Instructivo Quimica Clinica

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE ESTUDIOS CIENTÍFICOS Y TECNOLÓGICOS No. 15

“DIÓDORO ANTÚNEZ ECHEGARAY”

INSTRUCTIVO DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

QUÍMICA CLÍNICA

ALUMNO: _________________________________________________________ GRUPO: ____________________ EQUIPO: _____________________ PROFESOR TITULAR:: _________________________________________________ PROFESORES DE LABORATORIO: ____________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

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ÍNDICE

PRÁCTICA CONTENIDO: Página

INTRODUCCIÓN.....................................................................…... 4

1 REGLAMENTO DE LABORATORIO DE QUÍMICA CLÍNICA Y PUNTOS QUE COMPRENDE EL REPORTE DE CADA PRÁCTICA……………………………………………………………..

6

2 VOLUMETRÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA EN QUÍMICA CLÍNICA…………

8

3 CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA SÉRICA………………………. 12

4 CUANTIFICACIÓN DE UREA SÉRICA……………………………. 16

5 CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO SÉRICO...……………….. 21

6 SEMINARIO DE INTEGRACIÓN I (Practica: 1, 2, 3, 4 y 5)

7 CUANTIFICACIÓN DE CREATININA SÉRICA……………………. 26

8 CUANTIFICACIÓN DE COLESTEROL SÉRICO…………………. 30

9 CUANTIFICACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS SÉRICOS…………….. 34

10 CUANTIFICACIÓN DE HIERRO SÉRICO…………………………. 37

11 CUANTIFICACIÓN DE BILIRRUBINAS SÉRICAS……………….. 40

12 SEMINARIO DE INTEGRACIÓN II (Practicas: 7, 8, 9, 10 y 11)

13 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES………………….. 46

14 CUANTIFICACIÓN DE ALBÚMINA SÉRICA……………………… 50

15 EXAMEN GENERAL DE ORINA. EXAMEN FISICO Y QUÍMICO…………... 54

16 EXAMEN GENERAL DE ORINA. EXAMEN QUÍMICO Y MICROSCÓPICO 60

17 INTEGRACIÓN DEL EXAMEN GENERAL DE ORINA

18 SEMINARIO DE INTEGRACIÓN III (Practicas: 13, 14, 15, 16, 17)

BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………….. 68

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INTRODUCCIÓN:

El presente instructivo, es un esfuerzo más que realiza la Academia de Química

Clínica como apoyo a los alumnos para su preparación y formación que se da en los

cursos teórico- prácticos de Química Clínica, el cual deberá permitirle enfrentar los retos

que encontrará en su vida profesional frente al creciente número de técnicas manuales

y automatizadas que continuamente se están desarrollando para la detección y

cuantificación de metabolitos u otros compuestos de interés clínico para la medicina

moderna. Además, cada vez es menor el tiempo que transcurre entre un

descubrimiento y su aplicación. No solamente la comunicación es más rápida, sino que

las casas comerciales de equipo de laboratorio elaboran muy pronto los aparatos y

reactivos necesarios.

La función del laboratorio de Química Clínica es realizar análisis cualitativos y

cuantitativos de líquidos corporales tales como sangre, suero, plasma, líquido

cefalorraquídeo y orina.

Así mismo, las personas responsables de realizar los análisis deberán conocer

perfectamente los aspectos técnicos de los que se realicen, así como el principio del

método para que los resultados obtenidos de dicha prueba sean útiles a los médicos

en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad.

Los análisis deberán realizarse lo más preciso y exacto posible, para lo cual se

requiere de métodos analíticos confiables y una buena instrumentación.

Esto implica el conocimiento de las reacciones químicas involucradas y el efecto

que de las variables físicas tienen sobre ellas, así como la función de cada uno de los

reactivos utilizados.

Los datos obtenidos en un laboratorio clínico se utilizan para tomar decisiones

importantes. Todos los resultados generados van asociados a variaciones que

interfieren con la evaluación e interpretación de los datos. El responsable de laboratorio

debe ser capaz de evaluar esta variación y determinar su significado para tomar

decisiones con base a los datos obtenidos. Esto lleva a la necesidad de enfatizar el

Control de Calidad en el trabajo de laboratorio. Por ello en cada una de las técnicas a

realizar los alumnos correrán un suero control junto con el problema, de tal manera que

se percaten de la importancia del control de calidad en su trabajo diario.

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PRACTICA No. 1

REGLAMENTO DE LABORATORIO DE QUÍMICA CLÍNICA Y PUNTOS QUE COMPRENDE EL REPORTE DE CADA PRÁCTICA:

I. COMPETENCIA:

Aplica el Reglamento del Laboratorio de Química Clínica y los puntos que abarca el reporte de cada práctica durante todo el semestre.

II. INTRODUCCIÓN:

REGLAMENTO DE LABORATORIO DE QUÍMICA CLÍNICA: 1. Sólo podrán entrar a las prácticas los alumnos que estén inscritos oficialmente. 2. Entrarán al laboratorio con bata blanca de manga larga, bien puesta y

perfectamente abotonada; sólo podrán quitársela al salir de éste. 3. Se impartirá 1 sesión por semana a cada grupo, tomándose la asistencia al inicio

de cada una de ellas y existiendo un margen de tolerancia de 5 minutos después de la hora señalada para ingresar al laboratorio.

4. Se anotarán las faltas de asistencia con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos después de la tolerancia, ni se justificarán las faltas.

5. Las faltas al laboratorio se calificarán con cero, ya que si no se realiza una práctica, no se puede evaluar.

6. Colocar todos sus objetos personales en los anaqueles. Dejar fuera exclusivamente el material que se va a utilizar.

7. Queda estrictamente prohibido el uso de aparatos electrónicos durante el trabajo en el laboratorio (MP3, MP4, Ipod, Ipad, audífonos, teléfonos celulares, entre otros); la primera vez que se le encuentre un aparato de éste tipo será notificado verbalmente, la segunda ocasión se le retendrá por el tiempo que dure la práctica y a la tercera, se le retendrá por el resto del semestre escolar. Los teléfonos celulares sólo podrán utilizarlos en modo vibrador y en caso de recibir alguna llamada de urgencia, deberán pedir permiso a los profesores para salir del laboratorio a responderla. Podrán utilizar la cámara del teléfono únicamente para tomar fotografías de sus evidencias de trabajo en el laboratorio.

8. A aquellos estudiantes que vistan estrafalariamente, a la moda punk, dark o emo (pantalón corto, bermudas, cabello pintado, zapatos abiertos tipo huarache, con perforaciones o piercings, etc.) no se les permitirá la entrada al laboratorio ni al salón de clase.

9. Cada alumno deberá trabajar durante todo el curso en el equipo y mesa de trabajo que se le asigne al inicio del mismo, salvo que los profesores lo cambien.

10. Es obligación de los alumnos guardar orden, disciplina y atención durante la estancia en el laboratorio para prevenir accidentes y daños al equipo; quienes no cumplan con esta disposición, tendrán que abandonarlo, anulándose la práctica que estén realizando.

11. Para evitar retraso durante el desarrollo de la práctica, el alumno deberá estudiarla cuidadosamente antes de entrar al laboratorio y preparar

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adecuadamente su material didáctico a exponer. Procediendo de ésta manera, podrá el alumno preguntar a los profesores todas sus dudas, así como preparar el material necesario para cada una de las prácticas con la debida anticipación. Los alumnos que no cumplan con lo anterior no tendrán derecho a la evaluación respectiva, pudiendo permanecer en el laboratorio y desarrollar la práctica.

12. Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio. 13. La basura deberá separarse y depositarse en los botes colocados debajo de cada

mesa y no en las tarjas cónicas de las mismas. 14. Los RPBI deberán separarse y depositarse en las bolsas rojas colocadas dentro

del contenedor rojo. 15. Las agujas deberán depositarse en el contenedor de punzocortantes de color rojo,

mientras que su capuchón en la basura común. 16. El material que se utilice en la práctica deberá quedar en el lugar que se indique y

perfectamente limpio y seco. 17. Si se abandona el laboratorio sin autorización de algún profesor, aunque la

práctica se haya terminado, se considerará como falta. 18. Cuando todo el grupo deje de asistir a alguna práctica y no existe causa justificada

oficialmente, ésta se dará por vista y podrá ser tema de cualquier examen. 19. El material que se deteriore, rompa o extravíe, se deberá reponer en 15 días como

máximo o se suspenderán a los alumnos causantes. 20. El alumno que al finalizar las prácticas adeude material no tendrá derecho a

presentar el examen final. 21. Colocar los bancos sobre la mesa al terminar la sesión. 22. Para tener derecho a presentar el examen ordinario “C” será requisito

indispensable tener mínimo el 80% de asistencias y prácticas realizadas, si se tiene del 70 al 80% deberá presentar un examen extraordinario de todo el curso, si se tiene del 50 al 70% no tendrá derecho a presentar en examen ordinario “C” y deberá presentar ETS. Además, también deberá entregar en cada examen su carpeta de evidencias.

PUNTOS QUE COMPRENDE EL REPORTE DE CADA PRÁCTICA:

1. NÚMERO Y TÍTULO DE LA PRÁCTICA. 2. COMPETENCIA. 3. PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO UTILIZADO. 4. ESPECIFICACIONES DE DESEMPEÑO (POR EJEMPLO: LINEALIDAD,

PRECISIÓN, EXACTITUD EXPRESADA COMO INCERTIDUMBRE DE LA MEDICIÓN, LÍMITE DE DETECCIÓN, INTERVALO DE MEDICIÓN, VERACIDAD DE LA MEDICIÓN, SENSIBILIDAD ANALÍTICA Y ESPECIFICIDAD ANALÍTICA).

5. SISTEMA DE MUESTRA PRIMARIA (POR EJEMPLO: SUERO, PLASMA, ORINA).

6. TIPO DE CONTENEDOR Y ADITIVOS. 7. EQUIPO Y REACTIVOS REQUERIDOS. 8. INTERFERENCIAS (POR EJEMPLO: LIPEMIA, HEMÓLISIS, BILIRRUBINEMIA)

Y REACCIONES CRUZADAS. 9. INTERVALOS BIOLÓGICOS DE REFERENCIA. 10. INTERPRETACIÓN POR EL LABORATORIO.

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11. CUESTIONARIO Tomado de: ISO-15189:2003 NMC-EC-15189-IMNC-2006.

PRACTICA No. 2

VOLUMETRÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA EN QUÍMICA CLÍNICA

I. COMPETENCIA.

Realiza diluciones 1:2 a partir de una solución estándar y, por medio de ellas

construye una curva tipo, identificando la clasificación de los diferentes métodos

espectrofotométricos.

II. INTRODUCCIÓN.

La base de la colorimetría y la espectrofotometría es que muchas sustancias

tienen color propio o pueden dar lugar a productos finales coloreados en ciertas

reacciones químicas. Hay una relación entre la intensidad de éste color y la

concentración de uno o varios de los reactivos o productos; de esta manera, la

intensidad del color puede utilizarse para medir la concentración de reactivos o

productos. Existen muchos instrumentos para la medición del color; pero antes de

hablar de su funcionamiento y manejo, es necesario conocer las leyes físicas sobre las

cuales se basan, así mismo es conveniente tener presente algunos conceptos

empleados en este tema.

LUZ: Es una variedad de energía radiante que forma parte del espectro

electromagnético la cual tiene una velocidad de aproximadamente 3 x 1010 cm/seg.

SOLUCIONES COLOREADAS: Algunas soluciones tienen color, por que absorben la

luz de cierta longitud de onda y dejan pasar las de otras longitudes de onda. Las

soluciones que no absorben la luz visible, viéndose incoloras, pueden absorber en el

infrarrojo o el ultravioleta.

LEY DE LAMBERT Y BEER: La ley de Beer relaciona la cantidad de luz absorbida con

la concentración del componente coloreado y dice lo siguiente: cuando en una solución

diluida se hace incidir un rayo de luz monocromática, la cantidad de luz absorbida es

directamente proporcional a la cantidad de molécula presentes en la solución; e

inversamente proporcional será la cantidad de la luz transmitida.

SOLUCIÓN: Es una mezcla homogénea de dos o más componentes, uno llamado

soluto y otro llamado disolvente, en la cual el primero se encuentra en menor proporción

con respecto al segundo.

SOLUCIÓN ESTÁNDAR O PATRÓN: Es aquella solución en la cual se le conoce

exactamente su concentración.

CONCENTRACIÓN: Es la cantidad de soluto por unidad de disolvente que contiene

una solución.

DILUCIÓN: Es el proceso de añadir disolvente a una solución para hacer menos densa

o concentrada.

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BLANCO DE REACTIVOS O BLANCO: Es aquella solución que se trabaja en la misma

forma que el problema y bajo las mismas condiciones, pero que en lugar de contener

muestra problema generalmente se le adiciona agua destilada o únicamente los

reactivos.

TESTIGO: Es una solución usada como calibrador en la que la concentración de

analito* ha sido establecida por métodos analíticos de confiabilidad conocida.

SERIE TIPO: Es un conjunto de soluciones estándar o patrón. Se puede preparar

haciendo diluciones a partir de un patrón primario.

