A MIS QUERIDOS PADRES MARIA DE LOS MILAGROS …
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A MIS QUERIDOS PADRES
LUCIO DE LA O MORENO (q.e.p.d)
ESTHER MEDRANO PANIAGUA (q.e.p.d)
A MI QUERIDA ESPOSA
MARIA DE LOS MILAGROS CONTRERAS DELGADILLO
1. INTRODUCCIÓN
El estado de choque es considerado como un fracaso agudo y generalizado del
sistema circulatorio, ocasionando que el suministro de sangre sea inadecuado
para proporcionar la nutrición y oxigenación requerida por las células del cuerpo,
la alteración del volumen sanguíneo dará lugar al choque hipovolémico. Este se
presenta en tres etapas: etapa compensada, etapa progresiva y etapa irreversible.
Etapa compensada, el sistema adrenérgico provoca una vasoconstricción
arteriovenosa a nivel esplácnico, una estimulación del músculo cardiaco y
aumento del gasto cardiaco. Etapa progresiva, aparecen alteraciones como la
caída de la presión venosa central deteriorando el gasto cardiaco [1]. A nivel
celular la disminución del oxígeno: afecta la capacidad mitocondrial, aumenta la
concentración de lactato provocando una acidosis metabólica que representa un
signo tardío de hipoxia tisular y un parámetro en la valoración del estado de
gravedad del choque, así mismo se incrementa la permeabilidad de la membrana
y empieza una alteración del funcionamiento de la bomba sodio potasio
ocasionando un edema celular [2]. Etapa irreversible, en este punto cualquier
forma de tratamiento conocida no puede salvar los tejidos afectados [2].
Algunas patologías como la isquemia y necrosis que afectan a los tejidos, implican
alteraciones a nivel celular, que son reflejadas en cambios de impedancia. La
espectroscopía de impedancia eléctrica es un técnica diagnóstica empleada para
identificar el comportamiento del tejido de manera mínimamente invasiva,
utilizando sus características eléctricas y dispersiones, determinadas por tres
efectos; características eléctricas de las células o su integridad y normalidad;
variación de los volúmenes extra e intracelulares; y efectos de la bicapa celular [3].
Cuando se presenta una condición normóxica en un tejido, al aplicar corriente a
diferentes frecuencias está fluye fácilmente a través del espacio extracelular y al
ocurrir hipoxia las células no son capaces de generar suficiente energía para
alimentar las bombas iónicas ocasionando que el agua extracelular penetre al
interior de la célula, creciendo e invadiendo el espacio extracelular causando un
incremento en la impedancia. De acuerdo a lo anterior la conductividad de los
espacios extra e intracelulares contribuye a la resistencia promedio del tejido,
mientras la membrana celular contribuye al efecto capacitivo [4].
Con la técnica de espectroscopía de impedancia se ha medido la isquemia y el
daño tisular en la mucosa intestinal [5]. Para esto se utilizó la sonda con cuatro
electrodos y el espectrómetro de impedancia compleja descrito en detalle por
Sacristán [6], la misma tecnología será retomada para la realización del presente
proyecto.
Con la espectroscopía de impedancia eléctrica se han realizado estudios como la
evaluación de la perfusión tisular relacionada al nivel de isquemia y la
caracterización in vivo de los tejidos cancerosos [3].
Así mismo se han realizado estudios clínicos que muestran que la impedancia
aumenta en pacientes sometidos a cirugía cardiovascular respecto a voluntarios
sanos, estimando que esta técnica es una herramienta útil en el monitoreo para
diagnóstico de daño isquémico [7].
Pero a la fecha, no se cuenta con un estudio que permita relacionar el aumento de
impedancia gástrica con la cuantificación del daño tisular observado a partir de
imágenes in vivo. Para poder llevar a cabo lo anterior son necesarios cortes
histológicos. Actualmente en la UAM, en el Centro Nacional de Investigación en
Instrumentación e Imagenología Médica (CI3M) se cuenta con un equipo de
endoscopía confocal que realiza una histología in vivo, brindando imágenes
diagnósticas que permiten observar un panorama general de la estructura tisular,
a través de cortes ópticos de 7 micrómetros de espesor reconstruidos digitalmente
en escala de grises después de dos tipos de tinción, la primera con acriflavina
tópica para el contraste de núcleos y bordes de la membrana; la segunda con
fluoresceína sistémica para teñir citoplasma, vasos sanguíneos y visualizar la
arquitectura del tejido. Las limitantes presentes en esta tecnología son: el uso de
agentes de contraste óptimos, pequeños campos de visión, penetración
insuficiente y escasez de los estudios de validación clínica. Es por esto que se
plantea establecer una correlación entre endoscopía confocal e histología, que
permita el análisis e interpretación de la profundidad del daño isquémico,
basándose en una escala generada por un especialista en histología que validará
la cuantificación del daño tisular.
