Imunológia –praktické cvičenie č. 1.

bunky imunitného systému

Použité zdrojeBuc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z

imunológie, vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993, ISBN 80-88718-01-5

http://www.vpl.sk/zc/img/3_Kossarova_Imunodeficientne_stavy.pdf

Bunky imunitného systému dostupné na https.ics.upjs.sk~paulikovaimufilestahajimu2.p

df

hematopoéza• Bunky imunitného systému

• -rôzne dlhý čas života

• - úbytok je dopĺňaný hematopoézou

• Hematopoéza

• - formovanie a vývoj červených a bielych krviniek z kmeňovej pluripotentnej bunky

• -u dospelého jedinca prebieha najmä v kostnej dreni (medulárne)

• -základom hematopoézy je

• pluripotentná kmeňová bunka, ktorá sa diferencuje na lymfoidné a myeloidné kmeňové bunky

Hematopoéza -z kmeňových buniek vznikajú progenitorové bunky, ktoré sú nasmerované k diferenciácii na základné typy krvných buniek: Erytrocyty lymfocyty trombocyty monocyty Granulocyty -Hematopoéza je regulovaná najmä cytokínmi:

IL-3 (multilineage-CSF) GM-CSF M-CSF G-CSF erytropoetín IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8,IL-9

klasifikácia• prítomnosť membránových

znakov(rozpoznávacie glykoproteíny) na povrchu bunky

• CD (na všetkých leukocytoch)

• expresia receptorov na rozpoznávanie antigénov (len na T a B –Ly)

• MHC antigény

Systém bunkových znakov CD –znak (marker)

CD = cluster of differentiation

CD znak – jedinečná molekula alebo komplex molekúl,ktoré bunka exprimuje

Tieto molekuly pomáhajú diferencovať typ (subtyp) bunky, jej maturačné štádium, stupeň aktivácie...

Názov pozostáva z písmen CD a číslic (napr.:CD3,CD8,...)

CD znaky• CD3 –len naT –Ly (na všetkých subtypoch)• CD4 –TH• CD8 –TC• CD19 –len naB –Ly• CD64 –monocyty• CD66 –PMNLs• CD68 –makrofágy• CD16 –NK bunky• CD40 –dendritické bunky• CD33 –všetkymyeloidné bb.

Polymorfonukleárne lekocytyPMNLViaclaločnaté jadro a granuly v cytoplazmeNa základe rozdielneho farbenia granúl rozlišujeme

3 typy granulocytov:Neutrofily–nefarbia sa ani bázickymi ani kyslými farbivami

Eozinofily–farbia sa kyslými farbivami na červeno

Bazofily–farbia sa bázickými farbivami na tmavomodro

neutrofily• 60% z leukocytov (4,3–11x109/1lkrvi)• Veľkosť: 15μm

– Nezrelé –tyčka (tvar jadra)– Zrelé – segmentované jadro

Vcytoplazme:• -granuly s baktericídnymi látkami –primárne (azúrofilné)

obsahujú hydrolázy, myeloperoxidázu• Sekundárne – obsahujú laktoferín, lyzozým, alkalickú

fosfatázu, kolagenázu...• Glykogén –zdroj glukózy pri anaeróbnej glykolýze → PMNL

môžu zostať v poškodenom tkanive s nízkym obsahom O2, napr. vmiestebakteriálnejinfekcie

Bunková membrána:• Receptory (Fc R pre IgG, CR), adhezívne molekuly

(integríny, selektíny

neutrofilyFUNKCIA:• Základné bunky 1. obrannej línie proti

patogénom, cudzorodým bb. • Profesionálne fagocyty

• enzýmy sekundárnych granúl rozkladajú antigén (Ag)

• Dôležitá úloha v zápalovom procese (rýchla mobilizácia, uvoľnenie

mediátorov zápalu)

eozinofily• 4% zo všetkých PMNL• 18 μm

V cytoplazme:• okolo 200 granúl – hlavný bázický proteín (MBP), kyslá

fosfatáza, arylsulfatáza, eozinofilná peroxidáza, kationický proteín eozinofilu

• -MBP pôsobí toxicky na parazity a nádorové bb., väzbou na bazofilné bb. z nich uvoľňuje histamín

Na membráne: - receptory pre IgE a zložky komplementu - dôležitá úloha pri

alergických reakciáchFUNKCIA:• proti parazitárnym infekciám (hlavne proti helmintom v črevnom

trakte) • proti nádorovým bunkám • Účasť pri zápalových reakciách ( sú aktivované lymfocytmi)• alergické reakcie• schopnosť fagocytózy

bazofily• <0.2% z Leu

• Morfologicky sa podobajú tkanivovým mastocytom, • ochrana mukóznych povrchov tela

Cytoplazma:• Granuly – veľké množstvo zápalových mediátorov

(heparín,histamín...);• Neobsahujú peroxidázuMembrána:

– Receptory FcRε (pre IgE)

