49卷南 方 农 业 学 报·1332·

湖南省长沙市番茄黄化曲叶病毒的检测与系统发育分析

鲁清华1，2，张 宇1，2, 张松柏1，2，彭 静2，郑立敏2，张德咏1，2，刘 勇1，2*

（1 湖南大学 隆平分院，长沙 410125；2 湖南省农业科学院 植物保护研究所，长沙 410125）

摘要：【目的】对湖南省长沙市发生的疑似番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）样本进行检测，明确TYLCV在湖南长沙

的发生情况，为TYLCV的防控提供科学依据。【方法】2016年3和11月，在湖南长沙采集疑似TYLCV样本48份，采用已

发表的TYLCV不同株系的全基因组序列，利用DNAMAN进行序列比对，根据保守序列设计特异性引物TY-T-F和TY-

T-R、TY-P-F和TY-P-R对番茄样本的DNA进行PCR、Southern印迹杂交（Sourthern blotting）检测和系统发育分析。对

呈阳性条带的PCR产物进行切胶回收并送样测序，在NCBI上进行BLAST比对分析，利用系统发育分析TYLCV湖南

长沙分离物与国内外株系的相似性。【结果】采集的48份样本中有42份样本能扩增出目的条带，阳性检出率为87.5%；

将42个阳性克隆序列导入MEGA 7.0，得到27个分离物。对测序结果进行同源性分析、多重比对、聚类分析及进化分

析，结果显示27个湖南长沙TYLCV分离物与我国其他省（市）分离物的相似性在98.5%~99.8%，与伊朗株系

（AJ132711和GU076453）、墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亚株系（GU178814）和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分

别介于90.7%~91.5%、95.4%~95.5%、98.6%~98.8%和99.3%~99.4%。【结论】TYLCV已在湖南长沙发生危害，需加强检

疫工作，防止从疫区调运感病番茄，以控制病害扩散蔓延。

关键词：番茄黄化曲叶病毒；番茄；检测；湖南长沙

中图分类号：S436.412.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1332-06

收稿日期：2018-05-10基金项目：国家自然科学基金项目（31601609）；湖南省科技计划项目（2016RS2019）作者简介：*为通讯作者，刘勇（1966-），研究员，主要从事植物病理研究工作，E-mail：haoasliu@163.com。鲁清华（1992-），研究方

向为微生物、介体与植物互作，E-mail：15974138047@163.com

Detection and phylogenetic analysis of Tomato yellow leaf curlvirus in Changsha，Hunan，China

LU Qing-hua 1，2，ZHANG Yu 1，2，ZHANG Song-bai1，2，PENG Jing2，ZHENG Li-min2，ZHANG De-yong1，2，LIU Yong1，2*

（1College of Longping，Hunan University，Changsha 410125，China；2Institute of Hunan Plant Protection，HunanAcademy of Agricultural Science，Changsha 410125，China）

Abstract：【Objective】In order to clarify the occurrence of Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）in Changsha，Hu-nan，the scientific basis for the prevention and control of TYLCV was provided，and the suspected TYLCV samples col-lected in Changsha，Hunan were tested.【Method】In March and November of 2016，48 samples of suspected TYLCVwere collected in Changsha，Hunan. Sequences from the published whole genomes of different TYLCV strains werealigned by using DNAMAN ，then the specific primers TY-T-F and TY-T-R，TY-P-F and TY-P-R were designed accordingto the conserved fragments，and the DNA of the tomato sample was detected by PCR，Southern bloting and phylogeneticanalysis.The PCR products of some positive bands were excised for electrophorosis gel and sequenced. The sequencing re-sult were performed by BLAST comparison analysis on NCBI，and the similarity among Changsha isolates，domesticand foreign strains were studied by phylogenetic analysis.【Result】Among the 48 samples collected，42 samples were dec-ted the target band with a positive detection rate of 87.5%. The 42 positive clone sequences were introduced into MEGA7.0，and 27 isolates were obtained. Homology analysis，multiple alignment，cluster analysis and evolution analysis wereperformed on the sequencing results. The results showed that the similarity between 27 Changsha TYLCV isolates and iso-lates from other provinces（municipalities）in China was 98.5%-99.8%，and the similarities between Changsha TYLCVisolates and Iranian strains（AJ132711 and GU076453），Mexican strain（FJ012358），Australian strain（GU178814）andPortuguese strain（AF105975）were 90.7%-91.5%，95.4%-95.5%，98.6%-98.8% and 99.3%-99.4% respectively.【Conclu-sion】TYLCV has outbroken in Changsha，Hunan. Quarantine work needs to be executed to prevent the transfer of suscep-tible tomatoes from the affected provinces in order to control the epidemic of the disease.