CURVA DE CALIBRACIÓN: Es una sucesión de puntos en un papel milimétrico en

donde lo que se grafica es la relación que existe entre la concentración de una serie

tipo de un determinado analito y su respectiva absorbancia o transmitancia, y sirve para

poder conocer la concentración de un problema específico.

ANALITO: Es el componente del metabolismo en el momento de ser medido o

analizado.

CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS: I. POR LA CINÉTICA DE REACCIÓN (TIEMPO):

1. DE PUNTO FINAL.- Se lee la absorbancia al término de la reacción (formación de color).

2. CINÉTICOS.- Se mide la diferencia de absorbancias por minuto:

CONTINUOS.- Se leen los valores inmediatamente después de adicionarle el suero.

DISCONTINUOS.- Se leen los valores 5 ó 10 minutos después de adicionarle el suero, esto con la finalidad de que se incube la mezcla para que se lleve a cabo una inhibición inmunoquímica (Ag-Ac).

II. POR LA FOTOMETRÍA (COLOR): 1. VISIBLES.- Se leen utilizando una longitud de onda de 380 a 680 nm. 2. UVCERCANO.- Se leen utilizando una longitud de onda de 290 a 380 nm. 3. UV PURO.- Se leen utilizando una longitud de onda de 260 a 290 nm.

III. FUNDAMENTO:

La curva tipo o de calibración está basada en la Ley de Lambert-Beer-Bouger, la

cual dice que la absorbancia (A) = abc, donde a = absorción específica, b = longitud del

trayecto luminoso, y c = concentración del componente coloreado.

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS. MATERIAL DE VIDRIO:

6 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm.

4 frascos reactivos color ámbar de 250 mL.

1 vaso de precipitados de 250 mL.

2 pipetas serológica de 5.0 mL.

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2 Matraces aforados de 1000 mL.

5 celdillas o cubetas

UTENSILIOS:

Gradilla metálica

Franela

Papel parafilm

Marcador de tinta indeleble

Bulbo de hule

Espátula

Escobillón chico y grande

Tela suave o gasa.

APARATOS:

Espectrofotómetro

Balanza granataria

Balanza analítica

REACTIVOS:

Sulfato de cobre al 5%.

V. DESARROLLO:

1. Marcar 5 tubos de ensayo de 16 X 150 mm. del 1 al 5, enseguida:

2. Añadir al primer tubo 10.0 mL. de sulfato de cobre al 5% la cual se tomará como la

solución 1:1 con una concentración de 5 g/100 mL.

3. A partir de la solución anterior, realizar cuatro diluciones; para la dilución 1:2 tomar

5.0 mL. de solución 1:1 más 5.0 mL. de agua destilada, la cual tendrá una

concentración de 2.5 g/100 mL.

4. De la dilución 1:2 tomar 5.0 mL. y colocarlos en otro tubo, más 5.0 mL. de agua

destilada, obteniéndose una dilución 1:4 con una concentración de 1.25 g/100 mL.,

se hace lo mismo con esta dilución para obtener otra nueva de 1:8 con una

concentración de 0.625 g/100 mL. y finalmente otra de 1:16 con una concentración

de 0.312 g/100 mL. de sulfato de cobre.

5. Leer las absorbancias de cada tubo, así como la solución problema proporcionada

aparte y en otro tubo, a una longitud de onda de 700 nm, ajustado a cero con agua

destilada.

6. Realizar una curva de calibración con las lecturas obtenidas y concentraciones

correspondientes a cada una.

REPORTE DE LA PRÁCTICA:

A. Elaborar un cuadro de datos con las concentraciones de cada solución tipo y sus

respectivas lecturas obtenidas.

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B. Con los datos anteriores, construir la curva tipo en papel milimétrico con el cuadro

de datos, colocando la concentración de cada solución tipo en el eje de las

abscisas, y la absorbancia obtenida para cada una de ellas en el eje de las

ordenadas.

C. Interpolar en la curva tipo la absorbancia obtenida para la solución problema y

obtener la concentración de ésta.

D. Calcular la concentración del problema por medio del método analítico.

E. Establecer una comparación de los resultados obtenidos por ambos métodos.

VI. CUESTIONARIO:

1. Menciona si la gráfica obtenida cumple con la ley de Beer, y ¿por qué?

2. Anota las limitaciones de ésta ley.

3. Enuncia los conceptos de absorbancia y transmitancia.

4. Explica dos métodos para poder calcular la concentración de un determinado

analito en donde se utilicen la absorbancia o densidad óptica.

5. Esquematiza el proceso de lectura interno de un espectrofotómetro.

6. Explica dos métodos matemáticos para corregir las gráficas obtenidas.

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PRACTICA No. 3

CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSA SÉRICA

MÉTODO ENZIMÁTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE LA GLUCOSA-OXIDASA (GOD-POD) DE TRINDER

I. COMPETENCIA.

Determina cuantitativamente la concentración de glucosa en una muestra de

suero.

II. INTRODUCCIÓN.

La glucosa es el azúcar principal de la sangre que sirve a los tejidos como el

principal combustible metabólico. Es un compuesto orgánico conocido químicamente

como glúcido o azúcar, pues está constituido por los elementos C, H y O.

Químicamente es un derivado aldehídico de polialcohol cuya fórmula mínima o

condensada es C6H12O6. La glucosa es el carbohidrato o azúcar más importante de la

química médica ya que es la unidad constituyente del almidón, de la celulosa y el

glucógeno las cuales son los principales materiales de reserva energética.

Los monosacáridos, glucosa, y galactosa, productos finales de la digestión de

carbohidratos en el tubo digestivo, son absorbidos por la mucosa del duodeno y de la

primera parte del intestino delgado. Una vez absorbidos, los monosacáridos circulan en

el plasma en solución simple después de su absorción, la glucosa circulante es captada

principalmente por el hígado. Pero también por los músculos y otros tejidos, donde se

almacenan en forma de glucógeno mediante una serie de reacciones denominadas

glucogénesis, en las que se consume energía. También pueden ser transportados

hasta las células que necesitan energía en ese momento, penetrando en su interior;

aquí tras un proceso laborioso, conocido como glucólisis, que puede tener lugar en

condiciones aerobias o anaerobias, la célula consigue energía para sus procesos

metabólicos.

Cuando el organismo necesita glucosa, recurre al glucógeno, que actúa como

reserva y puede producir glucosa mediante un proceso conocido como glucogenolisis,

influido por dos hormonas; glucagon en el hígado, y adrenalina en el músculo. Así

mismo cuando la necesidad de glucosa es muy grande, bien porque no puede utilizarse

la glucosa existente en el torrente circulatorio, o bien porque no existen reservas, puede

formarse glucosa en la propia célula a partir de fuentes alternativas, como el lactato, los

aminoácidos, el glicerol, los ácidos grasos y los cuerpos cetónicos, mediante un

proceso conocido como neoglucogénesis o gluconeogénesis, que tiene lugar en las

células hepáticas, adiposas y musculares.

De esta forma es como se mantienen los niveles sanguíneos de glucosa que son

necesarios para las células.

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III. FUNDAMENTO.

La glucosa es oxidada por la enzima Glucosa Oxidasa (GOD) en solución acuosa

a ácido glucónico y peróxido de hidrogeno. El Peróxido de Hidrógeno formado

reacciona con fenol y 4-aminofenazona en presencia de la enzima Peroxidasa (POD)

dando un cromógeno de color rosa - rojizo de Quinonimina, cuya intensidad es

directamente proporcional a la cantidad de glucosa presente en la muestra.

GOD Glucosa + O2 + H2O Ac. Glucónico + H2 O2

POD H2 O2 + 4 aminofenazona + fenol Quinonimina + 2H20 (ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES) (CROMÓGENO ROSA-ROJIZO)

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS. MATERIAL DE VIDRIO:

5 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm.

1 Pipeta Pasteur con bulbo

1 Vaso de precipitados de 250 mL.

1 Termómetro de –10° C. a +110° C.

3 Celdillas, o fotoceldas

UTENSILIOS:

Gradilla metálica

Adaptador para vacutainer

Tubo para vacutainer sin anticoagulante

Agujas para vacutainer No. 21 (verde)

Torundas con alcohol

Ligadura o tubo látex

Franela

Aplicadores de madera

Papel parafilm



Bulbo de hule

EQUIPO:

Centrífuga eléctrica

Baño maría

Espectrofotómetro

Refrigerador

Pipetas semiautomáticas de 1000 y 10 µL.

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MATERIAL BIOLÓGICO:

Suero o plasma, obtenidos dentro de los 30 minutos después de haber extraído la

sangre.

REACTIVOS:

KIT PARA GLUCOSA, MÉTODO ENZIMATICO DE TRINDER marca SPINREACT.

No. 1 Reactivo de color - enzimas (Glucosa Oxidasa, Peroxidasa, 4 aminofenazona,

Fenolato de sodio, Buffer de fosfatos y Excipientes y estabilizadores de pH 7.0 +- 0.2)

No. 2 Solución patrón de glucosa (100 mg/dL 5.56 mmol/L). Los reactivos están listos

para usarse. Bien cerrados y conservados en refrigeración, entre + 2° C. y + 8° C. son

estables hasta la fecha de caducidad señalada en el envase. Una vez abierto son

estables durante 30 días, conservados a la temperatura anterior o 7 días a temperatura

ambiente (15 - 25°C) protegidos de la luz.

Precauciones: Para uso de diagnóstico in vitro. El reactivo contiene azida de sodio

como conservador la cual puede reaccionar con el cobre o plomo de las tuberías

formando azidas metálicas explosivas. Para desecharlo enjuague con mucho agua para

prevenir su formación.

NOTA: Para prevenir la contaminación del reactivo de glucosa coloque un volumen

ligeramente mayor al que va a utilizar en un contenedor separado y no regrese el

remanente al frasco original.

V. PROCEDIMIENTO. Técnica: Laboratorios SPINREACT.

1. Tomar 3 tubos de ensayo de 13 X 100 mm y marcarlos como: B (blanco), M

(muestra) y P (patrón). Enseguida pipetear:

REACTIVOS BLANCO MUESTRA PATRÓN

R. de trabajo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Suero ______ 10 µL ______

Patrón de 100 mg/dL ______ ______ 10 µL

2. Mezclar bien e incubar a 37° C. en baño maría durante 10 minutos o a temperatura

ambiente durante 30 minutos (15 - 25°C).

3. Leer las absorbancias de la muestra y el patrón a 505 nm. ó con filtro verde,

ajustando a cero con el blanco de reactivos. El color es estable durante 60 minutos.

NOTA: El volumen se puede incrementar si el aparato requiere volúmenes mayores que

1 mL.

CÁLCULOS:

Glucosa (mg/100mL) = Absorbancia de la muestra X [Patrón] Absorbancia del patrón

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Como la reacción colorida sigue la Ley de Lambert y Beer, puede ser usado el factor para calcular los resultados, de acuerdo a la siguiente fórmula:

FACTOR (F) = Concentración del Patrón Absorbancia del Patrón Glucosa (mg/100 mL) = Absorbancia de la Muestra X FACTOR (F)

Para obtener la concentración de glucosa en mmol/L se multiplica por el factor de

conversión, que es de 0.0555 ó 0.0556

CIFRAS DE REFERENCIA:

Suero o plasma: 60 a 110 mg/dL (3.33 - 6.10 mmol/L)

REPORTE DEL ALUMNO:

A) Datos obtenidos

B) Fórmulas

C) Cálculos

D) Resultados (con sus unidades correspondientes)

E) Discusión o análisis de resultados

F) Conclusiones

G) Cuestionario

H) Bibliografía

VI. CUESTIONARIO.

1. Menciona 5 síntomas que presenta una persona diabética.

2. Menciona el tiempo de estabilidad que tiene una muestra antes de separarla y

después de separarla, para realizar la prueba.

3. Explica el significado de una glucosa preprandial y una glucosa postprandial.

4. Menciona otros exámenes de laboratorio útiles en el diagnóstico de la diabetes.

5. Indica por qué la determinación de la glucosa en sangre se realiza en ayunas.

6. Que recomendaciones darías a un paciente con una glucosa por arriba de las

cifras de referencia.

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PRACTICA No. 4

CUANTIFICACIÓN DE UREA SÉRICA

MÉTODO QUÍMICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE O-FTALALDEHÍDO Y METODO UV CINÉTICO DE SAMPSON

I. COMPETENCIA.

Determina cuantitativamente la concentración de urea en una muestra de suero.

II. INTRODUCCIÓN.

SUSTANCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS.

Existen en el suero aproximadamente unas quince sustancias nitrogenadas no

proteicas (NNP) con importancia desde el punto de vista clínico, pero solo seis de ellas

se determinan rutinariamente en los laboratorios de química clínica. Esta fracción NNP

consta de nitrógeno no ureico, el cual constituye aproximadamente el 45% del total,

seguido, en orden de importancia cuantitativa, por los aminoácidos, el, ácido úrico, la

creatinina, la creatina y el amonio.

UREA.

La mayoría de las investigaciones iniciales destinadas a la cuantificación de la

urea fueron realizadas por autores interesados en el problema de blanco nitrogenado.

Esta es la razón por la que, especialmente en los países anglosajones, ha quedado la

costumbre de expresar los valores de urea como nitrógeno ureico en sangre (BUN).