FUNKCIA:• -alergické reakcie• -nefagocytujú

mastocyty• Tkanivové bunky• 30μm• Mononukleárne bunky s metachromaticky zafarbenýmig

ranulami• Relatívne maléj adro - v spojivovom tkanive, hlavne pri krvných, lymfatických cievach a pri periférnych nervoch - blízko epitelových povrchov(dýchací, tráviaci systém a

koža)

Cytoplazma:• granuly : zápalové mediátory (heparín,histamín...), neobsahujú peroxidázuMembrána:• -receptory FcRε (preIgE)Funkcia : hlavné bunky pri alergických reakciách

Mastocyty

monocyty• 6-8% – mononukleárne bb.• Okrúhly tvar, veľa cytoplazmy, veľké, excentricky uložené

jadro Cytoplazma : vakuolizovaná, farbí sa slabo bazofilne (sivo-

fialovo) .• (Monocytóza so zvýšením množstva leukocytov je aj

priaznivým symptómom pri septických procesoch a infekčných ochoreniach)

FUNKCIA:• Profesionálne fagocyty• APC

• *Zrelé monocyty putujú z kostnej drene do krvi, kde zostávajú cca15-30 hodín Potom adherujú na cievny endotel a opúšťajú krvné riečište diapedézou, premiestňujú sa do tkanív, kde sa premieňajú na makrofágy.

Monocyty

Antigén prezentujúce bunky = APC(Antigen Presenting Cells)

• DENDRITICKÉ BUNKY (DC)• MAKROFÁGY • B -LYMFOCYTY

• FUNKCIA:• vychytanie Ag • spracovanie Ag• prezentácia Ag peptidov špecifickým T -Ly

makrofágy• Determinačné povrchové znaky: CD54, CD68, MHC, Fc receptory, C receptoryMonocyt z krvi →prechod do tkaniva →premena na makrofág

– mononukleárne fagocyty– dĺžka života 75 dní– antigén prezentujúce bb. = APC– Tkanivové makrofágy –1. obranná línia hostiteľa

• VÝSKYT:-• Alveolárne v pľúcach

• Kupfferove bb. v pečeni• histiocyty v spojivovom tkanive• mikroglia v CNS• osteoklasty v kostiach• peritoneálne a pleurálne v seróznych dutinách• Intravaskulárne v endoteli kapilár

makrofágy• FUNKCIE:

– Schopnosť rozpoznať, vychytať, spracovať a prezentovať antigén

– fagocytóza– Expresia MHC molekúl II. triedy– Produkcia imunoregulačných látok– Schopnosť odovzdávať nešpecifické

stimulačné signály– Produkcia reaktívnych molekúl

Dendritické bunky DCv nelymfatických periférnych tkaniváchLangerhansove bb.(koža, dlaždicový

epitel ústnej dutiny, pažeráku a pošvy)intersticiálne DC (srdce, obličky)v cirkulácii : DC v periférnej krvi (0,4 %)závojnaté bb.(aferentné lymfatické cievy)v sekundárnych lymfatických tkanivách :

vmedzerené DCv medule týmusu týmusové DC

• Dendritické bunky (DC)• FUNKCIA:• najvýkonnejšie APC• schopnosť aktivovať naivné

T –Ly• fagocytóza (častice a

mikróby)• makropinocytóza (solubilné

Ag)

• Závojnatá DC + Ly

lymfocyty• Ly : malý, stredný, veľký• Malý 8-12μm.Jadro: - okrúhle alebo oválne tvorené masami

chromatínu Cytoplazma:- úzky lem, svetlomodrá

• T–lymfocyty (65–75%)• B–lymfocyty(20–30%)

lymfocyty

lymfocytyLymfocyty - vyvíjajú sa z hematopoetickej

kmeňovej bunky v kostnej dreni T lymfocyty migrujú do thymusu, B lymfocyty zostávajú v kostnej dreni

B lymfocyty - zodpovedné za humorálnu časť (Ab)

T lymfocyty - celulárna časť imunitnej reakcie

• B-lymfocyty: produkujú a secernujú Ab do telesných tekutín, zastupujú preto humorálnu imunitu

• T-lymfocyty: reagujú priamo s cieľovými bunkami (napr. ktoré boli napadnuté vírusmi alebo tumorózne zvrhnuté), preto reprezentujú bunkovú imunitu

• Obidve populácie majú na svojom povrchu odlišné glykoproteíny, ktoré môžu byť dokázané pomocou monoklonálnych protilátok

T lymfocytyTH(helpery) CD4:

- Regulujú humorálne aj bunkami sprostredkované imunitné odpovede

– pomáhajú

TS(supresory) CD8 :

- Môžu potláčať imunitnú odpoveď

TC(cytotoxické) CD8: - Efektorové bb. S cytolytickým účinkom- TDH(delayed-type hypersensitivity reaction)-- sprostredkujúoneskorenýtyphypersenzitivity

• TH a TS majú odlišné vlastnéa ntigény, podľa ktorých sa identifikujú

T lymfocyty• Dozrievanie v týmuse je sprevádzané

identifikáciou provrchových označení CD (cluster of differentiation – diferenciačných antigénov)

• CD3- prenášač signálu z antigénneho receptoru do vnútra bb, vedie k aktivácii b

• CD4, CD8 prítomné pôvodne u spolu všetkých ly, umožňujú rozdeliť T-lymf.