Key words：Tomato yellow leaf curl virus；tomato；detection；Changsha，Hunan

南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2018，49（7）：1332-1337ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp://www.nfnyxb.comDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.07.11

7期 ·1333·

0 引言

【研究意义】番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow

leaf curl virus，TYLCV）是一种在全世界暴发的番茄

病毒之一。最先在以色列报道发生（Picó et al.，

1996），目前已逐步扩展到热带和亚热地区的多个国

家（Segbefia et al.，2018），在我国江苏（赵统敏等，

2007；姜静等，2018）、山东和安徽（余文贵等，2009）、

天津（郝永娟等，2010；金凤媚等，2011）、河北（李志

勇等，2011）、四川（熊艳等，2011）、北京（宋晰等，

2013）、湖北（汤亚飞等，2015）及河南（王浩权等，

2016）等地区均有发生，严重危害我国番茄等经济作

物的生产。番茄是湖南省消费量最大、栽培面积最

广的蔬菜作物之一，是农民增收致富和出口创汇的

重要经济作物，因此，对番茄黄化曲叶病害的检疫及

预防工作必须严格把关，以确保湖南省番茄生产的

健康良性发展。【前人研究进展】国内外对TYLCV的

研究主要集中在基因组结构、传毒介体、地理分布、

症状和传播途径等方面。TYLCV属于双生病毒科

（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）

成员，为单组分双生病毒，DNA-A组分大小2.7~2.8

kb，可用RNA干扰方法将植株体内的病毒滴度降低

（Ammara et al.，2015）。利用病毒诱导的基因沉默

（Virus - induced gene silencing，VIGS）技 术 ，Sl-

MAPK3可调节水杨酸和茉莉酸的信号传导，从而使

番茄对TYLCV的耐受性增强（Li et al.，2017b）。根

据生态学和流行病学研究，在自然界中TYLCV经烟

粉虱持久性传播（Kil et al.，2016；Li et al.，2017a；

Zhao et al.，2018），目前已逐步扩展到热带和亚热带

地区的多个国家（Segbefia et al.，2018），并蔓延到印

度洋海域和包括澳大利亚、新喀里多尼亚和毛里求

斯等的太平洋海域（Mabvakure et al.，2016）。TYL-

CV侵染番茄的典型症状为上部新叶叶片黄化变小，

叶缘卷曲，苗期染病可能导致绝收（Li et al.，

2017a）。【本研究切入点】TYLCV是一种在全球范围

内广泛传播的病毒，该病毒在我国多地被发现，极易

随种苗传播，对番茄产业存在极大威胁。虽然该病

毒的传播介体烟粉虱在湖南省为害严重，但目前尚

无TYLCV在湖南发生危害的报道。2016年3和11

月，湖南长沙市陆续发现疑似TYLCV的番茄植株，

本研究团队立即进行大田采样检测，鉴定疑似该病

毒的番茄幼苗及成苗，调查发生情况。【拟解决的关

键问题】采用TYLCV特异引物TY-T-F和TY-T-R、TY-

P-F和TY-P-R对湖南长沙发生的疑似TYLCV番茄样

本的DNA进行PCR和Southern印迹杂交（Sourthern

blotting）检测，以明确TYLCV在湖南长沙的发生情

况，为TYLCV的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 样本采集 于2016年3和11月从湖南长沙采

集疑似TYLCV样本48份，其中番茄幼苗15份、叶片

33份（表1）。样本用自封袋封口，写好标签，带回实

验室。

1. 1. 2 主要试剂和仪器设备 10×Buffer、dNTP、

Taq DNA聚合酶、DNA Marker和琼脂糖购自北京全

式金生物技术（Transgen Biotech）有限公司；DNA凝

胶回收试剂盒采用美国Axygen公司的AxyPrep

DNA凝胶回收试剂盒；荧光染料SYBR系列购自

Thermo Fisher生产的SYBR-GREEN系列；PCR仪为

基因有限公司（Gene Company Limited）产品；DIG

High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit

I购自Roche公司；BioDOC-IT凝胶成像系统为美国

伯乐公司产品；阳性对照DNA由湖南省农业科学院

植物保护研究所提供，阴性对照为灭菌双蒸水。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 番茄总DNA提取 采用CTAB法提取番茄

