การศกษารปแบบการดอยาและยนดอยาของเชอ Staphylococcus aureus

โดย นายณฐพล มงชเกยรตสกล

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต

วทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2559

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

การศกษารปแบบการดอยาและยนดอยาของเชอ Staphylococcus aureus

โดย นายณฐพล มงชเกยรตสกล

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต

วทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร ปการศกษา 2559

ลขสทธของบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร

DETERMINATION OF PATTERN AND ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

By

MR. Nutthapol MUNGCHUKEATSAKUL

A Thesis Submitted in partial Fulfillment of Requirements for Master of Science (MICROBIOLOGY)

Science Silpakorn University Academic Year 2016

Copyright of Graduate School, Silpakorn University

4

หวขอ การศกษารปแบบการดอยาและยนดอยาของเชอ Staphylococcus aureus

โดย ณฐพล มงชเกยรตสกล สาขาวชา จลชววทยา แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต อาจารยทปรกษาหลก ผชวยศาสตราจารย ดร. ธงชย เตโชวศาล

บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศลปากร ไดรบพจารณาอนมตใหเปนสวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต

คณบดบณฑตวทยาลย

(รองศาสตราจารย ดร.ปานใจ ธารทศนวงศ)

พจารณาเหนชอบโดย

ประธานกรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร. เอกพนธ บางยขน )

อาจารยทปรกษาหลก

(ผชวยศาสตราจารย ดร. ธงชย เตโชวศาล )

ผทรงคณวฒภายใน

(ดร. ทกษวน ทองอราม )

ผทรงคณวฒภายนอก

(รองศาสตราจารย ดร. เบญจภรณ ประภกด )

ง

บทคดยอภาษาไทย

56313201 : จลชววทยา แผน ก แบบ ก 2 ระดบปรญญามหาบณฑต ค าส าคญ : Staphylococcus aureus/ ยาตานจลชพ/รปแบบการดอตอยา/ ยนดอยา

นาย ณฐพล ม ง ช เ กยรตสกล : การศกษารปแบบการดอยาและยนดอยาของเชอ Staphylococcus aureus อาจารยทปรกษาวทยานพนธ : ผชวยศาสตราจารย ดร. ธงชย เตโชวศาล

Staphylococcus aureus เปนแบคทเรยกอโรคตดเชอภายในโรงพยาบาลทสาคญ และ

พบไดทวโลก โดยเฉพาะอยางยงเ ชอ S. aureus ท ดอตอยา methicillin (Methicillin resistant S. aureus) และยงสามารถดอตอยาไดอกหลายชนด (multidrug resistant)โดยกลไกการดอยาแตละชนดจะถกควบคมโดยยนดอยาชนดตางๆ วตถประสงคในการศกษาครงนคอศกษาความสมพนธระหวางรปแบบการดอตอยาและยนดอยาของเชอ S. aureus ทแยกไดจากตวอยางสงตรวจผปวยจานวน 31 ไอโซเลทและตวอยางจากสงแวดลอมภายในโรงพยาบาลจานวน 23 ไอโซเลท และยนยนสายพนธดวยการตรวจหายน femA นาเชอมาทดสอบความไวตอยาตานจลชพดวยวธ disc diffusion และหาคา MIC จากนนตรวจหายนทกากบการดอยาแตละชนดดวยเทคนค PCR และ multiplex-PCR ผลการทดสอบพบวาเชอทกไอโซเลทมความไวตอยา chloramphenicol rifampin linezolid และ vancomycin ดงนนจงไมพบเชอสายพนธ vancomycin- intermediate staphylococcus aureus (VISA) และ vancomycin-resistant staphylococcus aureus (VRSA) และตรวจพบเชอสายพนธ true MRSA รอยละ 14.8 เนองจากเชอดอตอยา cefoxitin และ oxacillin และตรวจพบยน mecA รวมดวย ทงนยงพบวาเชอสวนใหญ (รอยละ 83.3) ทดอตอยา penicillin จะตรวจพบยน blaZ รวมดวย พบเชอจานวนรอยละ 9.3 ทไวตอยา erythromycin แตกลบตรวจพบยน ermA รอยละ 9.3 ทไวตอยา gentamicin แตกลบตรวจพบยน aac(6’)/ aph(2'') และรอยละ 12.9 ทดอตอยา tetracycline และตรวจพบยน tetK และ tetM หรอพบทง 2 ยน เชนเดยวกนมรอยละ 9.3 ทไวตอยา tetracycline แตกลบตรวจพบยน tetK และ tetM หรอพบทง 2 ยน จากผลการทดสอบเหลานสรปไดวาการใชวธการทางจโนไทปนอกจากจะชวยยนยนผลทดสอบของวธการทางฟโนไทปแลว ยงชวยลดขอผดพลาดตางๆใหนอยลงและชวยเพมความแมนยาและความจาเพาะไดมากขน ซงเปนสงสาคญสาหรบการตดสนใจเลอกใชยาตานจลชพในการรกษาผปวยไดอยางเหมาะสม และยงชวยลดอตราการดอตอยาไดอยางมประสทธภาพมากทสด

จ

บทคดยอภาษาองกฤษ

56313201 : Major (MICROBIOLOGY) Keyword : Staphylococcus aureus / antibiotic /antibiotic resistance pattern/ antibiotic resistance gene

MR. Nutthapol MUNGCHUKEATSAKUL: DETERMINATION OF PATTERN AND ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Thesis advisor : Assistant Professor Thongchai Taechowisan

Staphylococcus aureus is an important nosocomial infection worldwide, especially

Methicillin resistant S. aureus (MRSA) and multidrug resistant, each antibiotic resistance mechanism is controlled by various resistance genes. Therefore, the aim of this study was to determine correlation between antibiotic resistance pattern and resistance gene in S. aureus isolated from specimen (31 isolate) and swab sample from environment hospital (23 isolate) and species confirmed by femA detection. The antimicrobial susceptibility was determined by disc diffusion test and minimal inhibitory concentration (MIC), including detected antibiotic resistance gene by PCR and multiplex-PCR. The result showed all isolate were susceptible to chloramphenicol, rifampin, linezolid and vancomycin. Thus, Vancomycin- intermediate S. aureus (VISA) and Vancomycin-resistant S. aureus (VRSA) could not found in this study, and 8 ‘true’ MRSA isolates (14.8%) were found as resistance to cefoxitin and oxacillin, including carried mecA genes. In addition, most of S. aureus (83.3%) were found resistance to penicilin that carry to beta-lactam resistance gene (blaZ), 5 erythromycin-susceptible isolate (9.3%) but detected ermA gene, 5 gentamicin- susceptible isolate (9.3%) but detected aac(6’)/ aph(2'') gene, 7 tetracycline-resistant isolates (12.7%) were carry to tetK and tetM or both genes, as well as 5 tetracycline-susceptible isolates (9.3%) but detected tetK and tetM or both genes. These result suggests that can be used genotypic methods methods for confirmation of the results obtained by conventional phenotypic methods and also reduce errors and increase accuracy and specificity which important to determine the appropriate therapy, decisions include reduces the rate of drug resistance most effectively.

ฉ

กตตกรรมประก าศ

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนส าเรจไดดวยดเพราะไดรบความกรณาจาก ผชวยศาสตราจารย ดร. ธงชย เตโชวศาล รองศาสตราจารย ดร. เบญจภรณ ประภกด อาจารยประจ าคณะสงแวดลอมและทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยมหดลและอาจารยคณะกรรมการทปรกษางานวจย ประจ าภาควชาจลชวทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากรทกๆทานทไดใหค าแนะนา ชวยเหลอ สนบสนนและแกไขขอบกพรองตาง ๆ ตลอดระยะเวลาในการศกษาวจย ผวจยขอกราบขอบพระคณในความกรณาเปนอยางสงไว ณ โอกาสน

ขอขอบพระคณอาจารย วญญ ภกด จากภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏร าไพพรรณ และ คณอภวฒน ลาภอานวยทรพย ทใหความร แนวคด แนะแนวทางในการศกษาวจย และใหก าลงใจในการศกษาวจยครงน

ขอขอบพระคณคณกรพรรณ เศวตสวรรณกล นกวทยาศาสตรของภาควชาจลชววทยาทคอยใหคาแนะนาในการใชเครองมอ สารเคมตางๆ และใหความรในบางสวนทเกยวของกบวทยานพนธของผเขยน

ขอขอบคณ นายฐาเอก ปานเจรญกล นางสาวดาราวรรณ โนนสายทอง นางสาวอจฉรา อนทรานวงษ นางสาวพรพมล เลยยทธ นางสาวพรทวา แกวนาเคยน และรนพ ภาควชาจลชลวทยาทกคน ทไดใหความชวยเหลอและเปนกาลงใจตลอดมา สดทายนผเขยนขอขอบพระคณบดา มารดา ครอบครวของผเขยนตลอดจนผเขยนหนงสอและบทความตางๆทไดใหความรแกผเขยนจนสามารถใหวทยานพนธฉบบนสาเรจไดดวยด

ณฐพล มงชเกยรตสกล

ช

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย ............................................................................................................................ ง

บทคดยอภาษาองกฤษ ...................................................................................................................... จ

กตตกรรมประกาศ ............................................................................................................................ ฉ

สารบญ ............................................................................................................................................. ช

สารบญภาพ ...................................................................................................................................... ฎ

สารบญตาราง ................................................................................................................................... ฏ

บทท 1 บทน า .................................................................................................................................... 1

ความเปนมาและความส าคญของปญหา ....................................................................................... 1

วตถประสงคของการศกษา ........................................................................................................... 2

สมมตฐานของการศกษา ............................................................................................................... 3

ขอบเขตการศกษา ......................................................................................................................... 3

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ ........................................................................................................... 4

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ ............................................................................................. 5

โรคตดเชอในโรงพยาบาล (Nosocomial infection) ...................................................................... 5

เชอกอโรค (Pathogen) ........................................................................................................... 5

ผทตดเชอ (Host) .................................................................................................................... 6

สงแวดลอม (Environment) ................................................................................................... 6

Staphylococcus aureus ................................................................................................................. 6

สมบตทางชวเคมและลกษณะทางสณฐานวทยา ........................................................................... 7

สรรวทยาและปจจยทท าใหเกดความรนแรงในการเกดโรค .......................................................... 7

ซ

ผนงเซลล (cell wall) ............................................................................................................ 7

Protein A ..................................................................................................................... 9

Teichoic acids ............................................................................................................. 9

สารทเชอ S. aureus สรางขน ......................................................................................................... 9

สารพษ (Toxin) ..................................................................................................................... 9

เอนไซม (Enzymes) ............................................................................................................. 10

โรคตดเชอทเกดจากเชอ S. aureus .............................................................................................. 11

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ............................................................... 13

ระบาดวทยาของเชอ MRSA ....................................................................................................... 15

การดอตอยาตานจลชพและการรกษาโรคตดเชอ S. aureus ......................................................... 16

β -lactam ............................................................................................................................ 17

Penicillin ................................................................................................................... 17

Penicillinase-resistant penicillin ............................................................................... 17

Glycopeptide ....................................................................................................................... 18

Aminoglycoside .................................................................................................................. 19

Tetracycline ......................................................................................................................... 19

Macrolide, Lincosamide, Streptogramin (MLS) ................................................................. 20

Chloramphenicol ................................................................................................................. 21

Fluoroquinolone .................................................................................................................. 21

Rifampin .............................................................................................................................. 22

Linezolid ............................................................................................................................. 22

Sulfonamide และ Trimethoprim ......................................................................................... 23

การวนจฉยเชอ S. aureus ............................................................................................................ 25

การเกบสงสงสงตรวจ (specimen) ....................................................................................... 25

ฌ

การจ าแนกเชอ S. aureus ออกจากเชอกลมอน ..................................................................... 25

การวนจฉยการดอตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ดวยวธการทางฟโนไทป ......................... 27

Agar disc diffusion .............................................................................................................. 27

Minimal inhibitory concentration (MIC) by broth dilution test .......................................... 27

การวนจฉยการดอตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ดวยวธทางชวโมเลกล หรอวธทางจโนไทป ..................................................................................................................................... 29

Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................................................................ 29

บทท 3 วธการด าเนนการวจย .......................................................................................................... 33

วสดอปกรณและสารเคม............................................................................................................. 33

การเกบตวอยาง การเพาะเลยงเชอและการจ าแนกเชอ S. aureus ................................................. 35

การทดสอบความไวของเชอตอยาตานจลชพ .............................................................................. 35

Disc diffusion ...................................................................................................................... 35

Minimum inhibitory concentration (MIC) broth dilution test ............................................ 37

การตรวจหายนดอยาดวยเทคนค PCR และ multiplex-PCR ...................................................... 39

การสกดดเอนเอ (DNA extraction) ...................................................................................... 39

การตรวจหายนดอยาดวยเทคนค PCR และ multiplec-PCR ............................................... 39

บทท 4 ผลการทดลอง ...................................................................................................................... 41

การเกบตวอยางและการจ าแนกเชอ ............................................................................................. 41

การทดสอบความไวตอยาตานจลชพ .......................................................................................... 43

การหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเชอได (MIC) ของยา oxacillin และ vancomycin ... 45

รปแบบการดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus จากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ ............................................................................................................................................. 47

การตรวจหายนดอยาตานจลชพ .................................................................................................. 50

ความสมพนธระหวางผลทดสอบความไวตอยาและยนดอยาตานจลชพแตละชนด .................... 53

ญ

บทท 5 วจารณและสรปผลการทดลอง ............................................................................................ 59

รายการอางอง .................................................................................................................................. 67

ภาคผนวก ก อาหารเลยงเชอและสารเคม ......................................................................................... 80

ภาคผนวก ข ..................................................................................................................................... 84

McFarland Standard Solution No. 0.5 ....................................................................................... 84

ทดสอบคณสมบตทางชวเคม ...................................................................................................... 84

การทดสอบความไวของเชอตอยาตานจลชพ .............................................................................. 87

การสกด DNA............................................................................................................................. 89

การเตรยม Agarose gel ............................................................................................................... 91

การท า Gel electrophoresis ......................................................................................................... 91

ภาคผนวก ค ..................................................................................................................................... 92

ขอมลดบ ..................................................................................................................................... 92

ล าดบนวคลโอไทนของยนดอยาตานจลชพในเชอ S. aureus เทยบกบฐานขอมล GENBANK 109

ค าอธบายค ายอและสญลกษณ................................................................................................... 132

ประวตผเขยน ................................................................................................................................ 133

ฎ

สารบญภาพ หนา

ภาพท 1 องคประกอบของเชอ S. aureus ........................................................................................... 8

ภาพท 2 ความชกของ Hospital-Associated Methicillin-resistant S. aureus .................................. 16

ภาพท 3 Agar Diffusion Test .......................................................................................................... 28

ภาพท 4 Minimal inhibitory concentration (MIC) by broth dilution test ........................................ 28

ภาพท 5 ขนตอนการทดสอบความไวตอยาตานจลชพดวยวธ Disc Diffusion ................................ 36

ภาพท 6 ขนตอนการทดสอบหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเชอดวยวธ broth microdilution……………………………………………………………………………… ........... 38

ภาพท 7 ผลการทดสอบความไวตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ดวยวธ disc diffusion ............. 43

ภาพท 8 ผลทดสอบความไวตอยาของเชอ S. aureus ดวยแผนยาตานจลชพ 11 ชนด ..................... 44

ภาพท 9 ผลการทดสอบหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเชอไดของยา oxacillin 45

ภาพท 10 ผลการทดสอบหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเชอไดของยา vancomycin ......... 46

ภาพท 11 ผลการตรวจหายน femA ………………..…………………………………………… ... 51

ภาพท 12 ผลการตรวจหายน blaZ และ mecA…………………………………………………….52

ภาพท 13 ผลการตรวจหายน aac (6 ′)/aph(2 ′′) ............................................................................. 52

ภาพท 14 ผลการตรวจหายน ermA tetK และ tetM ......................................................................... 53

ภาพท 15 Gram positive cocci ........................................................................................................ 84

ภาพท 16 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมโคแอกลเลส ................................................................. 85

ภาพท 17 ผลทดสอบการหมกน าตาลแมนนทอล ............................................................................ 86

ภาพท 18 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมคาตาเลส ...................................................................... 86

ภาพท 19 ทดสอบความสามารถในการยอยสลายเมดเลอดแดง....................................................... 87

ฏ

สารบญตาราง

หนา ตารางท 1 ยนควบคมกลไกการตอการดอยาตางๆของ S. aureus .................................................... 24

ตารางท 2 คามาตรฐานความไวและดอตอยาตานจลชพททดสอบดวยวธ Disc Diffusion ............... 37

ตารางท 3 คา Minimum Inhibitory Concentration (MIC) มาตรฐานดวยวธ Broth Microdilution 38

ตารางท 4 ไพรเมอรและสภาวะการท าปฏกรยาลกโซทใชในการทดสอบ PCR และ multiplex ... 40

ตารางท 5 หมายเลขเชอ S. aureus ทแยกไดจากตวอยางสงสงตรวจผปวย (specimen) และตวอยางปายเชอ (swab) ................................................................................................................................ 42

ตารางท 6 คาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งการเจรญของเชอ (MIC) ของยา oxacillin และ vancomycin ..................................................................................................................................... 47

ตารางท 7 รปแบบการดอตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ ......................................................................................................................... 49

ตารางท 8 แสดงผลการตรวจหายนดอยาของเชอ S. aureus ในตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอดวยวธ PCR และ multiplex-PCR ........................................................................... 51

ตารางท 9 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Penicillin กบยน blaZ ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ ................................................................................... 54

ตารางท 10 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Cefoxitin และ Oxacillin กบยน mecA ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ.................................................54

ตารางท 11 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Erythromycin กบยน ermA ในเชอ S. aureus ท แยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ....................................................................55

ตารางท 12 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา gentamicin กบยน aac(6’)/ aph(2’’) ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ.................................................56

ตารางท 13 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Tetracycline กบยน tetK และ tetM ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ.................................................57

ตารางท 14 สวนผสมการท าปฏกรยา PCR ...................................................................................... 90

ฐ

ตารางท 15 แสดงขอมลและผลการทดสอบทางชวเคมของตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางทเกบตามสถานทตางๆ (ปายเชอ) ในโรงพยาบาลแหงหนงในจงหวดนครปฐมทงหมด 69 ตวอยาง. 92

ตารางท 16 แสดงผลของการทดสอบความไวตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวย ............................................................................................................................. 95

ตารางท 17 แสดงผลของการทดสอบความไวตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางทเกบดวยวธ ปายเชอ ....................................................................................................................... 97

ตารางท 18 แสดงผลของการหาคาความเขมขนต าสดของยาตานจลชพทสามารถยบย งเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวย ................................................................................................. 99

ตารางท 20 รปแบบการดอยาตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ ....................................................................................................................... 103

ตารางท 21 แสดงผลการตรวจหายนดอยาตานจลชพเชอ S. aureus ทพบในตวอยางสงสงตรวจผปวย ............................................................................................................................................. 104

ตารางท 22 แสดงผลการตรวจหายนดอยาตานจลชพเชอ S. aureus ทตรวจพบในตวอยางปายเชอ ....................................................................................................................................................... 105

ตารางท 23 การเปรยบเทยบระหวางผลการทดสอบความไวตอยาตานจลชพและยนดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ตวอยางสงสงตรวจผปวย ................................................................................. 106

ตารางท 24 การเปรยบเทยบระหวางผลการทดสอบความไวตอยาตานจลชพ MIC และยนดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus จากตวอยาง ปายเชอ ............................................................................... 107

ตารางท 25 แสดงความสมพนธระหวางรปแบบการดอยาและยนดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ...............................................................108

บทท 1 บทน า ความเปนมาและความส าคญของปญหา Staphylococcus aureus เปนแบคทเรยกอโรคทส าคญในมนษย จดอยในกลม staphylococci และถกจดเปนแบคทเรยประจ าถน หรอสามารถพบในรางกายของมนษย (colonization) โดยเฉพาะทบรเวณผวหนง และในรจมก บางครงกอาจกอใหเกดโรคตดเชอในโรงพยาบาล เชน การตดเชอทบรเวณผวหนง กระดก และ ปอด ทงนปจจยส าคญทมผลตอการตดเชอของผปวย เชน ผทมภมตานทานโรคต า ผทไดรบการผาตด ผทมแผลน ารอนลวกไฟไหม ผปวยทไดรบการสอดใสเครองมอทางการแพทยเขารางกาย และการตดเชอในกระแสเลอด ในผปวยทมการตดเชออยแลว ซงถอวามความรนแรงมากทสดท ากระทงอาจสงผลใหผปวยถงกบเสยชวตได นอกจากจะเปนแบคทเรยประจ าถนทกอโรคภายในรางกายผปวยไดแลว ยงมโอกาสตดเชอ S. aureus ไดจากสภาพแวดลอมภายในโรงพยาบาลหรอบคลากรทางการแพทยทอาจพบไดในขณะปฏบตงาน และไปสมผสกบสงแวดลอม และอปกรณตางๆ ภายในหองผปวย เชน เสอผา เตยงผปวย เกาอผปวย พน ผนงหอง ทผวดานนอก และดานในของระบบทอของเครองชวยหายใจ อางลางมอกอกน า สายรดแขนส าหรบเจาะเลอด เปนตน เชอ S. aureus สามารถแพรกระจายสอปกรณเครองใชและสงแวดลอมรอบตวผปวยได ซงถาหากมการสมผสบอยจะท าใหเกดการปนเปอนหรอการแพรกระจายเชอมากขน ดงนนถาสงแวดลอมไมสะอาดยอมจะมเชอโรคปนเปอนมาก สงผลใหผปวยมภาวะเสยงตอตดเชอมากขน (อสยา จนทรวทยานชต และ วชรนทร รงสภาณรตน, 2553)

การรกษาโรคตดเชอ S. aurues เรมขนในป ค.ศ. 1941 โดยการใชยา penicillin G ตอมาเชอไดเกดภาวะดอตอยาชนดนอยางรวดเรว โดยเชอมยน blaZ ทควบคมการสรางเอนไซม β -lactamase ออกมา เพอยบย งการออกฤทธของยา penicillin ตอมาในป ค.ศ. 1961 ไดมการพฒนายา methicillin เพอรกษาผปวยทตดเชอ S. aureus สายพนธทสรางเอนไซมชนดน หลงจากนนไมนานเชอดงกลาวเกดการดอตอยา methicillin และยาในกลม β-lactam จงเรยกเชอชนดนวา Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus หรอ MRSA (Yasmeen et al., 2010)

ปจจบนพบวาเชอ MRSA มการระบาดอยภายในโรงพยาบาลทวโลก (Hospital-associated MRSA, HA-MRSA) ในแถบทวปเอเชยบางประเทศพบวามการระบาดของเชอ HA-MRSA เชน เกาหลใต จน และเวยดนาม (รอยละ 70) รวมถงประเทศไทย (รอยละ 57) ดงนนการตดเชอ S. aureus ทดอยาสงผลใหผปวยมคาใชจายในการรกษาสงขน ใชเวลาในการรกษาเพมขนและยงม

2

โอกาสเสยชวตสงขนอกดวย นอกจากนเชอดอตอยายงสามารถสงผานยนดอยาไปสเชอสายพนธอนๆ สงผลใหเกดปญหาการดอตอยาทวความรนแรงยงขน เชอ S. aureus ทดอตอยา methicilin เกดจากยน mecA ทท าหนาทควบคมการแสดงออกของโปรตน penicillin binding protein 2a (PBP2a) ซงจะจบกบ β-lactam ring ทเปนสวนประกอบหลกของยาในกลม β-lactam แทนโปรตน PBP สงผลใหยาไมสามารถออกฤทธได และเชอ MRSA นอกจากจะดอตอยาในกลม β –lactam ทกชนดแลวยงมการดอตอยาไดหลายชนดรวมดวย (multidrug resistance) (Frost et al., 2009) อยางไรกตามสายพนธ MRSA ท ดอยาหลายชนดยงสามารถรกษาไดดวยยา vancomycin แตทวาในปจจบนพบวามบางสายพนธทดอตอยา vancomycin ในระดบปานกลาง (vancomycin-intermidiate Staphylococcus aureus, VISA และในระดบสง (vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA) สงผลใหตอไปในอนาคตอาจจะไมสามารถน ายา vancomycin มารกษาผปวยได

ในปจจบนเราสามารถตรวจสอบการดอตอยาของเชอ S. aurues ดวยวธทดสอบความไวตอยาตานจลชพมาตรฐานไดหลายวธ เชน oxacillin salt agar, disc diffusion, D-test และ MIC เปนตน ดงนนความแมนย าและความรวดเรวในการตรวจหาเชอ S. aureus นนมความจ าเปนอยางมากตอการตดสนใจเลอกใชยาตานจลชพ เพอหาทางรกษาผปวยทตดเชอ S. aureus ไดอยางเหมาะสม และทนเวลา อกทงการวนจฉยเชอ S. aureus ดวยวธการทางฟโนไทปน เปนวธทใชระยะเวลาในการทดสอบทนาน (Derek et al., 2005) และในบางครงอาจใหผลบวกปลอม (false positive) (รณภทร ส าเภา และ องอาจ, 2557; Datta et al., 2011) จงจ าเปนตองใชเทคนคทางชวโมเลกลในการยนยนการดอตอยา โดยเทคนคทเหมาะสมจะตองมความรวดเรว ใชงานงาย ท าซ าได เทคนคทางชวโมเลกลจงเปนอกทางเลอกหนงทถกน ามาประยกตใชทดสอบการดอตอยา และในการศกษาครงนไดใชเทคนค PCR ซงเปนวธทใหผลทดสอบทรวดเรวมความนาเชอถอ และยงเปนวธมาตรฐาน (gold strandard) ส าหรบตรวจสอบยนดอยาของเชอ S. aureus (CLSI, 2015) วตถประสงคของงานวจยน คอการศกษาความสมพนธของรปแบบการดอตอยา และยนดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ตรวจคดกรองเชอ MRSA VISA และ VRSA และเปรยบเทยบประสทธผลของการตรวจวนจฉยดวยวธการทางฟโนไทป (การทดสอบความไวตอยาตานจลชพ) และวธการทางจโนไทป (PCR และ multiplex-PCR) วตถประสงคของการศกษา

1. เพอศกษาความไวตอยาตานจลชพ และรปแบบการดอตอยาของเชอ S. aureus ดวยวธ disc diffusion

3

2. เพ อ ศกษา และคดกรองเ ชอ methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) และ vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) ดวยการหาคา Minimal Inhibition Concentration (MIC) โดยวธ broth microdilution

3. ตรวจหายนดอยาของเชอ S. aureus ดวยวธ PCR และ Multiplex-PCR เพอยนยนการดอตอยาของเชอ S. aureus 4. เพอศกษาความสมพนธระหวางรปแบบการดอตอยา และยนดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus สมมตฐานของการศกษา 1. เชอ S. aureus ทดอตอยามการแพรกระจายของเชออยางตอเนองภายในตวผปวย และสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล หรอสงของทผปวยสมผสอยเปนประจ า 2. เชอ S. aureus ทแยกไดจากผปวย และสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล มรปแบบการดอตอยาทหลากหลาย 3. เชอ S. aureus บางสายพนธมยนดอยาตานจลชพหลายชนด ขอบเขตการศกษา 1. แยกเชอ S. aureus จากตวอยางสงสงตรวจของผปวย เชน เลอด, เสมหะ และ ปสสาวะ เปนตน และเกบเชอจากสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล เชน ราวเหลก เตยงผปวย พน หองน า เปนตน โดยตวอยางทงหมดจะเกบในโรงพยาบาลแหงหนงในจงหวดนครปฐม

2. คดเลอกและจ าแนกเชอ S. aureus ดวยวธการทางชวเคม เชน การยอมแกรม, ทดสอบการสรางเอนไซมคาตาเลส การหมกน าตาลแมนนทอล การยอยสลายเมดเลอดแดง และการสรางเอนไซมโคแอกลเลส 3. ตรวจสอบความไวตอยาตานจลชพชนดตางๆดวยวธ disc diffusion และตรวจคดกรองเชอ MRSA VISA และ VRSA ดวยวธ broth microdilution

4. ตรวจสอบหายนทเกยวของกบการดอตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ดวยเทคนค PCR และ Multiplec-PCR

5. ตรวจสอบความสมพนธของรปแบบการดอตอยาและยนดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus

4

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ สามารถน าขอมลไปใชเพอเฝาระวงเชอดอตอยา เฝาระวงการใชยา รวมถงใชเปนขอมลก

ในการตดสนใจเลอกใชยาตานจลชพในการรกษาผปวย ไดอยางเหมาะสม ทนเวลาและยงชวยลดอตราการดอตอยาไดอยางมประสทธภาพมากทสด

5

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ โรคตดเชอในโรงพยาบาล (Nosocomial infection) โรคตดเชอในโรงพยาบาลเปนอกปญหาหนงทส าคญของทกโรงพยาบาลทวโลก ซงสาเหตของการตดเชอในโรงพยาบาล (Healthcare- associated infection) เปนผลมาจากการทผปวยไดรบเชอหรอ พษของเชอ (toxin) ขณะรบการรกษาในโรงพยาบาลโดยทผปวยไมมการตดเชอนนมากอน หรอการตดเชอนนไมอยในระยะฟกตวของโรค หรอ/และการตดเชอใดๆ กตามทเกดขนภายหลงจากผปวยเขารบการรกษาตวในโรงพยาบาล ผปวยมอตราเสยงตอการตดเชอเพมมากขน รวมถงท าใหเกดอตราการเสยชวตจากภาวะโรคแทรกซอนเพมขนหรอสงผลใหผปวยตองนอนพกรกษาตวในโรงพยาบาลยาวนานขน เปนสาเหตใหสญเสยเวลาและคาใชจายในการรกษาตวเพมมากขน นอกจากนยงมผลกระทบอนๆ คอ ความทกขทรมานจากการเจบปวยทเพมขนจากเดม ความสญเสยทางเศรษฐกจ และประสทธภาพการรกษาดอยลง ส าหรบการแพรกระจายเชอนน สวนใหญจะตดตอทางการสมผส ท งทางตรงโดยใชมอ และทางออมโดยผานอปกรณของเครองใชตางๆ นอกจากนการรกษาผปวยโรคตดเชอ ตองไดรบการวนจฉยอยางถกตองและตองใหการรกษาทรวดเรว โดยเฉพาะอยางยงถาเชอเกดการดอตอยาตานจลชพ (Antimicrobial Resistance, AMR) ซงมสาเหตมาจากพฤตกรรมการใชยาปฏชวนะอยางไมเหมาะสมของผ ปวย โดยเกดจากการรบประทานยาไมครบตามขนาดทเหมาะสม ท าใหเชอกอโรคเกดพฒนาหรอกลายพนธกระตนใหเชอกอโรคนนเกดการดอยาในทสด (ขวญตา กลาการนา , 2550; อสยา จนทรวทยานชต และ วชรนทร รงษภาณรตน, 2553; ยทธนา สดเจรญ, 2554) ส าหรบปจจยทกอใหเกดโรคตดเชอ ไดแก

เชอกอโรค (Pathogen) เชอกอโรคทเปนสาเหตของโรคตดเชอในโรงพยาบาล มกเปนเชอประจ าถน หรอเชอทพบในรางกายของผปวย (colonization) โดยพบวาสวนใหญเกดจากเชอแบคทเรย ซงเชอแบคทเรยทเปนสาเหตของโรคตดเชอในโรงพยาบาลมากทสดในประเทศไทย ไดแก แบคทเรยแกรมลบ เชน Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa และแบคทเรยแกรมบวก ไดแก Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) และ enterococci ซงเชอเหลานมกเปนเชอทดอตอยาตานจลชพในระดบสง เนองจากมการใชอยางไมระมดระวงสงผลใหอตราการดอตอยาของเชออยในระดบสง และจ าเปนตองใชสารตานจลชพทมประสทธภาพสงซงมราคาแพง และอาจกอใหเกดอาการขางเคยงทรนแรง

6

ผทตดเชอ (Host) ผตดเชอสวนใหญเปนผทเขารบการรกษาในโรงพยาบาล ปจจยส าคญทมผลตอการตดเชอ คอ สภาวะภมตานทานโรคของผตดเชอ โดยพบวาผทมภมตานทานโรคต า ไดแก เดกเลก ผสงอาย ผทไดรบการรกษาโดยใชยารกษามะเรง ผทไดรบการผาตด ผทมแผลน ารอนลวกไฟไหม ผปวยทไดรบการสอดใสเครองมอทางการแพทยเขารางกาย เพอการวนจฉย หรอการรกษาโรค เชน การใสสายสวนปสสาวะ การใชเครองชวยหายใจ การฉดยา การเจาะเลอด เปนตน

