Enzymové a jiné markery využívané v diagnostice vybraných patologických stavů

Cíle laboratorního vyšetření pomocí diagnostických markerů• laboratorní vyšetření informuje o probíhajících procesech v

organizmu• fyziologických i patologických

• změny laboratorních hodnot často předchází klinicky manifestní změny• subklinické, latentní stadium

• cca 70-80% rozhodování zdravotnických profesionálů je opřeno o lab. vyšetření

• cíle• (1) konstatování fyziologické situace (tj. zdraví) = prevence • (2) diagnóza choroby • (3) určení stadia • (4) odhad průběhu • (5) monitorování úspěšnosti terapie• (6) odhalení recidiv

Typy laboratorních vyšetření

• z hlediska dostupnosti• základní – ve všech zdrav. zařízeních• specializovaná – spec. referenční centra• vysoce specializovaná

• nejsou běžně indikována• ekonomická náročnost• netriviální interpretace nálezů

• z hlediska požadavků na rychlost• rutinní• statimová

• výsledek cca do 60 min od dodání do laboratoře• vitální indikace

• výsledek cca do 30 min od dodání do laboratoře• kontinuální monitorování u lůžka či v ambulanci

• např. ABR, oxygenace, glykemie, …

Obecné charakteristiky laboratorních metod• stanovení jednotlivých analytů může být prováděno

různými metodami s různou výpovědní hodnotou• analytická spolehlivost metody

• dána přístroj. vybavením, kalibrací, kvalifikace personálu aj.

• parametry• správnost = odchylka od skutečné hodnoty (kombinace

náhodných a systematických vlivů)• přesnost

• opakovatelnost (stejná metoda, laboratoř, pracovník, krátký časový úsek)

• reprodukovatelnost (stejná metoda, jiný pracovník, dlouhý časový úsek)

• robustnost = rezistence vůči malým vlivům• tj. spolehlivost při běžném používání

• selektivita = schopnost rozlišovat mezi měřeným analytem a ostatními přítomnými ve vzorku

• citlivost = nejmenší rozdíl který může být zachycen

Validita metody / testu• analytická spolehlivost je předpokladem validity metody

• tzn. vypovídací hodnoty• v praktické medicíně je to hranice, od které můžeme považovat

změny koncentrace analytu za pozitivní nález• ale většinou dochází k překryvu mezi zdravými a nemocnými

• skupina zdravých s falešně pozitivním testem (falešná pozitivita)• skupina nemocných s negativním testem (falešná negativita)

Validita metody / testu

Specificita vs. senzitivita metody

Referenční interval• raději než normální interval (co

je normální?) se volí referenční interval hodnot u jasně definované referenční skupiny osob

• co je referenční skupina?• zdraví, nebo spíše osoby bez

takového zdrav, stavu, který přímo ovlivňuje / interferuje s měřenou veličinou

• stanovení• historicky: x 2 SD

• tj. 95% normálně rozložených hodnot

• vlivy, které mohou ovlivňovat distribuci

• věk, pohlaví, rasa, dieta, …• hodnoty mimo referenční

interval• statistická/metodologická

variabilita• biologická variabilita • 5% zdravé populace mimo

Laboratorní vyšetření - fáze• preanalytická

• příprava nemocného na odběr, odběr, uchování, transport do laboratoře

• až 60% chyb vznikne zde• faktory ovlivňující preanalytickou fázi

• biologické (lačnění, věk, hmotnost, gravidita, kouření, pohlaví, rasa, zátěž, biologické rytmy, alkohol, léky a drogy, …)

• odběr (chybná identifikace vzorku, výběr stabilizačního a antikoagulačního (EDTA, heparin, citrát, oxalát) činidla, poloha pacienta, délka zaškrcení, nesprávný odběr z kanyly, hemolýza, špatná technika odběru moče, …)

• transport (doba do separace/centrifugace, teplota, osvětlení (bilirubin), …)

• analytická• laboratoř musí pracovat v souladu se „správnou laboratorní praxí“

• systém vnitřní kontroly (denní kontrola referenčních vzorků) – nutné pro uvolnění výsledku

• zapojení do systému externí kvality kontroly – nezávislou organizací, nutné pro akreditaci (ISO) / certifikaci laboratoře

• postanalytická• interpretace výsledků (referenční hodnoty a časová dynamika

změn)

Diagnostické markery• cirkulující

• ionty• Na, K, Cl, …

• metabolity• glukóza, cholesterol, TG, …

• odpadní produkty• urea, kreatinin, bilirubin, …

• nosiče či látky se specifickou funkcí (nejč. bílkoviny )

