Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity.
description
Transcript of Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity.
Strategie regulace (proteinové) enzymové aktivity.
1. Reversibilní kovalentní modifikace. Katalytické vlastnosti řady enzymů se mění po kovalentní vazbě nějaké skupiny na jejich molekulu – nejčastěji fosforylace. Modifikující enzymy jsou proteinkinasy a proteinfosfatasy.
2. Allosterická kontrola. Allosterické proteiny obsahují regulační místa odlišná od substrátových. Allosterický z řečtiny „allos“ = další, „steros“ = uspořádání. Skládají se z podjednotek (protomerů). Mají schopnost kooperativity. Jako příklady enzym aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa) a neenzymový kyslíkový přenašeč hemoglobin.
3. Mnohočetné formy enzymů. Isozymy – jsou homologní enzymy katalyzující stejnou reakci, ale lišící se jemně ve struktuře a více v Km a Vlim a regulačních vlastnostech.
• 4. Proteolytická aktivace. Mnoho proteinů je syntetizováno v neaktivní formě. U enzymů jsou to zymogeny (proenzymy). Po odštěpení části řetězce přechází zymogen na aktivní enzym. Jako aktivující složky působí proteolytické enzymy jako chymotrypsin, pepsin a trypsin. Aktivace je ireversibilní. Kaspasy, proteolytické enzymy, účastnící se programové buněčné smrti, jsou aktivovány z formy prokaspas. Dalším příkladem je kaskáda enzymů při srážení krve.
5. Kontrola množstvím přítomného enzymu-kontrola na úrovni transkripce. Modul 11, ibiochemie.upol.cz; Regulace genové exprese. (P. Peč).
1. Regulace enzymové aktivity kovalentní modifikací.
• Nejčastější jsou fosforylace a defosforylace• Dalším způsobem modifikace je např.
acetylace. Acetylovány jsou histony (pomocné proteiny obalující DNA v chromosomech a při regulaci genů). Vysoce acetylované histony spojené s geny jsou aktivně přepisovány. Enzymy jsou acetyltransferasa a deacetylasa a jsou regulovány fosforylací.
• Modifikace není vždy reversibilní. Např. připojení ubiquitinu k proteinu.
Kovalentní modifikace proteinů – acetylace vedlejšího řetězce Lys
Sirtuiny: EC 3.5.1.98 histondeacetylasy nebo histonamidohydrolasy.
Protipólem jsou histonacetylasy EC 2.3.1.48
• Sirtuiny (silent information regulator, SIRT) jsou enzymy kódované skupinou vysoce konzervovaných genů přítomných v genomech organismů počínaje archebakteriemi až po eukaryota.
• Tyto enzymy patří do skupiny NAD+-dependentních deacetylas katalyzujících deacetylaci různých proteinů včetně histonů, p53, p300, acetyl-CoAsynthetasy a R-deacetylacitubulin.
• Schopnost deacetylace širokého spektra substrátů určuje klíčovou roli sirtuinů při různých biologických funkcích jako je např. oprava DNA, umlčení transkripce, stabilita genomu, apoptosa, signál insulinu a mobilizace tuků.
Sirtuiny• Sirtuiny – regulace umlčování genů. Sirtuiny vyžadují
pro deacetylaci např. histonů NAD+. Tato skupina enzymů slouží jako citlivý senzor energetického stavu buňky.
• Pokud je k dispozici dostatek živin a metabolismus pracuje na plné obrátky, vzniká velké množství NADH (inhibitor sirtuinů). Naopak, pokud nevzniká velké množství NADH nebo je veškerý NADH převeden na NAD+, díky zvýšené aktivitě dýchacího řetězce, sirtuiny nerušeně fungují.
• Co sirtuiny umějí ? • U kvasinek bylo zjištěno, že větší množství sirtuinů vede
k prodloužení života. Omezený přísun potravy (glukosy) vede k poklesu NADH, sirtuiny jsou aktivovány a deacetylují. Pustí se do histonů a dalších substrátů, které se podílejí na délce života.
Sirtuiny• U savců (u laboratorních myší) je nejdůležitějším
enzymem SIRT1. K jeho substrátům patří proteiny p53 nebo MyoD, které jsou zapojeny do programované buněčné smrti.
• Další cestou vlivu SIRT je tuková tkáň, kde interaguje s transkripčním faktorem PPAR gama a touto cestou brání tvorbě proteinů nutných k syntéze tuků. Tuky jsou místo uskladňování odbourávány.
• SIRT brzdí programovou buněčnou smrt i diferenciaci, mobilizuje zásoby tuků a. umožňuje jejich lepší spalování. Větší počet mitochondrií produkuje méně ROS.
• Účinnost SIRT lze zvýšit podáním resveratrolu, což je přírodní polyfenolická látka vyskytující se např. v hroznové slupce a jadérkách. Francouzský paradox !!
Resveratrol
Vysvětlivky k tabulce: Common covalent modification of protein activity
• Ras = onkogen – rat sarcoma viruses.
• Src = onkogen – Rous sarcoma viruses.
• Myristoyl-CoA = CH3 – (CH2)12 – CO-CoA
• Farnesylpyrofosfát (3 x prenyl, prenylace) –
CH3
CH3 CH3 CH3
O-P-O-P
Fosforylace je vysoce účinný způsob modifikace regulující aktivitu cílového proteinu.
Pyruvátdehydrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2
• PDK inaktivuje pyruvátdehydrogenasu fosforylací za účasti ATP.
• PDK se podílí na regulaci pyruvátdehdrogenasového komplexu jehož je PD prvním enzymem. PDK a pyruvátdehydrogenasový komplex jsou lokalizovány v matrix mitochondrií u eukaryot.