สงแวดลอม (Environment) สงแวดลอมโดยครอบคลมถง หอผปวย, หองผาตด และอาคารสวนอนๆ ของโรงพยาบาล รวมถงเครองมอทางการแพทย บคลากรทางการแพทย ญาตของผปวย รวมทงสขอนามยของโรงพยาบาล ไดแก น าดม น าใช ระบบการระบายน า การก าจดของเสย ความสะอาดของอาคาร สถานท ซงถาสงแวดลอมทสกปรกยอมมเชอโรคปนเปอนมาก สงผลใหผปวยมโอกาสตดเชอกอโรคมากขน (สมหวง ดานชยวจตร, 2533; อสยา และคณะ, 2548; Harold, 1996) Staphylococcus aureus S. aureus เปนแบคทเรยกอโรคทส าคญในมนษย จดอยในกลม staphylococci และถกจดเปนแบคทเรยประจ าถน หรอเชอทสามารถพบในผปวย (colonization) ซงแบคทเรยชนดนไมไดพบเฉพาะคนทเปนโรคเนองจากตดเชอนเทานน แตยงพบในคนทมสขภาพดดวย นอกจากน S. aureus ยงพบตามสวนอนๆ ของรางกายไดอก เชน ผวหนง ในจมก คอ และผม บางครงพบในอจจาระดวย S. aureus เปนแบคทเรยทมความส าคญทางการแพทยอยางมาก เพราะสามารถกอใหเกดการตดเชอไดทกสวนของรางกายหรอการตดเชอทผวหนง เชน การอกเสบเปนหนองของรขมขน (folliculitis) ชนใตผวหนงอกเสบ (Cellulitis) และการตดเชอทผวหนงก าพรา (impetigo) เปนตน เชอ S. aureus สามารถกอใหเกดปจจยทท าใหเกดความรนแรงในการเกดโรคไดหลายแบบสรางสารพษ (α-hemolysin, Panton-Valentine leukocidin) superantigen (enterotoxin, toxic shock syndrome toxin-1) ย บย งกระบวนการฟาโกไซโตซส (polysaccraride capsule, protein A) และหลกเลยงระบบภมคมกน (staphylokinase) นอกจากนเชอ S. aureus สามารภกอใหเกดโรคขนรนแรงไดหลายชนด เชน โรคปอดบวม (pneumonia) การตดเชอในกระแสเลอด (septicemia) และการตดเชอแผลผาตด (surgical-wound infections) ซงการตดเชอกอโรคชนดนสงผลใหมอตราการเสยชวตของผปวยภายในโรงพยาบาลเพมขน (Levinson, 2010)

7

สมบตทางชวเคมและลกษณะทางสณฐานวทยา Staphylococcus aureus เปนแบคทเรยแกรมบวก มลกษณะเปนทรงกลมมขนาดเสนผาน

ศนยกลางเซลลประมาณ 0.5-1.5 ไมโครเมตร ไมเคลอนท ไมสรางสปอร มการเรยงตวเปนเซลลเดยว เซลลคสายสน ๆ หรออยรวมเปนกลมคลายพวงองน ไมเคลอนทและไมสรางสปอร ลกษณะโคโลนจะกลม นน ขอบเรยบและขนเลกนอย สามารถสรางรงควตถแคโรทนอยด (carotenoid) ทเรยกวา staphyloxanthin ซงท าใหโคโลนมสเหลองทองได บางสายพนธสามารถสรางแคปซลท าใหโคโลนเปนเมอก ซงชวยเพมความทนทานตอการท าลายของยาตานจลชพ และยงเพมความรนแรงในการกอโรค เชอมการด ารงชวตแบบ Facultative anaerobe โดยสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอทวไป เชน blood agar (BA), nutrient agar (NA), tryptic soy agar (TSA), และ brain heart infusion (BHI) agar เปนตน เชอยงสามารถเจรญไดดในททม และไมมออกซเจน ทอณหภม 37 ºC โดยทวไปเชอ S. aureus จะทนตอสภาพแวดลอมทไมเหมาะสมไดด และสามารถมชวตรอดไดนานแมจะอยในหนองหรอเสมหะแหง (สบณฑต นมรตน, 2555) คณสมบตทางสณฐานวทยา และทางชวเคมทวไปของเชอ S. aureus ไดแก การยอมสแกรมตดสแกรมบวก สรางเอนไซมคาตาเลสยอยสลายไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) ใหเปนน า และออกซเจน สรางเอนไซม β-hemolysin ทสามารถยอยเมดเลอดแดงบน blood agar ใหเหนลกษณะเปนวงใสๆรอบโคโลน สามารถหมกยอยน าตาลกลโคส และแมนนทอลได และสรางเอนไซมโคแอกลเลสทสงผลใหพลาสมาเกดการแขงตว เปลยนไฟบรโนเจนใหเปนไฟบรนซงจะปองกนกระบวนการฟาโกไซโตซสของเมดเลอดขาว และการเขาจบของยาตานจลชพได (Maria, 2012; Harris et al., 2002; John, 2006) บางชนดสามารถสรางเอนไซม β-lactamase และ ท าใหแบคทเรยดอตอยากลม β-lactam โดยเฉพาะยากลม Peniciแin (สบณฑต นมรตน, 2555; Kenneth, 2012; Lowy, 2003)

สรรวทยาและปจจยทท าใหเกดความรนแรงในการเกดโรค โครงสรางเซลลของ S. aureus จะมโครงสรางเชนเดยวกบเชอแบคทเรยแกรมบวกทวไป ไดแก

ผนงเซลล (cell wall) ผนงเซลลของ S. aureus ประกอบดวยเปปตโดไกลแคน (ภาพท 1) หลายๆชน เชอมตอกนดวยพนธะเปปไทด ในแตละชนของเปปตโดไกลแคนประกอบไปดวยโพลแซคาไรนซ าๆกนคอ N-acetylglucosamine (NAG) และ N-acetylmuramicacid (NAM) ตอกนเปนสายโซโพลเมอรและม

8

crosslink ระหวางสายเปปตโดไกลแคนแตละสายดวยพนธะเปปไทดของกรดอะมโน (อดมศกด ตงชยสรยา, 2556) นอกจากนเปปตโดไกลแคนยงมคณสมบตกระตนใหมการหลงไซโตไคนท าเกดภาวะเลอดแขงตวในหลอดเลอดแบบแพรกระจาย (Disseminated intravascular clotting, DIC) และยงสามารถสรางแคปซล (Capsule) ซงเปนชนเมอกของสาร Polysaccharide ลอมรอบเซลล แคปซลมคณสมบตเปนแอนตเจน (antigen) ท าใหเพมความรนแรงในการกอโรค (Foster, 1996) และยงปองกนไมใหเมดเลอดขาวชนดพอลมอรโฟนวเคลยรลวโคไซด (Polymorphonyclear leukocyte, PMN) มาจบท าใหเชอแพรในเนอเยออยางรวดเรว ยงชวยใหเชอไปเกาะตดกบเครองทางการแพทยได เชน ขอตอเทยม ลนหวใจเทยม เปนตน (สบณฑต นมรตน, 2555)

ภาพท 1 องคประกอบของเชอ S. aureus

ทมา: Kaplan S.L., Hulten K.G., Mason E.O (2009). Staphylococcus aureus infections

(Coagulase-positive Staphylococci). In: Feigin R.D., Cherry J.D., Demmler-Harrison G.L., Kaplan S.L editors. Feigin and Cherry’s Textbook of Infectious Diseases. 6th ed. Philadelphia: Elsevier Inc.; 2009. p. 1197-212.

9

ผนงเซลลของเชอ S. aureus ยงมองคประกอบทส าคญอยอกหลายองคประกอบ ไดแก

Protein A โปรตนทผนงเซลลของ S. aureus ทส าคญคอ โปรตนเอ (protein A) ซงจะยดกบ

จบชนเพปตโดไกลแคนดวยพนธะโควาเลนต และยงเปนปจจยกอความรนแรงของเชอโดยจะท าหนาทเกาะกบสวน Fe receptor ของ IgG1 IgG2 และ IgG4 สงผลท าใหยบย งการเกดกระบวนการออพโซไนเซชน (opsonization) และการกลนกนของเมดเลอดขาว (phagocytosis) และยงสามารถกอความเสยหายใหกบสวนทเกาะตดหรอสงผลใหเนอตายเฉพาะสวนได (necrotic tissue) คณสมบตนท าใหโปรตนเอถกน าไปใชในการตรวจแอนตเจนของเชอ S. aureus ในหองปฏบตการโดยวธ Coagglutination โดยอาศย IgG ทปลายดาน Fe จบอยกบ โปรตนเอ และปลายดาน Fab จะจบกบแอนตเจนจ าเพาะของเชอแบคทเรยเปาหมาย และยงมเอนไซม Bound coagulase หรอ Clumping factor ทอยในรปของ coagglutinate ซงเปนสารประกอบเชงซอนแอนตบอด-แอนตเจน (antign-antibody complexes) ซงสามารถเปลยนไฟบรโนเจน (Fibrinogen) ใหเปนไฟบรน (Fibrin) ทไมละลายน า และท าใหเชอแบคทเรยเกดการจบกลมกนได (ภทรชย กรตสน, 2549; Levinson, 2010)

Teichoic acids

เปนกรดอนทรยทแทรกอยในชนของเปปตโดไกลแคนซงจะเชอมตอกบสายเพปตโดไกลแคนดวยพนธะโควาเลนต (Covalent bond) กรดไทโคอกยงเปนสารพอลแซคคาไรดทมหมฟอสเฟตจบกบเปปตโดไกลแคนและเยอหมเซลล โดยสารพอลแซคคาไรดนเปนสารประกอบคารโบไฮเดรตทมฟอสเฟตชนดจ าเพาะกบสายพนธ S. aureus (species – specific carbohydrate antigens) โดยจะมกรดไรบทอลไทโคอก (Ribitol teichoic) จบกบ n-acetyl glucosamine เรยกวา polysaccharide A (นงลกษณ สวรรณพนจ, 2544)

สารทเชอ S. aureus สรางขน

สารพษ (Toxin) 1) Staphylococcal enterotoxin เปนสารพษทหลงออกมานอกเซลลชนดทนความ

รอน (heat-stable exotoxin) กอใหเกดโรคอาหารเปนพษ มหลายชนด (A-I) และชนดทพบวามรายงานในการกอโรคอาหารเปนพษบอยทสดคอ ชนด A และ E สารพษนสามารถทนความรอนไดด และยงทนตอสภาวะความเปนกรดและเอนซมในกระเพาะอาหารไดอกดวย ผปวยทไดรบสารพษ

10

ชนดนเขาสรางกายจะมอาการคลนไส อาเจยน ปวดทอง อจจาระรวง (Kenneth, 2012; ปยรชต สนตะรตตวงศ, 2554) 2) Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) ประมาณ 20% ของสายพนธ S. aureus ทสรางสารพษนได TSST-1 จดเปน Super antigen ทจะกระตนการท างานของ T-lymphocyte ใหปลดปลอยไซโตไคนตางๆออกมา เชน Tumor necrosis factor (TNF) และ interleukin 1 (IL-1) ซงเปนสอกลางในการกระตนการอกเสบ ผปวยทไดรบสารพษนมอาการไขขนสง หนาวสน มผนบรเวณผวหนง อจจาระรวงเปนน า รางกายขาดน า คลนไส อาเจยน ความดนเลอดต า และเนองจากสญเสยน าในระบบไหลเวยนเลอดจนอาจท าใหเกดภาวะ Hypovolemic shock ท าใหการท างานของอวยวะตางๆลมเหลว ท าใหเกดอาการชอกและเสยชวตได (Parsonnet et al., 2008)

3) Exfoliative toxin (ET) หรอ epidemolytic toxin เปนสารพษทมฤทธในการท าลายผวหนงชนก าพรา (epidermal layer) ท าใหผวหนงก าพราหลดออก กอใหเกดกลมอาการ staphylococcal scaled skin syndrome (SSSS) หรอโรค Ritter’s disease (ปยรชต , 2554) เ ชอ S. aureus สามารถสรางสารพษชนดนได 2 ชนด คอ ET-A และ ET-B ซงมคณสมบตแตกตางกน คอ ET-A สามารถทนตอความรอนได แต ET-B จะไมทนตอความรอน หลงจากการตดเชอ รางกายจะสามารถสรางแอนตบอดเพอปองกนการตดเชอซ าได (Kenneth, 2012; Wilailuckana, 2005). 4) Cytolytic toxin เปนกลมของสารพษทหลงออกมานอกเซลล ไดแก hemolysin หรอ staphylolysin ชนด แอลฟา (α) เบตา (β) และเดลตา (§)ทมฤทธท าลายเมดเลอดแดง เยอหมเซลลและเซลลอนๆหลายชนด รวมไปถง ชนด แกมมา (γ) และ Leucocidin Panton Valentine Leucocidin (PVL) เปนสารพษทออกฤทธในการท าลายเเยอหมเซลล ท าใหเกดความผดปกตในการควบคมการผานเขา-ออกเซลลของสาร ท าใหสญเสยสมดลแรงดนออสโมตก เซลลจงบวมและแตกในทสด PVL จะมฤทธจ าเพาะตอเมดเลอดขาว โดยจะปองกนเชอจากกระบวนการฟาโกไซโตซสของเมดเลอดขาว (Kenneth, 2012; ปยรชต สนตะรตตวงศ, 2554) นอกจากน PVL ยงเปนปจจยการกอความรนแรงของโรคในการตดเชอทเนอเยอออน ซงเชอสายพนธ MRSAสามารถสรางสารพษชนดนได และสารพษชนดนยงเปนสาเหตหลกของโรคปอดตดเชอขนรนแรงอกดวย (necrotizing pneumonia) โดยพบวาเชอ S. aureus ประมาณรอยละ 2 ทแยกไดจากผปวยจะสรางพษชนดน (Levinson, 2010)

เอนไซม (Enzymes) 1) Coagulase สามารถพบการสรางเอนไซมชนดนไดในเชอ Staphylococcus spp. เทานน โดยcoagulase เปนเอนไซมทท าใหพลาสมาเกดการแขงตวโดย การเปลยนไฟบรโนเจน

11

(Fibrinogen) เปนไฟบรน (Fibrin) ในปฏกรยานน Coagulase ตองการองคประกอบทอยในพลาสมาซงอาจเปนโพรทรอมบน (Prothrombin) หรอ Coagulase-reacting factor (CRF) ซงมอยในพลาสมาของมนษย และสตวบางชนดเทานนเมอรวมกนเปน Coagulase-CRF Complex แลวจะเปลยนไฟบรโนเจนเปนไฟบรนได สงผลใหพลาสมาแขงตว นอกจากนยงม Bound coagulase (Clumping factor) ทเปลยนไฟบรโนเจนเปนไฟบรนท าใหเชอเกาะกลมกน บทบาทของ Coagulase ท าใหเกดไฟบรนมาลอมรอบเชอจงเกดการตอตานกระบวนการฟาโกไซโตซส และทนตอการท าลายดวยแอนตบอดได 2) Catalase เปนเอนไซมทมฤทธในการสลายไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) ใหกลายเปนน า (H2O) และออกซเจน (O2) เพอปกปองเซลลแบคทเรยจากการถกท าลายในเซลลเมดเลอดขาว ภายหลงจากเซลลเมดเลอดขาวจบกนเชอแบคทเรยโดยขบวนการฟาโกไซโตซส (Phagocytosis) จะเกดการสรางไฮโดรเจนเปอรออกไซด และอนมลอสระทเปนพษเพอท าลายเชอแปลกปลอม 3) Hyaluronidase มหนาทในการสลายกรดไฮยาลโรนก (Hyaluronic acid) ซงเปนสวนประกอบของ เนอเยอเกยวพน (Connective tissue) ท าใหเชอสามารถแพรกระจายและลกลามเขาสชนเนอเยอตาง ๆ ไดงายขนและเชอ S. aureus มากกวารอยละ 90 สรางเอนไซมชนดนได 4) Staphylokinase ( fibrinolysin) ท าหนา ท ในการยอยไฟบรน โดย เ กดจากสารประกอบ Staphylokinase กบ Plasminogen ทไปกระตน Plasmin-like protoltiyca ctivity ท าใหไฟบรนทจบตวเปนกอนนนละลาย จงน ามาใชในการรกษาผปวยทมภาวะเกดลมเลอดอดตนหลอดเลอดของหวใจ (Coronary thrombosis) (Kenneth, 2012) 5) Lipase เปนเอนไซมทสามารถยอยสารตงตนหลายชนด เชน พลาสมาและไขมนทสะสมอยทผวหนงซงประกอบดวยตอมไขมนและเนอเยอไขมน และเปนสาเหตของการรวมกลมของเชอทบรเวณตอมเหงอ การสรางเอนไซมไลเปสจ าเปนตอการบกรกของเชอเขาสผวหนงสงผลใหเกดการตดเชอในชนผวหนงและใตผวหนง 6) β-lactamase เปนเอนไซมทสรางจากยนบนพลาสมดและท าใหเชอดอตอยาตานจลชพกลมβ-lactam อนๆอกหลายชนด โดยเอนไซม β-lactamase จะยอยสลาย β-lactam ring ท าใหยาสญสภาพและไมสามารถออกฤทธท าลาย (Foster, 1996)

โรคตดเชอทเกดจากเชอ S. aureus 1) โรคตดเชอทผวหนงและเนอเยอออน การตดเชอ S. aureus จะท าใหเกดฝ ซงสวนใหญจะเกดทบรเวณผวหนง ซงเรมจากการตดเชอทตอมไขมนบรเวณทเกดฝเกดการอกเสบ มการสะสม

12

ของเมดเลอดขาวทตายแลว เนอเยอตาย เมอฝเจรญเตมทบรเวณเนอเยอทตายจะเตมไปดวยเมดเลอดทตายแลวรวมทงแบคทเรยทเมดเลอดขาวจบกน และมไฟบรนมาลอมรอบ (นงลกษณ สวรรณพนจ, 2544) การเกดฝและฝฝกบว (furuncle และ carbuncle) โดยจะเกดการตดเชอทผวหนงชนนอกท าใหเกดการอกเสบ เชน รขมขนอกเสบ ซงเชอจะแพรกระจายเขาสเนอเยอใตผวหนงท าใหเกดหนอง กลายเปนฝ ( furuncle) สวนฝฝกบว (carbuncle) คลายกบฝ แตจะมจ านวนมากกกวา และแพรกระจายลกลงในเนอเยอเสนใย (fibrous tissue) และการเกดตมหนองทผวหนงหรอเปนตมพพอง (impetigo) มกเปนตมหนองตนๆ อยรวมกนเปนกลม พบบอยบรเวณใบหนาแขน ขา เมอตมหนองแตกออก กลายเปนรอยถลอกตนๆ ถามการตดเชอทตอมไขมนจะท าใหเกดการอกเสบ เชอบางสายพนธสามารถสรางสารพษ Epidermolytic toxin (ET) ทท าใหผวหนงชนก าพราหลดลอก ทเรยกวา Staphylococcal scalded skin syndrome (SSSS) (นงลกษณ สวรรณพนจ, 2544)

2) โรคปอดบวม (pneumonia) เปนโรคทส าคญมากเพราะท าใหมอตราการตายสง อาจเกดขนทนททนใดหรอตดเชอภายหลงจากเปนอนมากอน การตดเชอมกเกดขนกบผปวยทมระบบภมคมกนบกพรอง เชน ปวยเปนไขหวดใหญ โรคหดหรอผปวยหลงการผาตด ซงผปวยเหลานมโอกาสเสยงในการตดเชอสงกวาคนปกต อาการของโรคอาจเกดขนทนททตดเชอ จงจดวาเปนเชอฉวยโอกาสในผปวยท าใหมอตราการตายสง โดยทการตดเชอจะท าใหเกดการตายของเนอเยอ และฝจ านวนมากทปอด (นงลกษณ สวรรณพนจ, 2544) 3) โรคตดเชอของกระดกและขอ (osteomyelitis) การตดเชอทกระดกมกมสาเหตจากการตดเชอในกระแสเลอด และเมอเชอเขาไปอยในสวนของไดอะไฟซส (diaphysis) ของกระดกยาว (long bones) จะท าใหเกดการตดเชอรนแรง และมการสะสมของหนองบรเวณผวของกระดก เกดเปนหนองใตเยอหมกระดก (pyoarthrosis) ขอตอกระดกทมหนองจากการตดเชอจะท าลายกระดกออนของขอตอท าใหเกดความพการของขอตออยางถาวร (Foster, 1996)

4) โรคทเกดจากสารพษ (toxins) เกดจากสารพษทสรางโดยเชอ S.aureus เชน ฮโมลไลซน (hemolysin) เปนโปรตนทท าลายเซลลเมดเลอดแดง และเกลดเลอด ท าใหเกดการแตกตวของเมดเลอดแดง นอกจากนยงพบวาบางสายพนธจะสรางสารพษ Panton-Valentine-Leukocidin (PVL) เปนโปรตนทท าลายเซลลเมดเลอดขาว ท าใหเกดโรคปอดอกเสบอยางรนแรง นอกจากนยงสรางสารพษเอนเทอโรทอกซน(Enterotoxin) เปนสาเหตของโรคอาหารเปนพษโดยท าใหผปวยมอาการอาเจยน และทองรวงอยางรนแรง ในบางสายพนธท าใหเกดกลมอาการ Toxic-Shock Syndrome โดยการสราง toxicshock syndrome toxin-1 (TSST-1) ท าใหมไขสง คลนไสอาเจยน ความดนต า มผนแดงตามตว การท างานของไตลมเหลว และเกดอาการชอค (Batzing, 2002)

5) การตดเชอในกระแสเลอด และเยอบหวใจอกเสบ (bacteremia and endocarditis)

13

การตดเชอในกระแสเลอดอาจเกดขนจาการตดเชอเฉพาะท เชน ทผวหนงทางเดนหายใจหรอทางเดนระบบปสสาวะ และระบบสบพนธ มกพบในคนทเปนโรคหวใจ และหลอดเลอด ความผดปกตของเมดเลอดขาวแกรนโลไซต (granulocyte) และภาวะภมคมกนบกพรอง นอกจากนสงแปลกปลอมทเขาสกระแสเลอด เชน การสวนหวใจ กเปนสาเหตใหเกดภาวะตดเชอในกระแสเลอด (นงลกษณ สวรรณพนจ, 2544) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

เชอ S. aureus เปนเชอแบคทเรยทกอโรคไดหลายรปแบบทงการตดเชอเฉพาะท การตดเชอในอวยวะตางๆ และการตดเชอในกระแสเลอด ความรนแรงของโรคมตงแตนอยจนถงรนแรงมากจนสงผลใหมอตราเจบปวย และอตราการเสยชวตทสง โดยทวไปอาจแบงเชอ S. aureus ไดเปน 2 กลมคอ methicillin-sensitive Staphylococcus aureus หรอ MSSA จดเปนเชอทไวตอยา ยาทใชรกษาล าดบแรกคอยากลม β-lactam โดยเฉพาะยา cloxacillin, cefazolin และเชออกกลมหนงคอ methicillin-resistant Staphylococcus aureus หรอ MRSA ซงเปนเชอทดอตอยาท งสองดงกลาวขางตน และ Methicillin-resistat Staphylococcus aureus (MRSA) เปนเชอ S. aureus สายพนธทดอตอยา methicillin และยาในกลม β-lactam เกอบทงหมด และยงดอตอยาตานจลชพไดหลายกลม (Multiple drug resistant) เชน Tetracycline, Sulfonamide และ Aminoglycoside เปนตน (Yasmeen el tl, 2010; Kenneth, 2012)

กลไกหลกของการดอตอยาของ MRSA จะอยท Penicillin-binding protein (PBP) ซงโดยปกตยา Methicillin จะจบกบ PBPs (PBP1, 2 และ 3) เพอท าลาย Cross-link peptidoglycan ซงเปนสงจ าเปนในการสรางผนงเซลลของแบคทเรย แตใน MRSA นนเชอจะมการสราง PBP2a ท าใหยาในกลม β-lactam ไมสามารถออกฤทธท าลายเชอได ในการสรางโปรตน PBP2a นนจะถกควบคมโดยยน mecA งอยบนโครโมโซมของ MRSA และมยน mecI และ mecRI ควบคมการท างานของยน mecA อกตอหนง (Stephens, 2008; Hiramatsu et al., 2000)

ลกษณะทส าคญอยางหนงของ MRSA คอ การดอยาแบบ Heterogeneous resistance คอ มเพยงบางเซลลเทาน นทแสดงลกษณะการดอยา methiciแin และการดอยาแบบ Homogeneous resistance ซงเซลลทกเซลลของ S. aureus จะมการดอยาเหมอนกนหมดทกเซลลการดอยาในลกษณะนถกควบคมโดยยนทมชอวายน Factor essential for the expression of methicittine resistant (fem) โดยยนจะสรางโปรตน ทเกยวของกบกระบวนการเมตาบอลซมของผนงเซลลและพบไดในปรมาณมากในระหวางทเ ชอเจรญเตมท (Mehrotra et al., 2000) ยน fem จะประกอบดวยยนโครงสราง 4 ชนด คอ femA, femB และ femD โดยยน femA เปนยนทมความส าคญทสดในการ

14

แสดงออกของการดอยา methicillin ซงท างานรวมกบยน mecA ท าใหเกดการดอยา Methiciแin ในระดบสง (Ryffet et al., 1994) นอกจากนยงสามารถพบยน femA ใน S. aureus ไดทกสายพนธ แมวาเชอชนดนนจะไมมการดอยา methicillin (MSSA) ดงนนจงสามารถใชยนชนดนในการจ าแนกสายพนธ S. aureus ไดเชนกน (Mehrotra et al., 2000) และยงสามารถจ าแนก MRSA ออกเปนหลายประเภทตามกลไกการดอตอยา ดงน 1) True methicillin-resistant S. aureus (true MRSA) มกลไกการดอตอยาในกลม β-lactam นนคอโปรตน PBP ทบรเวณผนงเซลลไดเปลยนแปลงเปน PBP2a และยงตรวจพบยน mecA และมคา MIC ของ oxacillin ≥ 4 µg/ml 2) Borderline-resistant S. aureus (BORSA) เปน S. aureus สายพนธ ทดอยา methicillin ในระดบต าคอมคา MIC ตอยา oxacillin (0.5-8 µg/ml) แตจะตรวจไมพบยน mecA ซงกลไกการดอตอยาของเชอชนดนคอ มการสงเคราะหเอนไซม β-lactamase ออกมาในปรมาณทสงเพอยอยสลายโครงสรางของยา 3) Modified-resistant S. aureus (MORSA) เปน S. aureus สายพนธทดอยา methicillin ในระดบต าเชนเดยวกบสายพนธ BORSA (MIC ตอยา oxacillin 0.5-8 µg/ml) และจะตรวจไมพบยน mecA เชนกน โดยกลไกการดอยาของเชอคอการเพมจ านวนของ PBP ชนดอนๆทไมใช PBP2a สงผลใหผนงเซลลหนาขนและยาไมสามารถแทรกเขาสเซลลของแบคทเรยได 4) Methicillin-aminoglycosides-resistant S. aureus (MARSA) เปนเชอ S. aureus ทสรางเอนไซม aminoglycoside-modifying ชนดทเรยกวา bifunctional enzyme โดยมสงเคราะหเอนไซม ACC(6’) และ APH (2’’) รวมกบมการสรางโปรตน PBP2a ท าใหเชอกลมนดอตอยา methicillin และยากลม aminoglycoside (สบณฑต นมรตน, 2555; Wilailuckana, 2005) นอกจากน MRSA บางสายพนธยงดอตอยาไดหลายชนดรวมดวย (multidrug resistance) แตจะไวตอยาอนๆ บางชนด เชน vancomycin ซงเปนยาหลกทใชในการรกษาโรคตดเชอแบคทเรยแกรมบวกทดอตอยารวมทง MRSA โดยในปคศ. 1996 พบเชอ MRSA ทดอตอยา vancomycin ในระดบปานกลางหรอ vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) เปนครงแรกในประเทศญปน (Hiramatsu, 1998) ตอมาในป 2002 มรายงานถงการตรวจพบเชอ MRSA ทดอตอยา vancomycin ใ น ร ะ ด บ ส ง ห ร อ vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) ใ นสหรฐอเมรกา (CDC, 2002) และในปจจบนเชอเรมทจะดอตอยาชนดนเพมขน จงมยาทางเลอกใหมทใชในการรกษาโรคตดเชอ MRSA เชน linezolid, daptomycin, quinupristin/dalfopristin (Synercid) และ tigecycline ซงจะเปนยาทางเลอกในผปวยทไมสามารถใชยา vancomycin รวมทงอาจพจารณาเปนยาหลกส าหรบผ ปวยตดเชอ MRSA ทลมเหลวหรอไมตอบสนองตอการรกษาดวยยา

15

vancomycin จากขอมลนแสดงใหเหนวาเชอกอโรคชนดนไดพฒนาจนกลายเปนเชอกอโรคในโรงพยาบาลทรกษาไดยากอกชนดหนง (ธระพงษ มนตมธรพจน, 2558)

ระบาดวทยาของเชอ MRSA ในป คศ. 1961 เปนครงแรกทตรวจพบเชอ S. aureus ทดอตอยา methicillin โดยแยกไดจากผปวยในประเทศองกฤษ การตดเชอ MRSA สวนใหญจะเกดขนในโรงพยาบาล (nosocomial infection) หรอเรยกสายพนธเหลานวา Hospital-Associated MRSA (HA-MRSA) (Eriksen, 1961; Enright, 2002) ในปจจบนมรายงานถงเชอสายพนธ HA-MRSA ไดระบาดอยในโรงพยาบาลทวโลก (ภาพท 2) มรายงานวาเชอ HA-MRSA มากกวารอยละ 50 ระบาดในประเทศของทวปอเมรกาเหนอ อเมรกาใต และเอเชย มรายงานการระบาดในอตราปานกลาง (รอยละ 25ระบาดวทยาของเชอ MRSA-50) ในประเทศจน ออสเตรเลย แอฟรกา ปากสถาน และบางประเทศในทวปยโรป เชน โปรตเกส (รอยละ 49) อตาล (รอยละ 37) และโรมาเนย (รอยละ 34) (Heijer, 2013; Ullah et al., 2016) นอกจากนยงมรายงานถงการระบาดของเชอ HA-MRSA อตราสงในทวปเอเชย โดยเฉพาะอยางยงประเทศ ศรลงกา (รอยละ 86.5) เกาหลใต (รอยละ 77.6) เวยดนาม (รอยละ 74.1) ไตหวน (รอยละ 65) ฮองกง (รอยละ 56.8) รวมถงประเทศไทย (รอยละ 57) (Chambers et al., 2009; Grundmann et al., 2010; Mejia et al., 2010) นอกจากนยงมรายงานวา MRSA สามารถดอตอยาตานจลชพ ซงภายในระยะเวลามากกวา 10 ปทผานมาไดกอปญหาทางสาธารณสขไปทวโลก และมแนวโนมจะเพมขนเรอย ๆ (John and Harvin, 2007) เชอสายพนธ MRSA นอกจากจะดอตอยา methicillin และยาในกลม β-lactam ทงหมดแลวยงสามารถดอตอยาในกลมอนๆไดอกหลายชนดอกดวย ในปจจบนเชอ MRSA ทระบาดในประเทศแถบเอเชยจะมอตราการดอในระดบสงตอยา oxacillin (รอยละ 82.1) ciprofloxacin (รอยละ 78.2) clindamycin (รอยละ 64.2), erythromycin (รอยละ 76.5) และ tetracycline (รอยละ 70.9) (Cheol-In Kang and Jae-Hoon Song, 2013) ขณะท Zhoa และคณะ (2012) ไดรายงานวาในประเทศจนรายงานวาเชอ S. aureus มอตราความไวในระดบสงตอยา chloramphenicol (รอยละ 93.2) และtrimetthoprim-sulfamethoxazole (รอยละ 93.2 ) แตมอตราความไวในระดบปานกลางตอยาก ลม flouroquinolone (รอยละ 45-50) (Zhoa et al., 2012) นอกจากนมรายงานจากทวโลกถงเชอ S. aureus ทดอตอยา vancomycin ในระดบปานกลาง (VISA) และในระดบสง (VRSA) ในประเทศญปน อนเดย, เกาหล ฮองกง สเปน กรซ เยอรมน อตาล และสหราชอาณาจกร (Loomba et al., 2010 ) รวมถงประเทศไทย (Trakulsomboon et al., 2001) ดวยเหตนจงท าใหเกดความลมเหลวจากการรกษาดวยยา vancomycin เพมสงขน อยางไรกตาม Chitnis และคณะ (2013) ไดรายงานวาเชอ MRSA และ VRSA ทแยกจากโรงพยาบาลในประเทศอนเดยวมความ

16

ไวตอยา daptomycin และ linezolid รอยละ 100 (Chitnis et al., 2013) นอกจากนจากขอมลการศกษาของ US global surveillance ยงรายงานวาเชอ S. aureus มความไวตอยา linezolid มากกวารอยละ 99 (Gu et al., 2012)

ทมา Stefani S., Chung D.R., Lindsay J.A., Friedrich A.W., Kearns A.M., Westh H., (2012).

Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): global epidemiology and harmonisation of typing methods. International Journal of Antimicrobial Agents, 39: p 273-282

การดอตอยาตานจลชพและการรกษาโรคตดเชอ S. aureus การดอยาตานจลชพ (Antimicrobial Resistance, AMR) มสาเหตมาจากพฤตกรรมการใชยาปฏชวนะอยางไมเหมาะสมของผปวยโดยเกดจากการรบประทานยาไมครบตามขนาดทเหมาะสม ยาขนาดทแรงเกนไปจะสงผลใหเชอโรคดอยาอยางรวดเรวขน (ศนยเฝาระวงเชอดอยาตานจลชพแหงชาต, 2555) สงผลใหเชอมการปรบตวหรอกลายพนธเพอปองกนไมใหถกท าลาย และจะพฒนากลายเปนเชอดอยาในทสด (ขวญตา กลาการนา, 2550) อยางไรกตาม ยงพบวากระบวนการถายโอนยน (Horizontal Transfer Gene) ดอยาตานจลชพกมสวนท าใหเชอ S. aureus ดอตอยาไดหลายชนด โดยคาดวาสาเหตอาจเกดจาก 1) กระบวนการ transfomation เปนการขนถายยนดอยาจากตวให (donor)ไปยงตวรบ (receive) ไดคราวละ 1-2 ยน โดยยนดอยาจะอยในลกษณะทไมมอะไรหอหม

ภาพท 2 ความชกของ Hospital-Associated Methicillin-resistant S. aureus

17

(naked DNA) กระบวนการนสามารถเกดไดทงแบคทเรยแกรมบวก และแกรมลบ แตตองมลกษณะพนธกรรมทคลายคลงกน โดยอยในสกลเดยวกนหรอใกลเคยงกน 2) กระบวนการ transduction เปนการขนถายยนดอยาทอยในรปของฟาจ (phage) และอาศยไวรสเปนตวพา และ 3) กระบวนการ conjugation เปนการขนถายยนดอยาในรปของ R-plasmid ผานพไล (pili) เปนตวเชอมระหวางเซลลท งสอง และภายใน R-plasmid จะประกอบดวยยนดอยา 1-10 ชนด หรอมากกวา ซงยนเหลานสามารถถกขนถายไปยงตวรบในเวลาเดยวกนได (มาลน จลศร, 2532; Wongdindam, 2007) ส าหรบยาตานจลชพทใชในการรกษาโรคตดเชอ S. aureus และกลไกการดอตอยาตานจลชพทเกดจากยนดอยา (ภทรชย กรตสน, 2549; มาลน จลศร, 2532; Reygaert, 2013 และ Slade et al., 2009) หลกๆมดงน

β-lactam Penicillin เปนยากลม β -lactam ทใชรกษาโรคตดเชอ S. aureus ในชวงแรกๆ มโครงสราง

หลกคอ 6-aminopenicillanic ซงประกอบดวย β -lactam ring เชอมตอกบ thiazolidine ring โดยจะเขาจบกบเอนไซม carboxypeptidase และ transpeptidase หรอเรยกเอนไซมในกลมนวา penicillin-binding proteins (PBP) ตวยาจะจบกบบรเวณ active site ของ PBPs สงผลใหยบย งการออกฤทธของเอนไซมสงผลใหแบคทเรยหยดการสรางผนงเซลลและตายในทสด กลไกการดอตอยา penicillin คอ เชอจะสรางเอนไซม penicillinase (β –lactamases) เปนเอนไซมในกลม serine peptidase ซงจะออกฤทธทต าแหนงทประกอบดวยกรดอะมโน serine คอต าแหนง β –lactams ring มผลท าใหเกดการแยกพนธะ amide ของ β –lactams ring เรยกผลผลตทเกดขนนวา penicilloyl ซงจะเชอมตอกบกรดอะมโน serine ทต าแหนงทออกฤทธของเอนไซม penicillinase ท าใหเกดสารกงกลาง acylenzyme intermediate และตอมาจะท าปฏกรยากบน าท าใหเกดการแตกตว และปลอย penicilloyl ออกมา สงผลใหยาไมสามารถออกฤทธได โดยกลไกการดอตอยาชนดนจะมยน blaI และ blaR1 ควบคมการออกฤทธยน blaZ ในการสรางเอนไซม penicillinase ยนเหลานจะอยในทรานสโพซอน Tn552 (Tn552-like transposon) หรออยบนพลาสมด (ภทรชย กรตสน, 2549)

Penicillinase-resistant penicillin เปนยา penicillin กงสงเคราะห (Semi-synthetic penicillins) เ ชน methicillin, oxacillin และ ampicillin มโครงสรางยาทเหมอนกบยา penicillin (β-lactam ring) แตยากลมนสามารถทนตอการถกท าลายโดยเอนไซม penicillinase จงเรยกในกลมนวา Penicillinase-resistant penicillin โดยตวยาจะจบกบบรเวณ active site ของ PBPs และจะยบย งเอนไซมทจ าเปนส าหรบการ

18

สงเคราะหผนงเซลลรวมทงเอนไซม carboxypeptidase และ transpeptidase สงผลใหแบคทเรยหยดการสรางผนงเซลลและตายในทสด โครโมโซมของ MRSA จะมสวนพนธกรรมเคลอนททเรยกวา SCCmec ซงในสวนพนธกรรมนจะประกอบดวยยน mecR1 และ mecl ท าหนาทควบคมยน mecA ใหสรางโปรตน PBP2a ซงโดยปกตเชอ S. aureus จะม PBP เกาะอยทผนงเซลล และเปนสวนทยาจะเขาไปจบเพอยบย งการสรางผนงเซลล แตเชอ S. aureus ทมยน mecA จะสรางโปรตน PBP2a ขนมาแทนทโครงสราง PBP สงผลใหยาไมสามารถออกฤทธได การสรางโปรตน PBP2a เกดจากการกระตนซงเกดขนไดจากหลายปจจย เชน ความเปนกรดดาง อณหภม และยน mecl และ mecR1 จะถกกระตนเมอเชอไดสมผสกบยาโดยจะควบคมใหยน mecA สรางโปรตน PBP2a (Brown Derek and Peter Retnold, 1980)

Glycopeptide ยาในกลม glycopeptide ทส าคญไดแก vancomycin และ teicoplanin ยาจะออกฤทธฆาเชอแบคทเรยโดยจบเขากบสวนของ D-alanine-D-alanine ซง เปนสวนประกอบในการสราง peptidoglycan ท าใหยบย งการท างานของเอนไซม tranglycosylase ในการน าโมเลกลตนก าเนดไปสรางสาน peptidoglycan สงผลใหเชอไมสามารถสรางผนงเซลลได

การดอตอยา vancomycin ในเชอ S. aureus จะมกลไกการดอตอยาทแตกตางกน 2 แบบคอ Vacomycin Intermediate Staphylococcus aureus:VISAแลVacomycin Resistance Staphylococcus aureus:VRSA กลไกการดอตอยาของ VISA คอเชอจะจะท าใหโครงสรางของ D-alanine-D-alanine เพมจ านวนขนสงผลใหผนงเซลลของแบคทเรยหนาขน และท าใหยาไมสามารถเขาไปในตวเซลลได และยนทควบคมการ แสดงออกของการดอตอยายงไมทราบแนชด (Reygaert, 2013) สวนสายพนธ VRSA จะเกดการเปลยนแปลงโครงสรางโมเลกลตนก าเนดของ peptidoglycan ทเรยกวา depsipeptide peptidoglycan ทประกอบดวย D-alanine-D-lactase ใหแทนทสวน D-alanine-D-alanine สงผลใหยา vancomycin ไมสามารถจบกบเปาหมายทเปลยนไปได และยนทควบคมการดอตอยานคอยน vanA อยบนทรานโพซอน Tn1546 โดยมคณสมบตเปนเอนไซม ligase ท าหนาทเชอมตอโมเลกล D-alanine และ D-lactase ใหกลายเปน D-alanine-D-lactase โดยสนนษฐานวาไดรบยนนมาจากเชอ Enterococcus spp. (Vacomycin Resistance Enterococci, VRE) (Slade et al., 2009)

19

Aminoglycoside ยาก ลม Aminoglycoside ไดแ ก Gentamicin, Amikacin, Kanamycin และ Tobramicin โครงสรางของยาประกอบดวยหม amino sugar หรอ non-amino sugar อยางนอย 2 หม เชอมตอกบ aminocyclitol ring ดวยพนธะ glycosidic กลไกการออกฤทธคอยบย งการสรางโปรตนไรโบโซมทหนวยยอย 30S (30S ribosomal subunit) สงผลใหไรโบโซมท างานผดปกต เซลลไมสามารถสรางโปรตนไดและตายในทสด โดยปกตจะประกอบดวยอะตอมทม 2 ประจ เชน แมกนเซยม (Mg2+) และแคลเซยม (Ca2+) ดงนนยากลม aminoglycoside เปนยาทมประจบวกจะเขาจบกบโมเลกลทมประจลบในชนผนงเซลล มผลใหยามอตราการซมผานเขาสเซลลเพมขน กลไกการดอตอยาในกลม aminoglycoside ในเชอ S. aureus จะมการสรางเอนไซม Aminoglycoside-Modifying Enzymes (AMEs) ท าหนาทเปลยนแปลงโครงสรางของยา โดยการเปลยนหม acetyl สงผลใหยาไมสามารถจบกบไรโบโซม 30S ไดหรอจบไดนอยลง เอนไซม AME แบงออกไดเปน 3 กลมคอ Aminoglycoside Acetyltransferases (AACs) ออกฤทธโดยการท าปฏกรยา acetylation กบหม (-NH2) ของยา, Aminoglycoside Phosphotransferases (APHs) ออกฤทธโดยการท าปฏ ก รยา phosphorylation กบหม hydroxyl (-OH) ของยา และ Aminoglycoside Adenyltransferases (AADs) หรอ Aminoglycoside Nucleotidyltransferases (ANTs) ออกฤทธโดยการท าปฏกรยา adenylation กบหม hydroxyl (-OH) ของยา เอนไซม AMEs ทพบไดในเชอมยนท S. aureus สวนใหญจะสรางเอนไซมทมคณสมบตของเอนไซม 2 ชนดรวมกนเรยกวา bifunctional enzyme และมยนทควบคมกลไกการออกฤทธทแตกตางกน ไดแก

1) AAC ( 6′) /APH( 2′′) ส ง ผ ล ใ ห เ ช อ ด อ ต อ ย า Gentamicin, Kanamycin, Tobramycin, Amikacin และ Netilmicin สวนยนทควบคมการออกฤทธคอ aac (6 ′)/aph(2 ′′) ซงจะอยจบกบสวนประกอบ IS256 ในทรานโพซอน Tn4001 หรออยบนโครโมโซม

2) APH(3′)-III สงผลใหเชอดอตอยา Kanamycin และ Amikacin สวนยนทควบคมการออกฤทธ คอ aph(3′)-IIIa (aphA)

3) ANT(4′,4′′)-I สงผลใหเชอดอตอยา Neomycin, Kanamycin, Tobramycin และ Amikacin สวนยนทควบคมการออกฤทธคอ ant (4′,4′′) (aadD) (Fatholahzadeh et al., 2009)

Tetracycline ยากลม tetracycline ไดแก tetracycline, doxycycline และ minocycline มโครงสรางพนฐาน

คอวงแหวน hydronaphthacene กลไกการออกฤทธคอ ยาจะเขาสเซลลและจบกบไรโบโซม 30S สงผลให tRNA ไมสามารถรวมตวกบไรโบโซม เนองจาก tRNA เปนพาหะน ากรดอะมโนเขามา

20

เพอรวมตวส าหรบสรางสายโปรตนในระหวางขนตอนการแปลรหส ดงนนยากลมนจงมผลขดขวางกระบวนการสรางโปรตนและการจบตวกบไรโบโซมชวคราว สงผลใหไมสามารถสงเคราะหโปรตนได กลไกการดอตอยากลม Tetracycline ในเชอ S. aureus แบงไดเปน 2 แบบ 1) ขดขวางการออกฤทธของยาดวยวธ ribosome protection protien (RPP) โดยการสรางโปรตน Tet(M) และ Tet(O) เพอปองกนไมใหยาออกฤทธหรอเขาจบกบต าแหนงของบนไรโบโซม และยนทควบคมการออกฤทธของโปรตน 2 ชนดนคอ ยน tetM และ tetO ตามล าดบ 2) ขบยาออกนอกเซลลดวยวธ efflux เปนขบวนการขบยาออกจากเซลลโดยอาศยพลงงาน โดยอาศยการท างานของโปรตน tet(K) และ tet(L) ในชนเยอหมเซลล ซงมยน tetK และ tetL ทควบคมการสรางโปรตน โดยสวนใหญจะพบการแสดงออกของยน tetK มากกวา และต าแหนงของยนเหลานจะอยบนพลาสมด pT181

Macrolide, Lincosamide, Streptogramin (MLS) ยาก ลม Macrolide ไดแ ก Erythromycin และ oleandomycin ม โครงส รางพ นฐาน คอ

macrocyclic lactone ring เชอมตอกบโมเลกลน าตาล desosamine และ cladinose ออกฤทธโดยการจบตวชวคราวกบสวนของ 23S rRNA ซงเปนสวนประกอบยอยของ 50S ไรโบโซม ท าใหยบย งกระบวนการ elongation ในระหวางการสรางสายโปรตน

ยากลม Licosamide ไดแก clindamycin และ lincomycin มโครงสรางหลกประกอบดวย กรดอะมโนเชอมตอกบกลม amino sugar กลไกออกฤทธคลายกบกลม Macrolide คอยบย งการสรางสายโปรตน ยากลม Streptogramin เปนสารกงสงเคราะห แบงไดเปน 2 กลมทมโครงสรางทแตกตางกนคอ streptogramin A มโครงสรางหลกคอ polyunsaturated macrolactone ยาในกลมนไดแก pristinamycin IIA (quinupristin) และ pristinamycin IIB (dalfopristin) และ streptogramin B มโครงสรางหลกคอ cyclic hexadepsipeptide ยาในกลมนไดแก pristinamycin IIAและ pristinamycin IIc ยาทนยมใชในปจจบนคอ quinupristin/dalfopristin ซงออกฤทธเสรมกนในการยบย งการสรางโปรตน ซงยาสามารถผานชนผนงเซลลไดโดยกระบวนการ passive diffusion และเขาจบตวถาวรกบสวนประกอบยอยของ 50S ไรโบโซม

กลไกการดอตอยาของกลมยา MLS และยนดอยากลมนทพบในเชอ S. aureus คอ ermA ermB ermC โดยยน ermA นอกจากจะท าใหเชอดอตอยากลม MLS แลวยงท าหนาทรวมกบยน spc ท าใหเกดการดอตอยา spectinomycin เนองจากทง 2 ยนอยในทรานโพซอน Tn554 รวมกน ยน

21

ermB ถกพบอยในทรานโพซอน Tn 551 บนพลาสมด pl228 และยน ermC จะอยบนพลาสมด pE194 ซงเปนพลาสมดขนาดเลกทเรยกวา small multicopy plasmid ทง 3 ยนจะมกลไกการดอยาในกลม MLS ทใกลเคยงกน โดยการสรางเอนไซม rRNA methylase ท าหนาทเตมหม methyl ทต าแหนงจ าเพาะของ 23S rRNA มผลสงผลใหเกดการเปลยนแปลงเปาหมายของยา สงผลใหยาไมสามารถหาต าแหนงทจะออกฤทธได

กลไกดอตอยาของยากลมนอกแบบ คอ สรางโปรตนทสามารถขบยาออกนอกเซลลดวยวธ efflux และยนทควบคมกลไกนคอยน msrA ซงสวนใหญกลไกดอยานมกจะเกดขนในกลมยา macrolide และ streptogramin B (Piatkowska et al., 2012)

Chloramphenicol chloramphenicol มกลไกออกฤทธยบย งแบคทเรย โดยยาจะจบตวชวคราวกบเอนไซม

peptidyltransferase ซงเปนสวนประกอบของ 50S ribosomal โดยเอนไซมดงกลาวท าหนาทสรางพนธะเปปไทดระหวางเกดขบวนการ transpeptidation ในการสรางสายโปรตนและสงผลใหเชอหยดการสงเคราะหโปรตน

กลไกการดอตอยากลมนสวนใหญจะเกดจากยน cat ทอยบนพลาสมด pC221 โดยจะสรางเอนไซม chloramphenicol acetyltransferase (CAT) โดย การเตมหม acyl ซงไดมาจาก coenzyme A เขาไปในโครงสรางของยาในต าแหนงของหม hydroxyl โดยขบวนการ acetylation มผลสงผลใหยาไมสามารถเขาจบกบไรโบโซม 50S (Shaw and Brodsky, 1968)

Fluoroquinolone ยากลมนเกดจากการดดแปลงโครงสรางของยา nalixidic acid และยาในกลมน ไดแก

ciprofloxacin, norfloxacin, sparfloxacin และ ofloxacin มกลไกการออกฤทธคอ ยบย งเอนไซม DNA gyrase และ topoisomerase IV ซงเปนเอนไซมท เ กยวของกบการแบงตวของ DNA ในแบคทเรย

DNA gyrase เปนเอนไซมทท าหนาทคลายตวสาย DNA เพอใหเซลลสรางโครโมโซมชดใหม ในระหวางการแบงตว เปาหมายของยากลมน คอ หนวยยอย A (GyrA) และ B (GyrB) ควบคมการสรางโดยยน gryA และ gryB ตามล าดบ ซงเปนสวนประกอบของ DNA gyrase ท าหนาทในขบวนการ replication และ transcription โดยยาจะยบย งขนตอนทเอนไซมจบตวอยกบสาย DNA สงผลให DNA ไมสามารถเกดการแบงตว

22

topoisomerase IV ท าหนาทแยกโครโมโซมลกทง 2 โครโมโซมภายหลงจากการแบงตวของ DNA แลว เอนไซมนมโครงสรางประกอบดวยหนวยยอย A (GrlA) และ B (GrlB) ควบคมการสรางโดยยน grlA และยน grlB สวนเปาหมายของยาในการยบย งเอนไซมชนดน ยงไมทราบชดเจน กลไกการดอตอยาในกลมน แบงได 2 กลไก คอ 1) เกดการกลายพนธของยนทควบคมการสรางเอนไซม DNA gyrase และtopoisomerase IV สงผลใหโครงสรางเอนไซมเกดการเปลยนแปลง สงผลใหไมสามารถจบกบต าแหนงเปาหมายได สวนใหญเกดจากการกลายพนธของยน gyrA (DNA gyrase) และอาจพบการกลายพนธของยน grlA รวมดวย 2) การขบยาออกนอกเซลลดวยวธ efflux เกดจากการกลายพนธของยน norA ทควบคมการสรางระบบ efflux (Nakamura, 1997; Rasha et al., 2012)

Rifampin จดเปนยาในกลม rifamycin เปนยากงสงเคราะหโดยมโครงสรางเปน chromophoric

naphthoquinonone ห ร อ naphthohydroquinonone ring ย า ช น ด น ม ฤ ท ธ ฆ า เ ช อ แ บ ค ท เ ร ย (bactericidal) แกรมบวกไดหลายชนดรวมถงเชอสายพนธ MRSA โดยมกลไกเขาจบตวกบ β-subunit ของเอนไซม RNA polymerase และยบย งการท าหนาทของเอนไซมในการสรางสาย mRNA ในระหวางขบวนการถอดรหส ท าใหการท าหนาทของเซลลผดปกตและเชอจะตายลง กลไกการดอยา Rifampin ทส าคญคอยน rpoB ทอยบนพลาสมด RN4220 เกดจากการกลายพนธทบรเวณ resistance-determining (Rif) ซงจะท าหนาทยบยงการสรางเอนไซม RNA polymerase ท าใหยาไมสามารถเขาจบตวได (Damon et al., 1998)

Linezolid เปนยาในกลม oxazolidinone จดเปนยาสงเคราะห มกลไกออกฤทธโดยการสรางโปรตนไปขดขวางการเขารวมตวของหนวยยอย 30S ribosomal กบสาย mRNA ในขนตอนการแปลรหส ยามฤทธยบย งการเจรญของแบคทเรยแกรมบวกสวนใหญรวมถงเชอสายพนธ MRSA กลไกการดอยา linezolid ยงไมเปนทราบแนชด สนนษฐานวาเกดมาจากการกลายพนธของยน cfr ทอยบนพลาสมด pSCFS7 ซงท าใหเกดการสรางเอนไซม Cfr methyltransferase สงผลใหเกดการเปลยนแปลงโครงสรางยาในสวนทจบกบ 50S peptidyl transferase center (PTC) ท าใหยาไมสามารถหาเปาหมายในการเขาจบได (Locke et al., 2014)

23

Sulfonamide และ Trimethoprim ยากลม sulfonamide เกดจากดดแปลงโครงสราง sulfanilamide และทนยมใชกนในปจจบน

คอ Sulfamethoxazole (SMX) โดยใชรวมกบยา Trimethoprim (TMP) หรอ Co-trimoxazole กลไกการออกฤทธคอรบกวนการสงเคราะหกรดโฟลกทใชในการสรางกรดนวคลอกของแบคทเรย โดยกลมยา Sulfonamide มสตรโครงสรางทคลาย Para-aminobenzoic acid (PABA) ซงเปนสารตงตนในการสรางกรดโฟลก ในภาวะปกต PABA จะท าปฏกรยากบเอนไซม Dihydropteroate synthetase (DHPS) ไดเปนสาร Dihydropteroate (DHP) ซงจะถกเปลยนตอไปเปน Dihydrofolate (DHF) และ Tetrahydrofolate (THF) ตามล าดบ สาร T กลไกการออกฤทธของยา sulfonamide จะเขาแทนท PABA และท าปฏกรยากบ DHPS สงผลใหย บย งการสราง DHP สวนยา Trimethoprim จะมโครงสรางคลายกรดนวคลอกชนด pyrimidine และออกฤทธยบย งเอนไซม Dihydofolate (DHF) สงผลยบย งการเปลยน DHF เปน THF ดงนนยาทง 2 ชนดจงออกฤทธเสรมกนยบย งการสรางกรดโฟลก

กลไกการดอตอยา sulfamethoxazole เกดจากการกลายพนธของยน dhps ทควบคมการออกฤทธของเอนไซม DHPS มผลสงผลใหตวยาจบกบ PABA ไมไดหรอจบไดนอยลง และกลไกดอตอยา Trimethoprim เกดการกลายพนธของยน dfrA ทอยบนพลาสมด pSK1โดยจะควบคมการสรางเอนไซม DHFR มผลสงผลใหยาไมสามารถจบกบ DHFR หรอจบไดนอยลง (Young et al., 1987)

24

ตารางท 1 ยนควบคมกลไกการตอการดอยาตางๆของ S. aureus

Antimicrobial agent Product and Mechanism of resistance Gene Gene location

β-lactam Peniciilin Methicillin Oxacillin

- β-lactamase; hydrolysis of β-lactam ring - Penicillin-binding protein (PBP2a); Low-affinity PBP

blaZ mecA

Tn552 Transposon, SCCmec element Plasmid

Glycopeptide Vancomycin

-VISA D-alanine-D-alanine; cell wall thicken -VRSA, D-ala-D-lac ligase; modified target

unknown vanA

Tn1546 Transposon

Aminoglycoside Gentamicin Kanamycin Amikasin

-Aminoglycoside-Modifying enzymes (AMEs) AAC(6’)/APH(2”) APH(3’)-III bifunctional enzyme ANT(4’,”4)-I of drug inactivation

aac (6 ′)/aph(2 ′′) aph(3’)-IIIa (aphA) ant(4’,4”) (aadD)

Plasmid and Chromosome

Co-trimoxazole Trimethoprim Sulfamethoxazole

Target enzyme modification -S1 Dihydrofolate reductase; reduced affinity -pABA to bind but has greatly reduced binding of sulfamethoxazole

dfrA dhps

Chromosome

Macrolide-Lincosamide-Streptogramin (MLS) Erythromycin Clindamycin Streptogramin

-rRNA methylase; Methylation of ribosome- modifed target and decreased binding -Active efflux

ermA, ermB, ermC msrA

Chromosome

Chloramphenicol -chloramphenicol acetyltransferase; Acetylation of drug- inactivation

cat Plasmids

Tetracycline Tetracycline Minocycline

-Active efflux -ribosome protection protien; competitive binding

tetK, tetL tetM, tetO

pT181 plasmid SCCmec Type III

Fluoroquinolone Ciprofloxacin Norfloxacin

-Modified target – gyrase -Modified target – topoisomerase IV -Active efflux

gyrA grlA norA

Chromosome

25

ตารางท 1 ยนควบคมกลไกการตอการดอยาตางๆของ S. aureus (ตอ)

Antimicrobial agent Product and Mechanism of resistance Gene Gene location

Rifamycin Rifampin

Mutations in the rifampin resistance-determining (Rif)

regions of the rpoB gene and alterations in the target of rifampin

rpoB

RN4220 Plasmid

Oxazolidinone

Lizolid

structural alterations to the oxazolidinone binding site in the 50S peptidyl transferase center (PTC)

cfr

pSCFS7 plasmid

ดดแปลงมาจาก Reygaert, W.C. (2013) Antimicrobial resistance mechanisms of

Staphylococcus aureus. In: Méndez-Vilas, A. (ed.) Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education. p.297–305.

การวนจฉยเชอ S. aureus การวนจฉยแยกเชอ S. aureus เปนสงส าคญทหองปฏบตการจลชววทยาของโรงพยาบาลทกแหงจ าเปนตองท าการวนจฉยใหได เนองจากเปนเชอทกอปญหาทางการแพทยอยางมาก โดยขนตอนการทดสอบทใชในการจ าแนกเชอมดงน

การเกบสงสงสงตรวจ (specimen) เกบสงสงสงตรวจจากรอยโรคบรเวณตางๆ ไดแก ฝ หนอง แผลน ารอนลวกหรอไฟไหม รวมทง แผลผาตด ปสสาวะจากผปวยโรคกระเพาะปสสาวะอกเสบ เสมหะจากผปวยโรคปอดปวม อจจาระหรอสงอาเจยนจากผปวยโรคอาหารเปนพษ เลอดจากผปวยตดเชอในกระแสเลอด รวมทงสงสงสงตรวจปายจากรจมก (nasal swab)

การจ าแนกเชอ S. aureus ออกจากเชอกลมอน 1) การยอมแกรม ทดสอบการตดสและรปรางของเชอ โดยถาเปนเชอแกรมบวกจะตดสน าเงน-มวงของ crystal violet รปรางกลมเรยงตวกนคลายพวงองน (gram positive cocci in grape-like cluster)

2) ทดสอบการสรางเอนไซม catalase โดยหยด H2O2 3% ลงบนสไลด และเขยเชอมาผสมลงในสไลด สงเกตการเกดฟองแกสทเกดขน ถามฟองแกสเกดขนคอผลบวก แสดงวาเชอม

26

การสรางเอนไซม catalase โดยการเปลยน H2O2 เปนออกซเจนและน า ถาไมมฟองแกสเกดขนคอผลลบ 3) ทดสอบการหมกยอยน าตาลแมนทอลบนอาหารเลยงเชอ mannitol salt agar (MSA) ทมสวนประกอบทส าคญ คอน าตาลแมนทอล และม phenol red เปนอนดเคเตอร และมเกลอ NACl ในปรมาณทสามารถยบย งการเจรญของเชออนได โดยเชอ S. aureus มความสามารถทนเกลอไดด และนอกจากนยงสามารถหมกยอยน าตาลแมนทอลใหเปนกรด จงเปลยนสของ phenol red จากสแดงเปนสเหลอง และเกดโคโลนสเหลองทองบนอาหาร MSA

4) การทดสอบการยอยสลายเมดเลอดแดง (β - haemolysis) บนอาหาร blood agar (BA) โดยดจากลกษณะโคโลนทเกดขนบนอาหาร โดยโคโลนจะมขนาดเลก นน ขน สครม เกดวงใส (clear zone) รอบ ๆ โคโลน

5) การทดสอบการสรางเอนไซม coagulase ของเชอ S. aureus ซงม 2 ชนด ไดแก ชนดทเกาะอยกบผนงเซลลของเชอ (bound form หรอ clumping factor) และชนดทหลงออกมาภายนอกเซลล (extracellular enzyme) โดยแบงการทดสอบเปน 2 ชนด คอ 5.1) slide coagulase เปนการทดสอบการสรางเอนไซม coagulase ชนดทเกาะอยผนงเซลลของเชอ โดยท าการหยดพลาสมาลงบนสไลด จากนนเขยเชอทตองการทดสอบมาผสมใหเขากน ผลบวกจะพบการเกาะกลม (agglutination) ของเชอ และผลลบจะไมพบการเกาะกลมของเชอ อยางไรกตามควรน าเชอทใหผลลบไปทดสอบยนยนดวยการทดสอบ tube coagulase เนองจากพบวาเชอ S. aureus ประมาณ 15% จะไมมการสรางเอนไซม coagulase ชนดทเกาะอยทผนงเซลลแตจะสรางเฉพาะชนดทหลงออกมาภายนอกเซลลเทานน 5.2) tube coagulase เปนการทดสอบการสรางเอนไซม coagulase ชนดทหลงออกมาภายนอกเซลล โดยเอนไซมจะเปลยน fibrinogen ใหเปนกอน fibrin (fibrin clot) ท าการทดสอบโดยการเขยโคโลนเชอลงในหลอดทดลองทมพลาสมาปรมาณ 0.3-0.5 มลลลตร จากนนบมท 35 ◦C นาน 4 ชวโมง ผลบวกจะเกดการจบกนเปนของกอน fibrin ผลลบจะไมเกดการจบเปนกอน ทงนถาไดผลเปนลบควรบมตออก 18 ชวโมง เพราะการบมท 4 ชวโมง อาจใหผลลบลวง (false negative) อยางไรกตามพลาสมาทน ามาทดสอบ ควรใชพลาสมาทมาจากกระตาย (rabbit plasma) ทมสาร EDTA (ethylene diamine tetra acitat) ซงเปนสารปองกนเลอดแขงตว (anticoagulant) นอกจากนการทดสอบการสรางเอนไซม coagulase ยงสามารถจ าแนกเชอ S. aureus ออกเปน 2 กลม ไดแก coagulase-positive S. aureus และ coagulase-negative S. aureus (CNS)

27

การวนจฉยการดอตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ดวยวธการทางฟโนไทป ภายหลงจากวนจฉยแยกชนดของเชอ S. aureus โดยการทดสอบทางชวเคมแลว จะตองท าการทดสอบความไวตอยาตานจลชพ (Susceptibility testing) หรอเปนการทดสอบทางฟโนไทป ซงเปนวธมาตรฐานทใชส าหรบการตรวจสอบเชอดอตอยาโดยอาจมการปรบเปลยนสภาวะการเพาะเลยงเพอสงผลใหเชอมการแสดงออกมากขน การทดสอบความไวของเชอมดวยกนหลายวธ โดยสามารถท าไดทงในอาหารเลยงเชอชนดแขง และอาหารเลยงเชอชนดเหลว โดยมวธหลกอย 2 รปแบบ คอ broth dilution susceptibility test และ agar diffusion test

Agar disc diffusion Disc diffusion test (ภาพท 3) เปนวธทใชแพรหลายมากทสด เนองจากสะดวก ประหยด และใชเวลานอยกวาวธอนๆ วธนเปนการทดสอบในเชงคณภาพสามารถบอกผลไดวา เชอมความไวตอยาททดสอบหรอไม หลกการทวไปคอ ใหเลยงเชอทตองการทดสอบโดยปรบใหเชอใหมความขน 0.5 McFarland หรอมเชอปรมาณ 1 x 108 CFU/ml แลวน าเชอไปกระจายใหทวจานอาหาร Mueller-hinton agar ผสมกบ 2 % NaCl จากนนใหน าแผนยาตานจลชพทใชทดสอบมาวางบนผวหนาอาหาร น าไปบมเพาะทอณหภม 35◦C เปนเวลา 24 ชวโมง อานผลการทดสอบโดยการวดขนาดเสนผาศนยกลางของ inhibition zone ซงจะเหนเปนวงใสไมมโคโลนเชอรอบๆแผนยา เปรยบเทยบความสามารถในการยบย บเชอของแผนยากบคา inhibition zone ของสารมาตรฐานทก าหนดโดย Clinical laboratory standards institute(CLSI) (Brown et al., 2005; CLSI, 2015)

Minimal inhibitory concentration (MIC) by broth dilution test เปนการหาความเขมขนต าสดของยาทสามารถยบย งการเจรญของเชอได (ภาพท 4) หลกการโดยทวไปคอ เลยงเชอทตองการทดสอบในอาหารเลยงเชอชนดเหลว (Mueller hinton broth + 4 % NaCl) ซงมยาในความเขมขนตางๆกนผสมอย และสงเกตการเจรญของเชอ การอานคา MIC โดยดความขนดวยตาเปลา หรอ อาจใชสารบางอยางทสามารถชใหเหนการเจรญของเชอได เพอใหอานคาไดงายขนโดยอาจท าการทดลองโดยใชสาร Phenol red รวมกบ 10% glucose โดยหากมเชอเจรญจะเปลยนสอาหารจากสแดงเปนสสมเหลองได จากนนใหเปรยบเทยบคา MIC ของยาททดสอบกบคา MIC ของสารมาตรฐานทก าหนดโดย CLSI (Andrew, 2001; Brown et al., 2005; CLSI, 2015) การตรวจสอบความไวและการดอตอยาเปนสงทส าคญอยางมากตอการตดสนใจเลอกใชยาตานจลชพทเหมาะสมตอการรกษา ดงนนการเลอกใชยาตานจลชพเพอท าการรกษาขนอยกบผลการ

28

ทดสอบความไวตอยา ทใหผลในการลดหรอยบย งการเจรญของเชอแบคทเรย ซงถายาตานจลชพชนดใดมความไวตอตวอยางสงสงตรวจผปวย แสดงวายาชนดนนเหมาะสมตอการรกษา

ภาพท 3 Agar Diffusion Test ดดแปลงมาจาก Manisha Garg (2016) Top 4 Tests for Antimicrobial Drug Susceptibility,[online] http://www.biologydiscussion.com/medical-microbiology/top- .4-tests-for-antimicrobial- drug-susceptibility/55863

ดดแปลงมาจาก Manisha Garg (2016) Top 4 Tests for Antimicrobial Drug Susceptibility,[online] http://www.biologydiscussion.com/medical-microbiology/top-4-tests-for- antimicrobial-drug-susceptibility/55863

ภาพท 4 Minimal inhibitory concentration (MIC) by broth dilution test

29

การวนจฉยการดอตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ดวยวธทางชวโมเลกล หรอวธทางจโนไทป การทดสอบความไวตอยาตานจลชพ หรอวธการทางฟโนไทป เปนวธทใชเวลาในการ

ทดสอบทนานและบางวธตองใชความช านาญในการทดสอบ ดงนนจงตองใชวธทดสอบทาง ชวโมเลกลซงเปนการตรวจหาลกษณะทางจโนไทปของเชอซงจะมความจ าเพาะมากกวา และเปนการชวยยนยนผลการดอยาไดอกทางหนง