Bioquímica: La urea, el principal producto final del metabolismo de las proteínas

en el hombre, se forma principalmente a partir de los grupos amino de los aminoácidos.

El hígado es probablemente el órgano más importante en la síntesis de la urea a través

del ciclo de la ornitina.

MÉTODOS:

Los métodos para la determinación de la urea pueden clasificarse en tres grupos:

1. Directos: condensación de la urea con diacetilo para formar un cromógeno

mensurable.

2. Indirectos: determinación del amonio resultante de la acción de la ureasa sobre

la urea.

3. Diversos: Entre ellos existen múltiples procedimientos que recurren a diversos

principios analíticos, fotométricos o físicos.

El método directo, que utiliza la diacetilmonoxima tiene una ventaja importante:

no mide el NH4. Fue Fearou el primero en demostrar que la urea y otros compuestos

que tenían una estructura R-NH-CO-NH-R (donde R es un H o bien un radical alifático

único, y R no es un radical acíclico) reacciona con la diacetilmonoxima en presencia de

un ácido fuerte y de un agente oxidante, produciendo un cromógeno. Ormsby aplicó la

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reacción anterior a la medición de urea en soluciones desproteinizadas obtenidas a

partir de sangre y orina.

Con el objetivo de intensificar el color y minimizar su fotosensibilidad se han

agregado al reactivo las siguientes sustancias: ácido fenilantranílico, tiosemicarbazona

o glucuronolactona.

Las técnicas indirectas recurren a la enzima ureasa para descomponer la urea según la

siguiente reacción:

UREASA H2N-CO-NH2 + H2O + 2H+

4 2NH4+ + CO2

Después de este proceso se cuantifica, bien el amonio o bien el CO2 liberados

del carbonato amónico.

III. FUNDAMENTO (LAB. LICON)

La urea es hidrolizada en presencia de agua y de la enzima Ureasa para producir

amoniaco y bióxido de carbono.

El amoniaco formado, se combina con el alfacetoglutarato (ά-KG) y con el Dinucleótido

de Adenina Nicotidamina reducido (NADH + H+), en presencia de la enzima Glutamato

Deshidrogenasa (GDLH), para producir L-Glutamato más NAD+.

El adenosín difosfato (ADP), se incluye como un activador y estabilizador del GLDH. La

reacción es evaluada, midiendo la disminución de la absorbancia a 340 nm, al

convertirse el NADH en NAD+.

UREASA

Urea + H2O 2NH4 + + 2HO3

–

GLDH

NH3 + ά-KG + NADH + H+ L-Glutamato + NAD+ + H2O

FUNDAMENTO (LAB. SPINREACT)

La urea presente el suero es hidrolizada por el ortoftalaldehído en medio ácido para

formar un complejo colorido de color amarillo, cuya intensidad es directamente

proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra.

H+ Urea + o-Ftalaldehído Isoindolina (CROMÓGENO DE COLOR

AMARILLO PAJA)

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS

MATERIAL:

3 Tubos de 13 x 100 mm.


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2 Frascos color ámbar de 250 mL.

1 Termómetro de –10° C a +110° C

3 Celdillas o fotoceldas


UTENSILIOS:

Franela

Gradilla metálica






Parafilm



Bulbo de hule

EQUIPO:

Baño María

Parrilla eléctrica


Espectrofotómetro.

Pipetas semiautomáticas de 1000 y 25 µL.

Refrigerador

Cronómetro

REACTIVOS (LAB. SPINREACT)

Reactivo de trabajo 1. O – Ftalaldehído

Reactivo de trabajo 2. Solución borato

Estándar de Urea de 50 mg/dL

REACTIVOS (LAB. LICON)

Reactivo de trabajo 1. Regulador de BUN

Reactivo de trabajo 2. Enzima BUN

Estándar de urea de 30 mg/dL

PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE USO: El reactivo de los laboratorios SPINREACT se encuentra listo para ser usado. Estable a

temperatura ambiente hasta la fecha de caducidad.

El reactivo de trabajo de los laboratorios LICON, se prepara agregando 5 partes del

reactivo 1 por una parte del reactivo 2 a temperatura ambiente.

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V. PROCEDIMIENTO: Técnica: Laboratorios LICON. 1. Marcar tres tubos de ensayo como: M (muestra) y P (patrón). Enseguida agregar

REACTIVOS MUESTRA PATRÖN

Reactivo de trabajo 1.0 mL. 1.0 mL.

Suero 10 μL

Patrón _____ 10 μL

2. Después de añadir la muestra (suero), mezclar y poner en marcha el cronómetro

para leer las absorbancias a los 30 (As 1) y 60 (As 2) segundos a 340 nm, ajustando

a cero con agua destilada, mientras se mantiene constante la temperatura a 37°C.

3. En caso de que la segunda lectura sea la misma que la primera, realizar una tercera

lectura.

CÁLCULOS (LAB. LICON). Urea (mg /dL.) = Δ Absorbancia/minuto de la muestra X [ Patrón ]

Δ Absorbancia/minuto del Patrón

Donde:

Δ Absorbancia/minuto = Absorbancia 2 Absorbancia 1

A1 = Absorbancia inicial

A2 = Absorbancia final

VALORES DE REFERENCIA:

Suero:

Urea: 17 a 49 mg. /dL. (2.8 - 8.0 mmol/L)

Nitrógeno Ureico (BUN): 8 - 23 mg/dL

Orina:

Urea: 1.5 -3.4 mg/dL (0.25-0.57 mmol/L)

Nitrógeno Ureico: 7 -16 g/24 h.

Factor de conversión de mg/dL de Urea a BUN mmol/L = 2.14

Factor de conversión de mmol de Urea a mg/dL de Urea = 0.167

PROCEDIMIENTO: Técnica: Laboratorios SPINREACT.

1. Marcar tres tubos de ensayo como: B (blanco), M (muestra) y P (patrón). Enseguida

agregar:

18

REACTIVOS BLANCO MUESTRA PATRÖN

Reactivo de trabajo 1 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Suero _____ 25 μL _____

Patrón de 50 mg/dL _____ _____ 25 μL

Mezclar e incubar 1 minuto a 37°C y en seguida agregar:

Reactivo de trabajo 2 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

2. Mezclar e incubar 15 minutos en baño maría a 37°C.

3. Leer a 510 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos.

CÁLCULOS: Urea (mg/100 mL) = Absorbancia de la muestra X [Patrón] Absorbancia del patrón


Suero: 15 a 45 mg/dL (249 a 7.49 mmol/L)

Orina: 20 a 35 g/24 horas

INFORME DEL ALUMNO:

A) Anotación de datos

B) Fórmulas

C) Cálculos

D) Resultados (con sus unidades correspondientes)

E) Análisis o discusión de resultados

F) Conclusiones

G) Cuestionario

H) Bibliografía

VI. CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es la urea?

2. ¿Cuál es la función de la urea en el organismo?

3. Describa la síntesis de la urea en el organismo.

4. Enliste las anormalidades que pueden presentarse en el organismo que ocasionan

aumento o disminución de la urea.

5. Menciona otras pruebas de laboratorio que se realizan para el diagnóstico de

padecimientos renales.

19

PRACTICA No 5

CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO SÉRICO

MÉTODO ENZIMÁTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE TRINDER MODIFICADO POR

TRIVEDI Y KABASAKALIAN I. COMPETENCIA:

Determina cuantitativamente la concentración de ácido úrico en una muestra de

suero.

II. INTRODUCCIÓN.

DEGRADACIÓN DE LAS PURINAS.

En los animales superiores los nucleótidos resultantes de la degradación de las

nucleoproteínas, experimentan generalmente su hidrólisis enzimática hasta rendir

finalmente las bases púricas y pirimídicas libres. Si no son recuperadas y reutilizadas,

las bases libres son ulteriormente degradadas y sus productos finales excretados. En

algunos vertebrados, incluidos los primates, el perro dálmata, las aves y algunos

reptiles, el producto final de la degradación de las purinas es el ácido úrico.

La degradación de las purinas a ácido úrico, producto metabólico final en el

hombre, ha sido objeto de intensos estudios. Las purinas principales, adenina y

guanina, se convierten primero en xantina, la cual es entonces oxidada a ácido úrico

por la compleja flavoproteína xantina oxidasa:

XANTINA Xantina + H2O + O2 ÁCIDO ÚRICO + O2

OXIDASA

El ácido úrico se encuentra en la sangre, principalmente en forma de urato

monosódico; tanto el ácido libre como sus sales (los uratos) son relativamente

insolubles en agua, lo cual provoca en algunos individuos que el ácido úrico se precipite

y cristalice en la orina formando cálculos renales y lesionando al riñón. En los tejidos

cartilaginosos pueden formarse también depósitos de ácido úrico provocando la

enfermedad denominada gota, la cual se produce al parecer, por una superproducción

de ácido úrico. Esta enfermedad puede aliviarse por tratamiento con el fármaco llamado

Alopurinol, que es un análogo de la hipoxantina. El alopurinol inhibe a la xantina-

oxidasa y así disminuir la formación de ácido úrico.

METODOLOGÍA: ÁCIDO ÚRICO

Las investigaciones efectuadas sobre la metodología de la determinación de

ácido úrico se han encaminado fundamentalmente a mejorar la especificación de las

técnicas. En principio hay tres tipos de procedimientos para la separación preliminar de

20

del ácido úrico de otras sustancias capaces de interferir en su determinación, presentes

en el suero:

1. Separación en forma de sal de plata, de magnesio, de amonio, cuprosa o

cúprica.

2. Separación mediante técnicas de intercambio iónico y

3. Precipitación de las proteínas y análisis de los filtrados.

Resultan, sin duda, más convenientes los métodos en los que únicamente es

necesario eliminar las proteínas antes de pasar al desarrollo de la reacción coloreada.

Los precipitantes proteicos más adecuados para estos fines, son el ácido túngstico, el

ácido tricloroacético o el ácido fosfotúngstico,. Una vez que se han separado las

proteínas, por uno u otro procedimiento, se analiza la concentración de ácido úrico en el

filtrado mediante alguno de los métodos publicados a base de fosfotungstato.

La mayoría de los procedimientos fotométricos se basan en la reducción del

fosfotungstato, que se lleva a cabo con el ácido úrico en medio alcalino, dando lugar a

la formación de un cromógeno azul, llamado azul de tungsteno.

Hace ya tiempo que se recurre a la URICASA para aumentar la especificidad del

método, aprovechando que esta enzima oxida el ácido úrico a alantoína, la cual a

diferencia del ácido úrico no absorbe la luz en la zona 290-293nm.

III. FUNDAMENTO (LABORATORIOS SPINREACT)

El Ácido Úrico presente en el suero es oxidado en presencia de la enzima

URICASA para formar alantoina y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno

formado reacciona con la 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS)

en presencia de la enzima PEROXIDASA (POD) para formar un cromógeno de

Quinoneimina de color rosa-rojizo, cuya intensidad es directamente proporcional a la

concentración de ácido úrico presente en la muestra.

URICASA

Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoina + CO2 + 2H2O2

POD

2H2O2 + 4 – AF + DCPS Quinoneimina + 4H2O (ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES) (CROMÓGENO ROSA-ROJIZO)

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUÍPO Y REACTIVOS.

MATERIAL DE VIDRIO:

5 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm.

1Pipeta Pasteur con bulbo

1Vasos de precipitados de 250 mL.


21

1 Frasco reactivo color ámbar de 250 mL.

1 termómetro de + 110° C. a-10° C.

UTENSILIOS:

Gradilla metálica





Franela


Papel parafilm

Marcador de tinta Indeleble

Bulbo de hule


EQUIPO:


Espectrofotómetro

Refrigerador

Pipetas semiautomáticas de 1000, 20 y 25 µL.

MATERIAL BIOLOGICO:

Suero, orina, líquido amniótico o líquido sinovial.

El ácido úrico sérico es estable durante tres días a temperatura de 4° C. y seis meses

cuando el suero se congela. No usar plasma para la determinación porque se pueden

obtener resultados falsamente disminuidos.

REACTIVOS.

Reactivo 1. (Tampón).

Reactivo 2 (Enzimas)

Estándar primario de ácido Úrico de 6.0 mg/dL (0.36 mmol/L)

El reactivo de trabajo se prepara disolviendo el contenido de un vial de R2

(enzimas) en un frasco de R1 (tampón). Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su

contenido y es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Un mes en

refrigeración (2-8°C) o 10 días a temperatura ambiente.

NOTA: No ingerir, evitar el contacto con la piel y ojos, si esto sucede lavar con

abundante agua. El reactivo contiene azida de sodio (0.05%) el cual puede reaccionar

con el cobre o plomo de la tubería, agregar abundante agua al desechar.

22

V. PROCEDIMIENTO. Técnica: Laboratorios SPINREACT. 1. El reactivo de trabajo y las muestras deberán estar a temperatura ambiente al

momento de realizar la prueba.

2. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrón).

Enseguida agregar:

REACTIVO BLANCO MUESTRA PATRÓN

Reactivo de trabajo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Suero ______ 25 μL ______

Patrón de 6 mg/dL ______ 25 μL

3. Mezclar e incubar en baño maría a 37°C durante 5 minutos o 10 minutos a

temperatura ambiente (15 – 25°C).