叶片总DNA（Turaki et al.，2017）。番茄叶片在液氮

序号No.123456789

品种VarietyT306MT018MTM007

金粉石王后矮黄铃T308T1405MT1202F

T109F红洋梨

采集地点Sampling site

长沙市长沙县春华镇长沙市长沙县春华镇长沙市长沙县春华镇

长沙市芙蓉区湖南农业科学院丰泽小区长沙市芙蓉区湖南农业科学院丰泽小区长沙市芙蓉区湖南农业科学院丰泽小区长沙市芙蓉湖南区农业科学院丰泽小区长沙市芙蓉区湖南农业科学院丰泽小区长沙市芙蓉区湖南农业科学院丰泽小区

样本数（份）Sample number（sample）

654466764

采样日期（年-月-日）Time of collection（Y-M-D）

2016-03-022016-03-022016-03-022016-11-042016-11-042016-11-042016-11-042016-11-042016-11-04

表 1 供试材料情况Table 1 Information of tested material

3月2日采集的样本均为幼苗，11月4日采集的样本均为叶片The samples collected on 2 March were seedlings，and the samples collected on 4 November were leaves

鲁清华等：湖南省长沙市番茄黄化曲叶病毒的检测与系统发育分析

49卷南 方 农 业 学 报·1334·

中研磨成粉末，加入CTAB抽提缓冲液总DNA，经氯

仿∶异戊醇（体积比24∶1）纯化，加入异戊醇沉淀

DNA，加入ddH2O溶解，于-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 引物设计 根据已发表的TYLCV不同株系

全基因组序列，利用DNAMAN进行序列比对，根据

保守序列设计特异性引物（TY-T-F：5' -CTCTGG

AATGAAGGAACAGGCAT-3'，TY-T-R：5'-CCCACT

ATCTTCCTCTGCAATCCA-3'），由华大基因公司合

成，预期条带长800 bp，包含AV1及完整AC2和AC3

区，分别编码外壳蛋白（Coat protein，CP）、移动蛋白

（Movement protein，MP）及复制增强蛋白（Replica-

tion enhance protein，REn）。

1. 2. 3 PCR检测 PCR反应体系50.0 μL：10×Bu-

ffer 5.0 μL、dNTP 200 μmol/L，上、下引物各1.0 μL，

DNA模板 0.1~2.0 μg，Taq DNA聚合酶 1.0 μL，加

ddH2O至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性 5 min；

94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行30个循环；

72 ℃延伸10 min，4 ℃结果反应。每个样本进行3次

重复扩增检测。

1. 2. 4 电泳检测 将PCR扩增产物和番茄总DNA

用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，在BioDOC-IT成像仪

照像，将有特异条带的扩增产物经凝胶回收试剂盒

回收纯化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公

司进行测序。所得序列在NCBI中进行BLAST比对

分析。

1. 2. 5 Sourthern blotting检测 根据1.2.4的测序结

果设计Sourthern blotting特异性引物（TY-P-F：5' -

CAGAATGTATCGAAGCCCTGATG-3'，TY-P-R：5'-

TGCCTGTTCCTTCATTCCAGAG-3'），以总DNA为

模板进行PCR扩增，目的片段长约350 bp，回收后用

Roche 公司的 DIG High Prime DNA Labeling and

Detection Starter Kit I进行地高辛标记，获得探针，

-20 ℃保存。以番茄总DNA进行琼脂糖凝胶电泳

（0.8%浓度）、转膜，杂交方法参照说明书。以健康番

茄总DNA为阴性对照，接种TYLCV番茄总DNA作

为阳性对照。

1. 2. 6 TYLCV扩增片段序列分析 测序结果利用

DNAMAN v6.0进行序列处理，利用Seqman v7.1进

行序列同源性分析，利用MEGA 7.0进行多重比对、

聚类分析及进化分析，采用邻近（Neighbor-Joning）

法构建系统发育进化树，进化树可信度使用1000次

自导复制验证。

2 结果与分析

2. 1 TYLCV在湖南长沙的发生率调查结果

分别以设计的引物对番茄样本基因进行PCR和

Southern blotting检测，结果分别扩增出800（图1和图

2）和350 bp（图3）的片段，均与预期结果一致。表

明湖南省长沙市采集的疑似感病番茄样本均存在

TYLCV侵染。

由表2可知，48份番茄样本中有42份样本检测

出TYLCV感染，检出率为87.5%，其中2016年3月采

集的番茄幼苗样本TYLCV检出率为100.0%；2016年

11月采集的番茄叶片样本TYLCV检出率为81.8%。

2. 2 湖南长沙TYLCV分离物序列分析结果

利用DNAMAN v6.0对42个阳性序列进行处

图 1 番茄幼苗样本TYLCV PCR检测结果Fig.1 PCR detection of tomato seedling samples infected by

