Deneysel sepsis modelinde propranolol tedavisinin endotelyal

disfonksiyon üzerine etkisiEzgi Özyılmaz, Sinem Göktürk, Emine Kılıç Bağır, Leman Sancar, Özlem

Görüroğlu, İsmail Cem Eray, Yusuf Kenan Dağlıoğlu, Oya Baydar,

Gülşah Seydaoğlu, Ali Kocabaş

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji AD

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji AD

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji AD

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya AD

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji AD, Deney Hayvan Laboratuarı

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Genel Cerrahi AD

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik AD

GİRİŞ

• Sepsis, enfeksiyona karşı aşırı sistemik inflamatuar yanıt ile karakterize bir sendromdur.

• Patofizyolojisi ??

• İmmun sistem

• Koagülasyon sistemi

• Otonom sinir sistemi

DIC, MODS, ŞOK

Endotel hücre aktivasyonu, sepsiste MODS’a neden olan mikrovaskülerdisfonksiyonun temel mekanizmalarından biridir Organ

disfonksiyonu

Adrenerjik Sistem• Organ fonksiyonu ve kardiyovasküler homeostazın anahtar

sistemi

• İmmun sistemin güçlü bir düzenleyicisi

• Dalak, timus, LN, Kemik iliği sempatik sistemle inn. edilir.

• Th2-lenf. dışındaki pek çok

lenfoid hücre, yüzeyinde beta

adrenerjik reseptör eksprese eder.

• En yüksek reseptör ekspresyonu +

• En güçlü adenilat siklaz bağlanma

Etkinliği: NK

De Montnollin E et al. Crit Care 2009; 13:230

Sepsis ve Adrenerjik Sistem

• Sepsiste kemik iliği, monosit-mf üretiminde anahtar rol oynar.

• Sempatik aktivasyon, β2 res. aracılığıyla;

1- Ki’den monosit üretimini arttırır

2- Monositlerin aktif mf’a dönüşümünü indükler

3- NFκB aracılı sitokin salınımına neden olur.

Muthu K, et al. J Neuroimmunol 2005; 165: 129-135

Sepsis ve Adrenerjik Sistem

• Sepsiste, adrenenerjik sistem aktivasyonu sonucu plazma katekolamin düzeyleri artar.

• Persistan katekolamin artışları hücresel immunitearacılığıyla immunsupresyona neden olur.

• Aynı zamanda mortalite ile ilişkilidir.

Ackland GL, et al. Crit Care Med 2010; 38: 388-394

Prass K, et al. J Exp Med 2003; 198: 725-36

β-Blokerler

• Beta bloker endik.: HT, inme, angina, kalp yetmezliği…

• Beta blokerler:

1- İmmunsupresyonu düzeltir

2- Katabolizmayı geri döndürür

3- Proinflamatuar sitokin ekspresyonunu azaltır

4- Sempatovagal dengeyi korur

ANTİİNFLAMATUAR *Prass K, et al. J Exp Med 2003; 198: 725-36•Herndon DN. NEJM 2001; 345:1223-9

•Prabhu SD. Circulation 2000; 101: 2103-9•Tracey KJ. J Clin Invest 2007; 117: 289-96

KOAGÜLASYON SİSTEM

Amaç

• Bu çalışmanın amacı, deneysel sepsis modelinde non-selektif bir β-bloker olan propranolol’ün endotelyaldisfonksiyon ve survi üzerine etkisinin araştırılmasıdır.

Yöntem

• Araştırma yeri: ÇÜ-DETAUM

• Çukurova Üniversitesi Deney Hayvan Etik Kurul onayı alındı.

• Erişkin erkek (300 gr) Wistar-Albino ratlar

• Uygun yaşama koşulları, yem ve su kısıtlaması yok.

• 4 grup ve her grupta 12’şer rat olmak üzere toplam 48 rat

• Sepsis yöntemi: CLP

• Anestezi: 5 mg/kg Ksilazin + 80 mg/kg ketamin

• Tüm gruplara laparatomi sonrası 2ml/100 gr sc SF

• Propranolol: 100 mg/kg ip uygulama (Sigma Lab.)

Gruplar

• Grup 1: Sham

• Grup 2: Kontrol (CLP öncesi 3 gün ip SF)

• Grup 3: PreCLP Prop (Sepsis oluşturulmadan önceki 3 gün, 100 mg/kg ip propranolol uygulandı)

• Grup 4: PostCLP Prop (Sepsis sonrası tek doz 100 mg/kg ip Propranolol)

Çalışma Akışı1.gün 2.gün 3.gün 4. gün 120

saate kadar

SHAM Takip Takip Laparatomi,manuel palpasyon-

Kapama-survitakibi

* Her gruptan 6’şar rat, anestezi altında

sakrifiye edildi.*İntrakardiyak yolla

kan alındı•Akciğerleri

çıkarıldı.* -80°C’de saklandı.

*Kalan ratlara 120 saate kadar saatlik survi takibi yapıldı.

Takip

PRE-CLP SF İP-SF İp-SF İp SF-60 dk sonra Laparatomi-CLP-

survi takibi

Takip

PreCLP-Prop İP-Prop İP-Prop İp Prop-60 dk sonra Laparatomi-CLP-

survi takibi

Takip

PostCLP-Prop Takip Takip Laparatomi-CLP-60dk sonra tek doz ip

Prop-survi takibi

Takip

Değerlendirmeler

A- Biyokimyasal analiz: Serum örneğinden TNF-α, PAI-1, VEGF düzeyleri

B- Işık Mikroskopi ve İmmunohistokimyasal inceleme:

2 kör histopatolog, HE boyalı ışık mikroskopi ve immunohistokimyasal olarak akciğer dokusunda TNF-α ve IL-6 incelendi, hscore ile raporlandı.