4. Leer las absorbancias a 520 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos.

CÁLCULOS: Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbancia de la muestra X [ Patrón ] Absorbancia del patrón Como el sistema colorimétrico sigue estrictamente la Ley de Beer, también puede

usarse al método del factor para el cálculo de los resultados:

6.0 FACTOR DE CALIBRACIÓN (F) = Absorbancia del patrón Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbancia de la Muestra X FACTOR (F)

El color desarrollado es estable durante 30 minutos.


Suero:

Hombres: 3.6 – 7.7 mg/dL (0.21 – 0.44 mmol/L) o (214 a 458 µmol/L)

Mujeres: 2.5 – 6.8 mg/dL (0.15 – 0.40 mmol/L) o (149 a 405 µmol/L)

Niños: 2.0 – 5.5 mg/dL (0.12 – 0.33 mmol/L) o (200 a 550 µmol/L)

Orina:

Adultos: 250 a 750mg/dL /24 horas (14.9 – 44.6 mmol/L/24 horas)

Factor de conversión de mg/dL a µmol/L = 59.5

PROCEDIMIENTO:

Técnica: Laboratorios LICON.

1. El reactivo de trabajo y las muestras deberán estar a temperatura ambiente al


23


Enseguida agregar:



Suero ______ 20 μL ______

Patrón de 8 mg/dL ______ _____ 20 μL


temperatura ambiente (15 – 25°C).

4. Leer las absorbancias antes de 15 minutos a 520 nm ajustando a cero con el blanco

de reactivos.

5. El volumen puede ser incrementado si el instrumento requiere volúmenes mayores a

1 mL. (2 mL de reactivo de trabajo por 0.05 mL de muestra o patrón).

CÁLCULOS: Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbancia de la muestra X [ Patrón ] Absorbancia del patrón


Suero:

Hombres: 3.4 – 7.0 mg/dL (0.19 – 0.40 mmol/L)

Mujeres: 2.4 – 5.7 mg/dL (0.14 – 0.33 mmol/L)

Orina: 0.5 a 1.0 g/24 horas (va a depender del contenido de purinas en la dieta).

INFORME DEL ALUMNO:

A. Datos

B. Fórmulas

C. Cálculos

D. Resultados (con sus unidades correspondientes)

E. Análisis o discusión de resultados

F. Conclusiones

G. Cuestionario

H. Bibliografía

VI. CUESTIONARIO:

1. ¿Cómo se le llama a la elevación de ácido úrico en sangre?

2. Mencione tres factores que influyen en la concentración del ácido úrico en el

organismo.

3. Cita algunos casos en los cuales se ven alterados los valores normales de ácido

úrico en sangre.

4. ¿En qué consiste la enfermedad denominada gota?

24

PRACTICA No. 7

CUANTIFICACIÓN DE CREATININA SÉRICA

MÉTODO VISIBLE CINÉTICO DE PUNTO FINAL DE BONSNES Y TAUSSKY

(REACCIÓN DE JAFFÉ) I. COMPETENCIA.

Determina cuantitativamente la concentración de creatinina en una muestra de

suero.

II. INTRODUCCIÓN.

La Creatinina es el producto final del catabolismo de la creatina y se puede

definir como el anhídrido de la creatina, ya que se forma cuando la creatina pierde una

molécula de agua.

La creatina es una sustancia nitrogenada que se encuentra casi exclusivamente

en el músculo (98%), también en encéfalo y sangre, y sólo trazas de ella en orina.

Desempeña un papel esencial en la contracción muscular, y se excreta bajo la forma de

su anhídrido, la creatinina. La fosfocreatina existe en grandes concentraciones

especialmente en el músculo, donde es una forma importante de depósito de fosfato de

alta energía y se puede almacenar en cartílago.

En los hombres adultos, la orina sólo presenta creatinina; pero en las mujeres

adultas, embarazadas o en el puerperio y en los niños de ambos sexos, se encuentra

normalmente cierta cantidad de creatina en la orina. La creatina sólo aparece en la

orina del hombre adulto en las enfermedades que se acompañan de destrucción

muscular.

La formación de creatinina puede presentar un paso previo necesario para la

excreción de creatina; puesto que la creatina no es reabsorbida por los túbulos renales

después de haber sido filtrada.

III. FUNDAMENTO.

La creatinina presente en el plasma reacciona con el picrato alcalino (formado

por ácido pícrico e hidróxido de sodio) a temperatura ambiente, formando un complejo

de color amarillo-rojizo (reacción de Jaffé) de Picrato de creatinina, la intensidad del

color es directamente proporcional a la cantidad de creatinina presente en la muestra.

Creatinina sérica + Picrato alcalino Picrato de creatinina (Ácido pícrico + NaOH) (CROMÓGENO AMARILLO–ROJIZO)

25

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS.

MATERIAL:

3 Tubos de hemólisis de 13 x 100 mm.



3 Celdillas o fotoceldas.

2 Frascos reactivos color ámbar de 250 mL.

1 termómetro de + 110° C. a – 10° C.

UTENSILIOS:

Gradilla metálica.



Agujas para vacutainer

Torundas con alcohol.

Ligadura o tubo látex.

Franela.

Aplicadores de madera.

Papel parafilm.

Bulbo de hule.

Marcador de tinta indeleble.

APARATOS:

Centrífuga eléctrica.

Baño María eléctrico.

Espectrofotómetro o fotómetro de filtros.

Refrigerador

Pipetas semiautomáticas de 1000, 100 y 50 μL

REACTIVOS:

Reactivo de trabajo 1: Ácido pícrico

Reactivo de trabajo 2: Hidróxido de sodio

Estándar de Creatinina de 2 mg/dL.

El reactivo de trabajo para creatinina se prepara mezclando una parte del ácido pícrico

y una parte de hidróxido de sodio.

PELIGRO: El ácido pícrico es explosivo cuando esta seco. El reactivo contiene álcali

fuerte. Evitar la ingestión y contacto con la piel, boca y ojos. No pipetear con la boca. La

toxicidad del reactivo no ha sido determinada. Si se derrama, lavar las partes afectadas

con abundante agua. El ácido pícrico puede causar reacciones alérgicas.

Los reactivos se encuentran listos para usarse y son estables hasta la fecha de

caducidad impresa en la etiqueta cuando se almacena de 2 a 8°C.

26

V. DESARROLLO.

Técnica: Laboratorios SPINREACT. 1. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrón).

Enseguida agregar



Suero ______ 100 μL ______

Patrón de 2 mg/dL ______ _____ 100 μL

2. Después de añadir la muestra (suero), mezclar y poner en marcha el cronómetro.

3. Leer al minuto la absorbancia uno (As 1) y a los 2 minutos la absorbancia dos (As 2)

después de haber mezclado los tubos, a 492 nm, ajustando a cero con el blanco de

reactivos mientras se mantiene constante la temperatura a 37°C.

4. En caso de que la segunda lectura sea la misma que la primera, realizar una tercera

lectura.

CÁLCULOS: Creatinina (mg/dL) = (As 2 - As 1) Muestra X [ Patrón ] (As 2 - As 1) Patrón

Para obtener: Creatinina (mg/dL) = ΔAs Muestra X [ Patrón ] ΔAs Patrón Factor de conversión de mg/dL a mmol/L = 88.4

Los volúmenes de reactivo y de muestra pueden ser alterados proporcionalmente

para adaptarse a los diferentes requerimientos del espectrofotómetro.

Las muestras de creatinina con valores mayores a 1.8 mmol/L deben ser diluidas

con solución salina isotónica y reensayadas, multiplicando los resultados por el factor

de dilución.


Suero:

Mujeres: 0.6 - 1.2 mg/dL (0.050 - 0.105 mmol/L)

Hombres: 0.7 - 1.4 mg/dL (0.060 - 0.120 mmol/L)

Orina: 15 a 25 mg/Kg/24h.

Mujeres: de 8 a 18 mg/Kg/24h (71 a 177 µmol/Kg/24h)

Hombres: de 10 a 20 mg/Kg/24h (88 a 177 µmol/Kg/24h)

Se recomienda que cada laboratorio verifique el rango normal en su propio laboratorio.

27

INFORME DEL ALUMNO:

A. Datos

B. Fórmulas

C. Cálculos


E. Análisis o discusión de resultados

F. Conclusiones

G. Cuestionario

H. Bibliografía

VI. CUESTIONARIO.

1. Mencione tres enfermedades en las cuales haya aumento en los niveles de

creatinina en suero.

2. Explique la importancia del compuesto fosfocreatina en el organismo humano.

3. Mencione 3 enfermedades en la cual la creatinina está aumentada en la sangre por

arriba de los valores normales.

4. Escriba el significado de los siguientes términos:

Creatininemia

Creatininuria

Hipercreatinemia

5. Mencione otros métodos de laboratorio útiles para el diagnóstico de la función renal.

6. Explique en que consiste la técnica de Depuración de Creatinina y su importancia

en el diagnóstico Clínico.

28

PRACTICA No 8

CUANTIFICACIÓN DE COLESTEROL SÉRICO

MÉTODO ENZIMÁTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE ALLAIN Y COLS. MODIFICADO POR ROESCHLAU (TRINDER CHOD-POD).

I. COMPETENCIA:

Determina cuantitativamente la concentración de colesterol en una muestra de

suero.

II. INTRODUCCIÓN:

El colesterol es un alcohol esteroide (derivado del hidrocarburo tetracíclico

saturado llamado perihidrociclopentanofenantreno) que contiene un radical hidroxilo en

el carbono 3 del anillo A y una cadena ramificada de 8 átomos de carbono en el

carbono 17, lo cual le da la característica de lípido, como ser insoluble en agua, pero

soluble en compuestos orgánicos como éter, cloroformo, benceno y alcohol caliente.

Cualquier célula del organismo, prácticamente, puede producir colesterol a partir

de compuestos simples de dos carbonos (acetato). El hígado, corteza suprarrenal,

ovarios y testículos, así como el epitelio intestinal, son focos especialmente activos en

la síntesis de colesterol. La corteza suprarrenal los ovarios y los testículos utilizan el

colesterol y sus ésteres para producir hormonas esteroideas. Además de sintetizar

colesterol, el hígado también lo esterifica, transformando parte de él en ácido cólico, el

cual se excreta con la bilis

Clínicamente es importante, ya que existe una relación entre la concentración del

colesterol sérico y la presencia de problemas cardiacos coronarios.

III. FUNDAMENTO (LABORATORIOS HYCEL).

Los esteres de colesterol presentes en el suero son hidrolizados

enzimáticamente en presencia de la enzima COLESTEROL ESTERASA (CE), para

formar Colesterol y Ácidos Grasos libres.

El colesterol libre formado, incluyendo aquel que se encuentra originalmente, es

oxidado en presencia de la enzima COLESTEROL OXIDASA (CO) para formar Colest-

4-en-3-ona y Peróxido de hidrógeno.

El Peróxido de hidrógeno formado reacciona con el Ácido Hidroxibenzoico (HBA)

y la 4-aminoantipirina en presencia de la enzima PEROXIDASA (POD) para formar un

cromógeno de color rosa-rojizo de Quinoneimina cuya intensidad del color va a ser

directamente proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra.

Esteres de colesterol + H2O CE Colesterol + Ácidos grasos

Colesterol libre + O2 CO Colest-4-en-3-ona + H2O2

29

2H2O2 + HBA + 4-aminoantipirina POD Quinoneimina + 4H2O (ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES) (CROMÓGENO ROSA–ROJIZO)

DONDE:

HBA = ÁCIDO HIDROXIBENZOICO

FUNDAMENTO: Laboratorios SPINREACT.

Esteres de colesterol + H2O CHE Colesterol + Ácidos grasos

Colesterol libre + O2 CHOD 4 – Colestenona + H2O2

2H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona POD Quinonimina + 4H2O (ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES) (CROMÓGENO ROSA–ROJIZO)

El colesterol esterificado presente en la muestra va a ser hidrolizado en presencia de la

enzima COLESTEROL ESTERASA para formar Colesterol y ácidos grasos. El

colesterol libre formado, es oxidado por la enzima COLESTEROL OXIDASA para

formar 4-colestenona y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno formado

reacciona con el fenol y la 4-aminifenazona en presencia de la enzima PEROXIDASA

para formar quinonimina, cromógeno de color rosa-rojizo, cuya intensidad de color es

directamente proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS.

MATERIAL DE VIDRIO

3 Tubos de hemólisis de 13 x 100 mm


1 Vaso de precipitado de 250 mL.


1 Frascos reactivos color ámbar de 250 mL

UTENSILIOS:

Gradilla metálica


Tubos vacutainer sin anticoagulante



Franela


Papel parafilm


Perilla o bulbo de hule

30


Detergente iónico de pH neutro marca Extran

APARATOS:

Baño maría eléctrico


Espectrofotómetro

Refrigerador

Pipetas semiautomáticas de 1000 y 10 μL

MATERIAL BOIOLÓGICO;

Suero o plasma.

REACTIVOS: LABORATORIOS HYCEL

Reactivo de colesterol

Patrón de colesterol de 300 mg/dL (7.76 mmol/L).

El reactivo se encuentra listo para usarse y es estable hasta la fecha de caducidad

impresa en la etiqueta cuando se almacena de 2 a 8°C.

