

hacia arriba. El brazo debe estar descrubierto.

Observador: los profesionales que realizan las medidas de la presión

arterial deberán tener un entrenamiento similar. Deberán estar familiarizado

con el sonido del estetoscopio y tener la capacidad de discriminar sonidos

correspondientes a las fases de Korotkoff. En particular, los ruidos de las

fases IV y V deben ser perfectamente discriminados.

Equipos

El equipo preciso para la medida de la presión arterial está constituído por el

estetoscopio, el esfingomanómetro y el manguito.

Estetoscopio:

los sonidos arteriales son bien transmitidos y serán bien percibidos si se

coloca sobre la arteria humeral, en el pliegue del codo.

Esfigomanómetro:

puede ser de mercurio, aneroide u oscilométrico:

37

o de mercurio: consiste en un cubeta que contiene mercurio

conectada a un tubo vertical de cristal con un extermo abierto por

donde sube el mercurio al inflar el manguito. El tubo está calibrado

entre 0 y 300 mm . El sistema va conectado mediante un tubo de

goma al mecanismo de inflado que consiste en una pera y una

válvula que regula el paso del aire hacia el sistema o hacia el

exterior. Deberá estar en posición vertical sobre una mesa horizontal

o mejor aún colgado de una pared.

o aneroide: se trata de un mecanismo a resorte que se moviliza a una

presión determinada y de forma proporcional a la misma,

desplazando una aguja en una esfera graduada en mm de Hg.

Aunque vienen calibrados de fábrica, son sensibles a la temperatura

y humedad y se deben recalibrar cada 6 meses

o oscilométrico: es un aparato electrónico basado en el análisis de la

onda de pulso. Algunos equipos que llevan este tipo de

esfingomanómetro pueden ser muy sofisticados, siendo

programables y permitiendo el inflado automático del manguito.

Incluso algunos se han desarrollado como periféricos para conectar

a un PC. En los más sencillos y baratos, el inflado es manual. La

fiabilidad de estos aparatos ha sido bien establecida, lo que los hace

ideales para la toma domiciliaria de la PA.

Manguito:

el maguito consta de una cámara de caucho infable situada en el interior de

una funda de tela que la engloba y que permite un abombamiento en su

parte interna. Las dimensiones del mismo son críticas, ya que un brazal

demasiado ancho dará valores anormalmente bajos de la PA, mientras que

uno demasiado estrecho dará valores más altos.

Se han comercializado numeros tipos de manguitos para adultos y niños,

multiusuarios o para pacientes individuales. Las tallas más usuales se

muestran en la tabla 2.1

38

DETERMINACION DE INDICE DE MASA DE CINTURA

El índice cintura-cadera (IC-C) es una medida antropométrica específica para

medir los niveles de grasa intraabdominal, relaciona el perímetro de la cintura

con el de la cadera (en centímetros) y dependiendo del resultado se estima si hay

cierto riesgo cardiovascular.

La OMS establece unos niveles normales de 0,8 en mujeres y 1 en hombres,

valores superiores indicarían obesidad abdominovisceral, lo cual se asocia a

un riesgo cardiovascular aumentado. Este parámetro es un buen indicativo para

ir vigilando tu salud cardiovascular de manera sencilla, si tus niveles se salen de

los valores normales ve tomándote en serio empezar con una vida saludable,

mejor prevenir que curar.

Además esta medida es complementaria al Índice de Masa Corporal (IMC), ya que

el IMC no distingue si el sobrepeso se debe a retención de líquidos, hipertrofia o

similar. De este modo el medir el IMC y el IC-C nos aproximará mejor a

conocer nuestra situación respecto al peso y riesgo cardiovascular.

39

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE

INTRODUCCION:

En el laboratorio clínico el metabolismo que el organismo lleva a cabo sobre

los carbohidratos consumidos y producidos en él, se refleja en la concentración

que la glucosa alcanza a nivel sérico. Por tal motivo ésta determinación es una de

las más importantes a nivel del laboratorio clínico ya que permite definir el estado

basal de dicho proceso.