TYLCV1~15：番茄样本；P：阳性对照；CK：阴性对照；M：DL2000 DNA Marker1-15：Tomato samples；P：Positive control；CK：Negative control；M：DL2000 DNA Marker

图 2 番茄叶片样本TYLCV PCR检测结果Fig.2 PCR detection of tomato leaf samples infected by TYLCV1~33：番茄样本；P：阳性对照；CK：阴性对照；M：2K PlusII DNA Marker

1-33：Tomato samples；P：Positive control；CK：Negative control；M：2K PlusII DNA Marker

1000 bp 800 bp750 bp500 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 P CK

1000 bp

800 bp

750 bp500 bp

1000 bp750 bp500 bp

800 bp250 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 P CK M 28 29 30 31 32 33 P CK

7期 ·1335·

理，同时用Seqman v7.1进行序列同源性分析，利用

MEGA 7.0进行多重比对、聚类分析及进化分析，结

果得到27个分离物，27个TYLCV分离物的相似性在

98.6%~100.0%，与我国其他省（市）分离物的相似性

在98.5%~99.8%，与伊朗株系（AJ132711、GU076453）、

墨西哥株系（FJ012358）、澳大利亚株系（GU178814）

和葡萄牙株系（AF105975）的相似性分别介于90.7%~

91.5%、95.4%~95.5%、98.6%~98.8%和99.3%~99.4%。

聚类分析结果（图4）显示，TYLCV可分为5个分支，

TYLCV湖南长沙分离物与我国辽宁（KJ754193，

KJ754194）、上海（GU434143和GU434144）和广东

（JQ867092）等省（市）的TYLCV分离物及澳大利亚

（GU178814）、墨西哥（FJ012358）等TYLCV分离物

聚类在同一分支。

3 讨论

目前，TYLCV已在我国20多个省（市）发生并危

害番茄生产，该病毒的传播介体烟粉虱在湖南省为

害严重，但尚未见在湖南省发生危害的报道。本研

究对湖南长沙疑似感染TYLCV的番茄样本进行

PCR、Sourthern blotting检测和测序分析，结果表明

湖南长沙已有TYLCV发生，是TYLCV在湖南长沙

的首次报道。

从系统发育进化树（图4）分析可知，湖南长沙

27个TYLCV分离物的相似性在98.6%~100.0%，说明

这些分离物毒源相同，番茄从同一地方调运，11月采

集的番茄样本的毒源有可能来自3月采集的番茄；

湖南长沙TYLCV分离物与我国其他省（市）分离

物比较，相似性在98.5%~99.8%，从系统发育进化树

可知，其分离物与广东（JQ867092）、浙江（AM698117）

和天津（GU563330）等株系相似性较高，与上海株系

（GU434144）和辽宁株系（KJ754194）相似性最高，说

明湖南地区的TYLCV最有可能来自上海或辽宁地

区的番茄调运；湖南长沙TYLCV分离物与国外分离

物比较，与伊朗株系（AJ132711和GU076453）、墨西

哥株系（FJ012358）、澳大利亚株系（GU178814）和葡

萄牙株系（AF105975）的相似性分别介于90.7%~

91.5%、95.4%~95.5%、98.6%~98.8%和99.3%~99.4%，

说明湖南长沙TYLCV也有可能来自进口自澳大利

亚或葡萄牙的番茄。因此，湖南长沙TYLCV毒源可

能来自澳大利亚和葡萄牙进口的番茄，或来自辽宁

和上海等地调运的番茄。

据报道，TYLCV是一种在全世界暴发的番茄病

毒之一，最先在以色列报道发生，已在中东地区蔓延

（Picó et al.，1996），故而湖南长沙TYLCV分离物与

中东地区伊朗株系（AJ132711和GU076453）具有

90.7%~91.5%的相似性。目前TYLCV已逐步扩展

到热带和亚热带地区的多个国家（Segbefia et al.，

2018），在我国江苏（赵统敏等，2007；姜静等，2018）、

河南（王浩权等，2016）、山东和安徽（余文贵等，

2009）、河北（李志勇等，2011）、北京（宋晰等，2013）、

天津（郝永娟等，2010；金凤媚等，2011）、四川（熊艳

等，2011）和湖北（汤亚飞等，2015）等20多个地区也

先后发生危害，总体趋势是从沿海地区逐渐向内陆

乃至全国蔓延，严重危害我国的番茄生产。

目前，国内外尚缺乏对TYLCV抗性较好的番茄

品种。Mangal等（2017）分析对比辣椒和番茄的基因

组，找到番茄抗性区域，杂交选育TYLCV抗性品种。

Segbefia等（2018）通过对具有TYLCV抗性的野生