REACTIVOS: LABORATORIOS SPINREACT

Reactivo de trabajo: Disolver suavemente el contenido de un vial de R2 de enzimas

en un frasco de R1 Tampón.

La estabilidad del reactivo es de 4 meses en refrigeración de 2 a 8ºC ó 40 días de 15 a

25ºC. Mantener protegido de la luz.

Patrón primario de colesterol de 200 mg/dL (5.2 mmol/L)

NOTA: No ingerir, evitar el contacto con la piel y ojos, si esto sucede, lavar con

abundante agua la zona afectada.

V. PROCEDIMIENTO:

1. El reactivo de trabajo y las muestras deberán estar a temperatura ambiente al



Enseguida agregar


Reactivo de Colesterol 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Agua destilada 10 μL ______ ______

Patrón ______ ______ 10 μL

Suero ______ 10 μL ______


temperatura ambiente.


31

Esta determinación se puede llevar a cabo a 30°C aumentando el tiempo de incubación

a 10 minutos ó a 25°C incubando por 15 minutos, en baño maría.

CÁLCULOS:

Colesterol Total (mg/dL) = Absorbancia de la muestra X [ Patrón ] Absorbancia del patrón La reacción sigue la Ley de Beer y Lambert por lo que se puede usar el método del

factor de calibración para el cálculo de los resultados.

FACTOR DE CALIBRACIÓN (F) = 300 Absorbancia del patrón Colesterol Total (mg/dL.) = Absorbancia de la muestra X FACTOR (F)


Colesterol Total: hasta 200 mg/dL (menor de 5.2 mmol/L

REPORTE DEL ALUMNO:

A. Datos obtenidos.

B. Fórmulas.

C. Cálculos.


E. Discusión ó análisis de resultados.

F. Conclusiones.

G. Cuestionario.

H. Bibliografía

CUESTIONARIO:

1. Explicar brevemente la biosíntesis del colesterol.

2. Mencione en una persona normal los niveles de colesterol libre esterificado.

3. Qué ácidos se encuentran presentes en el colesterol esterificado.

4. Mencione 3 focos activos en la síntesis de colesterol.

5. Mencione 2 enfermedades en la cual hay aumento de colesterol en la sangre.

6. Defina que es la arterioesclerosis

32

PRACTICA No. 9

CUANTIFICACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS SÉRICOS

MÉTODO ENZIMÁTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL TRINDER, DE WAKO,

MODIFICADO POR McGOWAN Y FOSSATI

I. COMPETENCIA:

Cuantifica la concentración de triglicéridos en una muestra de suero. II. INTRODUCCIÓN:

Los triglicéridos se producen en el hígado a partir del glicerol y los ácidos grasos,

y de los triésteres de estos dos componentes. Los triglicéridos son lípidos que existen

normalmente en la sangre y se emplean para producir la energía para el organismo.

El exceso de triglicéridos se almacena en el tejido adiposo. Esta prueba se usa

para evaluar a los pacientes que se sospecha tienen aterosclerosis y como una

indicación de la capacidad del organismo para metabolizar las grasas.

Los triglicéridos aumentados, junto con el colesterol elevado, son factores de

riesgo en la enfermedad aterosclerótica. Puesto que el colesterol y los triglicéridos

pueden variar independientemente, la medición de ambos índices es más significativa

que la de cualquiera de ellos solo.

III. FUNDAMENTO:

Los triglicéridos presentes en el suero son hidrolizados en presencia de la

enzima LIPOPROTEINLIPASA (LPL) para formar como productos, glicerol y ácidos

grasos. El glicerol que no se hidrolizó es fosforilado por el Adenosin-trifosfato (ATP), en

presencia de la enzima GLICEROL KINASA (GK) para formar Glicerol-3-fosfato (G3P) y

Adenosin-Difosfato (ADP). El Glicerol-3-fosfato es oxidado en presencia de la enzima

GLICEROL FOSFATO OXIDASA (GPO) para formar Dihidroxiacetona Fosfato (DAP) y

Peróxido de Hidrógeno (H2O2). El peróxido de Hidrógeno formado reacciona con la 4-

aminofenazona (4-AF) y el p-clorofenol en presencia de la enzima PEROXIDASA

(POD) formando como producto final Quinonimina (complejo de color rosa-rojizo) y

agua. La intensidad de este color es directamente proporcional a la cantidad de

triglicéridos presentes en la muestra.

LIPO PROTEIN

Triglicéridos + H2O Glicerol + Ácidos grasos LIPASA

GLICEROL KINASA

Glicerol + ATP Glicerol-3-Fosfato + ADP

GLICEROL FOSFATO

Glicerol-3-Fosfato + O2 Dihidroxi acetona fosfato + H2O2 OXIDASA

33

PEROXIDASA

H2O2 + 4-AF + p-Clorofenol Quinonimina + H2O (ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES) (CROMÓGENO ROSA–ROJIZO)

NOTA: En el método de los laboratorios HYCEL, solo cambia el aceptor final de

electrones (4-AAP + 3,5-DHBS) y el producto final es Quinoneimina.

IV. MATERIAL UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS:

MATERIAL DE VIDRIO:

5 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm


2 Vasos de precipitado de 500 y 250 mL.

1 Termómetro de -10ºC a +110ºC


UTENSILIOS:

Gradilla

Equipo vacutainer

Torundas


Franela


Papel parafilm

Papel absorbente

Escobillón chico

EQUIPO:

Espectrofotómetro


Baño María

Refrigerador

Pipetas semiautomáticas de 1000 y 10 μL y sus puntillas correspondientes


Suero, plasma u orina

REACTIVOS:

Reactivo de trabajo 1. Amortiguador.

Reactivo de trabajo 2 Enzimas.

Patrón de triglicéridos de 200 mg/dL

El reactivo de trabajo se prepara disolviendo el contenido de un vial de R2 en un frasco

de R1.

34

En caso de tener como referencia el No. 1001310. Reconstituir el Reactivo de trabajo,

disolviendo el contenido de un vial de R2 en 10 mL de R1. Mezclar suavemente hasta

disolver su contenido. Estable hasta 6 semanas a 2 a 8ºC o una semana a 15 a 25ºC.

V. PROCEDIMIENTO:

TÉCNICA: Laboratorios SPINREACT

1. Marcar tres tubos de ensayo con las letras y B (Blanco), M (Muestra) y P (Patrón). Se

recomienda utilizar material de vidrio rigurosamente limpio para evitar errores.

2. Adicionar:

BLANCO MUESTRA PATRÓN


Suero _______ 10 µL _______

Patrón de 200 mg/dL _______ _______ 10 µL

3. Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C en baño maría o 10 minutos a temperatura

ambiente.

4. Leer a 505 nm, ajustando a cero de absorbancia con el blanco de reactivos.

CALCULOS:

As de la muestra Triglicéridos (mg/100 mL.) = ------------------------- x [Patrón]

As del Patrón

FACTOR DE CONVERSIÓN DE mg/dL a mmol/L = 0.0113


Hombres: 40 a 160 mg/dL (0.45 a 1.81 mmol/L)

Mujeres: 35 a 165 mg/dL (0.40 a 1.86 mmol/L)

VI. CUESTIONARIO:

1. Menciona las enzimas que intervienen, en orden de actividad, en la reacción que

se produce para la cuantificación de triglicéridos.

2. ¿Cuál es la función de los triglicéridos en el organismo humano?.

3. Menciona 2 alteraciones que producen un aumento de triglicéridos en sangre.

4. Menciona otros métodos de laboratorio para la cuantificación de triglicéridos.

5. ¿Quién transporta a los triglicéridos a través de la sangre?

6. Esquematiza cómo esta formado un triglicérido.

35

PRACTICA No. 10

CUANTIFICACIÓN DE HIERRO SÉRICO

MÉTODO QUÍMICO VISIBLE DE PUNTO FINAL

I. COMPETENCIA:

Cuantifica la concentración de hierro sérico en una muestra de suero. II. INTRODUCCIÓN:

El hierro sérico se distribuye en el organismo de diferentes maneras, incluyendo

hemoglobina, hierro tisular y mioglobina. El transporte de hierro de un órgano a otro se

realiza mediante una proteína transportadora llamada apotransferrina. El complejo que

forma con el hierro se conoce como transferrina.

La ferritina, localizada en casi todas las células del cuerpo, constituye una

reserva de hierro disponible para la formación de la hemoglobina y otras proteínas que

contienen el grupo hemo. La absorción de hierro ocurre principalmente en el duodeno.

Tanto la ferritina como la transferrina están presentes en las células de la mucosa

intestinal y juntas regulan la absorción de hierro.

Los mayores desórdenes del metabolismo de hierro se relacionan con su

deficiencia o exceso, sin embargo, se han observado alteraciones en muchas otras

enfermedades, incluyendo anemia, enfermedades cardiovasculares, hepatitis crónica,

enfermedades renales e infecciones.

La anemia por pérdida de hierro representa uno de los trastornos orgánicos más

frecuentes, especialmente en niños, mujeres jóvenes, embarazadas y ancianos.

También las úlceras gástricas o duodenales y carcinomas de estómago, constituyen

causas de anemia ferropénica.

Por el contrario, el exceso de hierro se asocia con otros desórdenes, como

hemosiderosis, hemocromatosis y anemia sideroblástica.

III. FUNDAMENTO:

El hierro sérico se libera de su unión con su proteína transportadora específica,

la transferrina, en buffer succinato de pH 3.7 y en presencia de un reductor, el ácido

mercaptoacético. Posteriormente reacciona con el reactivo de color, piridil bis-fenil

triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta, que se mide a 560 nm.

pH = 3.7 Hierro-transferrina + Ácido mercaptoacético Hierro + Transferrina

Hierro + Piridil bis-fenil triazina sulfonato Complejo de color magenta (REACTIVO DE COLOR) (CROMÓGENO)

36

IV. MATERIAL UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS:

MATERIAL DE VIDRIO:

5 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm


2 Vasos de precipitado de 500 y 250 mL.

1 Termómetro de -10ºC a +110ºC


UTENSILIOS:

Gradilla

Equipo vacutainer

Torundas


Franela


Papel parafilm

Papel absorbente

Escobillón chico

EQUIPO:

Espectrofotómetro


Baño María

Refrigerador

Pipetas semiautomáticas de 1000 y 10 μL y sus puntillas correspondientes


Suero.

REACTIVOS:

Reactivo PBTS: solución estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/L.

S. Estándar: solución de iones Fe (III) equivalente a 100 μg/dL.

Buffer succinato: solución de succinato 0.25 moles/L. para pH 3.7.

Reductor: ampolla autorrompible conteniendo ácido mercaptoacético al 70%.

INSTRUCCIONES PARA SU USO:

Reactivo PBTS y Standar: listos para usar.

Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato,

vertiéndolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversión. Anotar en el

rótulo la fecha de preparación.

37

V. PROCEDIMIENTO:

TÉCNICA: Laboratorios SPINREACT

1. Marcar tres tubos de ensayo con las letras y B (Blanco de Reactivos), D

(Desconocido) y S (Standard). Se recomienda utilizar material de vidrio

rigurosamente limpio para evitar errores.

2. Adicionar:

B D S

Agua bidestilada 500 µL. _______ _______

Standard (100 µg/dL) ______ _______ 500 µL.

Suero _______ 500 µL. ______

Buffer/Reductor 2 mL. 2 mL. 2 mL.

3. Mezclar.

4. Leer a 560 nm, ajustando a cero de absorbancia con el blanco de reactivos.

5. Agregar, manteniendo el frasco gotero en posición vertical, 1 gota de Reactivo PBTS

a cada tubo.

Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a a 560 nm entre 6 y 20

minutos, llevando el aparato a cero con agua.

CALCULOS:

Corregir las lecturas de S y D, restándoles los Blancos correspondientes: S – B = S corregida D – (B + BS) = D corregida Fe (µg/dL.) = D corregida x f 100 µg/dL. Donde: f = ------------------ S corregida VALORES DE REFERENCIA:

Hombres: 65 a 175 µg/dL (11.6 a 31.3 µmol/L)

Mujeres: 50 a 170 µg/dL (9 a 30.4 µmol/L)

VI. CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es la función del hierro en el organismo humano?.

2. Menciona 2 alteraciones que producen un aumento del hierro sérico en sangre.

3. Menciona otros métodos de laboratorio para la cuantificación de hierro sérico.

4. ¿Quién transporta al hierro a través de la sangre?

38

PRACTICA No. 11

CUANTIFICACIÓN DE BILIRRUBINAS SÉRICAS

MÉTODO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE JENDRASSICK I. COMPETENCIA:

Cuantifica la concentración de bilirrubinas en una muestra de suero.

II. INTRODUCCIÓN:

La bilirrubina resulta de la rotura de la hemoglobina de los eritrocitos, es un

subproducto de la hemólisis (destrucción de hematíes). Es producida por el sistema

reticuloendotelial. Es eliminada del organismo: por el hígado la cual la excreta hacia la

bilis y da a esta su principal pigmentación.

En el suero generalmente se encuentra una pequeña cantidad de bilirrubina. Se

presentará un aumento en las concentraciones séricas si hay destrucción excesiva de

eritrocitos o cuando el hígado es incapaz de excretar las cantidades normales de

bilirrubina producida.