• CD4 - prítomný u T helper bb, komunikuje s molekulami HLA II

• CD8 - prítomný u cytotoxických buniek, komunikuje s molekulami HLA I

Špecifická imunita sprostredkovaná bunkami• T bunky - po stimulácii sa stávajú efektorovými

bunkami (priamo napádajú a eliminujú bb napadnuté

vírusmi alebo tumorózne zmenené) - riadia spoluprácu rôznych imunitných bb (syntetizujú molekuly, ktoré pomáhajú iným

bunkám zničiť patogéna)

B lymfocyty• B-bb dozrievajú v prostredí kostnej drene• Zrelé B-lymf nesú na svojom povrchu

molekuly imunoglobulínov, ktoré slúžia ako špecifický receptor pre antigén.

• V prítomnosti Ag (týmusindependentné Ag) alebo aj v spolupráci s T-lymf (týmusdependentné Ag) sa menia B-lymf na plazmatické bunky, ktoré produkujú veľké množstvo špecifických Ab

Plazmatické bunky

NK bunky• CD16, CD56,CD57 5–15% , slezina• Nulové bb.=non–B,non–T• Majú Fc receptory• Bunková zložka vrodenej imunity

Funkcie: -lýza nádorových a vírusom infikovaných bb. (nešpecifická cytotoxicita bez predchádzajúcej

senzibilizácie) - produkcia cytokínov zapájajúcich sa do regulácie

iných procesov - rozpoznávajú cieľové bb. bez MHC restrikcie - IL-2; IFN zvyšujú proliferáciu a cytotoxickú aktivitu NKcytopl. Granuly obsahujú perforín, serínovú esterázu

Izolácia mononukleových bb• Z periférnej krvi• Za fyziol podm. : z 1 ml krvi....1-2x 106 mononukl.

bb.(lymfocyty a monocyty v pomere 80% : 10%)CIEĽ : oddelenie ery a granulocytovMETÓDA: diskontinuálna gradientová centrifugáciaPOSTUP: krv +heparín (konc. 10j./1 ml krvi) -premiešať + fyziol.roztok (1:1) - do skúmavky s 5 ml zriedenej krvi

navrstviť 2,5 ml separačného roztoku (verografín) - 20 min. centrifugácia

Izolácia mononukleových bbVÝSLEDOK : po centrifugácii sa nad separačným roztokom

utvorí belavý prstenec mononukleových bb., ktoré odsajeme pipetou

Získané bb. centrifugujemeSediment 2x premyjeme vo fyziolog. roztokubb. spočítame v Bürkerovej komôrke (1x106 )

Separácia T aB lymf. Na základe tvorby rozietT a B lymf. : rôzne membránové receptory

pre väzbu s ery iných živočíšnych druhovT lymf. : receptor pre baranie ery – tvorba E-

rozietB lymf. : receptor pre myšie ery – tvorba M-

rozietEry sa opracúvajú chemicky

(neuraminidázou) – pevnejšia väzba s lymf.

Separácia T aB lymf. Na základe tvorby roziet• POSTUP: • Suspenzia mononukleových bb. + premyté a

resuspendované baranie ery (1:1), centrifugácia • Inkubácia 30 min. pri 4b C, navrstvenie

separačného roztoku (verografín), centrifugácia• CIEĽ : • nad separač. roztokom ostanú nerozetujúce bb.

(odsatie)• Rozetujúce bb. Sedimentujú na dno skúmavky• VÝSLEDOK: • Získanie suspenzie lymfocytov (T lymf.- E-rozety)

(95% čistota)

Rozetové testyAktívne rozety – vyššia avidita receptorov pre

baranie ery (aj pri ich malom počte)Celkové rozety – po 18 – 24 hod inkubácii pri

nadbytku ery.

Aktívne rozety lepšie odrážajú imunitný stav pacienta

Rozetové testy• POSTUP :- 5ml krvi do heparínu izolácia lymfocytov- Pridať suspenziu ovčích ery ( pre aktívne rozety v c

0,2%, pre celkové rozety 0,1%)- Pri stanovení celkových roziet – na 24 hod do ľaduCIEĽ : - počítanie lymfocytov a roziet v Bürkerovej komôrkeVÝSLEDOK : - Rozeta : lymf. + najmenej 3 ery- Aktívne r. : 25 +/- 10%- Celkové r. : 65 +/- 10%

Pod mikroskopom počítame počiet roziet a čistých lymfocytov do 100, počet roziet udáva % počet B alebo T lymfocytov

Morč.ery

rozety

Lymfocyt