C- Elektron Mikroskopi: Reichert Ultracut S ultramikrotomuve Jeol JEM 1400 Transmisyon Elektron Mikroskopu

D- Survi takibi: 120 saate kadar

İstatistiksel Değerlendirme

• Sürekli değişkenler normale uygunluk açısından değerlendirildi.

• Normal dağılım göstermeyen değişkenler için Nonparametrik testlerde Mann-Whitney U ve Kruskal Wallis

• Kategorik değişkenlerin analizinde ise Ki kare ve FisherExact test kullanıldı.

• Survival analizi Kaplan Meier yöntemi ile yapıldı. • İstatistiksel fark p<0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

• SPSS 20.0

SonuçlarBiyokimyasal İnceleme

Tablo 1: Serum TNF-alfa, Serum PAI-1, Serum VEGF düzeylerinin karşılaştırılması (mean ±SD) (median)(min-max)

SHAM KONTROL (SF)

PRE-CLP PROP.

POST-CLP PROP

p

Serum TNF-α (pg/ml)median(min-max)

70,8±6.871.8

(58-77)

193 ± 27682

(75-757)

76.7±1,976.2

(75-81)

100.5±3,499.0

(97-106)0,0040,003

Serum PAI -1 (AU/ml) median(min-max)

14,5±1,6 14.1 (13-18)

18,9±2,3 18.2 (16-23)

19,8±3,2 19.2 (16-26)

15±2,5 15.8 (10-18)

0.0100,002

Serum VEGF (ng/L)median(min-max)

631±56 612 (564-707)

652±212697(290-920)

742±114758(568-884)

865±336783(401-

1376)

0.6310,147

SHAM KONTROL (SF) PRE-CLP PROP.

POST-CLP PROP

p

IL-6 Skoru Median(min-max)

163(125-205)

185(145-235)

218(190-255)

218(155-260)

0,069#

0,077*0,200¶

0,107₱

0,810ɸ

TNF-alfa skoruMedian(min-max)

22(2-139)

130(119-192)

205(180-245)

139(112-261)

0,002#

0,016*0,749¶

0,010₱

0,055ɸ

Tablo 2: Akciğer dokusunda immunohistokimyasal olarak h-score ile değerlendirilen TNF-α ve IL-6 sonuçları

#: 4 grup arası*: Sham- post arası¶: Kontrol-post arası₱: Kontrol- pre arasıɸ: Pre- Post arası

İmmunohistokimyasal İnceleme

Sonuçlar-3Elektron Mikroskopi

Şekil 1. Sham grubuna ait akciğer dokusunun elektron mikroskobik görünümü. Kapillerendotel hücrelerinin (E), çekirdek (Ç) ve sitoplazmik organelleri normal yapıda izlenmektedir. endotel hücreleri altındaki bazal lamina (BL) normal yapısını korumaktadır. M; Makrofaj, ER; Eritrosit, KAP; Kapiller. Bar: 1µm.

Elektron Mikroskopi

Şekil 2. Kontrol grubuna ait akciğer dokusunun elektron mikroskobik görünümü. Endotelhücrelerinin çekirdeğinde (Ç) heterokromatin artışı , hücre sitoplazmasında vakuolizasyonlar, mitokondrial genişleme ve mitokondri kristalarında harabiyetizlenmektedir. İnterstisyumda makrofajların (M) sitoplazmalarında fagositik cisimlerin varlığı görülmektedir. BL; kapiller endotel hücrelerinin bazal laminası, AH; Tip 2 alveolarhücre. Bar: 1µm.

Elektron Mikroskopi

Şekil 4. Pre-propranol grubuna ait akciğer dokusunun elektron mikroskobik görünümü.Kapillerendotel hücreleri (E) ve bazal lamina (BL) birçok alanda normal ince yapısını korumaktadır. Bununla birlikte bazı alanlarda endotel hücre çekirdeklerinde (Ç) heterokromatin artışı ve mitokondrialarda hafif dejeneratif değişiklikler izlendi. KAP; kapiller, ER; eritrosit. Bar: 1µm.

Elektron Mikroskopi

Şekil 3. Post propranol grubuna ait akciğer dokusunun elektron mikroskobik görünümü. Kapiller endotel hücreleri (E) ve bazal lamina (BL) birçok alanda normal yapısını korumaktadır. Bununla birlikte bazı alanlarda endotel hücre çekirdeklerinde hafif heterokromatin artışı izlendi. N; nötrofil, KAP; kapiller. Bar: 1µm.

Sonuçlar 4: Survival analizi

Gruplar Survival (Saat)

Mean (Medyan)

Kontrol(SF) 28.3 (14.0)

Pre-CLP Prop 118,3 (120)

Post-CLP Prop 38,9 (29,5)

P değeri

(3 grup arasında)

0,003

P değeri

(Kontrol ve Post –CLP

arasında)

0,325

Tartışma

• Bugüne kadar pek çok deneysel ve klinik sepsisaraştırmasında, özellikle survi üzerine olumlu etkileri gösterilmiş olan beta bloker tedavinin etki mekanizması “endotelyal sistem” olabilir.

• Bu konuda yapılacak ileri araştırmalar, sepsistemikrovasküler bozuklukların düzeltilmesi sonucu tedavi algoritmasını ve prognozu ciddi ölçüde değiştirebilir.