La glucosa es la principal fuente de energía del organismo. La insulina,

producida en las células de los islotes del páncreas, facilita la entrada de glucosa

en las células de los tejidos. Una deficiencia de insulina o una disminución de su

actividad ocasiona un aumento de la glucosa en sangre.

Se encuentran concentraciones elevadas de glucosa en suero o plasma en

pacientes con diabetes mellitus (dependiente de insulina o no dependiente de

insulina) y con otras condiciones o síndromes. La hipoglucemia puede darse como

respuesta al ayuno, o bien puede ser debida a fármacos, venenos, errores

congénitos del metabolismo o gastrectomía previa.

El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un

único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio (1).

OBJETIVO:

El alumno ejecutará la técnica para la determinación de glucosa sérica y

evaluará si se encuentras dentro o fuera de los límites biológicos de referencia.

MATERIAL Y REACTIVOS

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

40

La glucosa presente en la muestra origina, según las reacciones acopladas

descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por

espectrofotometría.

Glucosa + ½ O2 + H2O Glucónico + H2O2



Tanto el Reactivo como el Patrón están listos para su uso.

EQUIPO ADICIONAL− Baño de agua a 37ºC


MUESTRASSuero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El suero o plasma

deben separarse de los elementos celulares lo antes posible para evitar la

glucolisis. La adición de fluoruro sódico a la muestra de sangre previene la

glucolisis.

PROCEDIMIENTO

1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.2. Pipetear en tubos de ensayo: (Nota 1)

Blanco Patrón MuestraPatrón (S) 10 μL

Muestra 10 μLReactivo (A) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL


25ºC) o

durante 5 minutos a 37ºC.

41



CÁLCULOSLa concentración de glucosa en la muestra se calcula a partir de la siguiente

fórmula general:

A Muestra


A Patrón

Si se utiliza para calibrar el Patrón de Glucosa suministrado

x 100 = mg/dL glucosa

x 5,55 = mmol/L glucosa


Suero y plasma:

Neonato, prematuro 25-80 mg/dL = 1,39-4,44 mmol/L

Neonato, a término 30-90 mg/dL = 1,67-5,00 mmol/L

Niños, adultos 70-105 mg/dL = 3,89-5,83 mmol/L

BIBLIOGRAFÍA1. Trinder P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an

alternative oxygen acceptor. Ann Clin Biochem 1969; 6: 24-27.


3. National Diabetes Data Group: Classification and diagnosis of diabetes mellitus

and other categories of glucose intolerance. Diabetes 1979; 28:1039-1057.


1995.


AACC Press, 1997.

42

PRACTICA 11

DETERMINACION DE LDL-C Y FIBRINOGENO

REACTIVOS ADICIONALES PARA COLESTEROL LDL

Este reactivo precipitante debe ser utilizado junto con el Reactivo de Colesterol

contenido en cualquiera de los kits de Colesterol


El Reactivo está listo para su uso.

EQUIPO ADICIONAL


− Baño de agua a 37ºC


MUESTRAS

Suero recogido mediante procedimientos estándar.

El Colesterol LDL en suero es estable 24 horas días a 2-8ºC.

PROCEDIMIENTO

Precipitación


Muestra 0,4 mL

Reactivo (A) (kit de Colesterol LDL) 0,2 Ml



43


Colorimetría












CÁLCULOS

La concentración de colesterol en el sobrenadante se calcula a partir de la

siguiente fórmula

general:

A Muestra


A Patrón

44

Si se utiliza para calibrar el Patrón de Colesterol, incluido en el Kit de Colesterol:

x 200 x 1,5 = mg/dL colesterol en sobrenadante

x 5,18 x 1,5 = mmol/L colesterol en sobrenadante

La concentración de colesterol LDL en la muestra se calcula:

colesterol LDL = colesterol total – colesterol en sobrenadante



100-129 mg/dL = 2,59-3,34 mmol/L Casi óptimo


160-189 mg/dL = 4,14 -4,90-mmol/L Elevado

> 190 mg/dL = 4,92 mmol/L Muy elevado

BIBLIOGRAFÍA

1. Grove TH. Effect of reagent pH on determination of high-density lipoprotein

cholesterol by precipitation with sodium phosphotungstate-magnesium. Clin Chem

1979; 25: 560-564.