ในปจจบนไดมการพฒนาวธการทางชวโมเลกลมาใชทดสอบการดอยากนมากขน เนองจากสามารถแยกเชอดอตอยาไดอยางรวดเรวภายในเวลาไมนาน ท าใหสามารถตรวจสอบ ตดตาม ควบคมและปองกนโรคตดตอทเกดจากเชอ S. aureus ได นอกจากนมการศกษาจ านวนมากทใชเทคนคทางชวโมเลกลในการตรวจสอบเชอ S. aureus โดยสวนมากจะมงเนนไปทยนทเกยวของกบการดอตอยาตานจลชพ เพอเปนการยนยนผลการทดสอบทางฟโนไทปของการดอตอยา และในการวจยครงนผวจยไดเลอกทจะใชวธ PCR ซงเปนวธทนยมกนอยางแพรหลาย และยงเปนวธมาตรฐาน (gold standard) ในการตรวจหายนดอยาในเชอ S. aureus (CLSI, 2015) โดยเทคนค PCR จะเปนการเพมจ านวนของสารพนธกรรมทสนใจภายในหลอดทดลอง ท าใหสามารถตรวจสอบผลไดรวดเรวกวาหลายวธ อยางไรกตามเทคนค PCR ถอเปนเทคนคพนฐานหนงทสามารถน ามาประยกตใชใหมประสทธภาพมากยงขน เชน การใชเทคนค PCR ตรวจสอบยนดอยาหลายๆชนดในครงเดยวกนหรอทเรยกวา Multiplex PCR ซงมการใชกนอยางแพรหลายในหลายประเทศทวโลก ประโยชนของเทคนค PCR ทางดานการแพทย ไดแก การตรวจวนจฉยโรคโดยการตรวจหาเชอไวรสหรอแบคทเรยทเปนสาเหตของโรค การตรวจหายนกอมะเรง และการตรวจหายนดอยาตานจลชพ เปนตน ซงประโยชนของเทคนค PCR ทางการแพทยเหลานท าใหการวนจฉยโรคเพอปองกน และรกษาเปนไปอยางมประสทธภาพมากยงขน Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction หรอ PCR เปนเทคนคส าหรบเพมปรมาณดเอนเอโดยอาศยหลกการ DNA Replication ซงเปนการสงเคราะหสาย DNA สายใหม จาก ดเอนเอตนแบบในหลอดทดลองภายในระยะเวลาอนสน และไดดเอนเอสายใหมเกดขน จดเดนของเทคนค PCR คอ สามารถเพมปรมาณดเอนเอ ไดอยางเฉพาะเจาะจงโดยมขนตอนการท างานนอย และใชเวลานอย ส าหรบหลกการเทคนค PCR ใชหลกการพนฐานในการสงเคราะห DNA สายใหมจากสายดเอนเอแมแบบ (DNA template) หนงสายดวยเอนไซม DNA poloymerase ในการตดฉลากดเอนเอ และการศกษาวเคราะหล าดบเบส และ PCR สามารถสงเคราะหดเอนเอไดคราวละ 2 สายพรอมกน โดยใชไพรเมอร (primer) 1 ค ปฏกรยา PCR ม 3 ขนตอน และหมนเวยน ตอเนองกนไป ภายใตสภาวะท

30

เหมาะสมของแตละขนตอน ขนแรก คอ denaturing เปนการแยกสายดเอนเอตนแบบจากสภาพทเปนเสนคใหเปนเสนเดยวโดยใชอณหภมสง (92-95 ◦C) ขนทสอง คอ annealing จะลดอณหภมลงและจดใหไพรเมอร ซงเปนดเอนเอสายสนๆ (ประกอบดวยนวคลโอไทดจ านวน 14-13 เบส) ทมล าดบ เบสเปนคสมกบสายดเอนเอตนแบบจบคกน ซงนยมใชอณหภมในชวง (37-60◦C) จากนนจะเขาสขนท 3 คอ extension เปนขนตอนการสงเคราะหดเอนเอสายใหมโดยสงเคราะหตอจากสวนปลาย 5 ของไพรเมอร ตามขอมลบนสายดเอนเอตนแบบแตละสายโดยอาศยการท างานของเอนไซม DNA polymerase ซงเอนไซมนสามารถท างานไดดทสดทอณหภม 72-75 ◦C จากขนตอนท 1-3 ซงนบเปนจ านวน 1 รอบ (one cycle) ดงนนเมอจดใหเกดปฏกรยาลกโซจากขนท 1 ถง 3 หมนเวยนไปอกหลาย ๆ รอบจะเพมปรมาณดเอนเอได มากมาย (Frank Stephenson and Maria Abilock, 2012) ส าหรบการใชเทคนค PCR ในการตรวจสอบยนดอยาตานจลชพในเชอ S. aureus นน มหลกการดงน โดยท าการสกด DNA ทงจโนมของเชอแบคทเรย และน ามาท าการเพมปรมาณ DNA ของยนดอยาตางๆ เชน ยน mecA ซงเปนยนทน ารหสโครงสราง PBP2a มผลท าใหเชอนนดอตอยากลม β-lactam หรอยน femA ทเปนยนทมความจ าเพาะตอ staphylococci และมความเกยวของกบการแสดงของยนดอยาอกดวย นอกจากนยนดงกลาวเหลานจะมความแตกตางหลากหลายกน (polymorphism) ในขนาด DNA ในแตละสายพนธ ดงนนเทคนค PCR นอกจากจะใชในประโยชนในการตรวจหายนดอยา และยงสามารถใชในการจ าแนกชนดของเชอไดเชนกน นอกจากนยงมเทคนค Multiplex-PCR (m-PCR) ซงเปนเทคนค PCR อกแบบหนงซงเปนการเพมขยายดเอนเอเปาหมายโดยใชไพรเมอรหลายคพรอมกนในปฏกรยาเดยวกนโดยไพรเมอรแตละค ตองไมม complementary กน และเมอน าไปท า PCR จะใหผลผลตทมขนาดความยาวทแตกตางกน การท า multiplex PCR ตองปรบสภาวะใหเหมาะสมกบปฏกรยา เพอใหสามารถเพมขยายจ านวน DNA จากทกไพรเมอรใหเทากน จากนนจะท าการตรวจหา PCR product โดยใชกระแสไฟฟาแยก DNA บน agarose gel (Gel electrophoresis) น ามาเปรยบเทยบกบ DNA มาตรฐานททราบขนาดทแนนอน (DNA marker) จากนนยอมดวยส ethidium bromide แลวน าไปสองดดวยผาน UV ส าหรบ PCR product ทดควรเหนชนดเอนเอไดอยางชดเจน และตรงตามขนาดความตองการ (อสยา จนทรวทยานชต และ วชรนทร รงษภาณรตน, 2553)

ส าหรบตวอยางการศกษาทใชวธการทางฟโนไทปควบคกบวธการทางจโนไทปในการตรวจสอบการดอตอยาของเชอ S. aureus เชน รณภทร ส าเภา และ องอาจ เลาหวนจ (2557) ไดใชเทคนค PCR ยนยนการดอตอยาของเชอในกลม MRSA ทแยกไดจากสนข โดยหายน mecA ซงสามารถแยกเชอ S.aureus ไดทงหมด 99 ตวอยาง เมอน ามาทดสอบ disc diffusion พบวาดอตอยา methicillin 18 ตวอยาง หลงจากนนน าไปยนยนโดยเทคนค PCR เพอหายน mecA แตกลบพบยน

31

mecA เพยง 16 ตวอยาง แสดงใหเหนวา เทคนค disc diffusion มขอเสยทสงผลใหเกดผล false positive ดงนนจงมความจ าเปนทจะตองใชเทคนค PCR ในการตรวจหายนดอยาเพอยนยนผลการดอตอยา (รณภทร ส าเภา และ องอาจ เลาหวนจ, 2557)

เนตลกษณ ตนทวทธ และคณะ (2559) ไดพฒนาวธ Multiplex-PCR เพอลดระยะเวลาการตรวจวเคราะหเชอ S. aureus รวมทงตรวจหายนดอยา methicillin และ MLSB ไดอยางรวดเรว โดยศกษาเปรยบเทยบผลการใชวธ multiplex-PCR กบผลการวนจฉย และทดสอบความไวตอยาตานจลชพดวยวธดงเดมซงจากการทดสอบพบวายน femA mecA ermA ermB และ ermC มความจ าเพาะตอยนเปาหมาย และแสดงผลไปในทศทางเดยวกบการวเคราะหทางหองปฏบตการ คดเปนรอยละ 100 (เนตลกษณ ตนทวทธ และคณะ, 2559)

Murakami และคณะ (1991) ไดตรวจสอบหายน mecA ดวยวธ PCR เปรยบเทยบกบคา MIC ดวยวธ broth microdilluion ผลการทดลองพบวา MSSA 100% ไมพบยน mecA และ 98% ไวตอยา Oxacillin และตรวจไมพบยน mecA และมจ านวน 3 ตวอยางทมยน mecA แตมความไวตอยากลม β-lactams ซงอาจเปนเพราะเชอไมมการสราง PBP2a แตกลบสรางเอนไซม β-lactamase ออกมาเพอยอยสลายยาแทน (Murakami et al., 1991) Krzysztof และคณะ (2000) ทดสอบหายนดอยา Tetracycline ในเชอ MRSA โดยใชวธ PCR ในการตรวจหายน tetK, tetL, tetM หรอ tetO โดยในจ านวนทงหมด 66 ไอโซเลท พบวาม 24 ไอโซเลททมยน tetM ยนเดยว 21 ไอโซเลททมยน tetK ยนเดยว และ 21ไอโซเลท ทมยน tetK และ tetM (tetKM) เชอท งหมดมคา MIC ของยา Tetracycline > 8 mg/L. แตกลบพบวามบางเชอททดสอบดวยวธ Disc diffusion แลวพบเชอทไมดอตอยา Tetracycline และใหผลทไมสอดคลองกบวธ PCR แตทวาผลการทดสอบ MIC และ PCR กลบใหผลทสอดคลองกน สรปไดวาการทดสอบการดอตอยาตองใชขนตอนการตรวจสอบมากกวาหนงวธ จงจะสามารถยนยนผลการทดสอบได (Krzysztof et al., 2000) Duran และ คณะ (2012) ไดเปรยบเทยบรปแบบการดอตอยา และยนดอยาจากเชอ Staphylococci จ านวน 298 ไอโซเลททแยกไดจากตวอยางสงสงตรวจผปวยจากโรงพยาบาลในประเทศตรก โดยไดท าการทดสอบความไวตอยา และตรวจหายนดอยาดวยเทคนค multiplex-PCR สามารถแยกเชอ S. aureus จ านวน 139 ตวอยาง พบวาดอตอยา methicillin 23 ไอโซเลท (16.5%) แตกลบตรวจพบเชอทจบกบยน mecA 36 ไอโซเลท (25.9%) ม 53 ไอโซเลท (38.1%) ทดอตอยา Gentamicin และพบวาเชอในจ านวนนมยนดอยา gentamicin อยางนอย 1 ยน [aac(6’)/aph(2’’), aph(3’)-IIIa, ant(4’)-Ia] ซงพบวาม 17 ไอโซเลททมความไวตอยา gentamicin แตกลบตรวจพบยนดอยา gentamicin และในเชอจ านวนนจะมยนดอยาอยางนอย 1 ยน หรอมากกวา ม 84 ไอโซเลท

32

(60.4%) ท ดอตอยา erythromycin, และในเชอจ านวนนมยนดอยา Erythromycin (ermA, ermB, ermC and msrA) อยางนอย 1 ยนหรอมากกวา และยงพบวามเชอ S. aureus 57 ไอโซเลท (41%) ทดอตอยา Tetracycline แตกลบพบเชอทมยน tetK หรอ tetM หรอพบไดทงคจ านวน 59 ไอโซเลท นอกจากนเชอ S.aureus สวนใหญจะพบยน blaZ (93.5%). (Duran et al., 2012) Martineau และคณะ (2000) ไดคดแยกเชอ S. aureus และ S. epidermis ทแยกไดจากโรงพยาบาลหลายๆประเทศและน าทดสอบเพอตรวจหายนทเกยวของกบยาปฏชวนะ ดวยเทคนค multiplex-PCR โดยใชยนทก ากบการดอยาแตละชนดดงน oxacillin (mecA), gentamicin [aac (6 ') - aph (2 ")] และ erythromycin (ermA, ermB, ermC และ msrA) ผลการทดสอบพบความสมพนธระหวางยนดอยากบความไวตอยา ซงสวนใหญแสดงความสมพนธดงตอไปน คอ รอยละ 98 ดอตอยา oxacillin และตรวจพบยน mecA รอยละ 100 ดอตอยา gentamicin และตรวจพบยน aac (6 ') - aph (2 ") รอยละ 98.5 ดอตอยา erythromycin และตรวจพบยน ermA, ermB, ermC หรอ msrA (Martineau et al., 2000) Zmantar และคณะ (2013) ไดทดสอบความไวตอยาของเชอ S. aureus ทแยกไดจากโพรงจมกของผปวยโรงพยาบาลในประเทศลเบยโดยใชการหาคา MIC และใชเทคนค multiplex-PCR ในการตรวจหายนดอยาแตละชนด ผลการทดสอบพบวา เชอมอตราการดอตอยา oxacillin รอยละ 98และ erythromycin รอยละ 97 และสามารถตรวจพบยนดอยาไดดงน mecA (รอยละ 6), blaZ (รอยละ 100), ermA (รอยละ 15), ermB (รอยละ 30) , ermC (รอยละ 22) และ msrA (รอยละ 36) ชใหเหนวาเชอสวนใหญมอตราการดอตอยาในกลม macrolide ในระดบสงและสวนใหญจะพบกลมยน erm ทก ากบการดอยาในกลมนเชนกน (Zmantar et al., 2000)

33

บทท 3 วธการด าเนนการวจย วสดอปกรณและสารเคม 1. เชอแบคทเรยทใชในการวจย เชออางอง Staphylococus aureus ATCC 25923

2. อาหารเลยงเชอ 2.1 Nutrient broth (TM media, India) 2.2 Nutrient agar (TM media, India) 2.3 Mannitol salt agar (TM media, India) 2.4 Mueller-Hinton agar (TM media, India)

3. สารเคม 3.1 Agar (Mermaid, Thailand) 3.2 Ethanol 70% และ 95% (Merck KgaA, Germany)

3.3 Ethidium bromide (Bio-rad, USA) 3.4 McFarland standard 3.5 Sodium Chloride (NaCl; ChemeX, USA) 3.6 Agarose gel powder 1.0% (W/V) (Vivantis, USA) 3.7 Glycerol 20% 3.8 Phosphate buffer saline (PBS) 3.9 Hydrochoric acid (HCl; Mallinckrodt, USA) 3.10 Magnesium sulphate (MgSO4.7H2O; Univar, Australia)

3.11 Potassium chloride (KCl; Renkem, india) 3.12 Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4; Univar, Australia)

3.13 Potassium dihydrogen phosphate trihydrate (K2HPO4.3H20; ) 3.14 Sodium hydroxide (NaOH; Alpha, India) 3.15 Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4.7H2O; Unilab, Australia)

34

4. ยาตานจลชพ 4.1 Vancomycin powder 30 µg (Oxoid, England) 4.2 Oxacillin powder 1 µg (Himedia, India)

4.3 Cefoxitin disc 30 µg (Himedia, India) 4.4 Chloramphenical disc 30 µg (Himedia, India) 4.5 Tetracycline disc 30 µg (Himedia, India) 4.6 Penicillin disc 10 unit (Himedia, India) 4.7 Erythromycin disc 15 µg (Himedia, India) 4.8 Trimethoprim/Sulfamethoxazole disc 25 µg (Oxoid, England)

4.9 Gentamicin disc 10 µg (Himedia, India) 4.10 Clindamycin disc 2 µg (Himedia, India) 4.11 Linezolid disc 30 µg (Oxoid, England) 4.12 Ciprofloxacin disc 25 µg (Himedia, India)

5. วสดอปกรณและเครองมอ 5.1 จานเพาะเชอ (Petridish) (Sterilin,UK) 5.2 บกเกอร (Beaker) (SCHOTT,Germany) 5.3 หลอดทดลอง (Test tube) (Pyrex,USA) 5.4 ขวดแกว 500 และ 250 ml (Duran, Germany) 5.5 ไมพนส าลปราศจากเชอ (ปายเชอ) 5.6 หวงเขยเชอ (Loop) 5.7 Microscope (Nikon,Japan)

5.8 แผนสไลด (Pearl,China) 5.9 ขวดรปชมพ 500 และ 125 ml (Erlenmeyer flask)(SCHOTT,Germany) 5.10 กระบวกตวง (Cylinder) 5.11 Pasture pipette (Hirschmann Laborgerate) 5.12 96 well plate (Corning Incorporated,USA)

5.13 Micropipette (Discovery+,Poland) 5.14 Micropipette Tip (Extragene,USA)

5.15 Incubator (Memmert, Germany) 5.16 Polymerase Chain Reaction (PCR)

35

5.17 Autoclave (Kokusan, Japan) 5.18 Refrigerator (Sanyo, Japan) 5.19 Hot air oven (Memmert) 5.20 เครองชงสาร (Denver Instrument, USA) 5.21. Laminar airflow (Ehret) 5.22. Centrifuge (Hettich Zentrifugen Micro 22R,Germany) 5.23. Centrifuge tube (Extragenr,USA) 5.24. Vortex mixer (Vision Scientific) 5.25. 96 well plate (Corning Incorporated,USA) 5.26. Micropipette (Discovery+,Poland) 5.27. Micropipette Tip (Extragene,USA) 5.28. Gel electrophoresis (Biorad,Horizon)

6. ดเอนเอมาตรฐาน (DNA Ladder) 100 bp Ladder (Biolabs, England) การเกบตวอยาง การเพาะเลยงเชอและการจ าแนกเชอ S. aureus

ตวอยางเชอทใชในการวจยครงนไดรบความอนเคราะหจากโรงพยาบาลแหงหนงในจงหวดนครปฐม และท าการเกบตวอยางเชอตงแตเดอน พฤษภาคม พ.ศ. 2557 ถงเดอน สงหาคม พ.ศ. 2557 ทงนตวอยางเชอจากสงสงสงตรวจผปวย เชน เสมหะ, ปสสาวะ และน าไขสนหลง ไดรบความอนเคราะหจากหนวยจลชววทยาคลนกและตวอยางเชอทเกบสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล เชน ราวเหลก ราวบนไดและตามพน ผนงหอง ภายในแผนกผปวย หองตรวจโรค และหองพกผปวย โดยใชไมพนส าลจมสารละลาย PBS แลวท าการปายเชอ (swab) น าตวอยางเชอทงหมดทดสอบดวยวธการทางชวเคมในการคดแยกเชอ S. aureus ไดแก catalase test, haemolytic test, mannitol fermentation และ coagulase test เชอจะถกเกบไวใน glycerol 20% ทอณหภม -20 °C การทดสอบความไวของเชอตอยาตานจลชพ

Disc diffusion ส าหรบการทดสอบความไวของเชอ S. aureus ตอยาตานจลชพจะท าตามวธมาตรฐานของ

CLSI (ภาพท 5)โดยทดสอบกบแผนยาตานจลชพมาตรฐาน 11 ชนด (ตารางท 3) ไดแก Penicillin, Cefoxitin, Erythromycin, Chloramphenicol, Gentamicin, Clindamycin, Rifampin, Ciprofloxacin,

36

Linezolid, Sulfamethoxazole/Trimethoprim และ Tetracycline ซงเปนยาตานจลชพทจะตองใชในการทดสอบในเบองตน และใชเชอ S. aureus ATCC 25923 เปนกลมควบคมผลบวก น าเชอทดสอบมาเพาะเลยงบน Nutrient Agar (NA) บมทอณหภม 37 °C 24 ชวโมง เขยโคโลนเชอใสสารละลาย 0.85% NaCl ปรบความขนเทากบ 0.5 McFarland standard ( 108. CFU/ml) น าไมพนส าลปราศจากเชอจมลงในเชอทดสอบน าไปปายบนผวหนาอาหาร Mueller-Hinton agar + 2% NaCl (มความหนา 4 เซนตเมตร) ทงไวใหแหง ใชปากคบแผนยาปฏชวนะ (ตารางท 2) วางบนผวหนาอาหาร (ไมควรเกน 5 แผน/จาน) บมทอณหภม 35-37 °C เปนเวลา 18 – 24 ชวโมง อานผลโดยวดขนาดของเคลยรโซน (inhibition zone) (บรเวณวงใสรอบแผนยาทไมมเชอเจรญ) ทเกดจากแผนยาแตละชนดเปนหนวยมลลเมตร น าคาทวดไดไปเปรยบเทยบกบคา inhibition zone มาตรฐานดงแสดงในตารางท 2 เพอวดความสามารถของเชอททดสอบวามความไว (sensitive; S), กงกลาง (intermediate; I) หรอดอ (resistant; R) ตอยาตานจลชพทใชทดสอบและน ามาเขยนเปนรปแบบทดอตอยานนๆโดยอางองจาก CLSI (2015)

ภาพท 5 ขนตอนการทดสอบความไวตอยาตานจลชพดวยวธ Disc Diffusion

37

ตารางท 2 คามาตรฐานความไวและดอตอยาตานจลชพททดสอบดวยวธ Disc Diffusion

ทมา Clinical laboratory standards institute (CLSI). (2015). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing Twenty-Third Informational Supplement. CLSI document M100-S23 (ISBN 1- 56238-865-7).

Minimum inhibitory concentration (MIC) broth dilution test

การวจยครงนไดท าการทดสอบเพอหาคาความเขมขนต าสดของยา oxacillin และ vancomycin ทสามารถยบย งเชอได ทงนเพอคดกรองเชอ MRSA VISA และ VRSA และใชเชอ S. aureus ATCC 29213 เปนเชอกลมควบคมผลบวก (ภาพท 6) เตรยมอาหาร Mueller-Hinton broth + 4% Nacl ลงใน 96 well plate หลมละ 50 μl ระบระดบความเขมขนของแตละหลม ดงน 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 และ 0.125 μg/ml (ส าหรบยา oxacillin) และ 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, และ 0.25 μg/ml (ส าหรบยา vancomycin) เตรยมสารละลายยาปฏชวนะ (ตารางท 3) ทความเขมขน 256 μg/ml (oxacillin) และ 512 μg/ml ( vancomycin) จากนนใสลงในหลมแรกปรมาตร 50 μl จากนนดดสารละลายทจากหลมแรกปรมาตร 50 μl ไปใสใน well หลมท 2 จากท าซ าเชนนจนถงหลมระบความเขมขนสดทายของยาแตละชนด

Antimicrobial agent Disc content (μg)

Zone diameter (mm) Resistant Intermediate Sensitive

Penicillin (P) 10 unit ≤28 - ≥29 Cefoxitin (FOX) 30 ≤21 - ≥22 Erythromycin (E) 15 ≤13 14–22 ≥23 Chloramphenicol (C) 30 ≤12 13–17 ≥18 Gentamicin (CN) 10 ≤12 13–14 ≥15 Clindamycin (DA) 2 ≤14 15–20 ≥21 Rifampin (R) 30 ≤16 17-19 ≥20 Ciprofloxacin (CIP) 5 ≤15 16–20 ≥21 Linezolid (Lzd) 30 ≤20 - ≥21 Sulfamethoxazole/Trimethoprim (SXT) 25 ≤10 11-15 ≥16 Tetracycline (T) 30 ≤19 15–18 ≥14

38

และใหดดสารละลายในหลมสดทายทงไป 50 μl เตรยมเชอ S. aureus ใหมความขนเทากบ 0.5 McFarland standards (จ านวนเชอ 108 CFU/ml) ดวยสารละลาย 0.85% NaCl ใสเชอลงไป 50 μl ทกหลม (ยกเวน negative control) โดยเชอในแตละหลมจะมความเขมขนสดทายประมาณ 105 CFU/ml บมทอณหภม 35 °C เปนเวลา 18 – 24 ชวโมง อานคา MIC จากหลมทมความเขมขนของยาต าสดทยบย งการเจรญของเชอ (หรอหลมสดทายทอาหารเลยงเชอไมเปลยนเปนสเหลอง) และวเคราะหคา breakpoint มาตรฐานโดยอางองจาก CLSI (2015) (ตารางท 3)

ภาพท 6 ขนตอนการทดสอบหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเชอดวยวธ broth microdilution ตารางท 3 คา Minimum Inhibitory Concentration (MIC) มาตรฐานดวยวธ Broth Microdilution (CLSI, 2015)

ยาตานจลชพ MIC (μg/mL) Sensitive Intermediate Resistant

Oxacillin (OX) ≤2 - ≥4 Vancomycin (VA) ≤2 4-8 ≥16 ทมา Clinical laboratory standards institute (CLSI). (2015). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing Twenty-Third Informational Supplement. CLSI document M100-S23 (ISBN 1- 56238-865-7).

39

การตรวจหายนดอยาดวยเทคนค PCR และ multiplex-PCR การสกดดเอนเอ (DNA extraction)

ขนตอนการสกดดเอนเอนผวจยไดดดแปลงมาจากวธของ Tiago และคณะ (2015) โดยน าเชอตวอยางทเพาะเลยงใน Brain heart broth (BHB) มาท าการปนเหวยงทความเรว 12,396 g เปนเวลา 5 นาทและทงสวนใสดานบน (Supernatant) แลวเตม extraction buffer (200 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, 25 mM NaCl, 1% SDS, pH 8.0) ปรมาตร 600 µl วางทงไวเปนเวลา 5 นาท และน าไปแชในอางน ารอนทอณหภม 65°C นาน 30 นาท เตม phenol/chloroform : isoamyl alcohol [1:1 (24:1)] ในอตราสวน 1:1 และ ปนเหวยงทความเรว 10000 g เปนเวลา 5 นาท และเกบสวนใสดานบนไปใสหลอดใหมและเตม absolute ethanol ในปรมาณ 2 เทา เกบไวทอณหภม -20 °c เปนเวลา 2 ชวโมง ปนเหวยงทความเรว 14549 g เปนเวลา 30 นาท ทงสวนใสทงหมดและ ลางตะกอนดวย 70% ethanol ปรมาตร 500 µl ปนเหวยงท 13000 x g เปนเวลา 5 นาท ทงสวนใสไปและละลายตะกอนดเอนเอทไดดวย TE buffer (10 mM Tris-HCl (ph 8.0) ปรมาตร 30 µl จากนนเกบไวทอณหภม -20 °C

การตรวจหายนดอยาดวยเทคนค PCR และ multiplec-PCR น าดเอนเอตนแบบทไดมาท าการเพมจ านวนดเอนเอโดยใชไพรเมอรของยนทควบคมการดอยาซงผวจยมความสนใจจะใชเทคนค PCR ในการตรวจหายน femA (ยนยนสายพนธ S. aureus) และยน aac(6’)/aph(2’’) (ยนยนการดอตอยา gentamicin) และใชเทคนค multiplex-PCR ตรวจหายนดอยา blaZ (ยนยนการดอตอยา penicilin), mecA (ยนยนการดอตอยา methicilin และ oxacillin) ermA (ยนยนการดอตอยา erythromycin) tetK และ tetM (ยนยนการดอตอยา tetracycline) ผสมกบสวนผสมการท าปฏกรยาลกโซ (PCR mixture) (แสดงไวในตารางภาพผนวกหนา 90) และสภาวะการท าปฏกรยาลกโซจะแสดงในตารางท 5 จากนนตรวจสอบผลตภณฑ PCR (PCR product) ดวยวธ agarose gel electrophoresis โดยผสมผลตภณฑ PCR ทไดกบ loading dye และตรวจสอบใน 1% (w/v) agarose gel โดยใชเครอง electrophoresis chamber จากนนน า agarose gel ยอมสดวย ethidium bromide แลวน าไปสองดแถบดเอนเอ (band) ของผลตภณฑ PCR ภายใตแสง UV เพอเปรยบเทยบขนาดของ PCR product กบ 100 bp DNA ladder และใช S. aureus ATCC 25923 เปน negative control

40

ตารางท 4 ไพรเมอรและสภาวะการท าปฏกรยาลกโซทใชในการทดสอบ PCR และ multiplex

41

บทท 4 ผลการทดลอง

การเกบตวอยางและการจ าแนกเชอ ในการวจยครงนผวจยท าการเกบตวอยางเชอทงหมด 69 ตวอยาง ซงเปนตวอยางทไดจากตวอยางสงสงตรวจผปวย (specimen) เชน เลอด, เสมหะ, หนอง และจมก เปนตน จ านวน 36 ตวอยาง และตวอยางทเกบดวยวธการปายเชอ (swab) จากสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล เชน ราวเหลก ราวบนได และพนจ านวน 33 ตวอยาง เมอน ามาคดแยกเชอ S. aureus ดวยวธทางชวเคม พบวาสามารถแยกเชอ S. aureus จากตวอยางสงสงตรวจผปวยไดจ านวน 31 ไอโซเลท โดยสวนใหญจะแยกไดจากเสมหะของผปวย (รอยละ 41.9) หนอง (รอยละ 12.9) และเลอดผปวย (รอยละ 12.9) และตวอยางทเกบดวยวธปายเชอจ านวน 23 ไอโซเลท โดยสวนใหญจะแยกไดจากพน (รอยละ 30.4) และเตยงภายในหองผปวย (รอยละ 26) ดงนนเชอ S. aureus ทแยกไดจากทง 2 กลมรวมทงหมด 54 ไอโซเลท (ตารางท 5)

42

ตารางท 5 หมายเลขเชอ S. aureus ทแยกไดจากตวอยางสงสงตรวจผปวย (specimen) และตวอยาง ปายเชอ (swab)

ตวอยาง หมายเลขเชอ สงตรวจผปวย / ต าแหนงทเกบ

ตวอยาง จ านวน

(รอยละ)

ตวอยางทงหมด (n = 69)

เชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวย (n = 31)

Sp2, Sp6, Sp9, Sp13, Sp17, Sp19, Sp20, Sp22, Sp23, Sp24, Sp27, Sp29, Sp30

เสมหะ 13 (41.9)

Sp3, Sp5, Sp21, Sp28 หนอง 4 (12.9) Sp4, Sp10, Sp12, Sp26 เลอด 4 (12.9) Sp11, Sp16, Sp18 หวไหล, รกแร, แขน 3 (9.7) Sp8, Sp7 ขา, เทา 2 (6.4) Sp1 สายสวน 1 (3.2) Sp14 จมก 1 (3.2) Sp25 ปสสาวะ 1 (3.2) Sp15 คอ 1 (3.2) Sp31 ห 1 (3.2)

เชออนๆทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวย (n = 5)

Sp34, Sp35 Sp32 Sp33 Sp36

หนอง หลง เสมหะ เลอด

2 (6.4) 1 (3.2) 1 (3.2) 1 (3.2)

เชอ S. aureus ทแยกตวอยางปายเชอ

(n = 23)

Sw2, Sw3, Sw7, Sw8, Sw11, Sw19, Sw20 พนภายในหองผปวย 7 (30.4) Sw1, Sw4, Sw10, Sw12, Sw18, Sw22 เตยงผปวย 6 (26.1) Sw5, Sw13, Sw17, Sw21 พนหองน า 4 (17.4) Sw6, Sw14, Sw23 พนบนได 3 (13) Sw9, Sw15 ราวบนได 2 (8.7) Sw16 พนทางเดน 1 (4.3)

เชออนๆทแยกจากตวอยางปายเชอ (n = 10)

Sw2, Sw5, Sw9, Sw17,Sw23 Sw3,Sw16, Sw28 Sw6 Sw18

พน ราวบนได เตยงผปวย พนหองน า

5 (21.7) 3 (13) 1 (4.3) 1 (4.3)

รวม เชอ S. aureus ทแยกไดทงหมด 54 (78.3) เชออนๆ ทงหมด 15 (21.7) หมายเหต Sp (specimen) = ตวอยางสงตรวจผปวย , Sw (swab) = ตวอยางปายเชอ

43

การทดสอบความไวตอยาตานจลชพ ภาพท 7 แสดงผลการทดสอบความไวตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกไดจากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอจ านวน 54 ไอโซเลทโดยวธ disc diffusion (ภาพท 8 )โดยทดสอบกบแผนยาตานจลชพจ านวน 11 ชนด ไดแก penicillin, erythromycin, tetracycline, chloramphenicol,cefoxitin, gentamicin, ciprofloxacin, rifampin, sulfamethoxazole/trimethoprim, linezolid และ clindamycin ในสวนของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวย พบวาทกไอโซเลทมความไวตอยา chloramphenicol, rifampin และ linezolid แตดอตอยา penicillin มากทสด (รอยละ 96) รองลงมา คอ erythromycin (รอยละ 45.1) และ clindamycin (รอยละ 13.5 ) ซงในตวอยางปายเชอพบวาทกไอโซเลท มความไวตอยา chloramphenicol, gentamicin, ciprofloxacin, rifampin และ linezolid และแสดงออกวาดอตอยา penicillin มากทสด (รอยละ 65.2) รองลงมาคอ cefoxitin (รอยละ 43.5) และ tetracycline) (รอยละ 13) โดยรวมแลวเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอทกไอโซเลท มความไวตอยา chloramphenicol, rifampin และ linezolid และดอตอยา penicillin มากทสด (รอยละ 83.3) มอตราการดอตอยา erythromycin และ cefoxitin ในระดบปานกลางและดอตอยา tetracycline, clindamycin, gentamicin และ trimethoprim-sulfamethoxazole ในระดบต า

ภาพท 7 ผลการทดสอบความไวตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ดวยวธ disc diffusion S; ไวตอยา R; ดอตอยา

44

PEN

(penic

ilin); E

RY (e

rythro

mycin

); TE (

tetrac

yclin

e); C

HLO

(chlor

amph

enico

l); FO

X (ce

foxitin

); GEN

(gen

tamici

n); C

IP

(Cipr

oflox

acin)

; R (r

ifamp

in); S

XT (tr

imeth

oprim

-sulfa

metho

xazo

le);

LZD

(lineso

lid); D

A (cl

indam

ycin)

; SP (

spec

imen

); SW

(swa

b)