• Komplex převádí pyruvát, jako produkt glykolýzy vzniklý v cytoplasmě, na acetyl CoA., který je posléze oxidován v citrátovém cyklu za tvorby energie.
• PDK snižuje oxidaci pyruvátu v mitochondrii a zvyšuje převod pyruvátu na laktát v cytoplasmě.
• Opačné působení PDK- defosforylace – a aktivace pyruvátdehdrogenázového komplexu je katalyzováno fofoproteinfosfatasou nazývanou pyruvátdehydrogenasafosfatasa.
Regulace pyruvátdehydrogenasového komplexu
Pyruvátdehdrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2
• PDK je stimulována ATP, NADH a acetyl CoA.
• PDK je inhibována ADP, NAD+ CoA-SH a pyruvátem.
• • PDK je také inhibována farmakem
dichloroacetátem, který je sledován jako prostředek k léčení několika metabolických onemocnění – zvláště proti rakovině.
• PDK má čtyři isozymy – PDK1 až PDK4.
Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu:
• Pyruvátdehydrogenasa (E1)• Dihydrolipoyltransacetylasa (E2)• Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3)
• Např. komplex E. coli je 4 600 kD proteinový komplex. Mitochondriální komplex je 10 000 kD protein, obsahující 20 E2 trimerů obklopených 30 E1 heterotetramery a 12 E3 dimerů.
• Pyruvátdehydrogenasový komplex katalyzuje sekvencí tří reakcí, sumárně:
Pyruvát + CoA + NAD+ → acetyl CoA + CO2 + NADH
• Komplex využívá pěti různých koenzymů: Thiaminpyrofosfát (TPP), koenzym A (CoA SH), NAD+, FAD a lipoamid.
17
Thiaminpyrofosfát – TPP, také thiamindifosfát TDP.
Váže se pevně, ale nekovalentně na pyruvátdekarboxylasu. Prekurzorem je
vitamin
B1 – thiamin.
Nekovalentní vazba TPP na
pyruvátdekarboxylasu.
Pyruvátdehydrogenasa (E1)Pyruvát dekarboxyluje za tvorby
hydroxyethyl-TPP meziproduktu.
N+
SCR1
CH3 R2
-
E1
TPP E1
+O C C CH3
O O
-
Pyruvát
H+
CO2
N+
SCR1
CH3 R2
H O C CH3-
E1
Hydroxyethyl- TPP E1
20
Lipoamid a dihydrolipoamid. Lipoová kyselina je vázána na E2 amidovou vazbou
přes -aminoskupinu Lys.
Lipoamid
CH
CH2 CH2 CH2 CH2 C NH (CH2)4 CH
O NH
C
CH2S
SCH2
O
Lipoová kyselina Lysin
Dihydrolipoamid
CH
CH2 CH2 CH2 CH2 C NH (CH2)4 CH
O NH
C
CH2
SH
CH2
O
SH
2H+ + 2e-
21
Hydroxyethylová skupina je přenesena
na dihydrolipoyltransacetylasu (E2). Hydroxyethylový karbanion je současně
oxidován na acetyl a lipoamid redukován na
disulfid. N
+S
CR1
CH3 R2
E1
TPP E1
+
Acetyl- dihydrolipoamid- E2
N+
SCR1
CH3 R2
H O C CH3-
E1
Lipoamid- E2
H+ N+
SCR1
CH3 R2
H O C CH3
S
E2
SH
-E1
E2
S
S
H+
OC
CH3
S
E2
SH
22
E2 (Dihydrolipoyltransacetylasa) poté katalyzuje transesterifikací, při které se
acetyl přenese na CoA za tvorby acetyl-CoA.
Acetyl- dihydrolipoamid- E2
OC
CH3
S
E2
SH
CoA SH
Dihydrolipoamid- E2
SH
E2
SH
+
O
S C CH3CoA
Acetyl- CoA
23
Regenerace lipoamidu na E2. Reoxidace probíhá přes kovalentně vázaný
FAD.
E3 (oxidovaná forma)
SH
E2
SH+S
FAD
S
E3 (redukovaná forma)
S
E2
S+SH
FAD
SH
24
Reoxidace redukovaného E3
(Dihydrolipoyldehydrogenasa ). Elektrony z FADH2 se přenáší na NAD+ za tvorby
NADH. FAD slouží spíše jako vodič elektronů !!!
E3 (oxidovaná forma)
S
FAD
S
S
FAD
S
H2
E3 (redukovaná forma)
SH
FAD
SH
NADH + H+NAD+
25
Aktivní místo
dihydrolipoamiddehydrogenasy.
Cys43
Cys48
FAD
NAD+
Tyr 181
Lipoyllysylové raménko E2 (2x)
• Raménko přenáší meziprodukty reakce mezi jednotlivými enzymy.
CH
CH2
CH2
CH2
CH2
C
NH
O
CH2
SS
CH2
NH
CH
C
O
CH2
CH2
CH2
CH2
Lipoyllysylové raménko (plnì roztažené)
140 nm
27
Animace PD
• http://www.brookscole.com/chemistry_d/templates/student_resources/shared_resources/animations/pdc/pdc.html
Toxicita arsenitanu a organických sloučenin arsenu.
Inhibují pyruvátdehydrogenasu a 2-oxoglutarátdehydrogenasu a tím i
respiraci.
Arsenitan
+
Dihydrolipoamid
+As
OH
OH
O
SH
R
SH
S
R
S
AsO 2 H2O
Organická slouèenina arsenu
+ +As OR1
SH
R
SH
S
R
S
AsR1 H2O
- -
29