2. Burstein M, Scholnick HR and Morfin R. Rapid method for the isolation of

lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. Scand J Clin Lab

Invest 1980; 40: 583-595.



45

Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (ATP III). NIH



1995.



AACC Press, 1997.

DETERMINACION DE FIBRINOGENO

INTRODUCCION

Para la conversión del valor en segundos a mg/dl de fibrinógeno sirve

la tabla adjunta al estuche. Los valores indicados en ésta son válidos

sólo para el reactivo de fibrinógeno con el mismo número de control y

para los analizadores indicados.

La conversión (para la dilución 1 + 9) es posible en el intervalo de 5–

40 seg. El intervalo de precisión óptimo (8–25 seg) está marcado por

dos líneas negras. Si se requiere una determinación más exacta fuera

de este intervalo óptimo, se recomienda repetir el test con otra

dilución.

Si el tiempo de coagulación es inferior a 8 seg, se repite el test con

la dilución de 1 + 19 y se multiplica el resultado obtenido por 2. Si el

tiempo de coagulación es superior a 25 seg, se repite el test con una

dilución de 1 + 4 ó 1 + 1. Con una dilución de 1 + 4, dividir el valor

obtenido por 2, con una de 1 + 1 dividir por 5.

Observaciones

46

Un inhibidor de la heparina, añadido al reactivo, permite la

determinación también en pacientes bajo tratamiento con heparina.

OBJETIVO

El alumno realizarà la determinación de Marcadores para determinar enfermedad

metabolica o no

Extracción de sangre venosa

La estasis venosa debe hallarse entre la presión sistólica y diastólica

y no debe durar más de un minuto. La estasis repetida de la misma vena no es

posible antes de haber transcurrido 10 minutos.

Se recomienda emplear jeringas de un solo uso con solución estéril

de citrato sódico (0,11 mol/l). Hay que observar estrictamente las

proporciones de mezcla de citrato sódico y sangre de 1 + 9. La velocidad de la

extracción se elige de manera que no se presente una depresión demasiado alta

en la jeringa.

Obtención del plasma

Inmediatamente después de la extracción, mezclar bien la sangre y

trasladarla a un tubo de centrífuga, evitándose la formación de espuma.

Centrifugar 15 min. a aprox. 2500 g. Efectuar la centrifugación en el plazo de 2

horas después de la extracción de sangre. A continuación, pipetear el

sobrenadante.

Estabilidad de la muestra

4 horas a 15–25°C (a partir del momento de la extracción de sangre)

Dilución de plasma

Diluir una parte de plasma citratado con nueve partes de la solución

tampón, pH 7,35.

Método de determinación

Pipetear en un tubo de ensayo:

Muestra o plasma de control diluidos 0,2 ml

47

Incubar 1 min a 37°C

Reactivo de Fibrinógeno (20–25°C) 0,2 ml

Con la adición del reactivo de fibrinógeno, disparar el cronómetro y determinar el

comienzo de la coagulación.

* La determinación del fibrinógeno con el Fibrintimer requiere la adición de caolín.

Disolver el contenido del frasco 1 con 1,8 ml de agua bidest. y añadir 0,2 ml de

una

suspensión de caolín (p. ej. del Reactivo PTT, Ref. 126 551 ó 524 298).

Evaluación


la tabla adjunta al estuche. Los valores indicados en ésta son válidos

sólo para el reactivo de fibrinógeno con el mismo número de control

y para los analizadores indicados.

La conversión (para la dilución 1 + 9) es posible en el intervalo de 5– 40 seg. El

intervalo de precisión óptimo (8–25 seg) está marcado por

dos líneas negras. Si se requiere una determinación más exacta fuera

de este intervalo óptimo, se recomienda repetir el test con otra dilución.

Si el tiempo de coagulación es inferior a 8 seg, se repite el test con

la dilución de 1 + 19 y se multiplica el resultado obtenido por 2. Si el

tiempo de coagulación es superior a 25 seg, se repite el test con una

dilución de 1 + 4 ó 1 + 1. Con una dilución de 1 + 4, dividir el valor obtenido por 2,

con una de 1 + 1 dividir por 5.