ภาพท

8 ผล

ทดสอ

บความไ

วตอยาของเชอ

S. au

reus ด

วยแผ

นยาตาน

จลชพ

11 ชน

ด

45

การหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบยงเชอได (MIC) ของยา oxacillin และ vancomycin ผลการทดสอบหาคาความเขมขนต าสดของยา oxacillin (ภาพท 9 ) และ vancomycin (ภาพท 10 ) ทสามารถยบย งการเจรญของเชอดวยวธ broth microdilution เพอคดกรองเชอ MRSA VISA และ VRSA พบวาทงเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอทกไอโซเลทมความไวตอยา vancomycin ซงมคา MIC อยระหวาง 0.25 - 2 µg/ml และมเชอตวอยางทงหมดรอยละ 24.1 ทดอตอยา oxacillin ซงมคา MIC ≥ 4 µg/ml โดยเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยสวนใหญรอยละ 19.3 จะมคา MIC ตอยา oxacillin ในระดบสงทประมาณ 64->64 µg/ml ในขณะทเชอจากตวอยางปายเชอรอยละ 43.5 มคา MIC ตอยา oxacillin มชวงการดอยากระจายอยในชวง 8->64 µg/ml (ตารางท 6)

ภาพท 9 ผลการทดสอบหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเชอไดของยา oxacillin P = positive control คอ S. aureus ATCC 25923 N = negative control คอ อาหารเลยงเชอ สเหลอง = ผลบวก คอ เชอเจรญ สแดง = ผลลบ คอ เชอไมเจรญ

46

ภาพท 10 ผลการทดสอบหาคาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งเชอไดของยา vancomycin P = positive control คอ S. aureus ATCC 25923

N = negative control คอ อาหารเลยงเชอ สเหลอง = ผลบวก คอ เชอเจรญ สแดง = ผลลบ คอ เชอไมเจรญ

47

รปแบบการดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus จากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ ตารางท 7 แสดงรปแบบการดอตอยาตานจลชพในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ พบวาเชอทงหมดมรปแบบการดอตอยา penicillin, erythromycin, tetracycline, chloramphenicol, cefoxitin, gentamicin, ciprofloxacin, rifampin, sulfamethoxazole/Trimethoprim, linezolid, clindamycin และ oxacillin ตามล าดบ ท งหมด 22 รปแบบ โดยเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยมรปแบบการดอตอยา 13 รปแบบ ซงพบวามสวนใหญจะมรปแบบทดอตอยา penicillin ชนดเดยว (รปแบบท 1 ) มากทสดถงรอยละ 38.7 รองลงมาคอดอตอยา 2 ชนดคอ penicilin กบ erythromycin (รปแบบท 3) รอยละ 25.8 ในขณะทรปแบบการดอตอยาอนๆจะมจ านวนเชออยในชวงทใกลเคยงกนประมาณรอยละ 3.2 (รปแบบท 4, 9, 11-13 , 16-18 และ 20-21) ขณะทพบตวอยางรอยละ 29 (รปแบบท 9, 12-14 17-18 และ 20-21) ทมรปแบบการดอตอยาหลายชนด (ดอตอยา 3 ชนดหรอมากกวา, multidrug resistant) และมเพยง 1 ไอโซเลตเทานนทไมดอตอยาชนดใด ในตวอยางปายเชอมรปแบบการดอตอยา 13 รปแบบ พบรปแบบการดอตอยา penicillin ชนดเดยวมากทสด (รปแบบท 1) ถงรอยละ 30.4 รองลงมาคอดอตอยา cefoxitin (รปแบบท 2) รอยละ 6.4 และพบเชอทมรปแบบการดอตอยาหลายชนด (รปแบบท 7-8, 10, 15-16

ตารางท 6 คาความเขมขนต าสดทสามารถยบย งการเจรญของเชอ (MIC) ของยา oxacillin และ vancomycin

48

และ 19) รอยละ 34.7 ในขณะทรปแบบการดอตอยาอนๆ (รปแบบท 3, 5-8,10,14-16 และ 19) จะมจ านวนเชออยในชวงทใกลเคยงกนทประมาณรอยละ 4.3 โดยรวมแลวทงตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอ คอนขางทจะมรปแบบการดอตอยาทหลากหลาย โดยพบรปแบบการดอตอยาอยางนอยทสด 1 ชนด และอยางมากทสด 6 ชนด (ตารางท 2) อกทงยงพบวาสวนใหญมรปแบบการดอตอยา penicillin ชนดเดยว (รปแบบท 1) มากทสดถงรอยละ 35.2 รองลงมาคอดอตอยา penicilin กบ erythromycin (รปแบบท 3) (รอยละ 16.6) และรปแบบการดอตอยาอนๆ (รปแบบท 2, 4-21) จะมจ านวนเชออยในชวงทใกลเคยงกนประมาณรอยละ 1.8-3.7 ( 1-2 ไอโซเลต) นอกจากนพบวามถง 16ไอโซเลต (รอยละ 29.6) ทมรปแบบการดอตอยาหลายชนด (รปแบบท 7-21) โดยเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวย (รอยละ 34.7) มเชอทมรปแบบการดอตอยาหลายชนดในจ านวนทใกลเคยงกบเชอจากตวอยางปายเชอ(รอยละ 29) นอกจากนในตวอยางสงสงตรวจผปวยยงพบวาม 2 ไอโซเลททมรปแบบทดอตอยามากทสด 6 ชนด (รปแบบท 20 และ 21)

49

ตารางท 7 รปแบบการดอตอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ

รปแบบ รปแบบการดอตอยา

จ านวน (ไอโซเลท)

รวม (n=54) ตวอยางสงสงตรวจผปวย

จ านวน (n= 31)

ตวอยางปายเชอ

จ านวน (n=23) 1 PEN 12 (38.7) 7 (30.4) 19 (35.2) 2 FOX - 2 (8.6) 2 (3.7) 3 PEN/ERY 8 (25.8) 1 (4.3) 9 (16.6) 4 PEN/TE 1 (3.2) - 1 (1.8) 5 FOX/OXA - 1 (4.3) 1 (1.8) 6 PEN/FOX - 1 (4.3) 1 (1.8) 7 PEN/FOX/OXA - 1 (4.3) 1 (1.8) 8 TE/FOX/OXA - 1 (4.3) 1 (1.8) 9 PEN/CIP/DA 1 (3.2) - 1 (1.8)

10 PEN/SXT/DA - 1 (4.3) 1 (1.8) 11 PEN/ERY/TE/OXA 1 (3.2) - 1(1.8) 12 PEN/ERY/SXT/DA 1 (3.2) - 1 (1.8) 13 PEN/GEN/CIP/DA 1 (3.2) - 1(1.8) 14 PEN/FOX/DA/OXA - 1 (4.3) 1(1.8) 15 PEN/TE/FOX/OXA - 1 (4.3) 1(1.8) 16 PEN ERY/TE/ FOX/OXA 1 (3.2) 1 (4.3) 2 (3.7) 17 PEN/GEN/CIP/DA/OXA 1 (3.2) - 1(1.8) 18 PEN/ERY/FOX/DA/OXA 1 (3.2) - 1 (1.8) 19 PEN/FOX/SXT/DA/OXA - 1 (4.3) 1 (1.8) 20 PEN/ERY/FOX/CIP/DA/OXA 1 (3.2) - 1 (1.8) 21 PEN/ERY/TE/FOX/SXT/OXA 1 (3.2) - 1 (1.8) 22 ไมพบการดอตอยา 1 (3.2) 4 (17.4) 5 (9.2)

ดอตอยา 3 ชนดหรอมากกวา (multidrug resistant) 9 (29) 7 (30.4) 16 (29.6)

ดอตอยา 6 ชนด 2 (16.1) 0 2 (3.7)

PEN, penicilin; ERY, erythromycin; TE, tetracycline;; FOX, cefoxitin; GEN, gentamicin; CIP, Ciprofloxacin; SXT, trimethoprim-sulfamethoxazole; DA, clindamycin

50

การตรวจหายนดอยาตานจลชพ ตารางท 8 แสดงผลการทดสอบของการใชวธ Multiplex-PCR และ PCR ในการตรวจยนยนยน femA และยนดอยาตานจลชพ 6 ชนด ไดแก blaZ, mecA, ermA, aac(6’)/aph(2), tetK และ tetM ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอ โดยพบวาทกไอโซเลทตรวจพบยน femA (ภาพท 11) ในตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอสามารถตรวจพบเชอทจบกบยน blaZ (ภาพท 12 ) มากทสด (รอยละ 87) โดยตรวจพบยน blaZ จากตวอยางสงสงตรวจผปวยไดรอยละ 96.7 และตวอยางปายเชอรอยละ 74 ตรวจพบเชอทจบกบยน mecA (ภาพท 12)ทงหมดรอยละ 27.8 โดยตรวจพบเชอทจบกบยน mecA ในตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอรอยละ 22.5 และ 34.9 ตามล าดบ ตรวจพบเชอทจบกบยน ermA (ภาพท 14 ) รอยละ 37 โดยตรวจพบยน ermA ในตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอในระดบปานกลางรอยละ 48.4 และ 21.7 ตามล าดบ ตรวจพบเชอทจบกบยน tetK และ tetM (ภาพท 14) รอยละ 16.6 เทากน โดยตรวจพบยน tetK จากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอรอยละ 19.3 และ 13 ตามล าดบ และตรวจพบยน tetM ในเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอรอยละ 17.4 และ 16.1 ตามล าดบ นอกจากนยงตรวจพบเชอทมทงยน tetK และ tetM รอยละ 9.3 โดยตรวจพบในตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอรอยละ 9.7 และ 8.7 ตามล าดบ ในทางตรงกนขามกลบตรวจพบเชอทมการจบกบยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) (ภาพท 13)ในระดบต า (รอยละ 11.1) โดยตรวจพบยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) จากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอรอยละ 12.9 และ 8.7 ตามล าดบ

51

ตารางท 8 แสดงผลการตรวจหายนดอยาของเชอ S. aureus ในตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอดวยวธ PCR และ multiplex-PCR

ยนดอยา จ านวนตวอยางเชอทตรวจพบยนดอยา

รวม ตวอยางสงสงตรวจผปวย (n = 31 ) (รอยละ)

ตวอยางปายเชอ (n = 23) (รอยละ)

femA* 31 (100) 23 (100) 54 (100) blaZ 30 (96.7) 17 (74) 47 (87) mecA 7 (22.5) 8 (34.9) 15 (27.8) ermA 15 (48.4) 5 (21.7) 20 (37) aac (6 ′)/aph(2 ′′) 4 (12.9) 2 (8.7) 6 (11.1) tetK 6 (19.3) 3 (13) 9 (16.6) tetM 5(16.1) 4 (17.4) 9 (16.6) tetK + tetM 3 (9.7) 2 (8.7) 5 (9.3) ตรวจไมพบยนดอยา 1 (3.22) 6 (26.1) 7 (13)

*จ าเพาะกบสายพนธ S. aureus

ภาพท 11 ผลการตรวจหายน femA โดยเทคนค PCR ; M คอ 100 bp DNA marker, lane 1 คอ S. aureus ATCC 25923 (positive control) ; lane 2-6 คอ ยน femA (450 bp) lane 7; Escherichia coli ATCC 25922 (negative control)

52

ภาพท 12 ผลการตรวจหายน blaZ และ mecA โดยเทคนค Multiplex-PCR; M คอ100 bp DNA marker, lane 1-6 คอ blaZ (774 bp), lane 2, 3 และ 5 คอ ยนmecA(519 bp), lane 7; S. aureus ATCC 25923 (negative control)

ภาพท 13 ผลการตรวจหายน aac (6 ′)/aph(2 ′′) โดยเทคนค PCR; M คอ 100 bp DNA marker, lane 1, 2, 5 และ6 คอยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) (407 bp), lane 7; S. aureus ATCC 25923 (negative control)

53

ความสมพนธระหวางผลทดสอบความไวตอยาและยนดอยาตานจลชพแตละชนด ตาราง ท 9-13 แสดงความสมพนธระหวางผลทดสอบความไวตอยา penicillin, erythromycin, tetracycline, cefoxitin, และ gentamicin ททดสอบดวยวธ disc diffusion และยา oxacillin ททดสอบดวยวธ broth microdilution กบยนดอยาตานจลชพ 6 ชนด ททดสอบดวยวธ PCR และ Multiplex-PCR ไดแก blaZ (ยนยนการดอตอยา penicilin), mecA (ยนยนการดอตอยา methicilin และ oxacillin) ermA (ยนยนการดอตอยา erythromycin) aac(6’)/aph(2’’) (ยนยนการดอตอยา gentamicin) tetK และ tetM (ยนยนการดอตอยา tetracycline) ในตวอยางเชอ S. aureus จากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอจ านวน 54 ไอโซเลท

ภาพท 14 ผลการตรวจหายน ermA tetK และ tetM โดยเทคนค Multiplex-PCR M คอ 100 bp DNA marker, lane 1, 2, 4 และ 6 คอยน ermA (190 bp), lane l, 4, 5 และ6 คอยน tetK, (360 bp), lane 1, 3 และ 6 คอ ยน tetM (158 bp), lane 7; S. aureus ATCC 25923 (negative control)

54

ตารางท 9 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Penicillin กบยน blaZ ในเชอ S. aureus ทแยกจาก ตวอยาง สงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ

ตวอยาง Penicillin

ความไวตอยา จ านวน (รอยละ)

blaZ-positive จ านวน (รอยละ)

blaZ-negative จ านวน (รอยละ)

ตวอยางสงสงตรวจผปวย (n= 31)

R = 30 (96.7) 30 (96.7) - S = 1 (3.2) - 1 (3.2)

ตวอยางปายเชอ (n = 23)

R = 15 (65.2) 15 (65.2) - S = 8 (34.8) 2 (8.7) 6 (26.1)

รวม (n = 54)

R = 45 (83.3) 45 (83.3) - S = 9 (16.7) 2 (3.7) 7 (13)

R = Resistant; S = Susceptible

ตารางท 9 แสดงความสมพนธระหวางตวอยางเชอทแสดงออกวาดอตอยา penicilin กบยน blaZ พบวาเชอทกไอโซเลทรอยละ 83.3 โดยแบงเปนตวอยางสงสงตรวจผปวยรอยละ 96.7 และเชอจากตวอยางปายเชอรอยละ 65.2 มการแสดงออกวาดอตอยา penicilin และตรวจพบยน blaZ อยางไรกตามกลบพบวาในตวอยางปายเชอม 2 ไอโซเลททแสดงออกวาไวตอยา penicilin แตกลบตรวจพบยน blaZ ตารางท 10 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Cefoxitin และ Oxacillin กบยน mecA ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ

ตวอยาง Cefoxitin Oxacillin

ความไวตอยา จ านวน (รอยละ)

mecA-positive จ านวน (รอยละ)

mecA-negative จ านวน (รอยละ)

ความไวตอยา จ านวน (รอยละ)

mecA-positive จ านวน (รอยละ)

mecA-negative จ านวน (รอยละ)

ตวอยางสงสงตรวจผปวย

(n= 31)

R = 4 (12.9) 4 (12.9) - R = 6 (19.3) 5 (16.1) 1 (3.2) S = 27 (87) 3 (9.7) 24 (77.3) S = 25 (80.6) 2 (6.5) 23 (74.1)

ตวอยางปายเชอ (n = 23)

R = 10 (43.5) 4 (17.4) 6 (26.1) R = 7 (30.4) 3 (13) 4 (17.4) S = 13 (56.5) 4 (17.4) 9 (39.1) S = 16 (69.5) 5 (21.7) 11 (47.8)

รวม (n = 54)

R = 14 (25.9) 8 (14.8) 6 (11.1) R = 13 (24.1) 8 (14.8) 5 (9.3) S = 40 (74.1) 7 (13) 33 (61.1) S = 41 (76) 7 (13) 34 (63)

R = Resistant; S = Susceptible

55

ตารางท 10 แสดงความสมพนธระหวางตวอยางเชอทแสดงออกวาดอตอยา cefoxitin และ oxacillin กบยน mecA โดยพบวาเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยทงหมด (รอยละ 12.9) มการแสดงออกวาดอตอยา cefoxitin และตรวจพบยน mecA ในขณะทมเพยงรอยละ 9.7 ทมการแสดงออกวาไวตอยา cefoxitin แตกลบตรวจพบยน mecA และมตวอยางปายเชอรอยละ 43.5 ทแสดงออกวาดอตอยา cefoxitin แตกลบตรวจไมพบยน mecA ถงรอยละ 26.1 ในขณะทมตวอยางรอยละ 13 ทแสดงออกวาไวตอยา cefoxitin แตกลบตรวจพบยน mecA ความสมพนธระหวางตวอยางเชอทดอตอยา oxacillin กบยน mecA โดยพบวาเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยรอยละ 16.1 ทแสดงออกวาดอตอยา oxacillin แตกลบม 1 ไอโซเลททตรวจไมพบยน mecA ในขณะทม 2 ไอโซเลททแสดงออกวาไวตอยา oxacillin แตกลบตรวจพบยน mecA และในตวอยางปายเชอรอยละ 30.4 ทแสดงออกวาดอตอยา oxacillin แตกลบพบเชอทตรวจไมพบยน mecA ถงรอยละ 17.4 ตรงกนขามกลบพบวามเชอรอยละ 13 ทแสดงออกวาไวตอยาแตกลบตรวจพบยน mecA ตารางท 11 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Erythromycin กบยน ermA ในเชอ S. aureus ท แยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ

ตวอยาง Erythromycin

ความไวตอยา จ านวน (รอยละ)

ermA-positive จ านวน (รอยละ)

ermA-negative จ านวน (รอยละ)

ตวอยางสงสงตรวจผปวย (n= 31)

R = 14 (45.1) 13 (41.9) 1 (3.2) S = 17 (54.8) 2 (6.4) 15 (48.4)

ตวอยางปายเชอ (n = 23)

R = 2 (8.7) 1 (4.3) 1 (4.3) S = 21 (91.2) 3 (13) 18 (78.2)

รวม (n = 54)

R = 16 (29.6) 14 (25.9) 2 (3.7) S = 38 (70.4) 5 (9.3) 33 (61.1)

R = Resistant; S = Susceptible

ตารางท 11 แสดงความสมพนธระหวางตวอยางเชอทดอตอยา erythromycin กบยน ermA

โดยพบวาเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยรอยละ 45.1 ทแสดงออกวาดอตอยา erythromycin แตม 1 ไอโซเลททตรวจไมพบยน ermA ในขณะทม 2 ไอโซเลททแสดงออกวาไวตอยา erythromycin แตกลบตรวจพบมยน ermA และในตวอยางปายเชอมเพยง 1 ไอโซเลทเทานนทแสดงออกวาดอตอยา

56

erythromycin แตตรวจไมพบยน ermA ในขณะทมตวอยางรอยละ 13 ทแสดงออกวาไวตอยา erythromycin แตกลบตรวจพบยน ermA

ตารางท 12 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา gentamicin กบยน aac(6’)/ aph(2’’) ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ

ตวอยาง Gentamicin ความไวตอยา จ านวน (รอยละ)

aac(6’)/ aph(2)-positive จ านวน (รอยละ)

aac(6’)/ aph(2)-negative จ านวน (รอยละ)

ตวอยางสงสงตรวจผปวย (n= 31)

R = 2 (6.4) 2 (6.4) - S = 29 (93.5) 3 (9.6) 26 (83.9)

ตวอยางปายเชอ (n = 23)

R = 0 (0) - - S = 23 (100) 2 (8.7) 21 (91.3)

รวม (n = 54)

R = 2 (3.7) 2 (3.7) - S = 52 (96.3) 5 (9.3) 47 (87)

R = Resistant; S = Susceptible

ตารางท 12 แสดงความสมพนธระหวางตวอยางเชอทดอตอยา gentamicin กบยน aac(6’)/

aph(2’’) โดยพบวาเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยทงหมด 2 ไอโซเลททแสดงออกวาดอตอยา gentamicin และตรวจพบยน aac(6’)/ aph(2’’) ในขณะทม 3 ไอโซเลททแสดงออกวาไวตอยา gentamicin แตกลบตรวจพบวามยน aac(6’)/ aph(2’’) และในตวอยางปายเชอทงหมดไมมการแสดงออกวาดอตอยา gentamicin และตรวจไมพบยน aac(6’)/ aph(2’’) ตรงกนขามพบวาม 2 ไอโซเลททแสดงออกวาไวตอยา gentamicin แตกลบตรวจพบยน aac(6’)/ aph(2’’)

57

ตารางท 13 ความสมพนธระหวางเชอทดอตอยา Tetracycline กบยน tetK และ tetM ในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ

ตวอยาง Tetracycline

ความไวตอยา จ านวน (รอยละ)

tetK-positive จ านวน (รอยละ)

tetK-negative จ านวน (รอยละ)

tetM-positive จ านวน (รอยละ)

tetM-negative จ านวน (รอยละ)

tetK และ tetM-positive จ านวน (รอยละ)

ตวอยางสงสงตรวจผปวย

(n= 31)

R = 4 (12.9) 4 (12.9) - 3 (9.7) 1 (3.2) 3 (9.7) S = 27 (87.1) 4 (12.9) 23 (74.2) 2 (6.4) 25 (80.7) 2 (6.4)

ตวอยางปายเชอ

(n = 23)

R = 3 (13.9) 2 (8.6) 1 (4.3) 2 (8.6) 1 (4.3) 2 (8.6) S = 20 (87) 1 (4.3) 19 (82.6) 2 (8.6) 18 (78.3) 1 (4.3)

รวม (n = 54)

R =7 (12.9) 6 (11.1) 1 (1.8) 5 (9.3) 2 (3.7) 5 (9.3) S = 47 (87) 5 (9.3) 42 (77.7) 4 (7.4) 43 (79.6) 4 (7.4)

R = Resistant; S = Susceptible

ตารางท 13 แสดงความสมพนธระหวางตวอยางเชอทดอตอยา tetracycline กบยน tetK

และ tetM โดยพบวาเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยทงหมดรอยละ 9.7 แสดงออกวาดอตอยา tetracycline และตรวจพบยน tetK และ tetM แตมเพยง 1 ไอโซเลทเทานนทตรวจไมพบยน tetM ในขณะทมตวอยางรอยละ 87.1 ทแสดงออกวาไวตอยา tetracycline แตกลบตรวจพบเชอทมยน tetK และ tetM หรอพบทง 2 ยน รอยละ 12.9 6.4 และ 6.4 ตามล าดบ และในตวอยางปายเชอมรอยละ 8.6 ทแสดงออกวาดอตอยา tetracycline และตรวจพบทงยน tetK และ tetM แตมเพยง 1 ไอโซเลทเทาน นทตรวจไมพบยน tetK และ tetM ในขณะทมเชอรอยละ 78.3 ทแสดงออกวาไวตอยา tetracycline และตรวจไมพบทงยน tetK และ tetM ตรงกนขามกลบพบวาม 1 ไอโซเลท ทมยน tetM เพยงชนดเดยวเทานนและอก 2 ไอโซเลททตรวจพบทงยน tetK และ tetM จากความสมพนธระหวางผลทดสอบความไวตอยาและยนดอยาตานจลชพทตรวจพบในเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ (ตารางท 9-13) โดยรวมแลวพบวาเชอสวนใหญ (รอยละ 83.3) ทแสดงออกวาดอตอยา penicillin จะตรวจพบยน blaZ รวมอยดวย และมตวอยางรอยละ 14.8 ทแสดงออกวาดอตอยา cefoxitin และ oxacillin หรอดอยาชนดใดชนดหนงจะตรวจพบยน mecA รวมดวย ในทางตรงกนขามกลบพบวาม 7 ไอโซเลท ทแสดงออกวาไวตอยา cefoxitin และ oxacillin หรอไวตอยาชนดใดชนดหนงแตกลบตรวจพบยน mecA

58

นอกจากนมเพยง 2 ไอโซเลทเทานนทแสดงออกวาดอตอยา erythromycin แตตรวจไมพบยน ermA ในขณะทมตวอยางรอยละ 9.3 ทแสดงออกวาไวตอยา erythromycin แตกลบตรวจพบยน ermA นอกจากนยงตวอยางรอยละ 9.3 ทแสดงออกวาไวตอยา gentamicin แตกลบตรวจพบยน aac(6’)/ aph(2’’) อยางไรกตามพบวามเพยง 1 ไอโซเลทเทานนทแสดงออกวาดอตอยา tetracycline แตกลบตรวจไมพบทงยน tetK และ tetM เชนเดยวกนพบวามตวอยางรอยละ 7.4 ทแสดงออกวาไวตอยา tetracycline แตกลบตรวจพบทงยน tetK และ tetM

59

บทท 5 วจารณและสรปผลการทดลอง S. aureus เปนแบคทเรยทสามารถพบไดรางกายของผ ปวย (colonization) เชน รจมก ใบหนา แขน หรอขา เปนตน และยงสามารถพบแบคทเรยชนดนไดในสงแวดลอม เชน พน ผนง หรอราวบนได เปนตน เราสามารถตรวจพบแบคทเรยชนดนไดจากสารคดหลงจากรางกายผปวย เชน เสมหะ หนอง ปสสาวะ รวมถงเลอดของผปวย โดยในการศกษาครงนไดแยกเชอ S. aureus จากตวอยางสงสงตรวจ และพบวาสามารถแยกเชอไดจากตวอยางเสมหะมากทสด รองลงมาคอจากเลอด และหนองของผปวย ซงสามารถใชเปนสงบงชไดวาเชอ S. aureus ทแยกไดจากตวอยางดงกลาวมความเปนไปไดทจะกอใหเกดโรคตางๆ เชน เสมหะคอสารคดหลงทรางกายสรางออกมาจากตอมสรางสารคดหลงทอยในเยอบทางเดนหายใจดงนนการตรวจพบเชอ S. aureus ในเสมหะกมความเปนไปไดทเชออาจจะกอใหเกดโรคปอดบวม (pneumonia) หรอการตดเชอในระบบทางเดนหายใจ และการตรวจพบเชอ S. aureus ในเลอดของผปวยกมความเปนไปไดทเชออาจจะกอใหเกดการตดเชอในกระแสเลอด (septicemia) หรอโรคเยอบหวใจอกเสบ (endocarditis) เปนตน เชนเดยวกบงานวจยของ Nabeetha และคณะ (2005) ทพบวาสวนใหญจะสามารถแยกเชอ S. aureus ไดจากเสมหะของผปวยทเปนโรคปอดบวม (Nabeetha et al., 2005) และ Prabhu และคณะ (2010) สามารถแยกเชอ S. aureus ไดจากเลอดของผปวยทตดเชอในกระแสเลอด (Prabhu et al., 2010) นอกจากนเรายงสามารถแยกเชอ S. aureus ไดจากการปายเชอ (swab) จากสงแวดลอม สงของ และสถานทตางๆภายในโรงพยาบาล เชน พนในหองผปวย พนหองน า ผนง เตยงผปวย รถเขน เปนตน แสดงใหเหนวาเชอ S. aureus นอกจากจะอยในตวผปวยแลวยงสามารถพบไดอยในสงแวดลอม โดยตรวจพบเชอ S. aureus จากพนในหองผปวยไดมากทสด รองลงมาคอ เตยงผปวย ซงสนนษฐานไดวาเกดจากพาหะ เชน ญาตผปวย ผปวยทานอน แพทย หรอบคลากรภายในโรงพยาบาล ซงเปนผ น าพาเชอ S. aureus จากภายนอกเขามาภายในหองผปวย สงผลใหผปวยมอตราเสยงตอการสมผสกบเชอกอโรคมากขน เชนเดยวกนการศกษาของ Boyce และคณะ (1997) ทตรวจพบเชอ S. aureus บนพนหองผปวยและเตยงผปวย โดยพบวาสวนใหญเกดจากนางพยาบาลทเปนตนเหตท าใหผปวยตดเชอกอโรคชนดน (Boyce et al., 1997) แตอยางไรกตามความเสยงทผปวยจะสมผสกบเชอกอโรคและเกดอาการรนแรงนาจะขนอยกบภมคมกนของผปวยมากกวา สอดคลองกบการศกษาของ สมหวง ดานชยวจตร (2533) ทไดรายงานวา ถงแมแบคทเรยในสงแวดลอมจะมมาก แตอตราการตดเชอกอโรคในโรงพยาบาลอาจไมไดสงขนตาม เนองจากตวแปรทส าคญคอ ภมคมกนของผปวยและความรนแรงในการกอโรคของเชอ (สมหวง ดานชยวจตร, 2533)

60

การจ าแนกสายพนธ S. aureus ดวยวธทางชวเคมตามปกต (ทดสอบการหมกน าตาลและการสรางเอนไซมตางๆหลายชนด) นนจะใชเวลาทนานและสนเปลองสารเคมมาก ดงนนการจ าแนกเชอดวยวธทางชวเคมทจ าเพาะตอเชอ S. aureus อนไดแก catalase test, haemolytic test, mannitol fermentation และ coagulase test นนกเพยงพอแลวตอการจ าแนกสายพนธ S. aureus ซงจะชวยในการประหยดเวลาและลดการสนเปลองสารเคมอกดวย และนอกจากนเพอเปนยนยนสายพนธ S. aureus จงควรตรวจหายนทจ าเพาะตอสายพนธ S. aureus ซงในการศกษาครงนไดเลอกใชยน femA หรอ Factor essential for the expression of methicittine resistant (fem) ซงเปนยนทสามารถพบไดในเชอ S. aureus ทกสายพนธ ดงนนจงสามารถใชยนชนดนในการจ าแนกสายพนธ S. aureus ไดเชนกน (Mehrotra et al., 2000) ผลการทดสอบความไวตอยาตานจลชพพบวาตวอยางท งหมดมความไวตอยา chloramphenicol, rifampin, linezolid และ vancomycin แสดงใหเหนวายาตานจลชพเหลานยงสามารถใชรกษาโรคตดเชอ S. aureus อยางไดผล สอดคลองกบการศกษาของ Chayakul and Ingviya (2004) ทรายงานวาเชอ MRSA ทแยกไดจากโรงพยาบาลสงขลานครนทรยงคงมความไวตอยา vancomycin, fusidic acid และ linezolid (Hortiwakul, Chayakul and Ingviya, 2004) อกทงยงใหผลลพธทสอดคลองกบรายงานการศกษาอนๆ (Elsahn et al., 2010; Armin et al., 2013; Ullah et al., 2016) และในการศกษาครงนไมพบเชอสายพนธ VISA และ VRSA แมวาในปจจบนจะมรายงานถงการดอตอยาชนดนในตางประเทศ (Hiramatsu, 1998; Mazzulli, 2006; Zhu et al., 2008 และ Rahimi et al., 2013) รวมถงประเทศไทย (Trakulsomboon et al., 2001 และ Lulitanond et al., 2009) ทงน vancomycin ยงเปนยาทยอมรบกนโดยทวไปวาควรเลอกใชเปนอนดบแรกส าหรบรกษาโรคตดเชอ MRSA ทรนแรง แตทวายาดงกลาวยงมผลขางเคยงคอมความเปนพษตอหและไต ดงนนจงควรใชยาชนดนในปรมาณทเหมาะสมและใชดวยความระมดระวง (Yue et al., 2013) นอกจากนมรายงานวาในปจจบนยา linezolid สามารถยบย งไดทงเชอ MRSA VISA และ VRSA อยางไดผล (Ng et al., 2011; Gu et al., 2012; Chitnis et al., 2013) ในทางตรงกนขามพบวาเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวย และตวอยางปายเชอสวนใหญจะดอตอยา penicillin ในระดบสง สอดคลองกบรายงานจาก CLSI (2015) ทรายงานวาในปจจบนรอยละ 80 ของสายพนธ S. aureus ทแยกจากในโรงพยาบาลจะดอตอยา penicilin ชใหเหนวายาชนดนเกอบจะไมสามารถน ามาใชรกษาโรคตดเชอ S. aureus อยางไดผล (CLSI, 2015) ทกไอโซเลทมอตราการดอตอยา tetracycline, clindamycin gentamicin และ trimethoprim-sulfamethoxazole ในระดบต า สอดคลองกบงานวจยของ Moran และคณะ (2006) ทแยกเชอ S. aureus จากโรงพยาบาล 11 แหงในสหรฐอเมรกา ซงพบวาทกไอโซเลทมอตราการดอตอยาเหลานในระดบทต าจนถงปานกลาง (Moran et al., 2006) นอกจากนยง