• albumin, IgG, fibrinogen, další srážecí faktory, CRP, …

• enzymy• secernované• buněčné

• markery abnormální proliferace a dediferenciace

• mikrobiologické

• tkáňové/buněčné• molekulární

• proteiny • kvantitativní změna exprese

• RNA• kvantitativní změna

transkripce (genové exprese)• DNA

• kvalitativní průkaz poruchy - např. mutace/polymorfizmy

• velké – cytogenetika• malé - PCR

• kultivace buněk in vitro• mikrobiologické

Enzymové markery• lokalizace enzymů

• (1) secernované• plazma: enzymy srážení krve, ceruloplazmin, lipoproteinová

lipáza• GIT: amyláza, elastáza, lipáza, peptidázy

• (2) intracelulární• cytosolické, organelové, membránově vázané, (nukleární)

• faktory ovlivňující koncentraci enzymů v plazmě• aktivita enzymu v buňce• lokalizace enzymu v buňce• propustnost cytoplazmatické membrány• míra poškození buněk• celková masa postižených buněk• rychlost eliminace enzymu

• detekce enzymů• koncentrace

• fyzikálně-chemicky (elektroforéza, chromatografie)• imunochemicky (ELISA, imunohistochemie v tkáňových

řezech)• aktivita

• stanovení reakční rychlosti za různých podmínek – pH, t, c substrátu

• enzymový „vzorec“ orgánu• závisí na specifické aktivitě enzymu, zastoupení

isoenzymů, změna v průběhu ontogeneze• uvolnění intracelulárních enzymů – indikátor poškození

ALTLDH

ALPGMT

koagulačnífaktory

AST

Liver, kidney

Inhibitors

Inhibitors

Vybraná problematika z laboratorní medicíny

Laboratorní ukazatele v kardiologii

Laboratorní diagnostika nekrózy myokardu • klasicky

• myoglobin• kreatinkináza (CK)• isoenzym CK-MB• troponiny I a T (TnI a TnT)• aspartátaminotransferáza

(AST) • laktátdehydrogenáza (LDH)

• nověji• heart fatty acid binding

protein (HFABP)• natriuretický peptid B (BNP)• ischemií modifikovaný

albumin (IMA)• ve zkoušení

• karboanhydráza III• lehké řetězce myosinu (MLC)

• čím je molekula menší, tím rychleji uvolňována (clearance)

• proteiny vázané na membránu jsou uvolňovány > než cytosolické > vázané na kontraktilní aparát

• specificita pro myokard = troponiny 100%

Dynamika srdečních markerův prvních hodinách v horizontu dní

Srdeční strukturální a funkční proteiny – časná diagnostika IM• myoglobin

• intracelulární protein srdečních i kosterních svalových buněk účastnící se aerobního metabolismu

• při poškození buněk se vzhledem k malé velikosti vyplavuje velmi rychle do krevního oběhu (za 0.5 až 2 h)

• nejmenší ze srdečních markerů (~18kDa) - rychle se zvyšuje a velmi rychle se odbourává (normalizace do 24 hod.)

• vzhledem k výskytu myoglobinu i v buňkách kosterních svalů je markerem nespecifickým

• myopatie, úrazy, renální selhání

• troponiny• troponinový komplex – součást strukturálních

proteinů, které se podílí na kontrakci příčně pruhovaných svalů

• heterotrimer složený z troponinů I, T a C• těsně spojen s kontraktilním aparátem – nízké

koncentrace srdečních troponinů v oběhu• není-li srdeční sval poškozen, koncentrace TnI je

prakticky nulová a to i při poškození kosterního svalstva = vysoká senzitivita

• srdeční izoforma troponinu I (TnI) se strukturně liší od analogické izoformy v kosterním svalu – absolutní kardiospecificita

• výhody stanovení TnI• absolutní kardiospecifita• dlouhá doba vylučování – sledování průběhu• senzitivita – detekce i menších poškození• není ovlivněn chronickou renální insuficiencí

• nevýhody stanovení TnI• pomalejší nástup než myoglobin (který je

nespecifický)• dlouho zvýšen – neumožňuje dg. reinfarktu

Myoglobin TnI CK-MB

je zvýšená po 0,5 - 2 h 3 - 6 h 3 – 8h

vrcholí mezi 5 - 12 h 14 - 20 h 9-30 h

přetrvává zvýšená

18 – 30 h 5 - 7 dnů 48-72 h

Srdeční enzymy• kreatinkináza (CK)

• cytoplazmatický a mitochondriální enzym

• katalyzuje reverzibilní přenos fosfátu z ATP na kreatin

• ATP + kreatin ADP + kreatinfosfát

• dimerický enzym – 2 podjednotky• M (muscle)• B (brain)