Observaciones

Un inhibidor de la heparina, añadido al reactivo, permite la determinación también

en pacientes bajo tratamiento con heparina.

FUNDAMENTO DE LA TECNICA

Plasmas de control

Para el control de calidad se pueden emplear:

48

– los plasmas de control contenidos en el estuche (normal, frasco 3,y patológico,

frasco 4),

– PreciClot I/II (normal, patológico)

– PreciClot I/II (normal)

– PreciClot II/I (patológico)

Preparación de los plasmas de control normal y patológico

Disolver el contenido de un frasco de plasma de control con exactamente 0,5 ml

de agua bidest. La solución no se debe agitar y debe debe agitar y debe reposar

por lo menos 30 min antes del uso. – El plasma de control se trata como plasma

citratado normal.

Estabilidad: 2 horas a 4–25°C

Estabilidad: 1 mes a –20°C.

Dilución del plasma

Plasma de control normal: diluir 1 + 9 con solución tampón.

Plasma de control patológico: diluir 1 + 9 ó 1 + 4 con solución tampón.

Método de determinación

La determinación se efectúa según el esquema de al lado. Evaluación


la tabla adjunta al estuche. Con una dilución de 1 + 4, dividir por 2 el valor indicado

en la tabla.

Valores teóricos para los plasmas de control

Los valores exactos para los plasmas de control se toman de la hoja

adjunta a los estuches. Son válidos sólo para el número de control

correspondiente.

Valor normal200–400 mg/dl o resp. 2,0–4,0 g/l

Bibliografía

Clauss A. Acta haemat 1957;17:237.

Paar D. Blut 1971;23:1.

49

PRACTICA NÙMERO 12

DETERMINACIÒN DE CREATINA QUINASA

INTRODUCCIÒN:

La creatina quinasa (CK) desempeña una importante función en el músculo

proporcionando ATP, cuando el músculo se contrae, a partir de ADP y utilizando

creatina fosfato como reservorio de fosforilación.

La CK sérica procede fundamentalmente del músculo y su concentración

depende de una serie de variables fisiológicas (sexo, edad, masa muscular,

actividad física y raza).

La concentración sérica de CK se encuentra notablemente elevada en

pacientes con algunas de las enfermedades del músculo esquelético (distrofia

muscular, miositis, polimiositis, hipertermia maligna, trauma, rabdomiolisis aguda),

del sistema nervioso central (enfermedad cerebrovascular aguda, isquemia

cerebral, síndrome de Reye) y de el tiroides (hipotiroidismo). Se observan

concentraciones elevadas de CK al cabo de 3-6 horas de un infarto de miocardio

alcanzando valores máximos a las 24-36 horas. La concentración vuelve a la

normalidad en 3-4 días debido a que la enzima es eliminada rápidamente del

plasma. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado

de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.

OBJETIVO:

El alumno realizarà la determinación de CK como un indicador enzimático de

confirmación de diagnostico de Infarto agudo al miocardio.

MATERIAL Y MÈTODOS:


50

La creatina quinasa (CK) cataliza la fosforilación del ADP por el fosfato de

creatina, obteniéndose creatina y ATP. La concentración catalítica se determina,

empleando las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa, a partir de la velocidad de formación del NADPH, medido a 340

nm.

Fosfato de creatina + ADP Creatina + ATP

ATP + Glucosa ADP + Glucosa - 6 - fosfato

Glucosa - 6 - fosfato + NADP Gluconato - 6 - fosfato + NADPH + H

MUESTRAS

Suero recogido mediante procedimientos estándar

PROCEDIMIENTO

1. Precalentar el Reactivo de Trabajo y el instrumento a la temperatura de

reacción.

2. Pipetear en una cubeta:

Muestra 50 µL Reactivo de Trabajo 1,0 mL

3. Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro. Poner el cronómetro en marcha. 4.

A los 3 minutos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada

minuto durante3 minutos.

5. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (∆A/min).

CÁLCULOS

A/min x 3333 = U/L


25ºC 10-65 U/L

30ºC 15-105 U/L

51

37ºC 38-174 U/L

BIBLIOGRAFÍA

1. IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part

7: IFCC method for creatine kinase. JIFCC 1989; 1: 130-139.

2. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd edition. Burtis CA, Ashwood ER. WB

Saunders Co., 1999.


1997. 4. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th

ed. AACC Press,1997.

52

PRACTICA NUMERO 13

DETERMINACION DE CREATINA QUINASA TOTAL E ISOENZIMA

CK-MB

INTRODUCCIÒN:

La creatina kinasa esta compuesta de 2 cadenas polipeptídicas, denominadas

B (de cerebro) y M (de músculo), que dan origen a los tres isoenzimas diméricos:

MM (CK-1), MB (CK-2) y BB (CK-3).

Los porcentajes de la actividad de CK-MB sérica respecto a la actividad CK

total suele ser inferior al 6%. Sin embargo, estos valores aumentan al 10 a 30%

después de un infarto de miocardio dependiendo de la extensión de tejido

miocárdico afectado y de la localización del infarto. No obstante, pueden

encontrarse índices bajos de CK-MB sérica tras un infarto de un miocardio

previamente sano. Por consiguiente, el diagnóstico de infarto de miocardio debe

basarse en la historia clínica y otros datos, junto con la magnitud de la elevación

de CK-MB y su perfil en el tiempo.

OBJETIVO:

El alumno determinarà la CK-total y CK-MB como indicadores enzimáticos de la

confirmación y seguimiento de un Infarto al miocardio.

MATERIAL Y METODOS.


La creatina quinasa (CK) cataliza la fosforilación del ADP por el fosfato de

creatina, obteniéndose creatina y ATP. La concentración catalítica se determina,

53

empleando las reacciones acopladas de la hexoquinasa y glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa, a partir de la velocidad de formación del NADPH, medido a 340

nm.



Glucosa - 6 - fosfato + NADP Gluconato - 6 - fosfato + NADPH + H

MUESTRAS

Suero recogido mediante procedimientos estándar

PROCEDIMIENTO

1. Precalentar el Reactivo de Trabajo y el instrumento a la temperatura de

reacción.

2. Pipetear en una cubeta:


3. Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro. Poner el cronómetro en marcha. 4.

A los 3 minutos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada

minuto durante3 minutos.

5. Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (∆A/min).

CÁLCULOS

A/min x 3333 = U/L


25ºC 10-65 U/L

30ºC 15-105 U/L

37ºC 38-174 U/L

54


Un anticuerpo específico inhibe las dos subunidades M de la CK-MM

(CK-3) y la única subunidad M de la CK-MB (CK-2), lo que permite la

medición de la subunidad B de la de la CK- MB (asumiendo la ausencia

de CK-BB o CK-1)

. La concentración catalítica de CK-B, que corresponde a la mitad de la

actividad CK-MB, se determina empleando las reacciones acopladas de

la hexoquinasa (HK) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6P-DH), a

partir de la velocidad de formación del NADPH, medido a 340 nm.



Glucosa - 6 - fosfato + NADP Gluconato - 6 - fosfato + NADPH

+ H

PROCEDIMIENTO

1. Precalentar el Reactivo de Trabajo y el instrumento a 37ºC.

2. Pipetear en un tubo de ensayo:


3. Mezclar bien e incubar inmediatamente a 37ºC. Poner en marcha el

cronómetro.

4. Leer la absorbancia (A) a 340 nm exactamente a los 5 minutos (A 5)

y a los 10 minutos (A 10) de incubación.

CÁLCULOS

La concentración de CK-MB en la muestra se calcula a partir de la

siguiente fórmula:

A 10 – A 5 x 1651= U/L

55


Se han descrito valores discriminantes de alrededor de 25 U/L = 417

nkat/L para el infarto agudo de miocardio. No obstante, es preferible

emplear el límite del índice de CK-MB del 6% de la concentración de CK

total valor discriminante.

BIBLIOGRAFÍA

1. IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part

7: IFCC method for creatine kinase. JIFCC 1989; 1: 130-139.

2. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd edition. Burtis CA, Ashwood ER. WB

Saunders Co., 1999.


1997. 4. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th

ed. AACC Press,1997.

56

8. Manual de Prácticas Quimica Clinica II

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