61

พบวาทกไอโซเลทดอตอยา erythromycin, cefoxitin และ oxacillin ในระดบปานกลาง (รอยละ 26.9 25.6 และ 24.1 ตามล าดบ) ซงสอดคลองกบการศกษาของ Kitti และคณะ (2012) ทพบวาเชอ MRSA ทแยกจากผปวยในโรงพยาบาลมหาวทยาลยประเทศไทย สวนใหญจะดอยา erythromycin, oxacillin และ cefoxitin ในระดบปานกลางถงระดบต า (รอยละ 26.7, 6.7 และ 6.7 ตามล าดบ) (Kitti et al., 2012) แตตรงกนขามกบการศกษาของ Al-Zoubi และคณะ (2015) ไดรายงานวาเชอ S. aureus ทแยกไดจากตวอยางสงสงตรวจผปวยในโรงพยาบาลของประเทศจอรแดนสวนใหญรอยละ 57-63 จะดอตอยา erythromycin cefoxitin และ oxacillin ในระดบสง (Al-Zoubi et al., 2015) วธการตรวจหาเชอ MRSA ทนยมใชในหองปฏบตการมอยดวยกนหลายวธ โดยปจจบน CLSI ไดก าหนดใหการตรวจสอบคา MIC ของยา oxacillin ดวยวธ broth dilution (CLSI, 2015) เปนวธมาตรฐานในการตรวจสอบเชอ MRSA แตถาในกรณทตองใชวธ disc diffusion ทาง CLSI ไดแนะน าใหใชแผนยาปฏชวนะ cefoxitin (30 μg) ทดสอบบนอาหารเลยงเชอ Mueller Hinton agar (CLSI, 2015) ทงนยาทง 2 ชนดจดเปนยาทอยในกลม penicillinase resistant penicillins ซงเปนยากลมเดยวกบ methicillin จงเปนประโยชนทจะใชตรวจหาเชอ S. aureus ทดอตอยา methicillin หรอ MRSA ในการศกษาครงนเมอเปรยบเทยบผลการทดสอบดวยวธ disc diffusion โดยใชแผนยา cefoxitin สามารถตรวจพบเชอสายพนธ MRSA จ านวน 14 ไอโซเลท แตเมอทดสอบหาคา MIC ดวยวธ broth microdilution กบยา oxacillin กลบตรวจพบเชอสายพนธ MRSA เพยง 13 ไอโซเลทเทาน น (MIC ของ Oxacillin ≥4 μg/ml) ชใหเหนวายา cefoxitin มความไวและความจ าเพาะมากกวายา oxacillin อกทงยงมผวจยอกหลายกลมทรายงานวายา cefoxitin นนมความไวและความจ าเพาะกบยน mecA มากกวายา oxacillin อกทงยงเปนตวชกน า (inducer) ในการกระตนใหเชอแสดงการดอตอยาออกมา (Swenson et al., 2005; Broekema et al., 2009; Pourmand et al., 2014; CLSI, 2015) อยางไรกตามทง 2 วธเปนเพยงการตรวจสอบเชอสายพนธ MRSA เบองตนเทานน ดงนนถาตองการยนยนเชอสายพนธ MRSA จงควรใชเทคนคทางชวโมเลกลเพอตรวจหายน mecA ซงเปนยนทควบคมการดอตอยาในกลม β-lactam ของเชอ MRSA เชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอคอนขางทจะมรปแบบการดอยาทหลากหลาย ซงพบวาเชอประมาณครงหนงจะมรปแบบการดอตอยา 1-2 ชนดโดยสวนใหญจะมรปแบบทดอตอยา 1 ชนด คอดอตอยา penicillin ชนดเดยว และรองลงมาคอรปแบบทดอตอยา 2 ชนด คอดอตอยา penicillin และ erythromycin ถงกระนนกยงพบเชอถง 16 ไอโซเลททมรปแบบการดอตอยาหลายชนด (multidrug resistant) และพบวาในตวอยางสงสงตรวจผปวยม 2 ไอโซเลททมรปแบบการดอยามากทสดถง 6 ชนด สวนสาเหตทเชอดอตอยาหลายชนดสนนษฐานวาเกดจากผปวยไดรบยาตานจลชพมาเปนระยะเวลานาน หรอใชยาโดยไมปรกษาแพทยจนกระทงเชอดอตอ

62

ยาชนดนน สอดคลองกบบทความของ Carl Llor และ Lars Bjerrum (2014) ไดกลาวไววา สาเหตหลกทท าใหเชอกอโรคในตวผปวยดอตอยาหลายชนดนน เกดจากผปวยไดรบยาตานจลชพในปรมาณมาก และเปนเวลานานหรอบางครงทผปวยไมปรกษาแพทย และหายามารบประทานดวยตวเอง จงท าใหใชยาไมตรงกบชนดของเชอกอโรค จงมโอกาสท าใหเชอพฒนาจนกระทงดอตอยาตานจลชพหลายชนดไดเชนกน (Carl Llor and Lars Bjerrum, 2014) นอกจากนยงพบเชอ S. aureus ทดอตอยาหลายชนดจากสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล เชน เตยงผปวย ผนง และ พน สนนษฐานวาอาจจะเกดจากพาหะ เชน บคลากรทางการแพทยหรอญาตผปวยเเปนผน าเชอดอยามาแพรกระจายในสงแวดลอมของโรงพยาบาล นอกจากนสงของหรอต าแหนงดงกลาวกเปนสงทผปวยสมผสอยเปนประจ าจงมโอกาสอยางมากทผปวยจะสมผสกบเชอดอยาหลายชนดนได สอดคลองกบงานวจยของ Pravas และคณะ (2015) ทแยกเชอ S. aureus จากสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล เชน พน ผนง เตยงหองฉกเฉน และจากบคลากรทางแพทย และเชอมรปแบบการดอยา erythromycin ampicillin ciprofloxacin และ tetracycline มากทสด (Pravas et al., 2015) ความสมพนธระหวางผลการทดสอบความไวตอยาตานจลชพแตละชนดและการตรวจหายนดอยา พบวามทงผลลพธทสอดคลองกนและไมสอดคลองกน โดยแบงไดเปน 3 กรณ ไดแก กรณท 1) มการแสดงออกทางฟโนไทปและทางจโนไทปทสอดคลองกน คอ เชอแสดงออกวาดอตอยาชนดหนงและตรวจพบยนดอยาทควบคมการดอตอยาชนดนน กรณท 2) มการแสดงออกทางฟโนไทปแตตรวจไมพบยนดอยา คอ เชอแสดงออกวาดอตอยาชนดหนงแตกลบตรวจไมพบยนดอยาทควบคมกลไกการดอตอยาชนดนน และกรณท 3) ไมมการแสดงออกทางฟโนไทปแตตรวจพบยนดอยา คอ เชอแสดงออกวาไวตอยาชนดหนงแตกลบตรวจพบยนดอยาทควบคมกลไกการดอตอยาชนดนน (ศรลกษณ ธระภธร และ ธาน วงษชย, 2558) ยน blaZ จะควบคมการสรางเอนไซม β-lactamsae เขาท าลายโครงสราง β-lactam ring สงผลใหดอตอยา penicillin และในการศกษาครงน พบวาเชอจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอสวนใหญทดอตอยา penicillin และตรวจพบยน blaZ ดวยเชนกน ชใหเหนวายนชนดนมแพรการกระจายอยในเชอ S. aureus เปนวงกวาง อยางไรกตามพบวามบางไอโซเลททแสดงออกวาไวตอยา penicillin แตตรวจพบยน blaZ ซงสนนษฐานไดวายนไมมการแสดงออกหรอไมมการกระตนใหเกดการสรางเอนไซม β-lactamsae เขาท าลายโครงสรางของยา สงผลใหสามารถยบย งเชอไดส าเรจ (Feghaly et al., 2012) กลไกในการดอตอยา cefoxitin, oxacillin และยาในกลม β-lactam คอยน mecA โดยเกดจากการเปลยนแปลงโครงสรางของ penicillin binding protein (PBP) (โดยปกตเชอ S. aureus จะม PBP 4 ชนด)ใหกลายเปน PBP2a ท าใหเชอไมตอบสนองตอยากลม β –lactam ในการศกษาครงน

63

ไดตรวจพบเชอทแสดงออกวาดอตอยา cefoxitin และ oxacillin หรอชนดใดชนดหนงและตรวจพบยน mecA รวมอยดวย แสดงใหเหนวาเ ชอกลมนเปน True methicillin-resistant S. aureus (true MRSA) ซงมกลไกการดอตอยาทบรเวณผนงเซลลทมการเปลยนแปลงเปน PBP2a สอดคลองกบการศกษาของ Siripornmongcolchai และคณะ (2002) ไดท าการเปรยบเทยบกบการทดสอบ Oxacillin disc agar diffusion และ Oxacillin salt screening ในการตรวจหาเชอ MRSA และยนยนสายพนธ MRSA โดยการตรวจหายน mecA ผลการทดสอบพบวาเชอทแสดงออกวาดอตอยา Oxacillin พบว า ท ง หมดจบกบ ย น mecA แสดง ให เ ห น ว า เ ช อ เ ห ล า น เ ป น true MRSA (Siripornmongcolchai et al., 2002) นอกจากนยงมบางไอโซเลททแสดงออกวาดอตอยา cefoxitin และ oxacillin หรอชนดใดชนดหนงแลวตรวจไมพบยน mecA สนนษฐานวาอาจจะเปนเชอชนด Borderline-oxacillin resistant S. aureus (BORSA) ซงเชอจะสรางเอนไซม β-lactamase ออกมาในปรมาณมาก ท าใหสามารถยอยสลายยาไดโดยตรง (รตดาวลย ขนโยธา และคณะ 2555) สอดคลองกบการศกษาของ Maalej และ คณะ (2012) ทรายงานวาตรวจพบเชอ BORSA ในโรงพยาบาลประเทศตนเซย โดยเชอทงหมดแสดงออกวาดอตอยา oxacillin แตทงหมดกลบ แสดงออกวาไวตอยา cefoxitin อกทงยงตรวจไมพบยน mecA ชใหเหนวาการทดสอบในหองปฏบตการควรทดสอบทงยา cefoxitin และ oxacillin. (Maalej et al., 2012) ยน erm (erythromycin ribosome methylase) เปนยนทยนยนการดอตอยากลม macrolide, lincosamide และ streptogramin B (MLSB) เชน erythromycin โดยมกลไกการดอยาทท าใหเกดกระบวนการ methylation บรเวณ 23S ribosomal สงผลใหเกดการเปลยนแปลงเปาหมายของยา ท าใหไมสามารถหาต าแหนงทจะออกฤทธ ในการศกษาครงน พบวามบางไอโซเลททแสดงออกวาดอตอยา erythromycin แตตรวจพบไมพบยน ermA ซงสามารถแบงขอสนนษฐานเปน 2 กรณคอ กรณท 1) มยน erm ชนดอนนอกเหนอจากยน ermA คอยน ermB และ ermC ซงทง 3 ยนจะมลกษณะและกลไกการดอยาทคอนขางเหมอนกน ท าใหมความเปนไปไดวาเชออาจจะมยน ermB หรอ ermC ทควบคมการดอตอยากลม erythromycin และในกรณท 2) เชออาจมการแสดงออกของยน msrA (macrolide streptogramin B resistance) โดยจะสรางโปรตนทสามารถขบยาออกนอกเซลลดวยวธ efflux (Reygaert, 2013) อยางไรกตามในการศกษาครงนเหตผลแรกทเลอกใชยน ermA เพยงชนดเดยวในยนยนการดอตอยา erythromycin เนองจากมหลายๆการศกษาทใชยน ermA, ermB ermC หรอ msrA เพอยนยนการดอตอยา erythromycin ของเชอ S. aureus โดยพบวาสวนมากจะตรวจพบยน ermA มากกวายนชนดอนๆ เชนเดยวกนกบการศกษาของ Mlynarczyk และคณะ (2006) ทรายงานวายน ermA จะมความชกมากกวายน erm ชนดอนๆหรอยน msrA ในเชอ S. aureus ทดอตอยา erythromycin (Mlynarczyk et al., 2006) สวน Lim และคณะ (2002) ไดรายงานวาสวนใหญจะ

64

พบยน ermC ในเ ชอ coagulase-negative- S. aureus (CoNS )(Lim et al., 2002) ตรงกนขามกบการศกษาของ Zmantar และคณะ (2013) ทรายงานวาตรวจพบยน ermB และ msrA มากกวายน erm ชนดอนๆ ดงนนจงสรปไดวาเพอใหไดผลทดสอบทครอบคลมจงควรทดสอบดวยยน ermA, ermB, ermC และ msrA รวมกนเพอยนย นกลไกการดอตอยา erythromycin หรอยาในกลม MLSB (Zmantar et al., 2013) ยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) ท าหนาทสรางเอนไซม AAC (6′)/APH(2′′) ซงเปนเอนไซมชนด Aminoglycoside-Modifying Enzymes (AMEs) โดยจะเปลยนแปลงโครงสรางของยาในกลม aminoglycoside เชน gentamicin ท าใหเกดกระบวนการ acetylation และ phosphorylation รวมกน สงผลใหยาไมสามารถจบกบ 30S ribosomal ได ในการศกษาครงนพบวาม 2 ไอโซเลทเทานนทดอตอยา gentamicin และตรวจพบยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) ในกรณทเชอเหลานดอตอยาในกลม β-lactam และ gentamicin และตรวจพบยน mecA และ aac (6 ′)/aph(2 ′′) แสดงวาเชอเหลานเปนเชอชนด Methicillin-aminoglycosides-resistant S. aureus (MARSA) โดย เ ก ดจ ากก ารส ร า ง เ อนไซม aminoglycoside-modifying ชนดทเรยกวา bifunctional enzyme ท าใหมการสงเคราะหเอนไซม ACC(6’) และ APH (2’’) รวมกบมการสรางโปรตน PBP2a สงผลใหเชอกลมนดอตอยา methicillin และยากลม aminoglycoside (สบณฑต นมรตน, 2555; Wilailuckana, 2005) อยางไรกตามในจากผลการทดสอบพบวาเชอทง 2 ไอโซเลทแมจะแสดงออกวาดอตอยา gentamicin และตรวจพบยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) แตกลบไมแสดงออกวาดอตอยา cefoxitin หรอ oxacillin อกทงยงตรวจไมพบยน mecA ดวยเชนกน ชใหเหนวาเ ชอเหลานไมใช เ ชอในกลม MARSA แตเปนเชอท ดอตอยา gentamicin และมยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) ก ากบการดอยาเทานน กลมยน tet (Tetracycline resistance protein) เปนยนทเกยวของกบการดอตอยา tetracycline ในเชอ S. aureus ในการศกษาครงน พบวาเชอทแสดงออกวาดอตอยา tetracycline จะตรวจพบยน tetK, tetM หรอตรวจพบท ง 2 ยน แสดงใหเหนวาเชอกลมดงกลาวสามารถมกลไกดอตอยา tetracycline เพยงกลไกเดยวหรอมมากกวา 1 กลไกไดเชนกน นอกจากนยงพบวาม 1 ไอโซเลททแสดงออกวาดอตอยา tetracycline แตตรวจไมพบยน tetK หรอ tetM สนนษฐานวาเชอมยนดอยา tetracycline ชนดอนๆควบคมการแสดงออกนอกเหนอจากยน tetK หรอ tetM โดยไดแกยน tetL ทท าหนาทกระตนใหเกดกระบวนการขบยาออกนอกเซลลไดเชนเดยวกบยน tetK และมยน tetO ท าหนาทเชนเดยวกบยน tetM คอสรางโปรตนทกระตนท าใหเกดกลไก ribosome protection protien (RPP) เพอปองกนไมใหยาออกฤทธหรอเขาจบกบต าแหนงของบนไรโบโซม (Pentti, 1987) อยางไรกตามสาเหตทไมไดเลอกใชยน tetL และ tetO มาทดสอบการดอยาในกลม tetracycline นนเนองจากมรายงานการศกษาพบวามโอกาสทจะตรวจพบยน tetK และ tetM ไดมากกวายน tetL และ

65

tetO สอดคลองกบการศกษาของ Emaneini และคณะ (2013) ทรายงานวาสวนใหญจะตรวจพบยน tetK และ tetM ในเชอ S. aureus ทดอตอยา tetracycline แตจะตรวจพบยน tetL และ tetO ไดยากมาก (Emaneini et al., 2013) อยางไรกตามส าหรบตวอยางเชอทใหผลลพธทไมสมพนธกนอาจกอปญหาในการรายงานผลทดสอบทผดพลาดได ดงนนจงตองท าการตรวจสอบการดอตอยาของเชอเหลานอกครงดวยวธการอน ตวอยางเชน งานวจยของ Martineau และคณะ (2000) ไดน าเชอทใหผลทดสอบไวตอยาดวยวธ disc diffusion แตตรวจพบยนดอยาไปเพาะเลยงในอาหารเลยงเชอทผสมยาตานจลชพทมความเขมขนทแตกตางกนเพอหาคา MIC โดยพบวาเชอกลมดงกลาวมคา MIC อยในชวงทดอตอยา ดงนนจงสรปไดวาเชอกลมดงกลาวหากมการกระตนดวยยาตานจลชพทความเขมขนสงๆอาจกระตนใหเชอมการแสดงออกทางฟโนไทปเพมขนได (Martineau et al., 2000) ในการศกษาครงนไดเลอกทดสอบไมสามารถใชเทคนค multiplex-PCR ในการเพมขยายดเอนเอเปาหมายโดยใชไพรเมอรหลายคไดพรอมๆกนทงหมดได ซงสาเหตเกดจากแตละไพรเมอรจะมสภาวะการท าปฏกรยาลกโซทแตกตางกน จงท าใหไปสามารถท าการทดสอบพรอมๆกนได ดงนนเพอเปนการแกปญหาจงไดเลอกไพรเมอรทมสภาวะการท าปฏกรยาลกโซใกลเคยงกนมาทดสอบโดยใชเทคนค multiplex-PCR และใชเทคนค PCR ในการทดสอบกบไพรเมอรทเหลอแทนส าหรบสาเหตส าคญทท าใหผลการทดสอบไมสมพนธกนนน สนนษฐานวาในขนตอนการทดสอบความไวตอยาตานจลชพนาจะมผลตอการแสดงออกของการดอตอยาไดเชนกน ซงปจจยทอาจมผลตอการแสดงออกของการดอตอยานนมอยหลายปจจยทตองค านงถง เชน ปรมาณเชอทใช ระยะเวลาทใชส าหรบการบมเพาะเลยง, อณหภมทใช, pH ของอาหารเลยงเชอ รวมถงปจจยอนๆซงลวนมผลตอการทดสอบผดพลาด (false positive) ไดเชนกน สอดคลองกบการศกษาของ รณภทร ส าเภา และ องอาจ เลาหวนจ, (2557) ทรายงานวาในการทดสอบ disc diffusion หรอ MIC ทตองเตรยมความเขมขนของเชอแบคทเรยใหมความขนมาตรฐานท 0.5 Mcfarland จงมความเปนไปไดทขนตอนนจะท าใหความเขมขนของเชอผดพลาดไปอนเนองมาจากผวจยเอง สงผลใหในบางครงทน าเชอไปทดสอบหายนดอยาแลวตรวจพบหรอไมพบยนดอยาชนดนนสงผลใหตองท าการทดสอบใหมอกครง (รณภทร ส าเภา และ องอาจ เลาหวนจ, 2557) จากผลการทดลองเหลานสรปไดวาการวนจฉยเชอดอยาดวยวธการทางฟโนไทปเพยงอยางเดยวนนอาจไมสามารถตรวจหาเชอดอตอยาไดอยางแมนย าหรอมความจ าเพาะทเพยงพอ อกทงยงใชเวลาในการทดสอบทนานและบางวธการตองใชความช านาญในการทดสอบสงผลใหไดผลการทดสอบทผดพลาด ดงนนจงแนะน าใหใชวธการทางจโนไทปควบคกบวธการทางฟโนไทปในการตรวจสอบการดอตอยาซงจะชวยลดขอผดพลาดตางๆจากผลการทดสอบใหนอยลงและชวยเพม

66

ความแมนย าและความจ าเพาะไดมากขน นอกจากนยงสามารถชวยยนยนผลการทดสอบของวธการทางฟโนไทปไดอกทางหนง นอกจากนการควบคมการใชยาอยางสมเหตผลเปนอกสงหนงทส าคญในการชะลอเชอดอตอยา ควบคมการแพรกระจายของเชอดอตอยาในโรงพยาบาลซงจะเปนประโยชนในการลดการแพรกระจายของเชอดอตอยาสผปวยคนอนๆและสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล นอกจากนขอมลในการศกษาครงนสามารถน าไปประยกตใชเปนทางเลอกวธการทดสอบการดอยาภายในโรงพยาบาลเพอใชในการตดสนใจเลอกใชยาตานจลชพในการรกษาผปวย ไดอยางเหมาะสม ทนเวลาและยงสามารถใชเปนขอมลเพอเฝาระวงเชอดอตอยา เฝาระวงการใชยา และยงชวยลดอตราการดอตอยาไดอยางมประสทธภาพมากทสด

67 รายการอางอง

รายการอางอง

68

ขวญตา กลาการนา. (2550). ผลของโปรแกรมการสงเสรมความรและการปฏบตของพยาบาลตอการ ควบคมการแพรกระจายเชอสแตปฟโลคอกคสออเรยสทดอตอยาเมธซลลนในหอ ผปวยหนก. วทยานพนธ พยาบาลศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาการพยาบาลดานการ ควบคมการตดเชอมหาวทยาลยเชยงใหม. โชตชนะ วไลลกขณา. (2553). การศกษายนกอโรครวมกบ SCCmec typing และ variable

numbers of tandem repeats typing (VNTR) เพอจ าแนกสายพนธ S. aureus ทดอตอยา เมธซลลนในประเทศไทย. รายงานการวจยฉบบสมบรณ ส านกงานกองทนสนบสนนวจย. ปยรชต สนตะรตตวงศ. (2554). วคซนปองกนโรคตดเชอสแตฟฟลโลคอคคส, ต าราวคซนของ สมาคมโรคตด เชอในเดกแหงประเทศไทย กรงเทพฯ : นพชยการพมพ. ธระพงษ มนตมธรพจน (2558) ยาทางเลอกใหมส าหรบการรกษาภาวะตดเชอ Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ในโรงพยาบาล. วารสารเภสชศาสตรอสาน; 11: 1-19. นงลกษณ สวรรณพนจ. (2544) แบคทเรยทเกยวของกบโรค. คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศรนค รนทรวโรฒประสานมตร, กรงเทพฯ. เนตลกษณ ตนทวทธ, พทธภม ล าเจยกเทศ และ พทกษ สนตนรนดร. (2559). การพฒนาชดตรวจ วเคราะหเชอ Staphylococcus aureus.วารสารเทคนคการแพทย 44: 5553- 5566. ภทรชย กรตสน. (2549). ต าราวทยาแบคทเรยการแพทย. ภาควชาจลชววทยา, คณะแพทยศาสตร ศรราชพยาบาล มหาวทยาลยมหดล. มาลน จลศร. (2532). ยาตานจลชพ ความรพนฐานและการประยกต. (พมพครงท 1) กรงเทพฯ : ภาควชาจลชววทยา คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยมหดล. ยทธนา สดเจรญ. (2554) การแยกเชอจลชพทกอโรคตดเชอในโรงพยาบาลจากผปวยโรคมะเรง. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต. คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลย ราช ภฏสวนสนนทา. รณภทร ส าเภา และ องอาจ เลาหวนจ. (2557). การตรวจยนยนเชอแบคทเรย Staphylococcus aureus ทดอตอยาในกลม Methicillin ดวยวธ PCR จากสนขทเขารบการรกษาในโรงพยาบาลสตว. วารสารการประชมทางวชาการของมหาวทยาลยเกษตรศาสตร ครงท 52: สาขาสตว แพทยศาสตร. กรงเทพฯ. สมหวง ดานชยวจตร (2533) วธการปองกนโรคตดเชอในโรงพยาบาล. (พมพครงท 1) กรงเทพฯ : โครงการต าราศรราช คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาลมหาวทยาลยมหดล.

69

สบณฑต นมรตน (2555). การจดจ าแนกแบคทเรยแกรมบวก รปรางกลมวงศไมโครคอคเคซอ และสเตรปโตคอคเคซอ, พมพครงท 1. กรงเทพฯ : ส านกพมพแหงจฬาลงกรณ มหาวทยาลย. ศนยเฝาระวงเชอดอตอยาตานจลชพแหงชาต (NARST). (2555). สถานการณเชอดอตอยาใน ประเทศไทย. สถาบนวจย วทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวง สาธารณสข. นนทบร. อดมศกด ตงชยสรยา. (2556). โครงการการศกษาคณสมบตของปจจยทเกยวของกบการเกดโรคของ เชอสแต ไฟโลคอกคส ออเรยสทดอตอยาเมททซลน และเชอ โคแอกกเลส เนกกาทฟ สแต ไฟโลคอกไคทดอตอยาเมททซลนทแยกไดจากชมชน. รายงานวจยฉบบสมบรณ กองทน วจยมหาวทยาลยนเรศวรประจ าป งบประมาณ 2555. อสยา จนทรวทยานชต และ วชรนทร รงษภาณรตน(2553). แบคทเรยทางการแพทย. (พมพครงท 2) กรงเทพฯ : ส านกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย. ศรลกษณ ธระภธร และ ธาน วงษชย, (2558) การจ าแนกชนดและการตรวจหายนดอยาในกลม สแตปฟโลคอคคส. รายงานวจยฉบบสมบรณ, กองทนวจยมหาวทยาลยนเรศวรประจ าป งบประมาณ 2558. Al-Zoubi M., Ibrahim A. Al-T., Emad H., Alla A. J., and Salih K., (2015) Antimicrobial susceptibility pattern of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens in Northern area of Jordan Iran Journal of Microbiology.; 7(5): 265–272. Andrew M. J (2001). Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of Antimicrobial Chemother 48: p 5–16. Batzing, B. L. (2002). Microbiology: An Introduction. Brooks/Cole Thomson Learning, Stanford, CT. Bignardi, G.E., Woodford, N., Chapman A., Johnson A.P., and Speller D.C.E. (1996). Detection of the mecA gene and phenotypic detection of resistance in Staphylococcus aureus isolates with borderline or low-level methicillin resistance. Journal of Antimicrobial Chemother 37: p 53–63. Broekema N. M., Tam T. V., Timothy A. M., Steven A. M., and David M. W. (2009) Comparison of Cefoxitin and Oxacillin Disc Diffusion Methods for Detection of mecA-Mediated Resistance in Staphylococcus aureus in a Large-Scale Study. Journal of Clinical Microbiology 47: p 217-219.

70

Brown, D.F.J., Edward, D.I., and Hawkey, P.M. (2005).Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Journal of Antimicrobial Chemother 56: p 1000-1018. Brown Derek F. J. and Peter E. Retnold (1980) Intrinsic resistance to lactam antibiotics in staphylococcus aureus. FEBS Letters Journal 122 (2). Boyce J.M., Potter-Bynoe G., Chenevert C., King T. Environmental contamination due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus: possible infection control implications. Infection Control and Hospital Epidemiology Journal 18(9): p 622-627. Carl Llor and Lars Bjerrum (2014). Antimicrobial resistance: risk associated with antibiotic overuse and initiatives to reduce the problem. Therapeutic Advances in Drug Safety 5(6): p 229–241. Chambers H.F. and Deleo F.R. (2009) Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era. Nature Reviews Microbiology 7: p 629-641. Chitnis S. Gunjan K., Nanda H., Siddika P., and Dhananjay S. C., (2013) In vitro activity of daptomycin and linezolid against methicillin resistant Staphylococcus aureus and vancomycin resistant enterococci isolated from hospitalized cases in Central India. Indian Journal of Medical Research 137(1): 191–196. Cheol-In Kang and Jae-Hoon Song (2013). Antimicrobial Resistance in Asia: Current Epidemiology and Clinical Implications. Journal of Infection and Chemotherapy 45(1): p 22–31. Clinical laboratory standards institute (CLSI). (2015). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing Twenty-Third Informational Supplement. CLSI document M100-S23 (ISBN 1- 56238-865-7). Centers for Disease Control and Prevention. (2002) Staphylococcus aureus resistant to vancomycin - United States, Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR) 51: p 565-567. Damon H.A, Claude-James S., and Patrice C., (1998) Characterization of Mutations in the rpoB Gene That Confer Rifampin Resistance in Staphylococcus aureus Antimicrobial Agents and Chemotherapy; 42(10): 2590–2594.

71

Datta P., Gulati N., Singla N., Vasdeva H. R., Bala K. (2011). Evaluation of various methods for the detection of meticillin-resistant Staphylococcus aureus strains and susceptibility patterns. Journal of Medical Microbiology 60: p 1613-1616. Duran, N., Burcin, O., Gulay, G. D., Yusuf, O. and Cemil, D. (2012). Antibiotic resistance genes and susceptibility patterns in staphylococci, Indian Journal of Medical Research, 135: p 389-396. Elsahn A.F., Yildiz E.H., Jungkind D.L., Abdalla Y.F., Erdurmus M., Cremona F.A., Rapuano C.J., Hammersmith K.M., Cohen E.J. (2010) In vitro susceptibility patterns of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus corneal isolates to antibiotics. Cornea Journal 10: p 1131-1135. Emaneini M., Bigverdi R., Kalantar D., Soroush S., Jabalameli F., Noorazar K. B., Asadollahi P., and Taherikalani M., (2013), Distribution of genes encoding tetracycline resistance and aminoglycoside modifying enzymes in Staphylococcus aureus strains isolated from a burn center, Annals of Burns and Fire Disasters, 26(2). Enright M.C., Robinson D.A., Randle G., Feil E.J., Grundmann H., Spratt B.G. (2002). The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proceedings of the National Academy of Sciences, 99:p 7687–7692. Eriksen K.R. (1961) Celbenin-resistant staphylococci. Ugeskr Laeger ;123: p 384-386. Rahimi, F. Majid, B., Mohammad, K., and Mohammad, R. P. (2013). Antibiotic Resistance Pattern of Methicillin Resistant and Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus Isolates in Tehran, Iran. Journal of Microbial : p 144-149. Fatholahzadeh B., Mohammad E., Mohammad M. F., Hossein S., Marzieh A., Morovat T., Fereshteh J. (2009) Characterisation of genes encoding aminoglycoside-modifying enzymes among meticillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from two hospitals in Tehran, Iran. International Journal of Antimicrobial Agents 33; 264–265. Feghaly R. E, Jennifer E. S., Stephanie A. F., Carey-Ann D. B. (2012) Presence of the blaZ beta- lactamase gene in isolates of Staphylococcus aureus that appear penicillin susceptible by conventional phenotypic methods. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 74; 388–393.

72

Ferreira, A.M., Katheryne B.M., Vanessa R. S., Alessandro L. M., Maria L. R. S. C., (2017). Correlation of phenotypic tests with the presence of the blaZ gene for detection of beta-lactamase. Brazilian Journal of Microbiology 48: p 159-166. Frost, L.S., Leplae, R., Summer, A.O., and Toussaint, A. (2005). Mobile genetic elements : the agents of open source evolution. Nature Reviews Microbiology 3(9) : p 722-732. Foster T. (1996). Antimicrobial Chemotherapy. In: Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th edition. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; Chapter 11. George, M.E. (2003). Quinupristin-Dalfopristin and Linezolid: Evidence and Opinion. Journal of Clinical Infectious Diseases 36: p 473–481. Gerard, L, Alain, Q., Marie, E. R., Roland, L., Franc¸O. V. and Jerome, E. (1999). Distribution of Genes Encoding Resistance to Macrolides, Lincosamides, and Streptogramins among Staphylococci. Journal of antimicrobial agents and chemotherapy 43: p 1062–1066. Grundmann H., Aanensen D.M., van den Wijngaard C.C., Spratt B.G., Harmsen D., Friedrich A.W. (2010) Geographic distribution of Staphylococcus aureus causing invasive infections in Europe: a molecular-epidemiological analysis. Public Library of Science (PLOS) medicine, 7: 100-215. Haddadin, A. S., Fappiano, S. A. and Lipsett, P. A.. (2002). Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in the intensive care unit. Journal of Postgraduate Medicine. 78: p 385. Harold, C. N. and Thomas, D.G. (1996). Medical Microbiology (4th edition). University of Texas Medical Branch at Galveston, Galveston, Texas. Harris, L.G., Foster, S.J., and Richard, R.G.. (2002). An introduction to Staphylococcus aureus, andtechniques for identifying and quantifying S. aureus adhesins in relation to adhesion to biomaterials, European Cells and Materials. 4: p 39-60. Heijer, C. D. J., Evelien, M. E., Mike, P., Herman, G., Cathrien, A. B., Franois, G. S., Ellen, E. S., and The APRES Study Team. (2013). Prevalence and resistance of commensal Staphylococcus aureus. including meticillin-resistant S. aureus in nine European countries a cross-sectional study. The Lancet Infectious Diseases. 13: p 409-415. Hiramatsu, K. (1998). Vancomycin resistance in Staphylococci. Drug Resistance Updates I, Harcourt Brace and Company Limited: p 135-150.

73

Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover F.C., (2000) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus inical strain with reduced vancomycin susceptibility. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 40: p 135-136. Hortiwakul R., Chayakul P. and Ingviya N. (2004) In vitro Activiies of linezolid Vancomycin Fosfomycin and Fusidic acid Against Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases and Antimicrobial Agents: p 7-10. Ian, C. and Marilyn, R. (2001). Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiology and Molecular Biology review. 65: p 232–260. Ishino, K., Tsuchizaki, N., Saito, F., Ishikawa, J., Nakajima, M., and Hotta, K (2006). Trends of Arbekacin- resistant MRSA Strains in Japanese Hospitals (1979 to 2000), Journal of

Antibiotic. 59: p 229–233. John J.F and Harvin A.M. (2007) History and evolution of antibiotic resistance in coagulase- negative staphylococci: Susceptibility profiles of new anti-staphylococcal agents. Therapeutics and Clinical Risk Management Journal, 3: p 1143-1152. Kaplan S.L., Hulten K.G., Mason E.O (2009). Staphylococcus aureus infections (Coagulase-

positive Staphylococci). In: Feigin R.D., Cherry J.D., Demmler-Harrison G.L., Kaplan S.L editors. Feigin and Cherry’s Textbook of Infectious Diseases. 6th ed. Philadelphia: Elsevier Inc.;. p. 1197-212. Kenneth, T. P. (2017, April 15). Staphylococcus aureus and Staphylococcal Disease Retrieved Todar's Online Textbook of Bacteriology: [online] http://textbookofbacteriology.net/staph.html Krzysztof, T. Cooper B.S, Hryniewicz W., Dowson C.G., (2000). Expression of resistance to tetracyclines in strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 45: p 763–770. Kitti, T., Boonyonying, K., & Sitthisak, S. (2011). Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among university students in Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 42: p 1498- 1504. Levinson, W. (2010). Review of Medical Microbiology and Immunology 11th Edition, New York McGraw-Hill Medical: p 94-97.