• 3 izoformy • CK-MM - kosterní sval a myokard• CK-MB - myokard• CK-BB - hladký sval, mozek,

prostata

• CK-MB • diagnóza akutního infarktu

myokardu (i reinfarktu) a monitorování reperfuze během trombolytické léčby akutního infarktu myokardu

• subformy CK-MB1 (v cirkulaci) a 2 (tkáňová)

• poměr ukazuje akuitu IM

• AST• ve vysokých koncentracích v

játrech, svalu a myokardu• LDH

• enzym přítomný v mnoha tkáních• tetramer z LDH podjednotek

• M (gen LDHA, ch.11) • H (gen LDHB, ch.12)

• celkem 5 isoforem:• LDH1 (HHHH), 31 - 49% (myokard,

ledviny, erytrocyty)• LDH2 (HHHM), 38 - 58%

(retikuloendoteliální systém)• LDH3 (HHMM), 6 - 17% (plíce)• LDH4 (HMMM), 0 - 0.7% (ledviny)• LDH5 (MMMM), 0 - 1.5% (kosterní

svaly, játra)

• celk. LDH není dg. pro IM, v myokardu nejvíce LDH1

• poměr LDH1 / LDH2 > 1 podporuje dg. AIM

• v současnosti AST i LDH ztrácí význam v dg. AIM

Dynamika kardiomarkerů

enzym počátek vzestupu

maximum normalizace násobek v maximu

AST 4-8 hod 16-48 3-6 d do 25

CK 3-6 hod 16-36 3-5 d do 25

LD 6-12 hod 24-60 7-15 d do 8

myoglobin 0,5-2 hod 6-12 0,5-1 d do 20

troponin I 3,5-10 hod

12-18 7-20 d do 300

JATERNÍ MARKERY – akutní i chronická onemocnění jater

Dělení biochemických vyšetření jater

• ukazatelé poškození hepatocytů• ALT, AST, LDH

• ukazatelé obstrukce žlučových cest• ALP, GMT

• ukazatelé syntetické funkce jater• albumin, srážecí enzymy, CHE, LCAT, ….

• testy konjugace a jaterního transportu• bilirubin, urobilinogen

Poškození hepatocytů• Alaninaminotransferáza (ALT)

~ <1ukat/l• L-alanin + 2-oxoglutarát

pyruvát + L-glutamát• reakce je reverzibilní,

uplatňuje se při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin

• cytoplazmatický enzym• nejvíce je obsažen

v hepatocytech, hladina zvýšena již při poruše membránové permeability

• normálně převažuje nad AST

• Aspartátaminotransferáza (AST) ~ <1ukat/l• L-aspartát + 2-oxoglutarát

oxalacetát + L-glutamát• reakce je reverzibilní, uplatňuje

se při syntéze, odbourávání i přeměně aminokyselin

• cytoplazmatický a mitochondriální izoenzym

• obsažen zejm. v játrech, myokardu a kosterním svalu

• cytoplazmatický izoenzym se do krve dostává již při narušení permeability buněčné membrány, uvolnění mitochondriálního izoenzymu provází hepatocelulární nebo srdeční nekrózu

Interpretace ALT/AST• zvýšení aktivity ALT i AST u mnoha jaterních chorob

• extrémně vysoké hodnoty (10-100x) u toxických a akutních virových hepatitid a šokových stavů

• aktivita aminotransferáz v plazmě neříká nic o exkretorické či metabolické funkci hepatocytů

• není jednoznačná korelace mezi hladinou aminotransferáz a (histologickou) závažností jaterní léze

• De Ritisův index = AST/ALT• < 0.7 = dobrá prognóza• 1 a více = špatná prognóza (nekróza)

• za normálního stavu i u většiny jaterních chorob je ALT>AST• AST/ALT >2

• alkoholické poškození • postnekrotické cirhózy

Poškození hepatocytů

• Laktátdehydrogenáza (LDH)• játra hlavně LDH4 a LDH5

• přeměna pyruvátu na laktát ve tkáních s anaer. glykolýzou

Obstrukce žlučových cest• Alkalická fosfatáza (ALP)

• membránový enzym katalyzující hydrolýzu fosfátových esterů při alkalickém pH

• především v játrech, střevě a kostech (různé izoenzymy)

• stanovení aktivity v séru se využívá hlavně k posouzení kostních a hepatobiliárních onemocnění

• značná část jaterní ALP v membránách buněk výstelky žlučových cest

• při cholestáze narušení membrán mechanicky a účinkem žlučových kyselin

• zvýšená exprese enzymu při přetlaku ve žluč. cestách

• kromě cholestázy zvýšená u mnoha dalších stavů (tumory jater, cirhóza)

