Molekuláris genetikai vizsgálatok jelentősége a

daganatos megbetegedések diagnosztikájában

A molekuláris genetikai vizsgálatok mind jelentősebb szerepet töltenek be a daganatos betegségek diagnózisának kimondásában,valamint az egészséges egyének bizonyos tumoros megbetegedésre való hajlamának megállapításában.

A daganatok kialakulásának és fejlődésének legfontosabb fázisai:• Transzformáció (A normális sejt genetikai állományának a megváltozását

jelenti.)• Növekedés• Klonális evolúció• Invázió• Metasztázis képződés

A transzformáció során érintett legfontosabb gének:

A carcogenesis genetikai célpontjaiA daganatok kialakulásához általában nem elegendő egyetlen mutáció,gyakran egymás után bekövetkező mutációk egész sorára van szükség.A genetikai állományban bekövetkező változások lehetőséget teremtenek a daganatos sejtek jelenlétének kimutatására.

A genetikai változások típusai,melyek megfelelő módszerekkel detektálhatóak:

• Egy vagy néhány nukleotidot érintő változások: -pontmutáció

-delézió

-inzerció

• Nagyobb génszakaszt érintő változások: -transzlokáció

-kromoszómális delézió v.inverzió

-kromoszómális inverzió

A genetikai eltérések kimutatására alkalmas módszerek közül a PCR, RT-PCR, Southernblott, Fish és a RQ-PCR a leggyakrabban alkalmazott.

A genetikai állományban bekövetkezett változások kimutatása a tumor diagnosztika számos területen alkalmazható és különböző célok érdekében használható fel.

A legfontosabbak: -magas rizikójú családok szűrése(familiáris tumorok) -korai tumor diagnózis és monitorozás

-prognózis megítélése

A magas rizikójú családok tagjai olyan mutációkat hordoznak,amelynek jelenléte jelentős mértékben fokozza egy adott daganat kialakulását.Ha egy ilyen mutáció kimutatható egy daganatos betegségben szenvedő családtagban,érdemes az egészséges vérrokonokban is ennek genetikai eltérésnek a jelenlétét megvizsgálni.

Tumorszupresszor gének familiáris tumorokban

RETINOBLASZTOMA Magas rizikójú családok szűrése.

A BRCA gén mutációinak kimutatása az emlő és ovárium tumorok diagnosztikájában.

Az ilyen betegségben szenvedők 5-15%-ában mutatható ki örökletes genetikai elváltozás.Ezek genetikai eltérések kb. 50%-a a BRCA1gént, és 30%-a a BRCA2 gént érinti.Ezeknek a géneknek elsősorban a DNS-hibákat javító rendszer működésében van jelentőségük,valamint a genom stabilitásának fenntartásában.Ezek hiányában a DNS károsodás okozta eltérések lehetősége jelentősen megnő.

A mutációk kimutatása allélspecifikus PCR segítségéval történik.

A BRCA1185delAG mutáció azonosítása allélspecifikus PCR segítségével.

A BRCA1 5382insC és a BRCA2 6174delT mutációk azonosítása multiplex allélspecifikus PCR

segítségével.•Ebben az esetben két mutáció egyidejű kimutatása történik.

Az MTC diagnózisa biokémiai vizsgálatokon is nyugszik.Az öröklődő MTC esetek mintegy 95%-ban sikerült a RET protoonkogén mutációit azonosítani.

•A RET gén CYS634 mutációjának kimutatása PCR és RFLP segítségével

•A RET gén mutációinak kimutatása a familiáris medullaris pajzsmirigy carcinoma (MTC) diagnosztikájában

A különböző mutációk hatására a DdeI és a HHAI enzimek új hasítóhelye alakul ki.Az enzimek a vad típusú allél PCR termékét nem hasítják,a mutáns allél PCR termékét viszont vágják.

A PAGE segítségével a hasítási termékek elválaszthatóak és jól láthatóvá tehetők. (köv.ábra)

•A RET gén 3 különböző mutációjának detektálása PCR és RFLP segítségével

Az 1. Minta mutációja Fnu4HI emésztéssel mutatható ki.

A 2. Mutáció kimutatásáraa DdeI a 3.-éra a HHAI enzim alkalmas. (Itt a mutció hatására új hasítóhely alakul ki)

A RET-Cys634 mutációinak kimutatása szekvenálással

A képen az előző ábrán bemutatott 3 heterozigóta mutációt tartalmazó minta szekvencia képe látható.

A nyilak a mutációk helyét jelöljk.

Keringő, potenciálisan metastasist adó tumorsejtek kimutatása

A képalkotó eljárásokkal csak meglehetősen későn lehet a kialakult távoli áttéteket felismerni.Nagyon lényeges lenne ezért a keringésben lévő tumorsejtek kimutatása.

Ezen a területen a molekuláris biológiai módszerek jelenthetnek áttörést. ( egy RT-PCR reakción alapuló módszer segítségével akár 105-10^7 egészséges sejtből is kimutatható egyetlen tumoros sejt.)�Lényeges ezeknél a módszereknél megfelelő tumorspecifikus marker keresése,amely csak a tumorsejtekben található meg a normális sejtekben nem.

Molekuláris biológiai vizsgálatok jelentősége haematológiai malignómákban

• Egyre nagyob szerepet játszanak a leukémiák diagnosztikájában. Molekuláris genetika alkalmazásának legfontosabb lehetőségei ezen területen:

1. Klonalitás igazolása

2. Diagnózis felállítása(tumor specifikus gen.elt.kim.)

3. MRD kimutatása(minimális reziduális betegség),és és ennek monitorozása

4. Prognózis becslése(rossz v. jó indulatú)

5.Terápiára való reagálás megítélése(egyes génmutációk bizonyos kezelésekre rezisztensek)

Az MRD azt jelenti, hogy a leukémiás sejtek reziduális klónja van jelen a keringésben,amely csak molekuláris biológiai módszerekkel mutatható ki.

MRD kimutatása

A leggyakrabban alkalmazott MRD kimutatására alkalmas genetikai eltérések:

•Kromoszóma transzlokációk

•B-és T-sejt génátrendeződés B-ésT-sejt génátrendeződések vizsgálata a hematológiai malignómákban

Az átrendeződés során a gén különböző szakaszai véletlenszerűen kiválasztódva kerülnek egymás mellé, így minden B v. T sejtben egyedi mintázatot hoznak létre.Ha egy kóros leukémiás sejt burjánzik,akkor a sejtek nagy részére egy adott génátrendeződés lesz jellemző.(és a PAGEN egyetlen éles sávot látunk, köv.kép)

B és T sejt receptor génátrendeződés vizsgálata PCR reakciók és PAGE segítségével

A módszer egyrészt diagnosztikus célokat szolgálhat.

Másik alkalmazási terület az MRD kimutatása.Ezzel a módszerrel max. 1000 egészséges sejtből mutatható ki 1 tumorsejt.

A PCR termékek PAGE képe látható:B-CLL és T-CLL

B-ill.T-sejtes krónikus limfoid leukémia

B-ALL és T-ALL

B-ill.T-sejtes akut limfoid leukémia

T-sejt receptor (TcR) génátrendeződés kimutatása malignus haematológiai megbetegedésekben

Készítette: Kónya Katalin II.évfolyan

biológia-környezetvédelem szakos hallgató

Felhasznált irodalom:

Góth László,DE OEC

Molekuláris Biológiai Diagnosztikai Módszerek

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!