74

Lim K.T., Hanifah Y.A., Yusof M., Thong K.L. (2012) ermA, ermC , tetM and tetK are essential for erythromycin and tetracycline resistance among methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated from a tertiary hospital in Malaysia. Indian Journal of Medical Microbiology 30(2):p203-7 Locke J. B., Douglas E. Z., Caitlyn R. S., Jennifer D., Daniel F. S., Gerald A. D., Richard V. G., and Karen J. S. (2014) Linezolid-Resistant Staphylococcus aureus Strain 1128105, the First Known Clinical Isolate Possessing the cfr Multidrug Resistance Gene. Antimicrob Agents Chemother; 58(11): 6592–6598. Loomba P.S., Juhi T., and Bibhabati M. (2010) Methicillin and Vancomycin Resistant S. aureus in Hospitalized Patients. Journal of Global Infectious Diseases, 2(3): 275–283. Lowy D. F. (2003). Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Investigation, 111: p 1265–1273. Lulitanond, A., Chulapan E., Prajuab C., Malai V., Teruyo I., and Keiichi H. (2009). The First Vancomycin- Intermediate Staphylococcus aureus Strains Isolated from Patients in Thailand. Journal of Clinical Microbiology 47 : p 2311–2316. Ma X. X. En H. W., Yong L. and En J. L. (2011) Antibiotic susceptibility of coagulase-negative staphylococci (CoNS): emergence of teicoplaninnon- susceptible CoNS strains with inducible resistance to vancomycin.. Journal of Medical Microbiology, 60, p 1661– 1668. Maalej S. M., Faouzia M. R., Marguerite F., Basma M., Roland L., and Adnene H., (2012) Analysis of Borderline Oxacillin-Resistant Staphylococcus aureus (BORSA) Strains Isolated in Tunisia, Journal of Clinical Microbiology, 50 (10): p 3345–3348. Mathanraj S., Sujatha S., Sivasangeetha K., Parija S.C. (2009). Screening for methicillin- resistant Staphylococcus aureus carriers among patients and health care workers of a tertiary care hospitalin south India, Indian Journal of Medical Microbiology, 27: p 62-64. Maria S. (2012). Staphylococcus aureus colonisation and host-microbe interactions. Thesis, Department of medical biology, Faculty of Health Sciences, University of Tromsø. Martineau F. , François J. P., Nicolas L., Christian M., Paul H. R., Marc O., and Michel G. B . (2000). Correlation between the Resistance Genotype Determined by Multiplex PCR

75

Assays and the Antibiotic Susceptibility Patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Journal of Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 44: p 231–238. Martineaua F., François J. P., Louis G., Paul H. R., Marc O., the ESPRIT Trial and Michel G. B. (2000) Multiplex PCR assays for the detection of clinically relevant antibiotic resistance genes in staphylococci isolated from patientsinfected after cardiac, Surgery Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 46: p 527–533. Manisha Garg (2016) Top 4 Tests for Antimicrobial Drug Susceptibility, [online] http://www.biologydiscussion.com/medical-microbiology/top-4-tests-for-antimicrobial- drug- susceptibility/55863. Mazzulli T., (2006). Canadian patterns of antimicrobial resistance: Overview of current trends related to hospital pathogens. Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology; 173B-175B. Mehrotra M., Gehua W., and Wendy M. J., (2000), Multiplex PCR for Detection of Genes for Staphylococcus aureus Enterotoxins, Exfoliative Toxins, Toxic ShockSyndrome Toxin 1, and Methicillin Resistance, Journal of Clinical Microbiology, 38: p. 1032–1035. Mejia C, Zurita J, Guzman-Blanco M. (2010) Epidemiology and surveillance of methicillin- resistant Staphylococcus aureus in Latin America. Brazilian Journal of Infectious Diseases, 14: p 79-86. Mlynarczyk G., Mlynarczyk A., Szymanek K, Luczak M. The frequency of the occurrence of genes ermA, ermB, ermC and msrA/B among methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains resistant to erythromycin. Medycyna Doswiadczalna I Mikrobiologia, 58(3): p 183-190. Murakami, K and Minamido W. (1991). Identification of methicillin-resistant strains of Staphylococci by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 29: p 2240-2244. Moran J. G., Anusha K., Rachel J. G., Gregory E. F., Linda K. M., Roberta B. C., and David A. T., (2006) Methicillin-resistant S. aureus infections among patients in the emergency department. The New England Journal of Medicine, 355(7): p 666-674.

76

Nabeetha A. N.; Abiodun A. A.; William H. S.; Maria B., (2005). A cross-sectional study of isolates from sputum samples from bacterial pneumonia patients in Trinidad. Brazilian Journal Infection Disease 9 (3). Nakamura S.(1997). Mechanisms of Quinolone Resistance , Journal of Infection and Chemotherapy, 3:p 128 138. Neda R. D.,, Seyed D. S., Farzam V., J., Vand Y., Naser H., Ali R., Bahareh R., Mehrangiz Z., Alireza J. N., Shahin N. P. and Ahmad R. B. (2015). Identification of Staphylococcus aureus and Coagulase- negative Staphylococcus (CoNS) as well as Detection of Methicillin Resistance and Panton-Valentine Leucocidin by Multiplex PCR. Journal of Pure and Applied Microbiology, 9: p. proof. Nkwelang G., Jane-Francis T. K. A., Lucien H. K., Emmanuel D. N. and Roland N. N., (2009) Staphylococcus aureus isolates from clinical and environmental samples in a semi-rural area of Cameroon: phenotypic characterization of isolates, African Journal of Microbiology esearch 3(11): p. 731-736. Oluseun, A.O. (2012). Molecular characterization and antibiotic susceptibility pattern of

Staphylococcus aureus isolated from clinical and environmental sources. Thesis of Department of biological science, school of natural and applied science, college of science and technology , Covenart university, OTA, Ogun stage, Nigeria. Parsonnet, J., Goering, R. V., Hansmann, M. A., Jones, M. B., Ohtagaki, K., Davis, C.C. and

Totsuka, K. (2008). Prevalence of Toxic Shock Syndrome Toxin 1 (TSST-1)-Producing Strains of Staphylococcus aureus and Antibody to TSST-1 among Healthy Japanese Women. Journal of clinical microbiology. 46: p. 2731–2738.

Pallab, R., Vika G. and Rachna S., (2011). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in developing and developed countries: implications and solutions. Regional Health Forum,. 15: p 74-82. Patchanee, P. (2011). Staphylococcus aureus and Methicillin-resistant Staphylococcus aureus among outpatients with skin and soft tissue infections at Prachuapkhirikhan general, Hua Hin and Pranburi hospital. Master’s Thesis Department of Public Health, Facultry of Science, Mahidol.

77

Pentti H. (1987). Trimethoprim Resistance. Journal of Antimicrobial agents and chemotherapy.31: p. 1451-1456. Piatkowska E., Jerzy P. and; Anna P-M. (2012) The strongest resistance of Staphylococcus aureus toerythromycin is caused by decreasing uptake of the antibiotic into the cells.

Cellular and Molecular Biology Letters An International Journal, 17: p 633-645. Prabhu K., Sevitha B., and Sunil R. (2010) Bacteriologic Profile and Antibiogram of Blood Culture Isolates in a Pediatric Care Unit. Journal of Lab Physicians., 2(2): p 85–88. Pravas C. R., Shaheduzzaman M., Nigarin S., Iqbal K.J. (2015) Comparative Antibiotic Sensitivity Pattern of Hospital and Community Acquired Staphylococcus aureus Isolates of Jessore, Bangladesh. Journal of Biosciences and Medicines, 3: p 17-23. Pourmand M. R., Sepideh H., Rahil M., Emran A., (2014). Comparison of four diagnostic methods for detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus, Indian journal of microbiology 6: p 341- 344. Ryffet, C., Strassle, A., Kayser, F.H. and Berger-Bachi, B. (1994), Mechanisms of heteroresistance in methicillin-resistant Stophylococcus oureus. Antimicrobio{ Agents ond Chemotheropy, 38, 724-728 . Ralbetli C., Mehmet P., Yasemin B., Huseyin G., and Nesrin C., (2016) Evaluation of Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus Isolates by Years, Journal of Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 10 : p 1-4. Ramazanzadeh R, Salimizand H, Shahbazi B, Khonshah M, Narenji H. (2015). Prevalence of mecA Gene of Methicillin Resistant Staphylococcus spp. Isolated from Nosocomial Infections and Environmental Specimens in Sanandaj Hospitals, Kurdistan, Iran. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 3: p 38-42. Rasha, A. H., Aymen, S. Y., Hamdallah, H. Z., and Magdy A. A (2012). Fluoroquinolone resistant mechanisms in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates in Cairo, Egypt. Infection in Developing Countries. Journal 7: p 796-803. Reygaert, W.C. (2013). Antimicrobial resistance mechanisms of Staphylococcus aureus. In: Méndez- Vilas, A. (ed.) Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education.; p. 297–305.

78

Shaw W. V. and Brossky R. F. (1968) Characterization of Chloramphenicol Acetyltransferase from Chloramphenicol-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology, 95 (1) p. 28-36. Siripornmongcolchai T., Chariya C., Kunyaluk C.,Temduang L. and Chaisiri W. (2002). Evaluation of different primers for detecting mecA gene by PCR in comparison with phenotypic methods for discrimination of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 33 :p 758-63. Slade, O. J., and Bruce, R. L. (2009). Genetics of Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus. Future Microbial journal.4 : p 565-582. Stefani S., Chung D.R., Lindsay J.A., Friedrich A.W., Kearns A.M., Westh H., (2012). Meticillin- resistant Staphylococcus aureus (MRSA): global epidemiology and harmonisation of typing methods. International Journal of Antimicrobial Agents, 39: p 273-282. Strommenger B, Kettlitz C, Werner G, Witte W. (2003) Multiplex PCR assay for simultaneous detection of nine clinically relevant antibiotic resistance genes in Staphylococcus aureus. Journal of clinical microbiology 41: p.4089-4094. Suwanparadon P. (1995). Antibiogram and plasmid DNA analysis to characterize

Staphylococcus aureus strains. Thesis of Public Hearth Facultry. Mahidol University. Swenson M.J., Fred C. T., and the Cefoxitin Disc Study Group, (2005) Results of Disc Diffusion Testing with Cefoxitin Correlate with Presence of mecA in Staphylococcus spp. Journal of Clinical Microbiology, 43(8) p. 3818–3823. Trakulsomboon, S., Somwang, D., Yong, R.g, Chertsak, D., Wattanachai, S., Teruyo, I., & Keiichi, H.(2001). First report of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin in Thailand. Journal of Clinical Microbiology 39 : p. 591–595 . Ullah A., Muhammad Q., Hazir R., Jafar K., Mohammad H., Niaz M., (2016) High frequency of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Peshawar Region of Pakistan. Springer Plus, 5: p 600. Wang L.,Yingchao L.,Yonghong Y., Guoying H., Chuanqing W., Li D.,Yuejie Z., Zhou F.,Changcong L.,Yunxiao S., Changan Z., Mingjiao S., Xiangmei L., Sangjie Y., Kaihu Y. and Xuzhuang S. (2012) Multidrug-resistant clones of community-associated

79

meticillin-resistant Staphylococcus aureus isolated from Chinese children and the resistance genes toclindamycin and mupirocin Journal of Medical Microbiology; 61,1240–1247. Wilailuckana, C. (2005). Molecular characteristic Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Thesis of Medical Microbiology Facultry. Mahidol University. Yasmeen, T., Farhan, E. A. & Shahana, U.K. (2010). Current Pattern of Antibiotic Resistance in Staphylococcus aureus Clinical Isolates and the Emergence of Vancomycin Resistance. Journal of the College of Physicians and Surgeons Pakistan. 20 : p 728- 732. Yue J., Dong B.R., Yang M., Chen X., Wu T., Liu G.J.,. (2013) Linezolid versus vancomycin for skin and soft tissue infections. pulished in The Cochrane Library (7). Young H-K., Ronald A. S. and Sebastian G. B. (1987). Plasmid-mediated trimethoprim-resistance in Staphylococcus aureus Characterization of the first Gram-positive plasmid dihydrofolate reductase (type Si). Biochemical Journal, 243: p 309-312. Zehra A., Randhir S., Simranpreet K. and Gill J. P. S. (2017) Molecular characterization of antibiotic-resistant Staphylococcus aureus from livestock (bovine and swine). Veterinary World: 10(6): p 598–604. Zhu W., Nancye C. C., Linda K. M., Jeffery H. L., Clifford M. and Jean B. P. (2008) Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus Isolates Associated with Inc18-Like vanA Plasmids in Michigan. Journal of antimicrobial agents and chemotherapy, 52: p 452- 457.

80

ภาคผนวก ก อาหารเลยงเชอและสารเคม 1. Nutrient agar (NA) Suspend 23 g/L

Peptone 5.0 g Beef extract 3.0 g Agar 15.0 g Final pH: 6.8 ± 0.2 at 25ºC

ละลายสวนผสมทงหมดในน ากลนปลอดเชอ 1000 มลลลตร น าไปฆาเชอดวยเครอง autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนปลอยใหเยนลงทอณหภมหอง 2. Mueller Hinton Agar (MHA agar) Suspend 38 g/L

Beef Extract 2 g Acid Hydrolysate of Casein 17.5 g Starch 1.5 g Agar 17 g Final pH 7.3 ± 0.1 at 25°C ละลายสวนผสมทงหมดในน ากลนปลอดเชอ 1000 มลลลตร น าไปฆาเชอดวยเครอง

autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนปลอยใหเยนลงทอณหภมหอง

ส าหรบการทดสอบ Disc diffusion ใหเตรยม MHA ใสจานเพาะเชอจานละ 20 ml จะไดความหนาของ MHA 4 cm 3. Mueller Hinton II broth (MHB) Suspend 38 g/L

Beef Extract 2 g Acid Hydrolysate of Casein 17.5 g Starch 1.5 g Nacl 20 g Final pH 7.3 ± 0.1 at 25°C

81

ละลายสวนผสมทงหมดในน ากลนปลอดเชอ 1000 มลลลตร น าไปฆาเชอดวยเครอง autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนปลอยใหเยนลงทอณหภมหอง 4. Mannitol Salt Agar (MSA agar) Suspend 111 g/L

Enzymatic Digest of Casein 5 g Enzymatic Digest of Animal Tissue 5 g Beef Extract 1 g D-Mannitol 10 g Sodium Chloride 75 g Phenol Red 0.025 g Agar 15 g Final pH: 7.4 ± 0.2 at 25C ละลายสวนผสมทงหมดในน ากลนปลอดเชอ 1000 มลลลตร น าไปฆาเชอดวยเครอง

autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนปลอยใหเยนลงทอณหภมหอง 5. Blood Agar (BA) Suspend 42 g/L

Tryptic Soy borth 30 g Agar 14 g Whole blood 50 ml Final pH: 7.0 ± 0.2 at 25C ละลาย TSB กบ Agar ในน ากลนปลอดเชอ 900 มลลลตร แลวเตม Human plasma ลงไป

จากนนเตมน ากลนใหครบ 1000 ml แลวน าไปฆาเชอดวยเครอง autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนปลอยใหเยนลงทอณหภมหอง 7. Normal saline 0.85%

NaCl 8.5 g น ากลน (distilled water) 1000 ml

82

ละลาย NaCl ในน ากลนปลอดเชอ 1000 มลลลตร แลวน าไปฆาเชอดวยเครอง autoclave ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนปลอยใหเยนลงทอณหภมหอง 8. Tris-buffer saline solution (TBS)

Tris 3.03 g NaCl 29.22 g Distilled water 800 ml pH 7.5 แลวปรบปรมาตรใหได 1000 ml

9. 1 M Tris HCL Tris base 12.1 g

deionized water 100 ml ชง Tris base จ านวน 12.1 ละลายในน ากลน 80 ml ปรบ pH 8.0 ดวย HCl จากนนเตมน าให

ครบ 100 ml 10. 500 mM EDTA

Disodium EDTA 18.61 g deionized water 100 ml NaOH 20 g pH 8

ชง Disodium EDTA จ านวน 18.61 g และ NaOH 20 g ละลายน ากลน 80 ml ปรบ pH ใหได 8.0 แลวเตมน ากลนใหไดปรมาตร 100 ml น าไปอนเลกนอยและคนจนละลายหมด 11. 10X TAE buffer 1 L Tris base 48.5 g

acetic acid 11.4 ml 0.5M EDTA (pH 8.0) 20 ml ชง Tris base 48.5 g ละลายน ากลน 800 ml เตม acetic acid 11.4 ml และ EDTA 20 ml เตมน ากลน ใหได 1 ลตร น าไป autoclave 121 ◦C 15 นาท และเกบไวทอณหภมหอง 12. 1X TAE buffer 1 L 10X TAE buffer 100 ml

83

deionized water 900 ml ใช 10X TAE buffer 100 ml เตมน ากลน 900 ml จะได 1x TAE ปรมาตร 1000 ml 13. 1 % Agarose gel Agarose powder 1 g 1X TAE buffer 100 ml เตรยมผงอะกาโรส 1 g จากนนเตม 1x TAE ปรมาตร 100 มลลลตรลงไป น าไปอนใน เตาไมโครเวฟ ใหผงวนละลายด ทงไวอณหภมลดลง 14. Phosphate Buffer Saline (PBS) 10X (pH 7.4)

NaCl 80 g KCl 2 g Na2HPO4 .2H2O 14.4 g KH2PO4 2.4 g ddH2O 1000 ml

ละลายสารทงหมดในน ากลน 800 ml ปรบ pH 7.4 ดวย 1 N NaOH หรอ 20% HCl เตมน ากลน

ปรบปรมาตรจนครบ 1000 ml เกบทอณหภม 4 oC 15. Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X

PBS 10X 100 ml ddH2O 900 ml

ดด PBS 10X มา 100 มลลลตรผสมในน ากลน 900 มลลลตร 16. 1% SDS SDS 1 g ddH2O 100 ml ละลาย SDS 1 กรมในน ากลน 100 มลลลตร

84

ภาคผนวก ข McFarland Standard Solution No. 0.5 Barium chloride 0.048 M (1.175%W/V BaCl2.H2O) 0.5 ml Sulfuric acid 0.35 N (1% V/V) 99.5 ml น า Barium chloride ผสมกบ Sulfuric acid จะไดสารละลาย McFarland Standard No. 0.5 และเมอน าไปตรวจเชคดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 625 nm ควรมคาการดดกลนแสงท 0.08 - 1.0 ทดสอบคณสมบตทางชวเคม 1) Gram’s stain ทดสอบการตดสและรปรางของเชอแบคทเรย โดยท าการเขยเชอลงบนสไลด โดยใชเขมเขยเชอแตะเชอมากระจายตวในหยดน าแลวเกลยเปนแผนบาง ๆ ทงไวใหแหง หยด crystal violet บนสไลดทงไว 10 วนาท ลางออกดวยน ากลน จากนนหยด Gram’s iodine ทงไว 10 วนาทลางออกดวยน ากลน แลวเทแอลกอฮอล 95% บนสไลดแลวลางออกดวยน ากลน จากนนหยด safranin ลงบนสไลดทงไว 10 วนาท แลวจงลางออกดวยน ากลนซบดวยกระดาษกรองจนแหง น าไปสองดวยกลองจลทรรศน สงเกตการตดสและรปรางของเชอแบคทเรยถาเปนเชอแกรมบวกจะตดสน าเงน-มวงของ crystal violet รปรางกลมเรยงตวกนคลายพวงองน (ภาพท 15)

ภาพท 15 Gram positive cocci

85

2) Coagulase test ทดสอบความสามารถในการสรางเอนไซมโคแอกกเลสซงจะเปลยนไฟบรโนเจนใน พลาศมาใหเปนกอนไฟบรน (fibrin clot) ซงจะใชการทดสอบแบบ tube test โดยใช Human plasma แบงใส Sterile Tube ๆ ละ 1 ml จากนนเขยเชอผสมกบเขากนกบ plasma น าไปบมท 37° C เปนเวลา 4 ชวโมง เพออานผลเบองตนหากใหผลลบ ใหบมตออก 18-24 ชวโมง ถาผลเปนบวกคอ ถาเกดการแขงตวของพลาสมา (Clot) ถาผลเปนลบ คอ ไมมการแขงตวของพลาสมา (No Clot) (ภาพท 16)

3) Mannitol fermentation ทดสอบการหมกน าตาลแมนนทอลของเชอโดยเลยงเชอลงบนอาหาร Mannitol Salt Agar (MSA) บมทอณหภม 35-37 °C เปนเวลา 18-24 ชวโมง ตรวจผลการใชน าตาลแมนนทอลแลวเกดกรด โดยสงเกตสของฟนอลเรดทเปลยนจากสแดงเปนสเหลอง (ภาพท 17) 4) Catalase test ทดสอบการสรางเอนไซมคาตาเลส โดยหยด H2O2 3% ลงบนสไลด และเขยเชอมาแตะลงในสไลดและหยด H2O2 สงเกตการเกดฟองแกสทเกดขน ถามฟองแกสเกดขนคอผลเปนบวก แสดงวาเชอมการสรางเอนไซมคาตาเล ถาไมมฟองแกสเกดขนคอผลเปนลบ (ภาพท 18)

ภาพท 16 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมโคแอกลเลส: ผลบวก เกดการแขงตวของพลาสมา; ผลลบ ไมมการแขงตวของพลาสมา

86

5) β- haemolysis

ทดสอบความสามารถในการยอยสลายเมดเลอดแดง (haemolysis) ของเชอ วธทดสอบ โดยท าการเลยงเชอลงบน blood agar (BA) บมทอณหภม 35-37 °C เปนเวลา 18-24 ชวโมง สงเกตลกษณะโคโลนทไดและการสลายเมดเลอดแดง โดยโคโลนจะมขนาดเลก นน ขน สครม สามารถสลายเมดเลอดแดง โดยสงเกตเหน clear zone รอบ ๆโคโลน (β - haemolysis) (ภาพท 21)

ภาพท 17 ผลทดสอบการหมกน าตาลแมนนทอล ผลบวกอาหารเปลยนเปนสเหลอง; ผลลบอาหารไมเปลยนส

ภาพท 18 ผลการทดสอบการสรางเอนไซมคาตาเลส ผลบวกเกดฟองแกส ผลลบไมเกดฟองแกส

87

การทดสอบความไวของเชอตอยาตานจลชพ 1. Disc diffusion ทดสอบความไวของเชอ S. aureus ตามวธการของ Kirby-Bauer โดยแผนยาตานจลชพมาตรฐาน 11 ชนด (ตารางท 2) ใชเชอ S. aureus ATCC 25923 เปนเชออางอง มขนตอนวธท าดงน 1) น าเชอทดสอบมาเพาะเลยงบน Nutrient Agar และน าไปบมทอณหภม 37 °C 24 ชวโมง 2) ปรบความขนของเชอทตองการทดสอบทเพาะเลยงใน NaCl 0.85% ใหมความขนเทากบ 0.5 McFarland standard หรอมปรมาณเชอ 1 X 108. CFU/ml

3) น าไมพนส าลปราศจากเชอจมลงในเชอทเตรยมได น าไปปายบนผวหนาอาหาร Mueller-Hinton agar (หนา 4 ซม.) โดยลากเสนผานศนยกลางแลวปายเปนเสนตงฉากผานเสนทลากไวถใหทวผวหนา โดยจะปายทงหมด 3 ระนาบ เพอใหเชอกระจายสม าเสมอทวผวหนา แลวจงปายรอบจานเพาะเลยง อาจท าซ าไปมาประมาณ 2 – 3 ครง เพอใหเชอกระจายทวจานเพาะเลยงในปรมาณทเทากน 4) ทงไว 5 นาท เพอใหผวหนาอาหารทปายไวแลวแหง แลวจงใชปากคบจมแอลกอฮอลผานเปลวไฟเพอฆาเชอ รอจนปากคบเยนแลวคบแผนยาปฏชวนะ วางบนผวหนาอาหาร

ภาพท 19 ทดสอบความสามารถในการยอยสลายเมดเลอดแดง ผลบวกคอเกดวงใสรอบๆโคโลนสขาวขน นน

88

ทปายเชอไวแลว การวางแผนยาปฏชวนะไมควรเกน 5 แผน/จาน ควรวางหางจากขอบจานอาหาร 15 mm และวางหางกนอยางนอย 3 cm

5) น าไปบมทอณหภม 35-37 °C เปนเวลา 18 – 24 ชวโมง 6) อานผลดานหลงของจานเพาะเลยง โดยวดขนาดของเคลยรโซน (inhibition

zone) (บรเวณวงใสรอบแผนยาทไมมเชอเจรญ) ทเกดจากยาปฏชวนะแตละชนดเปนมลลเมตร 7) น าคาเฉลยของ inhibition zone ทเกดจากยาปฏชวนะแตละชนดไปเปรยบเทยบ

กบคา inhibition zone มาตรฐานดงแสดงในตารางท 2 เพอดความสามารถของเชอททดสอบทมตอยาปฏชวนะวามความไว (sensitive; S), กงกลาง (intermediate; I) หรอดอ (resistant; R) ตอยาปฏชวนะทใชทดสอบและน ามาเขยนเปนรปแบบทดอตอยานนๆโดยอางองจาก Clinical laboratory standards institute(CLSI, 2015) 2. หาคา Minimum inhibitory concentration (MIC) ดวยวธ Broth Microdilution ศกษา รปแบบการ ดอ ตอยาของ เ ชอ (Antibiogram) โดยหาค า Minimum inhibitory concentration (MIC) ของยาทใชทดสอบคอ Oxacillin และ Vancomycin และใชเ ชอ S. aureus ATCC 29213 เปนเชออางอง วธการทดสอบคอ 1) ถายอาหาร Mueller-Hinton broth ลงใน 96 well plate ปรมาตรหลมละ 50 μl ระบระดบความเขมขนของแตละหลม ดงน 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 และ 0.125 μg/ml (oxacillin)128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.และ 0.25 μg/ml (vancomycin) 2) ปเปตสารละลายยาปฏชวนะ (ตารางท 3) ทเตรยมไวทความเขมขน 256 μg/ml ปรมาตร 50 μl ลงใน well ทเขยนระบระดบความเขมขน 64 μg/ml ผสมใหเขากน แลวปเปตสารละลายทไดปรมาตร 50 μl ลงใน well ทเขยนระบระดบความเขมขน 32 μg/ml ผสมใหเขากน แลวท าซ าเชนนจนถง well ทเขยนระบระดบความเขมขน 0.125 μg/ml จากนนเมอผสมสารเขากนดแลว ปเปตสารละลายใน well สดทายทงไปปรมาตร 50 μl 3) ขนตอนการเตรยมเชอ โดยน าโคโลนของเชอผสมลงในสารละลาย 0.85% NaCl ปรบความขนของเชอใหเทากบ 0.5 McFarland standards สงผลใหเชอมจ านวน 1 × 108 CFU/ml และถายเชอปรมาตร 50 μl ลงใน well ทง 11 well ผสมใหเขากน เชอในแตละ well จะมความเขมขนสดทายเทากบ 105 CFU/ml 4) น าไปบมเชอทอณหภม 35 °C เปนเวลา 18 – 24 ชวโมง

89

5) อานคา MIC จาก well ทมความเขมขนของยาปฏชวนะต าทสดทยบย งการเจรญของเชอ และวเคราะหคา breakpoint โดยอางองจาก National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2013) การสกด DNA ดดแปลงมาจากวธการของ Tiago และคณะ, 2015 1) น า เ ชอ S. aureus ท เพาะ เ ล ยงใน Brain heart broth (BHB) มาใ สหลอด microcentrifuge ปนเหวยงท 12,396 x g นาน 5 นาทและดดสวนใส (Supernatant) ออก 2) เ ตม extraction buffer (200 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, 25 mM NaCl, 1% SDS, pH 8.0) 600 µl วางทงไว 5 นาท และน าไปแชในอางน ารอนทอณหภม 65°c นาน 30 นาท 3) เตม phenol/chloroform : isoamyl alcohol [1:1 (24:1)] ในปรมาตรทเทากนและ ปนเหวยงท 10000 x g นาน 5 นาท และเกบสวนใสดานบนไปใสหลอด microcentifuge ใหม 4) เตม 100 % ethanol ในปรมาณ 2 เทา น าไปเกบไวทอณหภม -20 °c เปนเวลา 2 ชวโมง 5) ปนเหวยงท 14549 x g เปนเวลา 30 นาท และ ลางตะกอนดวย 70% ethanol 500 µl ปนเหวยงท 13000 x g เปนเวลา 5 นาท 6) เตม TE buffer (10 mM Tris-HCl (ph 8.0)) 30 µl เกบไวท -20 °C

90

ตารางท 14 สวนผสมการท าปฏกรยา PCR

ชอยน สารละลาย ความเขมขนสดทาย (1 reatcion)

ปรมาณ (µl) Reference

femA

10x PCR buffer 50 mM MgCl2

10 mM dNTPs 10 µM of each forward primer 10 µM of each reverse primer Template DNA 5 U Taq polymerase น ากลน

1x PCR Buffer 3 mM MgCl2

200 µM dNTPs 1 µM (femA) 1 µM (femA) 2.5 U Taq polymerase

5 3 1

5 (femA) 5 (femA)

2 0.5 8.5

Neda et al., (2015)

blaZ และ mecA

10x PCR buffer 1x PCR Buffer 5

Wilailuckana,(2005)

50 mM MgCl2 1.5 mM MgCl2 1.5 10 mM dNTPs mix 200 µM dNTPs 1 10 µM of each forward primer 0.5 µM of each forward primer 2.5 each primer 10 µM of each reverse primer 0.5 µM of each reverse primer 2.5 each primer Template DNA 1 5 U Taq polymerase 2.5 U Taq polymerase 0.5 น ากลน 31

ermA, tetKและ tetM

10x PCR buffer 1x PCR Buffer 2.5

Strommenger et al., (2003)

50 mM MgCl2 1.5 mM MgCl2 0.75 10 mM dNTPs mix 200 µM dNTPs 0.5 10 µM of each forward primer 0.25 µM of each forward primer 0.6 each primer 10 µM of each reverse primer 0.25 µM of each forward primer 0.6 each primer

Template DNA 2 5 U Taq polymerase 1.25 U Taq polymerase 0.25 น ากลน 17.8

91

การเตรยม Agarose gel

เตรยม 1 % Agarose gel ละลายใน 1X TAE buffer น าไปละลายจนกระทงละลายใหเปนเนอเดยวกนทอณหภม 50-60 ºC ประกบ chamber เขากบ comb เขาดวยกน จากนนเท agarose gel ใส chamber ตงทงใหเจลแขงตวหลงจากเจลแขงตวแลวดง comb ออก จากนนน า agarose gel ทมแมพมพวางใน electrophoresis chamber โดยหนดานทมหลม (origin) ไปทางขวลบ และเตม 1X TAE buffer จนทวมผวหนาของ gel

การท า Gel electrophoresis

การเตรยมตวอยาง : ผสม PCR product 10 µl กบ loading dye 5 µl การเตรยม ladder : DNA marker (100 bp DNA ladder) 10 μl marker ขนตอนการ run gel : ท าการ load PCR product ทผสมใน loading dye ลงในแตละหลมโดย

หลมแรกจะ load marker ลงไปกอนเพอใชเปนตวเปรยบเทยบจากนนจง load PCR product ตามลงไปในหลมอนๆ จากนนจงท าการ run gel (ใน TAE buffer) โดยใชกระแสไฟฟา 100 โวลต ใหตรงข วประจไฟฟา โดยข วลบจะอยดาน loading well เ มอ run gel เสรจโดยสงเกตไดจากสของ bromphenol blue ทเคลอนทไปใกลขอบเจลอกดานและจงหยดจายกระแสไฟฟาน าไปยอมดวย ethidium bromide เปนเวลา 10 นาท และแชในน ากลนอก 15 นาท จากนนน าไปสอง UV ดวยเครอง UV light transilluminator เพอดแถบของ PCR product ทเกดบนวน

ตารางท14 สวนผสมการท าปฏกรยา PCR (ตอ)

ชอยน สารละลาย ความเขมขนสดทาย (1 reatcion)

ปรมาณ (µl) Reference

aac (6 ′)/aph(2 ′′)

10x PCR buffer 1x PCR Buffer 2.5

Ishino, el al (2006)

50 mM MgCl2 1.0 mM MgCl2 0.5 10 mM dNTPs mix 200 µM dNTPs 0.5 10 µM of each forward primer 0.3 µM of each forward primer 0.75 10 µM of each reverse primer 0.3 µM of each reverse primer 0.75 Template DNA 2 5 U Taq polymerase 0.4 U Taq polymerase 0.25 น ากลน 17.75

92

ภาคผนวก ค ขอมลดบ ตารางท 15 แสดงขอมลดบและผลการทดสอบทางชวเคมของตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางทเกบตามสถานทตางๆ (ปายเชอ) ในโรงพยาบาลแหงหนงในจงหวดนครปฐมทงหมด 69 ตวอยาง

หมายเลขเชอ

ตวอยางสงสงตรวจผปวย

สถานทเกบตวอยาง วน/เดอน/ป ทเกบตวอยาง

การทดสอบทางชวเคม catalase coagulase mannitol β-haemolytic

5-142 เสมหะ ICU แผนกศลยกรรม 11/05/57 + + + + 6-106 หนอง แผนกศลยกรรม 22/05/57 + + + + 1-588 เลอด แผนกศลยกรรม 14/05/57 + + + + 6-57 เทา (ซาย) หองพเศษศลยกรรม 14/05/57 + + + + 6-60 cavafix - ปายเชอ แผนกศลยกรรม 14/05/57 + + + + 5-24 เสมหะ แผนกอายรกรรมหญง 03/06/57 + + + + 5-398 เสมหะ แผนกอายรกรรมชาย 28/05/57 + + + + 6-87 ขา (ซาย) แผนกกระดกชาย 18/06/57 + + + + 6-46 รกแร (ขวา) แผนกศลยกรรมหญง 11/05/57 + + + + 5-124 เสมหะ แผนกอายรกรรมชาย 10/05/57 + + + + 5-140 เสมหะ ICU แผนกอายรกรรม 11/05/57 + + + + 5-319 เสมหะ แผนกอายรกรรมชาย 22/05/57 + + + + 6-110 หนอง แผนกศลยกรรมชาย 22/05/57 + + + + 5-200 เสมหะ ตกผปวยพเศษ 11/05/57 + + + + 1-664 เลอด ICUแผนกกมารเวชกรรม 16/05/57 + + + + 5-189 จมก(ขวา) แผนกลางชองไต 14/05/57 + + + + 5-226 เสมหะ แผนกอายรกรรมหญง 16/05/57 + + + + 5-263 เสมหะ แผนกศลยกรรมประสาท 18/05/57 + + + + 1-643 เลอด ICUแผนกกมารเวชกรรม 15/05/57 + + + + 2-59 ปสสาวะ หองผปวยพเศษรวม 4/05/57 + + + +