番茄与栽培番茄回交杂交，选育出具有一定抗性的

番茄品种。因此，在番茄生产上，选择抗TYLCV品

种非常重要。此外，在番茄苗期应注意检测和防治

TYLCV发生危害，以防TYLCV在湖南省快速扩展

蔓延。

4 结论

对48份番茄样本的PCR和Sourthern blotting检

测结果表明，TYLCV在湖南长沙已有发生。今后需

加强检疫工作，防止从疫区调运感病番茄，以控制番

茄黄化曲叶病毒病进一步扩散蔓延。

样本Sample

番茄幼苗 Tomato seedling番茄叶片 Tomato leaf

检测数量（份）Number tested（sample）

1533

感染数量（份）Number infected

（sample）1527

图 3 番茄样本DNA Sourthern blotting分析结果Fig.3 Southern blotting analysis for DNA of tomato samples1~11：从48个番茄样本中随机挑选的11份番茄样本（1、3、4：番茄幼苗样本；2、5~11：番茄叶片样本）；P：阳性对照；CK：阴性对照1-11：11 tomato samples randomly selected from 48 samples（1，3，4：To-mato seedling samples；2，5-11：Tomato leaf samples）；P：Positive con-trol；CK：Negative control

表 2 48份番茄样本的YLCV检测结果Table 2 Detection of TYLCV in 48 tomato samples

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P CK

350 bp

鲁清华等：湖南省长沙市番茄黄化曲叶病毒的检测与系统发育分析

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图 4 基于TYLCV相似性构建的系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on TYLCV similarity

TYLCV-HN-22

TYLCV-HN-29TYLCV-HN-30

TYLCV-HN-26

TYLCV-HN-7TYLCV-HN-18

TYLCV-HN-seedling-4

TYLCV-HN-seedling-5TYLCV-HN-3

TYLCV-HN-16

TYLCV-HN-24TYLCV-China-shanghai（GU434144）

TYLCV-HN-seedling-1TYLCV-HN-seedling-6

TYLCV-HN-seedling-8

TYLCV-HN-10

TYLCV-HN-23

TYLCV-HN-seedling-3

TYLCV-HN-27TYLCV-HN-seedling-2

TYLCV-HN-19

TYLCV-HN-31

TYLCV-HN-5

TYLCV-HN-2

TYLCV-HN-seedling-7

TYLCV-China-Liaoning（KJ754194）TYLCV-HN-20

TYLCV-Portugal（AF105975）TYLCV-Shanghai（GU434143）

TYLCV-Bundaberg（GU178820）

TYLCV-China-Guangdong（JQ867092）TYLCV-Australia（GU178814）

TYLCV-Mexico（FJ012358）

TYLCV-China-zhejiang（AM698117）TYLCV-China-Shijiazhuang（KF612971）

TYLCV-HN-15

TYLCV-HN-11TYLCV-China-Liaoning（KJ754193）

TYLCV-China（KU892717）TYLCV-China-Shanxi（JN412854）

TYLCV-China-Tianjin（GU563330）

TYLCV-USA（EF539831）TYLCV-Australia（KX347135）

TYLCV-Osaka（LC099965）TYLCV-Iran（AJ132711）

TYLCV-Iran（GU076453）

TYLCV-Egypt（AY594174）

TYLCV-Jordan（JX131286）

TYLCV-Turkey（AJ812277）

TYLCV-Mauritius（KX347172）

TYLCV-Iran2（EU085423）TYLCV-Iraq（JQ354991）

TYLCV-Italy（DQ144621）

TYLCV-Gezira（AY044138）ToLCTWV-Taiwan（KP195720）

0.02

5550

52

53

60

52

64

7期 ·1337·

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（责任编辑 麻小燕）

鲁清华等：湖南省长沙市番茄黄化曲叶病毒的检测与系统发育分析