Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére
-
Upload
emily-decker -
Category
Documents
-
view
29 -
download
0
description
Transcript of Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére
![Page 1: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/1.jpg)
Állatkísérletek az Állatkísérletek az orvostudományban- orvostudományban- In vitroIn vitro
modellek élő állatok modellek élő állatok helyettesítésérehelyettesítésére
Tuboly Eszter
Tanársegéd
Sebészeti Műtéttani Intézet
![Page 2: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/2.jpg)
Az alternatívák szükségességeAz alternatívák szükségessége
• Élő modellek kiváltása
– Társadalmi megítélés, az igény egyre nő– Szervezeti fellépések– Törvényi szabályozás– Költségek, ellenőrzés
• 2013. 03.11-étől 2013. 03.11-étől Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését
– SEURAT-1 (50 millió €)
![Page 3: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/3.jpg)
• In vitro modellek előnyeiIn vitro modellek előnyei
– Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak– Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség– Sokszor szükségesek a publikáláshoz– Időmegtakarítás, elemszám
• HátrányokHátrányok
– Nem feltétlenül költséghatékonyabb– Nem igazán életszerű– Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma)– Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem
alkalmas
![Page 4: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/4.jpg)
A 3A 3 R: R:
• Replacement • Reduction• Refinement
Russell and Burch
![Page 5: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/5.jpg)
A helyettesítés egyre hatékonyabbA helyettesítés egyre hatékonyabb
![Page 6: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/6.jpg)
Lehetőségek élő állatmodellek helyettesítéséreLehetőségek élő állatmodellek helyettesítésére
• Csak kémiai komponensek• Szöveti homogenizátum,
izolált organellum • Ex vivo kísérletek• Sejt-és szövetkultúrák• Mesterségesen növesztett
szövetek, szervek• Invazív beavatkozás
helyett kezelés
![Page 7: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/7.jpg)
• Biokémiai tesztek• Immunkémiai technikák (bakteriális
toxinok azonosítására)• Szerv, szövet vagy sejtkultúrák
(biokémiai kutatások céljára)• Mikroorganizmusok (karcinogén ill.
mutagén anyagok tesztelésére)• Magasabbrendű növények• Néhány metazoa parazita• Komputer szimulációs modellek
![Page 8: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/8.jpg)
SejttenyésztésSejttenyésztés• 1907 óta létező technika• ’50-es évektől kezdve elterjedt eljárás
– Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin
• Társaságok, sejt-és szövetbankok• Izolált-és mai napig fenntartott
sejtvonalak (HeLa)• Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése
(gyógyszergyártás)• Gén-és biotechnológia alappillére
(klónozás)• Rákkutatás (nanotechnológia)• Őssejt-és génterápia (etikai kérdések)• Szintetikus biológia (mesterséges
szervek, programozott sejtek)• Virológia (vakcinák készítése)
![Page 9: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/9.jpg)
Vizsgálati lehetőségekVizsgálati lehetőségek• Az adott sejt életfolyamatainak
nyomonkövetése (sejtanalízis)• sejt-sejt kölcsönhatások, a
sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok)• a sejtek különböző kémiai anyagokra adott
válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés)• különböző sejteredetű fehérje termékek
előállítására (biotechnológiai ipar) • “tissue engineering” céljára
• Sejttenyészetek eredete:• szöveti explantok ("explant kultúrák") • sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")
![Page 10: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/10.jpg)
Sejttenyészetek típusaiSejttenyészetek típusaiPrimer tenyészetek:
• embrionális ill. felnőtt szövetből• korlátozott ideig tarthatók fenn• élettartamuk véges (hetek,
néhány hónap)
• előnyük:– a sejtek nem tekinthetők módosított
ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri.
• hátrányuk: – a kultúrák korlátozott élettartama– minden egyes preparátum kicsit
eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk.
Sejtvonalak:
• abnormális, gyakran transzformált sejtek
• homogén sejtpopuláció• élettartamuk korlátlan• Leggyakrabban rákkutatási
célok• Könnyebb velük dolgozni, már
nem kell izolálni
![Page 11: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/11.jpg)
Ami nélkül nem megy…Ami nélkül nem megy…
• Laminaris fülke• HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít • Horizontális
– A levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas
• Vertikális– A levegő felülről lefelé áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a
legalkalmasabb
• CO2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom)• Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp
![Page 12: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/12.jpg)
![Page 13: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/13.jpg)
• Speciális tápfolyadék (médium)
• Ionikus homeosztázis
• Vitaminok, kofaktorok, fémek
• Fehérjék, lipidek• Energia• Szérum• Bakteriocid-fungicid
koktél
• Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés)
• Steril öltözet• UV-védelem• Speciális
tenyésztőedények• Saját eszközök• Vízfürdő,
hűtőszekrény• 70%-os alkohol• Dezinficiens
![Page 14: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/15.jpg)
![Page 16: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/16.jpg)
• A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk:
• Kollagen (kötőszöveti fehérje)• Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék)• Laminin (heteromer glycoprotein)• Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos
polimer)• Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav)
• A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz
adott szuplementumok:• Foetal bovine vagy calf serum• Növekedési faktorok • Insulin
![Page 17: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/17.jpg)
Alkalmas sejttípusokAlkalmas sejttípusok
• Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az izom-és idegsejtek
• Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem osztódnak, rövid élettartam
• Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak, generációs idejük rövid,gyorsan nőnek
• Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük, gyorsan nőnek
• Embrionális sejtek: jól szaporodnak, kényesebbek
• Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek, rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)
![Page 18: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/18.jpg)
![Page 19: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/19.jpg)
Sejtkultúra előállításaSejtkultúra előállítása• Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus,
sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt
• Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok• neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg
hibridómák, transzformált sejtek• Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés
üteme különböző• A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek
növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)
![Page 20: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/20.jpg)
• Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter)
• Mosás, szűrés• Sejtek médiumba ágyazása, kezelése • Sejtnövesztés inkubátorban• Sejtszámolás időről-időre (ePetri)• Minden típus esetén szükséges a rendszer ki-
titrálása• Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra• Passzálás • Viabilitási-tesztek• Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)
![Page 21: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/21.jpg)
![Page 22: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/22.jpg)
A sejttenyésztő rémálma…A sejttenyésztő rémálma…
Befertőződés
• Kémiai anyagok által (lejárt médium)• Biológiai ágensek: baktériumok, gomba
(mycoplasma-tesztek, alkohol, szájmaszk)• Médiumban indikátor: fenolvörös: metabolikus
aktivitást jelez a pH változása• Fertőzésgyanúnál ki kell dobni a rendszert és
mikrobiológiai vizsgálatot kérni• Újra kell fertőtleníteni a helyiséget és az eszközöket• Autokláv, inkubátor vízcseréje, alkohol• Félévente speciális takarítás ajánlott
![Page 23: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/24.jpg)
SzövettenyésztésSzövettenyésztés• Sejtek szövetekként történő növesztése egy
speciális vázon (scaffold)• Célja: pótolni a többé már nem funkcióképes
szöveteket, javítani az adott szerv funkcióját• Regeneratív medicína-szintetikus biológia-őssejt
terápia • Fontos az immunrendszer válaszának
minimalizálása (graft vs. host) így a legjobbak az autológ sejtek
• Alkalmaznak allogén sejteket is (immunszupresszió, MHC mutációk)
• Xenogén sejtek (sertés, anti-inflammációs gének KI- a jövő útja?)
![Page 25: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/25.jpg)
ScaffoldScaffold• Hálózatos polymer, különböző anyagokból
készülhet (protein, poliszacharid, polipeptid)
• Lehetővé teszi a sejtek számára a növekedést, átjárható a tápanyagok számára, ECM képes rajta létrejönni
• Meg kell tartania a szövet eredeti 3D-s struktúráját
• Biztosítania kell a sejtek számára megfelelő mikrokörnyezetet
• Megengedi a sejtek migrációját
![Page 26: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/26.jpg)
Egy ideális scaffold…Egy ideális scaffold…
• 3D• Keresztkötéseket tartalmaz• Pórusokat tartalmaz• Biológiailag lebontható• Megfelelő kémiai körülmények uralkodnak a
felszínén• Bírja a mechanikai terhelést• Biokompatibilis• Elősegíti a természetes gyógyulási folyamatokat• Hozzáférhető• Nagyüzemben gyártható
![Page 27: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/27.jpg)
![Page 28: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/28.jpg)
![Page 29: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/29.jpg)
Leggyakoribb típusokLeggyakoribb típusok
• Polymerek– Kollagén– Laminin– Fibrin– Decellularized matrix (szív)
• Kristályos anyagok– Hydroxyapatite– Kálcium-foszfát– Bioglass
![Page 30: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/30.jpg)
Elkopott porcok helyettesítéseElkopott porcok helyettesítése
– Porcsejtek– Kollagén váz– Nem igényel kiterjedt
érhálózatot
![Page 31: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/31.jpg)
CsontnövesztésCsontnövesztés
• Őssejtek csontsejtekké történő differenciálódásával– A parancs növekedési
faktor függő
• Nem szabad túl nagynak lennie a váznak, különben a sejtek nem kapnak elég oxigént
3D Calcium- scaffold
![Page 32: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/32.jpg)
BőrnövesztésBőrnövesztés
• Kollagén-kitozán, vagy hialuronsav scaffold
• Egyszerre egyféle sejt, 3 sejtréteg
• Égési sérülteknél siker
![Page 33: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/33.jpg)
Cukorbetegek Cukorbetegek ßß-sejtjeinek pótlása-sejtjeinek pótlása
In vivo Islet of Langerhans in pancreas
![Page 34: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/34.jpg)
Mesterséges Mesterséges véredényekvéredények
• By-pass műtéteknél használatos http://popularmechanics.com/
popmech/sci/tech/9805TUMDOM.html
![Page 35: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/35.jpg)
Szív regenerációjaSzív regenerációja
• Szívizomsejt, véredények
• Felnőtt szívizomsejtek tenyésztése nehézkes
• Természetes scaffold (decellularized matrix)
• Sokféle sejttípus, bonyolult terület
![Page 36: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/36.jpg)
Lehetőségek májbetegeknekLehetőségek májbetegeknek
![Page 37: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/37.jpg)
BioprintingBioprinting• Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem)• Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele• Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket,
több rétegben, körben is (3D)• 2 nyomtatófejet használ: sejtek
nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása
• Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít• Véredények by-pass műtétekhez• Távolabbi célok : teljes szervek nyomtatása,
bőrpótlás, mint rutin kezelés
![Page 38: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/38.jpg)
![Page 39: Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051401/568134f3550346895d9c3736/html5/thumbnails/39.jpg)
Köszönöm a figyelmet!!!Köszönöm a figyelmet!!!