Existen dos formas de encontrar la bilirrubina en el organismo: 1) bilirrubina

indirecta o no conjugada (relacionada con las proteínas), y 2) bilirrubina directa o

conjugada que circula libremente en la sangre hasta que llega al hígado, donde se

conjuga con la glucuronil transferasa y entonces es excretada hacia la bilis. Un aumento

en la unión de bilirrubina o proteínas (bilirrubina no conjugada) guarda relación más

frecuentemente con destrucción aumentada de eritrocitos (hemólisis); un incremento de

la bilirrubina que circula libre se va más frecuentemente en una disfunción o bloqueo del

hígado.

EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA:

La medición de la bilirrubina es importante en la evaluación de la función

hepática, anemia hemolítica e hiperbilirrubinemia (en los recién nacidos).

MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA BILIRRUBINA TOTAL Y LA

DIRECTA.

La mayoría de los métodos para la determinación de la bilirrubina se basan en la

diazorreacción se presentan en los productos de reacción de los diferentes

componentes de la bilirrubina sérica en la diazorreacción implica la rotura de la

molécula de bilirrubina en uno u otro lado del puente meténico (-CH2-) central, con

la formación de dos pirroles.

39

III. FUNDAMENTO (LABORATORIOS SPINREACT)

La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante la acción del ácido

sulfanílico diazotado, midiéndose fotométricamente. De las dos fracciones presentes en

el suero, bilirrubin-glucorónido y bilirrubina libre ligada a la albúmina, solo la primera

reacciona en medio acuoso (Bilirrubina Directa) precisando la segunda la solubilización

con Dimetilsulfóxido (DMSO) para que reaccione (Bilirrubina Indirecta). La intensidad

del color es directamente proporcional a la cantidad de bilirrubina presente en la

muestra

La bilirrubina indirecta se obtiene de la diferencia entre la bilirrubina total y la bilirrubina

directa.

BILIRRUBINA DIRECTA H+

Ácido sulfanílico diazotado + Bilirrubinas Azobilirrubina

(Diazo reactivo de Erhlich) (suero) (CROMÓGENO DE COLOR ROSA-VIOLÁCEO)

BILIRRUBINA TOTAL H+

Ácido sulfanílico diazotado + Bilirubinas Azobilirrubina

(Diazo reactivo de Erhlich) (suero) (CROMÓGENO DE COLOR ROSA-VIOLÁCEO)

+ Acelerador (Dimetilsulfóxido)

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO

8 Tubos de ensaye de 13 x 100mm.



1 Vaso de precipitados de 250mL

1 Termómetros de –10° a +110° C.

UTENSILIOS

Gradilla metálica

Franela






40

Parafilm





Espectrofotómetro

Refrigerador


Baño maría



Suero o plasma no hemolizado.

La estabilidad de la bilirrubina en suero, protegido de la luz, es de 4 días a temperatura

2 – 8°C ó 2 meses a -20°C.

La presencia de hemólisis disminuye el valor de las Bilirrubinas.

REACTIVOS (Laboratorio SPINREACT)

Reactivo 1. (BD): Ácido Sulfanílico y Ácido Clorhídrico

Reactivo 2. (BT): Ácido Sulfanílico, Ácido Clorhídrico (CIH) y Dimetilsulfoxido (DMSO)

Reactivo 3. : Nitrito de Sodio

Estándar (Opcional)

Todos los reactivos se encuentran listos para usarse y son estables hasta la fecha de

caducidad impresa en la etiqueta cuando se almacena de 2 - 8°C. No usar reactivos

fuera de la fecha indicada.

NOTA: El ácido clorhídrico es bastante irritante, irrita los ojos, la piel y las vías

respiratorias. En caso de contacto con los ojos, lávese inmediatamente con abundante

agua y acudir a un médico.

REACTIVOS (Laboratorios STANBIO)

Reactivo de Bilirrubina Total

Reactivo de Bilirrubina Directa

Oxidante de Bilirrubina (Nitrito de sodio)

Patrón de Bilirrubina de 10 mg/Dl

V. PROCEDIMIENTO

Técnica: Laboratorios SPINREACT

TÉCNICA PARA BILIRRUBINA TOTAL Y BILIRRUBINA DIRECTA.

1. Marcar seis tubos de ensaye con las letras B (Blanco) BT (B. Total), B (Blanco) BD

(B. Directa), B (Blanco) y BP (B. Patrón). Enseguida agregar:

41

REACTIVO BLANCO B. TOTAL BLANCO B. DIRECTA BLANCO PATRÓN

Reactivo 1 (D) _____ _____ 1.5 mL 1.5 mL

Reactivo 2 (T) 1.5 mL 1.5 mL _____ _____ 1.5 mL 1.5 mL

Reactivo 3 50 μL _____ 50 μL 50 μL

Suero 100 μL 100 μL 100 μL 100 μL

Patrón 100 μL 100 μL

2. Mezclar y dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente.

3. Leer las absorbancias a 555 nm, ajustando a cero con agua destilada como blanco.

CÁLCULO.

Con Calibrador o patrón:

Bilirrubina mg/dL = As de la Muestra – As del Blanco de Muestra X [ Patrón ] As del Patrón – As del Blanco del Patrón

Con Factor:

Bilirrubina mg/dL = As de la Muestra – As del Blanco de Muestra X Factor

Donde:

Factor = Concentración del Patrón As del Patrón – As del Blanco del Patrón

Valor del Factor:

Bilirrubina Total = 19.1

Bilirrubina Directa = 14

Factor de Conversión de mg/dL a µmol/L = 17.1

VALORES DE REFERENCIA.

Bilirrubina Total: Hasta 1.10 mg./dL

Hasta 18.81 umol/L

Bilirrubina Directa: Hasta 0.25 mg. /dL.

Hasta 4.27 umol/L.

PROCEDIMIENTO

Técnica: Laboratorios STANBIO

TÉCNICA PARA BILIRRUBINA TOTAL.

1. Marcar cuatro tubos de ensaye con las letras RB (Blanco de Reactivo), BM (Blanco

de Muestra), M (Muestra) y P (Patrón). Enseguida agregar:

42

REACTIVOS B. DE REACTIVO B. DE MUESTRA MUESTRA PATRÓN

Reactivo de B. Total 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Oxidante (gotas) 1 1 1

Agua destilada 50 µL _____ _____ _____

Suero _____ 50 µL 50 µL

Patrón _____ _____ _____ 50 µL



TÉCNICA PARA BILIRRUBINA DIRECTA.

1. Marcar cuatro tubos de ensaye con las letras RB (Blanco de Reactivo), BM (Blanco

de Muestra), M (Muestra) y P (Patrón). Enseguida agregar:

REACTIVOS B. DE REACTIVO B. DE MUESTRA MUESTRA PATRÓN

Reactivo de B. Total 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Oxidante (gotas) 1 1 1

Agua destilada 100 µL _____ _____ _____

Suero _____ 100 µL 100 µL

Patrón _____ _____ _____ 100 µL



La bilirrubina es estable en suero o plasma de 4 – 7 días a 2 -8ºC por 3 meses cuando

se congela a -20ºC.

CÁLCULOS.

Bilirrubina mg/dL = As de la Muestra – As del Blanco de Muestra X [ Patrón ] As del Patrón

VALORES DE REFERENCIA.

Bilirrubina Total (Adultos) = 1.2 mg/dL

Bilirrubina Total (Recién nacidos) = 12.0 mg/dL

Bilirrubina Directa (Adultos e infantes mayores de 1 año) = 0.5 mg/dL

Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

Si la Concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir a la mitad con

Cloruro de Sodio al 0.9% y multiplicar el resultado por 2.

INTERFERENCIAS

La hemoglobina interfiere con el ensayo, disminuyendo falsamente los valores de

bilirrubina directa. La turbidez, debida a concentraciones altas de triglicéridos, puede

elevar falsamente los resultados de bilirrubina total.

43

VI. CUESTIONARIO:

1. Mencione 3 diferencias entre bilirrubina directa y bilirrubina total.

2. Mencione tres enfermedades que origina el aumento de la bilirrubina directa.

3. ¿Qué otro nombre reciben estas don bilirrubinas?

4. Dentro del metabolismo de la bilirrubina que sustancias dan la coloración a las

heces y a la orina.

5. A la presencia de bilirrubina en orina se le conoce como.

44

PRACTICA No 13

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

POR EL MÉTODO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE BIURET

I. COMPETENCIA.

Cuantifica la concentración de proteínas totales en una muestra de suero.

II. INTRODUCCIÓN.

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en las células.

Constituyen el 50% o más de su peso seco. Todas ellas contienen los elementos C, H,

O, N y algunas S. Los pesos moleculares de las proteínas son muy elevados, pero con

hidrólisis, las moléculas proteicas dan una serie de compuestos orgánicos sencillos de

bajo peso molecular llamados aminoácidos, los cuales constituyen las unidades de las

proteínas.

Los aminoácidos son compuestos orgánicos están formados por un grupo amino

y un ácido orgánico. Por lo común, solamente se encuentran 20 aminoácidos naturales

diferentes y sus posibles combinaciones nos dan 1048 opciones.

En las moléculas proteicas, los sucesivos restos de aminoácidos se hallan unidos

covalentemente entre si mediante unas uniones amida sustituidas llamadas enlaces

peptídicos, producidos por la eliminación de una molécula de agua entre grupo

carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del siguiente aminoácido, constituyendo

una cadena polipeptídica.

Las cadenas polipeptídicas de, las proteínas poseen una específica composición

química, un peso molecular y una secuencia ordenada de sus aminoácido estructurales

y una forma tridimensional.

Las principales proteínas que se encuentran en el plasma son la albúmina, las

globulinas y el fibrinógeno. Las globulinas pueden dividirse todavía en variedades alfa

1, alfa 2, beta y gamma; el fibrinógeno y casi todos los factores de coagulación también

son globulinas.

Las proteínas plasmáticas son producidas por el hígado; pero las

inmunoglobulinas provienen en parte de las células plasmáticas y probablemente

también del tejido linfoide.

III. FUNDAMENTO.

Las proteínas presentes en suero o plasma reaccionan con el reactivo de Biuret

en un medio alcalino, formando un complejo de color violeta azulado en presencia de

sales de cobre, contiene yoduro como antioxidante, cuya intensidad de color es

proporcional a la cantidad de proteínas presentes en la muestra.

45


6 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm.


2 Frascos reactivos de 500 mL. color ámbar

2 Tubos vacutainer sin anticoagulante


UTENSILIOS:

Gradilla metálica






Franela


Papel parafilm





APARATOS:


Espectrofotómetro

Refrigerador


MATERIAL BIOLOGICO:

Suero o líquidos (pleural, sinovial), no hemolizado ni lipémico.

REACTIVOS:

Reactivo de trabajo para Proteínas Totales

Reactivo de trabajo para Albúmina

No. 1. Patrón de Proteínas Totales (7 g/dL). Es estable a temperatura ambiente.

Reactivo de Biuret:

CuSO4 1.5 g.

Tartrato doble de Na y K 6.0 g.

Yoduro de K 1.0 g.

NaOH 2.5 N 300 mL.

H2O c. b. p. 1000 mL.

46

Disolver en el orden indicador en unos 500 mL. de agua destilada, calentando

para facilitar la dilución, agregar la solución de NaOH, agitar, y agregar agua destilada

hasta la señal del aforo. Guardar el frasco ámbar, de preferencia entre +2 y +8° C.

No. 4. Amortiguador. Consérvese entre +2 y +8° C. de preferencia.

No 5. Verde de Bromocresol. Consérvese entre +2 y +8° C. de preferencia.

Los reactivos están listos para su uso.

V. PROCEDIMIENTO PARA PROTEÍNAS TOTALES

Técnica: Laboratorios SPINREACT


Enseguida agregar



Patrón de 7 g/dL ______ ______ 25 μL

Suero ______ 25 μL ______

2. Mezclar e incubar en baño maría durante 5 minutos a 37°C o 10 minutos a

temperatura ambiente (15ª 25ºC).

3. Leer las absorbancias a 540 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos. El color

es estable por 30 minutos

CÁLCULOS: Proteínas Totales g/dL. = Absorbancia de la muestra X [ Patrón ] Absorbancia del patrón FACTOR DE CALIBRACIÓN = 7 Absorbancia del patrón Proteínas Totales g/dL. = Absorbancia de la muestra X FACTOR (F) LINEALIDAD:

La reacción es lineal hasta la concentración de 12 g/100 mL.

Para valores superiores, diluir la muestra con solución salina fisiológica y hacer nueva

determinación multiplicando el resultado por el factor de dilución.


Proteínas totales: 6.6 a 8.3 g/dL.

REPORTE DEL ALUMNO:

A. Datos obtenidos

B. Fórmulas

C. Cálculos

47

D. Resultados

E. Discusión o análisis de resultados

F. Conclusiones.

G. Cuestionario

H. Bibliografía

VI. CUESTIONARIO.

1. Mencione tres funciones que realicen las proteínas plasmáticas.

2. Anote en orden progresivo de mayor a menor las diferentes proteínas plasmáticas

así como el peso molecular de cada una.