• ‑glutamyltransferáza (GMT)• membránově vázaný enzym

katalyzující přenos ‑glutamylu z glutathionu na aminokyselinu

• umožňuje tak transport aminokyseliny přes buněčnou membránu

• nacházející se v játrech, ledvinách a v prostatě

• stanovení aktivity GMT v séru se využívá pro posouzení hepatobiliárních onemocnění

Syntetická funkce jater

• Albumin• tvořen v játrech, určení

hladiny v séru• dlouhý poločas – neklesá

u akutních poruch• pokles provází chron.

jaterní onemocnění po vyloučení jiné příčiny poklesu

• malabsorpce, snížený přívod bílkovin, onemocnění ledvin

• výrazné snížení u alkoholických cirhóz

• Cholinesteráza (CHE)• sekreční enzym

produkovaný jaterními buňkami do krve

• v plazmě katalyzuje hydrolytické štěpení esterů cholinu a některých dalších substrátů

• pokles aktivity v plazmě u poškození jaterního parenchymu nebo při nedostatku proteinů v dietě

• nevratně je enzym inhibován organofosfáty

CHE vs. ACHE

• Cholinesteráza (CHE)• vyskytuje se volný v

plazmě• pseudocholinesteráza,

nespecifická cholinesteráza, cholinesteráza II, butyrylcholinesteráza

• Acetylcholinesteráza (ACHE)• účastní se přenosu

nervového vzruchu na cholinergních synapsích

• v plazmě se volný nevyskytuje (je však přítomen v erytrocytech)

Syntetická funkce jater

• Hemokoagulační faktory• tvořeny v játrech, krátký poločas – jejich

změny jsou rychlé• Quickův test – vnější cesta aktivace

koagulačního systému• hodnoty se mění u onemocnění jaterního

parenchymu provázených poruchou proteosyntézy

• nebo u obstrukčního ikteru s poruchou vstřebávání tuků a v nich rozpustných vitaminů

Tumorové markery

• látky tvořené nádorem nebo jinými tkáněmi jako reakce na maligní proces• nádorem tvořené

• antigeny (dediferenciace)

• hormony

• enzymy

• onkogeny a antionkogeny

• s nádorem sdružené

Charakteristika ideálního onkomarkeru • kauzální souvislost s maligním procesem

• korelace se stupněm malignity a stadiem nemoci

• odhad histologického typu a lokalizace tumoru

• posouzení efektu terapie a odhad prognózy • takový marker zatím nalezen nebyl

zdraví

četn

ost

(%

)

nemocní

A - absolutní diskriminace

zdraví

četn

ost

(%

)

nemocní

B - omezená diskriminace

Charakteristika onkomarkerů v klinické praxi

• specificita• procento zdravých s negativním nálezem

• ti, kteří jsou vyšetřením správně hodnoceni jako zdraví

• senzitivita• podíl nemocných, kteří byli správně klasifikováni

jako nemocní

• prediktivní hodnota• pravděpodobnost, že pacient, který je testován

pozitivní je opravdu pozitivní a pacient, který je testován jako negativní je opravdu negativní

Charakteristika onkomarkerů v klinické praxi

nemocný zdravý

vyšetření

pozitivní správně pozitivnísenzitivita

falešně pozitivní

negativní falešně negativní správně negativníspecificita

STANOVENÍ IZOENZYMŮ LDH VE VZORKU SÉRA

Praktické cvičení

Laktátdehydrogenáza (LDH) jako diagnostický marker

• Tetramer z LDH podjednotek• M (gen LDHA, ch.11) • H (gen LDHB, ch.12)

• Celkem 5 isoforem:• LDH1 (HHHH), 31 - 49%

• myokard, ledviny, erytrocyty

• LDH2 (HHHM), 38 - 58%• retikuloendoteliální systém

• LDH3 (HHMM), 6 - 17%• plíce

• LDH4 (HMMM), 0 - 0.7%• ledviny

• LDH5 (MMMM), 0 - 1.5% • kosterní svaly, játra

Stanovení isoenzymů LDH

• Isoenzymy se liší nábojem (=ELFO)• elektroforetická

separace v agarózovém gelu s barbitalovým pufrem

• barvící roztok • laktát, NAD+, barvivo

(NBT), fenazinmethosulfát (přenašeč elektronů mezi NADH a barvivem)

• denzitometrické zhodnocení

podložní sklíčkos agarózovýmgelem

vzorek séra

U = 200VI = 30mAt = 60minT = 10*C

barvící roztok(tj. substrát,koenzymy,barvivo)

denzitometrie

Detekce elektroforetických drah• laktát + NAD+ pyruvát + NADH + H+

• NADH + H+ + tetrazoliová sůl (NBT) NAD+ + formazan

Denzitometrické hodnocení