1-1234 เลอด แผนกอายรกรรมหญง 28/05/57 + + + + 5-402 เสมหะ แผนกศลยกรรมหญง 28/05/57 + + + + 6-133 หวไหล หองผปวยพเศษ 29/05/57 + + + + 6-20 แขน (ซาย) แผนกศลยกรรมหญง 05/06/57 + + + +

93

หมายเลขเชอ

ตวอยางสงสงตรวจผปวย

สถานทเกบตวอยาง วน/เดอน/ป ทเกบตวอยาง

การทดสอบทางชวเคม catalase coagulase mannitol β-haemolytic

6-74 หลง แผนกศลยกรรม 14/06/57 - - + - 6-80 หนอง OPDแผนกอายรกรรม 17/06/57 + + + + 5-53 เสมหะ แผนกอายรกรรมหญง 17/06/57 - - + +

5-231 เสมหะ แผนกอายรกรรมหญง 17/06/57 + + + + 5-261 เสมหะ ICUแผนกกมารเวชกรรม 18/05/57 + + + + 5-411 เสมหะ แผนกอายรกรรมหญง 29/05/57 + + + + 6-147 คอ แผนกอายรกรรมหญง 30/05/57 + + + + 6-103 ทอง แผนกลางชองไต 22/05/57 + + + + 6-127 หนอง แผนกกมารเวชกรรม 28/05/57 + + + + 6-63 ห แผนกกมารเวชกรรม 15/05/57 + + + + 5-63 หนอง แผนกอายรกรรมหญง 04/06/57 + - + -

6-122 หนอง แผนกสตกรรม 26/05/57 - - + +

1-115 เลอด พเศษรวม 04/05/57 - - + - ตวอยางปายเชอ

หมายเลขเชอ

ตวอยางปายเชอ สถานทเกบตวอยาง วน/เดอน/ป ทเกบตวอยาง

การทดสอบทางชวเคม catalase coagulase mannitol β-haemolytic

Sw1 เตยงผปวย แผนกศลยกรรม 19/06/57 + + + + Sw2 พน แผนกศลยกรรม 19/06/57 - - - - Sw3 ราวบนได ตกผปวยพเศษ ชน 2 19/06/57 - - + - Sw4 พน ตกผปวยพเศษ ชน 3 19/06/57 + + + + Sw5 พน ตกผปวยพเศษ ชน 4 19/06/57 - - + - Sw6 เตยงผปวย ตกผปวยพเศษ ชน 5 25/06/57 - - - - Sw7 เตยงผปวย หองผปวยพเศษรวม 25/06/57 + + + + Sw8 พนหองน า หองผปวยพเศษรวม 25/06/57 + + + + Sw9 พนทางเดน ตกผปวยพเศษ 25/06/57 - - - - Sw10 พนบนได ตกผปวยพเศษ 25/06/57 + + + + Sw11 พน หองผปวยพเศษรวม 30/06/57 + + + +

94

หมายเลขเชอ

ตวอยางปายเชอ สถานทเกบตวอยาง วน/เดอน/ป ทเกบตวอยาง

การทดสอบทางชวเคม catalase coagulase mannitol β-haemolytic

Sw12 พน แผนกอายรกรรมชาย 30/06/57 + + + + Sw13 ราวบนได แผนกอายรกรรมชาย 30/06/57 + + + + Sw14 เตยงผปวย แผนกไตเทยม 30/06/57 + + + + Sw15 พน แผนกไตเทยม 30/06/57 + + + + Sw16 ราวบนได แผนกศลยกรรมหญง 30/06/57 - - - - Sw17 พน แผนกศลยกรรมหญง 10/07/57 - - + - Sw18 พนหองน า แผนกศลยกรรมหญง 10/07/57 - - - - Sw19 เตยงผปวย แผนกลางชองไต 10/07/57 + + + + Sw20 พนหองน า แผนกลางชองไต 10/07/57 + + + + Sw21 พนบนได แผนกลางชองไต 10/07/57 + + + + Sw22 ราวบนได แผนกลางชองไต 10/07/57 + + + + Sw23 พน ตกอบตเหต 10/07/57 - - - - Sw24 พนทางเดน ตกอบตเหต 10/07/57 + + + + Sw25 พนบนได ตกอบตเหต 17/07/57 + + + + Sw26 พนหองน า ตกอบตเหต 17/07/57 + + + + Sw27 เตยงผปวย ตกอบตเหต 17/07/57 + + + + Sw28 ราวบนได ตกอบตเหต 17/07/57 - - - - Sw29 พน แผนกไตเทยม 17/07/57 + + + + Sw30 พน ICU กมารเวชกรรม 17/07/57 + + + + Sw31 พนหองน า แผนกกมารเวชกรรม 17/07/57 + + + + Sw32 เตยงผปวย ICU กมารเวชกรรม 17/07/57 + + + + Sw33 พนบนได แผนกกมารเวชกรรม 17/07/57 + + + +

95

ตารางท

16 แส

ดงผล

ของการทด

สอบค

วามไ

วต อยาตานจล

ชพขอ

งเชอ S

. aur

eus ท

แยกจ

ากตว

อยางสง

สงตรวจผป

วย (s

p)

96

ตารางท

16 แส

ดงผล

ของการทด

สอบค

วามไ

วต อยาตานจล

ชพขอ

งเชอ S

. aur

eus ท

แยกจ

ากตว

อยางสง

สงตรวจผป

วย (s

p)(ต อ

)

97

ตารางท

17 แส

ดงผล

ของการทด

สอบค

วามไ

วตอยาตาน

จลชพ

ของเช

อ S. a

ureu

s ทแยกจ

ากตว

อยางทเก บ

ดวยวธ ป

ายเชอ

(sw)

98

ตารางท

17 แสด

งผลข

องการท

ดสอบ

ความไวตอ

ยาตานจ

ลชพข

องเชอ

S. au

reus ท

แยกจ

ากตว

อยางทเก บ

ดวยวธ ป

ายเชอ

(sw)

(ตอ)

99

ตารางท

18 แส

ดงผล

ของการหา

คาคว

ามเขม

ขนต าสด

ของยาตานจล

ชพทส

ามารถยบย

งเชอ S

. aure

us ทแยกจ

ากตว

อยางสง

สงตรวจผป

วย

100

ตารางท

18 แส

ดงผล

ของการหา

ค าคว

ามเขม

ขนต าสด

ของยาตานจล

ชพทส

ามารถยบย

งเชอ S

. aur

eus ท

แยกจ

ากตว

อยางสง

สงตรวจผป

วย(ตอ)

101

ตารางท

19 แส

ดงผล

ของการหา

ค าคว

ามเขม

ขนต าสด

ของยาตานจล

ชพทส

ามารถยบย

งเชอ S

. aur

eus ท

แยกจ

ากตว

อยางทเก บ

ดวยวธป

ายเชอ

102

ตารางท

19 แส

ดงผล

ของการหา

ค าคว

ามเขม

ขนต าสด

ของยาตานจล

ชพทส

ามารถยบย

งเชอ S

. aur

eus ท

แยกจ

ากตว

อยางทเก บ

ดวยวธป

ายเชอ

(ตอ)

103

ตารางท

19 รป

แบบก

ารดอ

ยาตอ

ยาตานจ

ลชพข

องเชอ

S. au

reus ท

แยกจ

ากตว

อยางสง

สงตรวจผป

วยแล

ะตวอ

ยางป

ายเชอ

104

ตารางท

20 แส

ดงผล

การต

รวจห

ายนด

อยาตานจล

ชพเชอ

S. au

reus ท

พบใน

ตวอยางสง

สงตรวจผป

วย (S

p)

105

ตารางท

21 แส

ดงผล

การต

รวจห

ายนด

อยาตาน

จลชพ

เชอ S.

aureu

s ทตรวจพบ

ในตว

อยางปายเช

อ (Sw

)

106

ตารางท

22 กา

รเปรยบเทย

บระห

วางผลก

ารทด

สอบค

วามไ

วตอยาตาน

จลชพ

และยนด

อยาตานจล

ชพขอ

งเชอ S

. aur

eus ต

วอยางส

งสงตรวจผ

ปวย

107

ตารางท

23 กา

รเปรยบเทย

บระห

วางผลก

ารทด

สอบค

วามไ

วตอยาตาน

จลชพ

MIC

และยนด

อยาตาน

จลชพ

ของเช

อ S. a

ureus

จากต

วอยาง ป

ายเชอ

108

Sp = ตวอยางสงสงตรวจผปวย; Sw = ตวอยางปายเชอ

ตารางท 24 แสดงความสมพนธระหวางรปแบบการดอยาและยนดอยาตานจลชพของเชอ S. aureus ทแยกจากตวอยางสงสงตรวจผปวยและตวอยางปายเชอ

กลม รปแบบการดอยากบยนดอยาตานจลชพทตรวจพบในตวอยาง จ านวนตวอยาง PEN blaZ FOX OXA mecA ERY ermA GEN aac(6’)/

aph(2’’) TE tetK tetM ตวอยางสงสงสงตรวจ

ผปวย (รอยละ) (n = 31)

ตวอยางปายเชอ (รอยละ) (n = 23)

รวม (รอยละ) (n = 54)

1 + + - - - - + - - - - + Sp1 (3.2) Sw4 (4.3) 2 (3.7) 2 + + + + + + + - - + + - Sp2 (3.2) - 1 (1.9) 3 + + + + + + + - + - Sp3 (3.2) - 1 (1.9) 4 + + - - - - - + + + - Sp4 (3.2) - 1 (1.9) 5 + + - - - - - - - - - - Sp5,Sp16,Sp19,Sp20,S

p23,Sp25,Sp26,Sp27,Sp28, Sp30 (32.3)

Sw5,Sw14 (8.7) 12 (22.2)

6 + + + + + + + - - + + + Sp6 (3.2) - 1 (1.9) 7 + + - - + + + - + + + Sp7 (3.2) - 1 (1.9) 8 + + + + + + + - - - - - Sp8 (3.2) - 1 (1.9) 9 + + - - - - - - - - - + Sp9 (3.2) - 1 (1.9) 10 + + + + + + + - - + + + Sp10 (3.2) - 1 (1.9) 11 + + - + - - - + + Sp11 (3.2) - 1 (1.9) 12 + + - - - - - - - + + + Sp12 (3.2) - 1 (1.9) 13 + + - - + - - - - - - - Sp14 (3.2) Sw7,Sw11,Sw12

(13) 4 (7.4)

14 + + - - - + - - - - - - Sp15,Sp20 (6.5) Sw22 (4.3) 3 (5.5) 15 + + - - - + + - - - - - Sp,13,Sp17,Sp18,Sp22,

Sp24,Sp27,Sp31 (22.6) - 7 (13)

16 - - - - - - - - - - - - Sp29 (3.2) Sw1 (4.3) 2 (3.7) 17 + + + + + - - + - - - - Sw2 (4.3) 1 (1.9) 18 - + - - - - - - - - - - - Sw3 (4.3) 1 (1.9) 19 + + + - - - + + - - - - Sw6 (4.3) 1 (1.9) 20 + + + + + - - - - - - - - Sw8,Sw13,Sw19

(13) 3 (5.5)

21 - + + + - - - - - + + - - Sw9 (4.3) 1 (1.9) 22 + + + + - + + - + + + - Sw10 (4.3) 1 (1.9) 23 - - + - + - - - - - - - - Sw15 (4.3) 1 (1.9) 24 - - + + - - - - - - - - - Sw16 (4.3) 1 (1.9) 25 - - + - - - - - - - - - - Sw17 (4.3) 1 (1.9) 26 + + - - - - + - - - + + - Sw18 (4.3) 1 (1.9) 27 + + + + - - - - - + + + - Sw20 (4.3) 1 (1.9) 28 - + - - - - - - - - - - - Sw21 (4.3) 1 (1.9) 29 + + - - - - - - - - - + - Sw23 (4.3) 1 (1.9)

109

ล าดบนวคลโอไทนของยนดอยาตานจลชพในเชอ S. aureus เทยบกบฐานขอมล GENBANK 1. femA

ล าดบนวคลโอไทนของยน femA เทยบกบฐานขอมล GENBANK# CP000255

Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300_FPR3757, complete genome

Sequence ID: CP000255.1Length: 2872769 Number of Matches: 1

Score Expect Identities Gaps Strand

833 bits(451) 0.0 451/451(100%) 0/451(0%) Plus/Plus

Query 1 CGATCCATATTTACCATATCAATACTTGAATCATGATGGCGAGATTACAGGTAATGCTGG 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1397366 CGATCCATATTTACCATATCAATACTTGAATCATGATGGCGAGATTACAGGTAATGCTGG 1397425

Query 61 TAATGATTGGTTCTTTGATAAAATGAGTAACTTAGGATTTGAACATACTGGATTCCATAA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1397426 TAATGATTGGTTCTTTGATAAAATGAGTAACTTAGGATTTGAACATACTGGATTCCATAA 1397485

110

Query 121 AGGATTTGATCCTGTGCTACAAATTCGTTATCACTCAGTGTTAGATTTAAAAGATAAAAC 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1397486 AGGATTTGATCCTGTGCTACAAATTCGTTATCACTCAGTGTTAGATTTAAAAGATAAAAC 1397545

Query 181 AGCAGATGACATCATTAAAAATATGGATGGACTTAGaaaaagaaacacgaaaaaagttaa 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1397546 AGCAGATGACATCATTAAAAATATGGATGGACTTAGAAAAAGAAACACGAAAAAAGTTAA 1397605

Query 241 aaaGAATGGTGTTAAAGTAAGATTTTTATCTGAAGAAGAACTACCAATTTTTAGATCATT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1397606 AAAGAATGGTGTTAAAGTAAGATTTTTATCTGAAGAAGAACTACCAATTTTTAGATCATT 1397665

Query 301 TATGGAAGATACGTCAGAATCAAAAGCTTTTGCTGATCGTGATGACAAATTTTACTACAA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

111

Sbjct 1397666 TATGGAAGATACGTCAGAATCAAAAGCTTTTGCTGATCGTGATGACAAATTTTACTACAA 1397725

Query 361 TCGCTTAAAATATTACAAAGACCGTGTGTTAGTACCTTTAGCGTATATCAACTTTGATGA 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1397726 TCGCTTAAAATATTACAAAGACCGTGTGTTAGTACCTTTAGCGTATATCAACTTTGATGA 1397785

Query 421 ATATATTAAAGAACTAAACGAAGAGCGTGAT 451

|||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1397786 ATATATTAAAGAACTAAACGAAGAGCGTGAT 1397816

112

2. ยน blaZ ล าดบนวคลโอไทนของยนดอยา blaZ เทยบกบฐานขอมล GENBANK# X52734

S.aureus Tn552 transposable element Sequence ID: X52734.1 Length: 6545Number of Matches: 1

Score Expect Identities Gaps Strand

2169 bits(1174) 0.0 1174/1174(100%) 0/1174(0%) Plus/Plus

Query 1 TACAACTGTAATATCGGAGGGTTTATTTTGAAAAAGTTAATATTTTTAATTGTAATTGCT 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5372 TACAACTGTAATATCGGAGGGTTTATTTTGAAAAAGTTAATATTTTTAATTGTAATTGCT 5431

Query 61 TTAGTTTTAAGTGCATGTAATTCAAACAGTTCACATGCCAAAGAGTTAAATGATTTAGaa 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5432 TTAGTTTTAAGTGCATGTAATTCAAACAGTTCACATGCCAAAGAGTTAAATGATTTAGAA 5491

Query 121 aaaaaaTATAATGCTCATATTGGTGTTTATGCTTTAGATACTAAAAGTGGTAAGGAAGTA 180

113

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5492 AAAAAATATAATGCTCATATTGGTGTTTATGCTTTAGATACTAAAAGTGGTAAGGAAGTA 5551

Query 181 AAATTTAATTCAGATAAGAGATTTGCCTATGCTTCAACTTCAAAAGCGATAAATAGTGCT 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5552 AAATTTAATTCAGATAAGAGATTTGCCTATGCTTCAACTTCAAAAGCGATAAATAGTGCT 5611

Query 241 ATTTTGTTAGAACAAGTACCTTATAATAAGTTAAATAAAAAAGTACATATTAACAAAGAT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5612 ATTTTGTTAGAACAAGTACCTTATAATAAGTTAAATAAAAAAGTACATATTAACAAAGAT 5671

Query 301 GATATAGTTGCTTATTCTCCTATTTTAGAAAAATATGTAGGAAAAGATATCACTTTAAAA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

114

Sbjct 5672 GATATAGTTGCTTATTCTCCTATTTTAGAAAAATATGTAGGAAAAGATATCACTTTAAAA 5731

Query 361 GCACTTATTGAGGCTTCAATGACATATAGTGATAATACAGCAAACAATAAAATTATAAAA 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5732 GCACTTATTGAGGCTTCAATGACATATAGTGATAATACAGCAAACAATAAAATTATAAAA 5791

Query 421 GAAATCGGTGGAATCAAAAAAGTTAAACAACGTCTAAAAGAACTAGGAGATAAAGTAACA 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5792 GAAATCGGTGGAATCAAAAAAGTTAAACAACGTCTAAAAGAACTAGGAGATAAAGTAACA 5851

Query 481 AATCCAGTTAGATATGAGATAGAATTAAATTACTATTCACCAAAGAGCAAAAAAGATACT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5852 AATCCAGTTAGATATGAGATAGAATTAAATTACTATTCACCAAAGAGCAAAAAAGATACT 5911

115

Query 541 TCAACACCTGCTGCTTTCGGTAAGACTTTAAATAAACTTATCGCAAATGGAAAATTAAGC 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5912 TCAACACCTGCTGCTTTCGGTAAGACTTTAAATAAACTTATCGCAAATGGAAAATTAAGC 5971

Query 601 AAAGAAAACAAAAAATTCTTACTTGATTTAATGTTAAATAATAAAAGCGGAGATACTTTA 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 5972 AAAGAAAACAAAAAATTCTTACTTGATTTAATGTTAAATAATAAAAGCGGAGATACTTTA 6031

Query 661 ATTAAAGACGGTGTTCCAAAAGACTATAAGGTTGCTGATAAAAGTGGTCAAGCAATAACA 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 6032 ATTAAAGACGGTGTTCCAAAAGACTATAAGGTTGCTGATAAAAGTGGTCAAGCAATAACA 6091

116

Query 721 TATGCTTCTAGAAATGATGTTGCTTTTGTTTATCCTAAGGGCCAATCTGAACCTATTGTT 780

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 6092 TATGCTTCTAGAAATGATGTTGCTTTTGTTTATCCTAAGGGCCAATCTGAACCTATTGTT 6151

117

3. ยน mecA ล าดบนวคลโอไทนของยนดอยา mecA เทยบกบฐานขอมล GENBANK# AB037671

Staphylococcus aureus strain M92, complete genome Sequence ID: CP015447.1Length: 3050062 Number of Matches: 1

Score Expect Identities Gaps Strand

959 bits(519) 0.0 519/519(100%) 0/519(0%) Plus/Plus

Query 1 TGTCCGTAACCTGAATCAGCTAATAATATTTCATTATCTAAATTTTTGTTTGAAATTTGA 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77385 TGTCCGTAACCTGAATCAGCTAATAATATTTCATTATCTAAATTTTTGTTTGAAATTTGA 77444

Query 61 GCATTATAAAATGGATAATCACTTGGTATATCTTCACCAACACCTAGTTTTTTCATGCCT 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||

Sbjct 77445 GCATTATAAAATGGATAATCACTTGGTATATCTTCACCAACACCTAGTTTTTTCATGCCT 77504

Query 121 TTTTCAAATTTCTTACTGCCTAATTCGAGTGCTACTCTAGCAAAGAAAATGTTATCTGAT 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

118

Sbjct 77505 TTTTCAAATTTCTTACTGCCTAATTCGAGTGCTACTCTAGCAAAGAAAATGTTATCTGAT 77564

Query 181 GATTCTATTGCTTGTTTTAAGTCGATATTACCATTTACCACTTCATATCTTGTAACGTTG 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77565 GATTCTATTGCTTGTTTTAAGTCGATATTACCATTTACCACTTCATATCTTGTAACGTTG 77624

Query 241 TAACCACCCCAAGATTTATCTTTTTGCCAACCTTTACCATCGATTTTATAACTTGTTTTA 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77625 TAACCACCCCAAGATTTATCTTTTTGCCAACCTTTACCATCGATTTTATAACTTGTTTTA 77684

Query 301 TCGTCTAATGTTTTGTTATTTAACCCAATCATTGCTGTTAATATTTTTTGAGTTGAACCT 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77685 TCGTCTAATGTTTTGTTATTTAACCCAATCATTGCTGTTAATATTTTTTGAGTTGAACCT 77744

119

Query 361 GGTGAAGTTGTAATCTGGAACTTGTTGAGCAGAGGTTCTTTTTTATCTTCGGTTAATTTA 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77745 GGTGAAGTTGTAATCTGGAACTTGTTGAGCAGAGGTTCTTTTTTATCTTCGGTTAATTTA 77804

Query 421 TTATATTCTTCGTTACTCATGCCATACATAAATGGATAGACGTCATATGAAGGTGTGCTT 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77805 TTATATTCTTCGTTACTCATGCCATACATAAATGGATAGACGTCATATGAAGGTGTGCTT 77864

Query 481 ACAAGTGCTAATAATTCACCTGTTTGAGGGTGGATAGCA 519

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 77865 ACAAGTGCTAATAATTCACCTGTTTGAGGGTGGATAGCA 77903

120

4. ยน aac (6 ′)/aph(2 ′′) ล าดบนวคลโอไทนของยนดอยา aac (6’)/aph (2”) เทยบกบฐานขอมล GENBANK#

AF051917 Staphylococcus aureus plasmid pSK41, complete sequence Sequence ID: AF051917.1Length: 46445Number of Matches: 2

Score Expect Identities Gaps Strand

2069 bits(1120) 0.0 1120/1120(100%) 0/1120(0%) Plus/Plus

Query 1 CCTACATGATGAATGGATTTATTCTTCAAGAAAATACATCAATTTTGATAAGTAGAAATG 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42001 CCTACATGATGAATGGATTTATTCTTCAAGAAAATACATCAATTTTGATAAGTAGAAATG 42060

Query 61 GTAAAAACATTGTATAGCATTTTACACAGGAGTCTGGACTTGACTGAGTTTATGGAAGAA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42061 GTAAAAACATTGTATAGCATTTTACACAGGAGTCTGGACTTGACTGAGTTTATGGAAGAA 42120

Query 121 GTTTTAATTGATGATAATATGGTTTTTGATATTGATAATTTAAAAGGATTTCTTAATGAT 180

121

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||

Sbjct 42121 GTTTTAATTGATGATAATATGGTTTTTGATATTGATAATTTAAAAGGATTTCTTAATGAT 42180

Query 181 ACCAGTTCATTTGGGTTTATAGCTAAAGAAAATAATAAAATTATAGGATTTGCATATTGC 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42181 ACCAGTTCATTTGGGTTTATAGCTAAAGAAAATAATAAAATTATAGGATTTGCATATTGC 42240

Query 241 TATACACTTTTAAGACCTGATGGAAAAACAATGTTTTATTTACACTCAATAGGAATGTTA 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42241 TATACACTTTTAAGACCTGATGGAAAAACAATGTTTTATTTACACTCAATAGGAATGTTA 42300

Query 301 CCTAACTATCAAGACAAAGGTTATGGTTCAAAATTATTATCTTTTATTAAGGAATATTCT 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

122

Sbjct 42301 CCTAACTATCAAGACAAAGGTTATGGTTCAAAATTATTATCTTTTATTAAGGAATATTCT 42360

Query 361 AAAGAGATTGGTTGTTCTGAAATGTTTTTAATAACTGATAAAGGTAATCCTAGAGCTTGC 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42361 AAAGAGATTGGTTGTTCTGAAATGTTTTTAATAACTGATAAAGGTAATCCTAGAGCTTGC 42420

Query 421 CATGTATATGAAAAATTAGGTGGtaaaaatgattataaagatgaaatagtatatgtatat 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42421 CATGTATATGAAAAATTAGGTGGTAAAAATGATTATAAAGATGAAATAGTATATGTATAT 42480

Query 481 gattatgaaaaaggtgataaataaatgaatatagttgaaaatgaaatatgtataAGAACT 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42481 GATTATGAAAAAGGTGATAAATAAATGAATATAGTTGAAAATGAAATATGTATAAGAACT 42540

123

Query 541 TTAATAGATGATGATTTTCCTTTGATGTTAAAATGGTTAACTGATGAAAGAGTATTAGAA 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42541 TTAATAGATGATGATTTTCCTTTGATGTTAAAATGGTTAACTGATGAAAGAGTATTAGAA 42600

Query 601 TTTTATGGTGGTAGAGATAAAAAATATACATTAGAATCATTAAAAAAACATTATACAGAG 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42601 TTTTATGGTGGTAGAGATAAAAAATATACATTAGAATCATTAAAAAAACATTATACAGAG 42660

Query 661 CCTTGGGAAGATGAAGTTTTTAGAGTAATTATTGAATATAACAATGTTCCTATTGGATAT 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42661 CCTTGGGAAGATGAAGTTTTTAGAGTAATTATTGAATATAACAATGTTCCTATTGGATAT 42720

Query 721 GGACAAATATATAAAATGTATGATGAGTTATATACTGATTATCATTATCCAAAAACTGAT 780

124

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42721 GGACAAATATATAAAATGTATGATGAGTTATATACTGATTATCATTATCCAAAAACTGAT 42780

Query 781 GAGATAGTCTATGGTATGGATCAATTTATAGGAGAGCCAAATTATTGGAGTAAAGGAATT 840

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42781 GAGATAGTCTATGGTATGGATCAATTTATAGGAGAGCCAAATTATTGGAGTAAAGGAATT 42840

Query 841 GGTACAAGATATATTAAATTGATTTTTGAATTTTTGAAAAAAGAAAGAAATGCTAATGCA 900

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42841 GGTACAAGATATATTAAATTGATTTTTGAATTTTTGAAAAAAGAAAGAAATGCTAATGCA 42900

Query 901 GTTATTTTAGACCCTCATAAAAATAATCCAAGAGCAATAAGGGCATACCAAAAATCTGGT 960

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

125

Sbjct 42901 GTTATTTTAGACCCTCATAAAAATAATCCAAGAGCAATAAGGGCATACCAAAAATCTGGT 42960

Query 961 TTTAGAATTATTGAAGATTTGCCAGAACATGAATTACACGAGGGCAAAAAAGAAGATTGT 1020

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 42961 TTTAGAATTATTGAAGATTTGCCAGAACATGAATTACACGAGGGCAAAAAAGAAGATTGT 43020

Query 1021 TATTTAATGGAATATAGATATGATGATAATGCCACAAATGTTAAGGCAATGAAATATTTA 1080

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 43021 TATTTAATGGAATATAGATATGATGATAATGCCACAAATGTTAAGGCAATGAAATATTTA 43080

126

5. ยน tetK ล าดบนวคลโอไทนของยนดอยา tetK เทยบกบฐานขอมล GENBANK# S67449 Staphylococcus aureus plasmid pT181 tetracycline efflux protein (tet(K)) gene, complete cds Sequence ID: S67449.1Length: 1380Number of Matches: 1

Score Expect Identities Gaps Strand

942 bits(510) 0.0 510/510(100%) 0/510(0%) Plus/Plus

Query 1 GTAGCGACAATAGGTAATAGTGTTATTTTTCCTGGAACCATGAGTgttattgtttttggt 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 871 GTAGCGACAATAGGTAATAGTGTTATTTTTCCTGGAACCATGAGTGTTATTGTTTTTGGT 930

Query 61 tattttggtggttttttagtggatagaaaaggatcattatttgtttttattttaggatca 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 931 TATTTTGGTGGTTTTTTAGTGGATAGAAAAGGATCATTATTTGTTTTTATTTTAGGATCA 990

Query 121 ttgtctatctctataagttttttaactattgcattttttgttgAGTTTAGTATGTGGTTG 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 991 TTGTCTATCTCTATAAGTTTTTTAACTATTGCATTTTTTGTTGAGTTTAGTATGTGGTTG 1050

127

Query 181 ACTACTTTTATGTTTATATTTGTTATGGGCGGATTATCTTTTACTAAAACAGTTATATCA 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1051 ACTACTTTTATGTTTATATTTGTTATGGGCGGATTATCTTTTACTAAAACAGTTATATCA 1110

Query 241 AAAATAGTATCAAGTAGTCTTTCTGAAGAAGAAGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCTAAAT 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1111 AAAATAGTATCAAGTAGTCTTTCTGAAGAAGAAGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCTAAAT 1170

Query 301 TTCACAAGTTTTTTATCAGAGGGAACAGGTATAGCAATTGTAGGAGGTTTATTGTCACTA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1171 TTCACAAGTTTTTTATCAGAGGGAACAGGTATAGCAATTGTAGGAGGTTTATTGTCACTA 1230

Query 361 CAATTGATTAATCGTAAACTAGTTCTGGAATTTATAAATTATTCTTCTGGAGTGTATAGT 420

128

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1231 CAATTGATTAATCGTAAACTAGTTCTGGAATTTATAAATTATTCTTCTGGAGTGTATAGT 1290

Query 421 AATATTCTTGTAGCCATGGCTATCCTTATTATTTTATGTTGTCTTTTGACGATTATTGTA 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 1291 AATATTCTTGTAGCCATGGCTATCCTTATTATTTTATGTTGTCTTTTGACGATTATTGTA 1350

129

6. ยน tetM ล าดบนวคลโอไทนของยนดอยา tetM เทยบกบฐานขอมล GENBANK# S67449 S. faecalis tet(M)916 gene for tetracycline resistance Sequence ID: X56353.1Length: 2186Number of Matches: 1

Score Expect Identities Gaps Strand

1077 bits(560) 0.0 560/560(100%) 0/560(0%) Plus/Plus

Query 1 GAGGAAAATCACATGAAAATTATTAATATTGGAGTTTTAGCTCATGTTGATGCAGGAAAA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 211 GAGGAAAATCACATGAAAATTATTAATATTGGAGTTTTAGCTCATGTTGATGCAGGAAAA 270 Query 61 ACTACCTTAACAGAAAGCTTATTATATAACAGTGGAGCGATTACAGAATTAGGAAGCGTG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 271 ACTACCTTAACAGAAAGCTTATTATATAACAGTGGAGCGATTACAGAATTAGGAAGCGTG 330 Query 121 GACAAAGGTACAACGAGGACGGATAATACGCTTTTAGAACGTCAGAGAGGAATTACAATT 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

130

Sbjct 331 GACAAAGGTACAACGAGGACGGATAATACGCTTTTAGAACGTCAGAGAGGAATTACAATT 390 Query 181 CAGACAGGAATAACCTCTTTTCAGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 391 CAGACAGGAATAACCTCTTTTCAGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCA 450 Query 241 GGACATATGGATTTCTTAGCAGAAGTATATCGTTCATTATCAGTTTTAGATGGGGCAATT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 451 GGACATATGGATTTCTTAGCAGAAGTATATCGTTCATTATCAGTTTTAGATGGGGCAATT 510 Query 301 CTACTGATTTCTGCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATATTATTTCATGCACTT 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 511 CTACTGATTTCTGCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATATTATTTCATGCACTT 570

131

Query 361 AGGAAAATGGGGATTCCCACAATCTTTTTTATCAATAAGATTGACCAAAATGGAATTGAT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 571 AGGAAAATGGGGATTCCCACAATCTTTTTTATCAATAAGATTGACCAAAATGGAATTGAT 630 Query 421 TTATCAACGGTTTATCAGGATATTAAAGAGAAACTTTCTGCCGAAATTGTAATCAAACAG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 631 TTATCAACGGTTTATCAGGATATTAAAGAGAAACTTTCTGCCGAAATTGTAATCAAACAG 690

132

ค าอธบายค ายอและสญลกษณ PEN = penicilin ERY = erythromycin TE = tetracycline; FOX = cefoxitin SXT = trimethoprim-sulfamethoxazole CHLO = chloramphenicol OXA = oxacillin VAN = vancomycin MIC = ความเขมขนต าสดทสามารถยบย งแบคทเรยได µl = ไมโครลตร ºC = องศาเซลเซยส ml = มลลลตร cm = เซนตเมตร bp = คเบส µg/ml = ไมโครกรมตอมลลลตร µg = ไมโครกรม mmol/l = มลลโมลตอลตร µm = ไมโครโมล ml = มลลลตร mm = มลลเมตร rpm = รอบตอนาท et al. = และคณะ

133 ประวตผเขยน

ประวตผเขยน

ชอ-สกล ณฐพล มงชเกยรตสกล

วน เดอน ป เกด 30 สงหาคม 2533 สถานทเกด จงหวดตราด

วฒการศกษา 2556-ปจจบน: ปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยศลปากร วทยาเขตพระราชวงสนามจนทร

จงหวดนครปฐม

2552-2556: ปรญญาวทยาศาสตรบณฑต สาขาสตวศาสตรและเทคโนโลยการเกษตร คณะสตวศาสตรและเทคโนโลยการเกษตร

มหาวทยาลยศลปากร วทยาเขตสารสนเทศเพชรบร จงหวดเพชรบร ทอยปจจบน 44/2 ม.1 ซ.แหลมตะโคย ถ. ตราด-แหลมงอบ ต.หนองเสมด อ.เมอง จ.ตราด

23000

ผลงานตพมพ ณฐพล มงชเกยรตสกล และ ธงชย เตโชวศาล . (2559). “การศกษารปแบบการดอยาและยนดอยาตานจลชพของเชอ Staphylococcus aureus.” การน าเสนอผลงานในงานประชมวชาการระดบชาต เกษตรแฟร นนทรอสาน

ครงท 4, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตสกลนคร 27 พฤศจกายน, 2559.

134