3. Explique brevemente en que consiste la técnica de Electroforesis.

4. Mencione la importancia clínica que tiene determinar las proteínas totales en suero.

5. Esquematice un proteinograma indicando el nombre de cada una.

48

PRACTICA No 14

CUANTIFICACIÓN DE ALBÚMINA SÉRICA

POR EL MÉTODO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE VERDE DE BROMOCRESOL

I. COMPETENCIA.

Cuantifica la concentración de albúmina en una muestra de suero.

II. INTRODUCCIÓN.

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en las células.

Constituyen el 50% o más de su peso seco. Todas ellas contienen los elementos C, H,

O, N y algunas S. Los pesos moleculares de las proteínas son muy elevados, pero con

hidrólisis, las moléculas proteicas dan una serie de compuestos orgánicos sencillos de

bajo peso molecular llamados aminoácidos, los cuales constituyen las unidades de las

proteínas.

Los aminoácidos son compuestos orgánicos están formados por un grupo amino

y un ácido orgánico. Por lo común, solamente se encuentran 20 aminoácidos naturales

diferentes y sus posibles combinaciones nos dan 1048 opciones.

En las moléculas proteicas, los sucesivos restos de aminoácidos se hallan unidos

covalentemente entre si mediante unas uniones amida sustituidas llamadas enlaces

peptídicos, producidos por la eliminación de una molécula de agua entre grupo

carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del siguiente aminoácido, constituyendo

una cadena polipeptídica.

Las cadenas polipeptídicas de, las proteínas poseen una específica composición

química, un peso molecular y una secuencia ordenada de sus aminoácido estructurales

y una forma tridimensional.

Las principales proteínas que se encuentran en el plasma son la albúmina, las

globulinas y el fibrinógeno. Las globulinas pueden dividirse todavía en variedades alfa

1, alfa 2, beta y gamma; el fibrinógeno y casi todos los factores de coagulación también

son globulinas.

Las proteínas plasmáticas son producidas por el hígado; pero las

inmunoglobulinas provienen en parte de las células plasmáticas y probablemente

también del tejido linfoide.

III. FUNDAMENTO.

Las proteínas presentes en suero o plasma reaccionan con el reactivo de Biuret

en un medio alcalino, formando un complejo de color violeta azulado en presencia de

sales de cobre, contiene yoduro como antioxidante, cuya intensidad de color es

proporcional a la cantidad de proteínas presentes en la muestra.

49


6 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm.


2 Frascos reactivos de 500 mL. color ámbar

2 Tubos vacutainer sin anticoagulante


UTENSILIOS:

Gradilla metálica






Franela


Papel parafilm





APARATOS:


Espectrofotómetro

Refrigerador


MATERIAL BIOLOGICO:

Suero o líquidos (pleural, sinovial), no hemolizado ni lipémico.

REACTIVOS:

Reactivo de trabajo para Albúmina

No. 2. Patrón de Albúmina (3.8 g/dL). Es estable a temperatura ambiente

Reactivo de Biuret:

CuSO4 1.5 g.

Tartrato doble de Na y K 6.0 g.

Yoduro de K 1.0 g.

NaOH 2.5 N 300 mL.

H2O c. b. p. 1000 mL.

50

Disolver en el orden indicador en unos 500 mL. de agua destilada, calentando

para facilitar la dilución, agregar la solución de NaOH, agitar, y agregar agua destilada

hasta la señal del aforo. Guardar el frasco ámbar, de preferencia entre +2 y +8° C.

No. 4. Amortiguador. Consérvese entre +2 y +8° C. de preferencia.

No 5. Verde de Bromocresol. Consérvese entre +2 y +8° C. de preferencia.

Los reactivos están listos para su uso.

V. PROCEDIMIENTO PARA ALBÚMINA

Técnica: Laboratorios SPINREACT. 1. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrón).

Enseguida agregar:


Reactivo de Albúmina 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Patrón de 5 g/dL ______ ______ 5 μL

Suero ______ 5 μL ______

2. Mezclar bien y dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Leer las absorbancias del patrón y de la muestra a 630 nm o con filtro rojo ajustado a

cero con el blanco de reactivos. El color es estable por 3 horas.

CÁLCULOS: Albúmina (g/100mL.) = Absorbancias de la muestra X [ Patrón ] Absorbancia del patrón FACTOR DE CALIBRACIÓN = 5 Absorbancia del patrón Concentración de Albúmina (g/100 mL) = Absorbancia de la muestra X Factor. LINEALIDAD:

La reacción es lineal hasta la concentración de 5.6 g/100 mL.; para valores

superiores diluir la muestra con solución salina fisiológica, proceder a nueva

determinación y multiplicar el resultado por el factor de dilución.

El valor de la globulinas (g/100 mL. ( se obtiene restando de las proteínas (g/100ml), el

valor de la albúmina (g/100ml). La reacción A/G (Albúmina/Globulina). Se obtiene

dividiendo la concentración de la albúmina entre la concentración de las globulinas.

EJEMPLO:

Proteínas totales = 7.0 g/100mL.

Albúminas = 4.0g/100mL.

Globulinas = 3.0 g/100mL.

51

Relación A/G = 4.0 = 1.3 3.0


Albúmina: 3.5 a 5.5 g/dL.

REPORTE DEL ALUMNO:

A. Datos obtenidos

B. Fórmulas

C. Cálculos

D. Resultados

E. Discusión o análisis de resultados

F. Conclusiones.

G. Cuestionario

H. Bibliografía

VI. CUESTIONARIO:

1. Mencione tres funciones que realiza la albúmina.

2. Anote el peso molecular de la albúmina.

3. Explique brevemente en qué consiste la técnica de Electroforesis.

4. Mencione la importancia clínica que tiene determinar la albúmina en suero.

52

PRÁCTICA No. 15

EXAMEN GENERAL DE ORINA EXAMEN FÍSICO Y QUÍMICO

I. COMPETENCIA:

Realiza el análisis cualitativo de la orina (exámenes físico y químico)

II. INTRODUCCIÓN:

La orina es un líquido excretado por el riñón y su examen es de gran utilidad en

el diagnóstico de varios padecimientos, en los que se modifican sus caracteres físicos

y/o químicos, ó aumentan los elementos celulares que normalmente se encuentran en

pequeña cantidad.

Respecto a la muestra que se emplea para el examen, es conveniente efectuar

el estado de la orina eliminada durante 24 horas. En ocasiones se prefiere la primera

orina de la mañana con abstención en la ingesta de líquidos de la noche anterior a la

colecta, ya que esto trae como consecuencia una orina más concentrada y evita las

complicaciones de recolectar la muestra durante el día.

El examen general de la orina comprende tres aspectos principales: El examen

físico, El examen Químico y el Examen Microscópico del sedimento urinario.

EXAMEN FÍSICO: VOLUMEN.

La cantidad de orina eliminada en 24 horas está sujeta a diversas influencias

según la edad, el peso la temperatura, la dieta, etc.

Por lo común un sujeto adulto elimina entre 1200 a 1400 mL. en 24 horas. Los

niños entre 6 y 12 años orinan un volumen casi igual a la mitad del de los adultos.

La poliuria es el aumento anormal del volumen urinario de 24 horas y puede

provocarla el aumento de la ingestión de líquidos, el descenso de la temperatura

ambiental, factores nerviosos o emocionales, alteraciones metabólicas como la

Diabetes Mellitus (DM).

La oliguria es la disminución anormal del volumen urinario y se produce en casos

de gran sudoración o restricción acentuada de la ingesta de líquidos; procesos

infecciosos agudos: trastornos cardiacos que afectan la circulación renal, hemorragias,

diarreas, vómitos etc.

COLOR:

Casi siempre la orina es de color amarillo, de tonalidad variable entre el tono

ambarino y el amarillo paja. Este color se debe a la presencia de pigmentos como el

urocromo, la uroeritrina, la urobilina y la hematoporfirina. A mayor volumen eliminado y

53

por más bajo peso específico, corresponde un color amarillo más pálido. En general la

orina ácida es más oscura que la alcalina.

En condiciones anormales, sean patológicas o provocadas por la ingesta de

alimentos o medicamentos pueden aparecer diversas coloraciones en la orina.

OLOR:

El olor de la orina normal es característico, algo aromático, y puede variar en

diversas circunstancias. Así, la ingestión proteica abundante acentúa el olor urinario. La

cetonuria produce el olor acetónico característico.

ASPECTO:

En general la orina de micción reciente es límpida y transparente; al poco tiempo

de estar estacionada aparecen enturbiamientos que originan un sedimento más o

menos abundantes, provocados por mucus, células epiteliales, leucocitos, etc.

DENSIDAD:

La densidad urinaria varía entre 1.015 y 1.025 por lo general existe una relación

inversa entre el volumen y la densidad influida por la ingestión de líquidos, la

sudoración excesiva u otras formas de pérdidas hídricas, como la diarrea o el vómito

persistente.

EXAMEN QUÍMICO:

PROTEÍNAS:

Normalmente la orina no contiene cantidades demostrables de proteínas (salvo

en la proteinuria ortostática o postural). En las enfermedades del riñón se pierde

proteínas plasmáticas, sobre todo albúminas cuyas moléculas son de menor tamaño.

ACETONAS Y CUERPOS CETÓNICOS:

Cuando el metabolismo de la glucosa está trastornado como en la diabetes

mellitus no tratada, las fiebres, la diarrea, y otros vómitos, el ayuno, etc., se excretan en

la orina cantidades excesivas de productos intermediarios del metabolismo de las

grasas, sobre todo ácido betahidroxibutírico y ácido acetoacético (ácido diacético). En

esta última substancia se transforma lentamente en acetona cuando la orina se deja

reposar a la temperatura ambiente.

UROBILINA Y UROBILINÓGENO.

El urobilinógeno, la urobilina, el estercobilinógeno y la estercobilina son

productos de descomposición de la bilirrubina que está normalmente presente en las

heces. Cuando el hígado aumenta su excreción de bilis como la ictericia hemolítica, etc.

tiene lugar una mayor absorción intestinal de estas substancias, que luego se excretan

con la orina.

54

BIBIRRUBINA:

La orina normal casi no tienen bilirrubina. Este cuerpo se elimina por la orina en

la ictericia obstructiva, pero no en la hemolítica.

GLUCOSA.

De ordinario se eliminan por la orina cantidades pequeñísimas de glucosa no

determinables por métodos usuales.

En determinadas circunstancias puede aparecer una glucosuria transitoria como

ocurre en el hpertiroidismo, en traumatismos craneanos, en ciertos estados emotivos,

etc. La glucosuria persistente ocurre en traumatismos craneanos que afectan el piso del

4 ventrículo; en denominada glucosuria renal y por fin el la diabetes mellitus.

III. FUNDAMENTO.

La orina es un líquido excretado por el riñón en una cantidad que varía entre 800

y 1500 mL. en 24 horas. Algunos padecimientos renales, de las vías urinarias y

extrarenales modifican la orina en:

Sus caracteres físicos: volumen, densidad, y pH.

Su composición con la aparición de compuestos que normalmente no contiene:

glucosa, proteínas, hemoglobinas, cuerpos cetónicos, bilirrubinas o con el aumento de

la cantidad de compuestos normales, como el urobilinógeno.

Los elementos morfológicos del sedimento pueden aumentar, como los leucocitos,

eritrocitos o bien aparecer como cilindros.

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO:

Portaobjetos

Cubreobjetos

Pipetas serológicas de 5.0 mL.

1 Urodensímetro de 1.000 a 1.045

Tubos de ensaye de 13 x 100 mm

1 Probeta graduada de 50 mL.

1 Pipeta pasteur con bulbo

UTENSILIOS

Gradilla metálica

Franela



Parafilm

Bulbo de hule

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EQUIPO

Microscopio


MATERIAL BIOLOGICO:

Orina reciente (primera de la mañana)

REACTIVOS:

Tiras reactivas para uroanálisis

Colorante de Sternheimer-Malbin (solución diluida)

PREPARACIÓN DEL REACTIVO:

SOLUCIÓN A: Cristal violeta 3 gr

Alcohol etílico 95 20 mL.

Oxalato de amonio 0.8 gr

Agua destilada 80 mL.

SOLUCIÓN B: Safranina 0.25 g

Alcohol etílico 10 mL.


COLORANTE DILUIDO: Se mezclan 3 volúmenes de la solución A con 97 volúmenes

de la solución B y se filtra, estable durante 3 meses.

V. PROCEDIMIENTO: EXAMEN FÍSICO:

COLOR: Se describe el color de la orina. Normalmente debe ser amarillo paja.

OLOR: Al abrir el frasco, se describe el olor de acuerdo a las características que

presente la orina.

VOLÚMEN: Se mide el volumen total de la orina, normalmente en una muestra de 24

horas. Varía de 800 a 1200 mL./24 horas.

ASPECTO: Se observa la orina y se describe el aspecto, que normalmente debe ser

claro y transparente

DENSIDAD: Se determina de dos formas, la primera, se coloca en una probeta

aproximadamente 40mL de orina se introduce el densímetro cuidando que no toquen

las paredes del recipiente y se le da un jiro, observando en que lugar de la escala

coincide con el menisco que forma la orina y se toma la lectura. La segunda, a través

de la tira reactiva comparándolo con los colores que trae el frasco. La densidad normal

de la orina varía de 1.015 a 1.025.

56

EXAMEN QUÍMICO.

El examen químico consiste en medir semicuantitativamente la concentración de

una serie de sustancias que aparece en la orina en ciertos padecimientos o que si

existen normalmente pueden sufrir una elevación en su concentración.

El examen se efectúa con una tira reactiva de plástico e la que se encuentran

colocadas unas áreas de papel filtro que contiene reactivos específicos para determinar

una sustancia. Las sustancias que comúnmente se miden son: Proteínas, Bilirrubina,

Glucosa, Cetona, Sangre, Leucocitos y Urobinógeno, además de la medición de pH y

Densidad. Algunas tiras traen otras áreas para medir la reducción de nitratos a nitritos

(reacción de Griesse), cuando la orina esta contaminada con bacterias.

El examen se efectúa de la siguiente manera:

Colocar, aproximadamente 8mL de orina en un tubo de ensaye.

Sumergir la tira en la orina durante unos segundos cuidando de que se humedezcan

todas las áreas reactivas, sacar la tira eliminado el exceso de orina.

Comparar la coloración de las áreas respectivas, con la escala anexa, cuidando que

no pasen más de 30 segundos antes de tomar la lectura. Fig. 1, 2, 3 y 4.

Reportar las lecturas que normalmente deben ser las siguientes:

pH de 4.0 a 6.5

Proteínas: Negativo

Bilirrubina: Negativo

Glucosa: Negativo

Acetona: Negativo

Sangre: Negativo

Densidad: Normal

Urobilionógeno: Normal

Nitritos: Negativos.

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INFORME DEL ALUMNO.

ANÁLISIS GENERAL DE LA ORINA: A) EXAMEN FÍSICO B) EXAMEN QUÍMICO COLOR: _________________ PROTEÍNAS: _______________ OLOR: ___________________ GLUCOSA: ________________ DENSIDAD: _______________ CETONAS: _______________ VOLÚMEN: ________________ BILIRRUBINA: ______________ ASPECTO: _________________ UROBILINÓGENO: __________ NITRITOS: _________________ SANGRE: __________________ pH: _______________________ VI. CUESTIONARIO. 1. ¿Cuáles son los tres factores principales que influyen en la composición de la orina?

2. ¿Cuál es la importancia del examen general de orina en la clínica?

3. Describa la técnica de recolección de la orina para un examen general de orina

4. Mencione los casos en que cursa la glucosuria con la hiperglucemia.

58

PRÁCTICA No. 16

EXAMEN GENERAL DE ORINA EXAMEN QUÍMICO Y MICROSCÓPICO

I. COMPETENCIA:

Realiza el estudio químico y microscópico del sedimento urinario.

II. INTRODUCCIÓN:

La orina es un líquido excretado por el riñón y su examen es de gran utilidad en

el diagnóstico de varios padecimientos, en los que se modifican sus caracteres físicos

y/o químicos, ó aumentan los elementos celulares que normalmente se encuentran en

pequeña cantidad.

Respecto a la muestra que se emplea para el examen, es conveniente efectuar

el estado de la orina eliminada durante 24 horas. En ocasiones se prefiere la primera

orina de la mañana con abstención en la ingesta de líquidos de la noche anterior a la

colecta, ya que esto trae como consecuencia una orina más concentrada y evita las

complicaciones de recolectar la muestra durante el día.

EXAMEN MICROSCÓPICO DEL SEDIMENTO URINARIO.

De ser posible, los sedimentos urinarios deben examinarse antes de que hayan

transcurrido 8 horas desde su obtención, de preferencia en un plazo de una a dos

horas.

En el sedimento urinario se encuentran 3 elementos principales: células,

cilíndricos y cristales (incluyendo precipitados amorfos).

CÉLULAS

CÉLULAS EPITELIALES:

CÉLULAS EPITELIALES ESCAMOSAS: Son células grandes, con núcleos pequeños

redondos u ovales, que provienen de los uréteres, la vejiga y la uretra.

CÉLULAS EPITELIALES POLIÉDRICAS: Son células pequeñas y redondas, un poco

mayores que los leucocitos, y células epiteliales piriformes, menores que las células

escamosas, con un apéndice terminal. Provienen principalmente de las vías altas.

GLÓBULOS ROJOS: En las orinas hipertónicas, los glóbulos rojos pueden ser

detentados, de un tamaño inferior al normal. En las orinas hipotónicas, se hinchan y se

vuelven mayores que normalmente, perdiendo su aspecto típico en doble anillo. La

presencia de glóbulos rojos en la orina indica sangrado en algún lugar de las vías

urinarias.

LEUCOCITOS: La eliminación normal de leucocitos por la orina es del orden de 3mm3,

o sea 3000 por mL.

59

ESPERMATOZOIDES: Pueden concentrarse espermatozoides en la orina del hombre

después de la eyaculación, o en la mujer contaminada por secreción vaginal después

del coito. Son fáciles de identificar.

BACTERIAS: La orina normal no contiene bacterias. La contaminación es muy

frecuente cuando la orina se recoge con sonda, y si permanece a temperatura

ambiente por algún tiempo, los microbios se multiplican con rapidez. No tienen

significación, salvo cuando la orina ha sido obtenida por sonda y recogida en envase

estéril.

CILINDROS: Hay mucha variedad de cilindros: se deben a solidificación de proteínas

en el túbulo de la nefrona y contienen a veces células, gránulos etc.

Cilindros hialinos

Cilindros granulosos

Cilindros leucocitarios

Cilindros hemáticos

Cilindros grasosos

Cilindros céreos

Cilindros de insuficiencia renal

Cilindroides

Filamentos mucosos

CRISTALES:

Normalmente no hay cristales en la orina fresca y se forman al enfriarse la

muestra. En general los cristales urinarios no tienen significado, salvo si son de

sulfonamidas, cistina, oxalatos en sujetos con historial de cólico uretral o formación de

cálculos y quizá en los enfermos de gota.

CRISTALES EN LAS ORINAS ÁCIDAS:

Oxalato de calcio

Ácido úrico

Uratos

Cistina

Tirosina

CRISTALES EN LAS ORINAS ALCALINAS:

Fosfato amorfo

Fosfatos triples

Carbonato de calcio

60

III. FUNDAMENTO.

La orina es un líquido excretado por el riñón en una cantidad que varía entre 800

y 1500 mL. en 24 horas. Algunos padecimientos renales, de las vías urinarias y

extrarenales modifican la orina en algunos elementos morfológicos del sedimento, los

cuales pueden aumentar, como los leucocitos, eritrocitos o bien aparecer cilindros,

bacterias, células epiteliales.

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO:

Portaobjetos

Cubreobjetos

Tubos de ensaye de 13 x 100 mm


UTENSILIOS

Gradilla metálica

Franela



Parafilm

Bulbo de hule


EQUIPO

Microscopio


MATERIAL BIOLOGICO:

Orina reciente (primera de la mañana)

REACTIVOS:

Colorante de Sternheimer-Malbin (solución diluida)

PREPARACIÓN DEL REACTIVO:

SOLUCIÓN A: Cristal violeta 3 gr

Alcohol etílico 95 20 mL.

Oxalato de amonio 0.8 gr


SOLUCIÓN B: Safranina 0.25 g

Alcohol etílico 10 mL.


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COLORANTE DILUIDO: Se mezclan 3 volúmenes de la solución A con 97 volúmenes

de la solución B y se filtra, estable durante 3 meses.

V. PROCEDIMIENTO:

EXAMEN MICROSCÓPICO DEL SEDIMENTO URINARIO.

Homogenizar bien la orina y colocar 8 mL de orina en un tubo de ensaye.

Centrifugar a 2000rpm durante 5 a 10 minutos

Decantar de golpe todo la orina.

Resuspender el sedimento con la orina que escurre de las paredes del tubo.

Colocar una gota de sedimento sobre un portaobjetos y enseguida colocarle un

cubreobjetos.

Observar el microscopio con el objetivo seco débil (10X) con el fin de ver que la

distribución del sedimento sea uniforme.

Cambiar al objetivo seco fuerte (40X) y contar los elementos celulares y cilindros

que se observen en el campo. Identificar los diferentes tipos de cristales que pueda

poseer la orina.

TINCIÓN DEL SEDIMENTO URINARIO.

Al remanente del sedimento en el tubo de ensaye, agregarle una gota del colorante

de Sternheimer-Malbin.

Agitar y dejar reposar dos a tres minutos.

Colocar una gota del sedimento teñido entre portaobjetos y cubreobjetos.

Seguir el procedimiento anterior a partir del penúltimo paso.

El objeto de la tinción es ayudar a la identificación de elementos celulares y

cilindros. Los leucocitos se tiñen de color anaranjado a púrpura; los leucocitos del

parénquima renal de azul pálido o son incoloros; los cilindros hialinos de rosado o

púrpura; Trichomonas de azul pálidos: los núcleos de las células de epitelios vesical y

vaginal se tiñen de azul y púrpura respectivamente.

El reporte del sedimento urinario se hace de la siguiente manera.

Los elementos celulares se cuentan al igual que los cilindros, y se saca un

promedio por campo; los cristales se reportan de acuerdo a su abundancia o escasez

(mencionando éstos términos o por cruces)

INFORME DEL ALUMNO. A) SEDIMENTO URINARIO DATOS GRALES DEL PACIENTE

LEUCOCITOS: _________________ NOMBRE: _____________________

ERITROCITOS: ________________ EDAD: ________________________

CILINDROS: ___________________ SEXO: ________________________

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CRISTALES: ___________________ FECHA: _______________________

CÉL. E. RENALES: _____________ PRACTICO EXAMEN:___________

TRINCHOMONAS: ______________________

ESPERMATOZOIDES: ___________________

OTROS: ___________________________________________________________

NOTA: REALIZAR LOS ESQUEMAS DE LOS DIFERENTES ELEMENTOS ENCONTRADOS EN EL SEDIMENTO URINARIOA. ESQUEMAS DEL SEDIMENTO URINARIO

LEUCOCITOS LEUCOCITOS

CÉLULAS EPITELIALES CÉLULAS EPITELIALES

CILINDRO GRANULOSO CILINDRO GRANULOSO

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CILINDROS ERITROCITARIOS CILINDROS LEUCOCITARIOS

CRISTALES DE ÁCIDO ÚRICO CRISTALES DE URATO AMORFO

CRISTALES DE FOSFATO AMÓNICO CRISTALES DE CISTINA

CRISTALES DE OXALATO DE CALCIO CRISTALES DE ÁCIDO HIPÚRICO

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CRISTALES DE FOSFATO TRIPLE LEVADURAS Y BACTERIAS

AGUJAS DE TIROSINA Y LEUCINA CRISTALES DE FOSFATO AMORFO

VI. CUESTIONARIO. 1. ¿Cuales son los tres factores principales que influyen en la composición de la orina? 2. ¿Cual es la importancia clínica del Examen General de Orina? 3. Menciona las indicaciones para la recolección de orina para el examen de la misma. 4. Menciona los casos en que cursa la glucosuria con la hiperglucemia. 5. ¿En caso de la glomérulonefritis, nefrosis, y padecimientos de parénquima renal,

diga qué tipos de estructuras se observan en el sedimento urinario?

65

BIBLIOGRAFIA: 1. Iovine-Selva. El Laboratorio en la Clínica, 2ª edición, editorial Pamanericana,

Argentina 1979, pag. 342, 343 y 344.

2. Manual de practicas del curso de Análisis Químico. Responsable: Q.F.B. Estela

Cevallos Ferriz 1989.

3. Lynch, y Cols., Métodos de Laboratorio, Ed. Interamericana. 2ª edición, México 1972,

páginas, 71a73, 105 a 109, 215 a 225, 386 a 396

4. Todd-Sanford, Diagnóstico Clínico por el Laboratorio, Ed. Salvat, 6ª edición,

Barcelona España 1978, página 513 a 529, 579 a 604, 625 y 653.

5. W. Tietz, Norbert, Química Clínica Moderna, Ed. Interamericana, 1ª edición, México

1972, página 86 a 96.

6. Willard-Merrit, Análisis Instrumental, Ed. C.E.C.S.A.

7. Salve, María Luisa, et., al. Bioquímica, Editorial Interamericana, 1° edición,

Barcelona, España 1994.

8. Lehninger. Bioquímica, 2ª Edición, editorial Omega, Barcelona 1985, pags.

9. J. Henry/D.C. Cannon/J.W. Winkelman. Química Clínica, Tomo I, 2ª Edición,

editorial Jims, paginas, 528,529,530 y 531.

10. Iovine Selva. El laboratorio en la clínica, editorial Alhambra, Madird España 1985.

11. Apuntes de Química clínica, elaborados por el Q. B .P. Alberto León Hernández.

WEBGRAFÍA:

1. http://www.medicodirecto.com/~temasalud/s01_203.htm#index3

2. http://www.botanica.cnba.uba.ar:80/cgibin/i/monografias/sedimento/images/sto_004.j

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3. http://es.wikipedia.org/wiki/Colesterol#Estructura_qu.C3.ADmica

4. http://www.urologia.tv/icua/es/diseases.aspx?cod=12

5. http://www.umm.edu/esp_ency/article/001559.htm

6. http://quimicosclinicosxalapa04.spaces.live.com/blog/cns!204AC1C68E772D5!711.en

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http://www.umm.edu/esp_ency/article/001559.htm

Instructivo Quimica Clinica

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