El presente proyecto de investigación consiste en relacionar los cambios de
impedancia gástrica con el daño tisular observado en imágenes de endoscopía
confocal en un modelo de choque hemorrágico en cerdos, pudiéndose lograr con
esto generar un índice de cuantificación del daño tisular gástrico.
Los resultados del proyecto ayudarán en la interpretación del cambio de
impedancia eléctrica observado con el aumento de isquemia.
2. ANTECEDENTES
La información que se describirá a continuación se basa en trabajos producidos
por diversos grupos de investigadores, y representa una base para el presente
proyecto. Además se mencionaran temas relacionados al proyecto como:
Isquemia y su repercusión.
Espectroscopía de impedancia.
Endoscopía confocal
Histología
Segmentación de imágenes
LA ISQUEMIA Y SU REPERCUSIÓN
La isquemia es considerada en el área clínica como una falla parcial o total en la
aportación de sangre a un órgano o a una parte de él, provocando una deficiencia
de oxígeno, nutrientes y una inadecuada remoción de metabolitos de desecho en
la zona venosa. Esta disminución de la perfusión genera: incapacidad de sintetizar
ATP para la recuperación de órganos, altas concentraciones de CO2 que origina
altas concentraciones de acido carbónico; aumento en la concentración del acido
láctico debido a la activación del proceso anaerobio de la glucólisis [1] entre otros.
Aún con esto cuando el riego sanguíneo se ve comprometido hay tejidos
resistentes a la hipovolemia, como esqueléticos y lisos. Por otra parte, existen
tejidos que presentan una alta vulnerabilidad como la mucosa intestinal, que
resulta ser la más sensible a la iniciación de isquemia provocada por una
disminución de la perfusión sanguínea, esto debido a que presenta en su
estructura células lábiles y a su riego sanguíneo [1]. Por esta razón se ha
demostrado que la mucosa gastrointestinal es un indicador temprano y específico
de choque [2]. Al haber una disminución del flujo sanguíneo, inicialmente la
circulación arterial mesentérica trata de compensar esta hipoperfusión local
provocando vasoconstricción de una o más de sus tres arterias mesentéricas, las
cuales vienen directamente de la aorta, por ende cuando ocurre el estrechamiento
o bloqueo la mucosa gastrointestinal se compromete en forma muy temprana por
ser la última capa de la circulación mesentérica [1].
Si la isquemia se ha prolongado por un periodo mayor, se provoca una variación
del funcionamiento de la bomba sodio potasio, produciéndose una acumulación de
iones y un aumento en la osmolaridad intracelular, asociado el aumento de la
permeabilidad de la membrana que en la pared intestinal daría lugar a la
translocación de bacterias entéricas provenientes del lumen a la circulación
linfática, portal y a la cavidad peritoneal, así como la entrada de endotoxinas [1].
Si el tiempo de isquemia es prolongado, se puede llegar a un punto irreversible en
el que el daño es suficientemente grave y es importante salvar la vida del paciente
previniendo daños como la FOM. El primer paso para lograr una estabilización es
la reperfusión sanguínea o soluciones electrolíticas, etc., para compensar o salvar
la vida del paciente [2]. A pesar de que la reperfusión es el proceso en el que se
restablece el flujo sanguíneo al tejido, esta debe realizarse en tiempos
aproximados de 15 a 30 min. Al aumentar la exposición de un tejido a la isquemia,
este presentará un mayor daño tisular debido a la acumulación de la enzima
xantina oxidasa, que produce radicales libres al llevar a cabo una reperfusión,
estos radicales afectarán el tejido y aceleran la destrucción de la mucosa intestinal
[5].
ESPECTROSCOPÍA DE IMPEDANCIA
La espectroscopía de impedancia ha sido propuesta como un método para el
monitoreo de lesiones de la mucosa por hipoperfusión e isquemia, en pacientes
críticamente enfermos [7]. El método más usado en la medición de las
características bioléctricas (espectrometría de impedancia) de tejido vivo, es el
método de 4 electrodos, que consiste en conectar los dos electrodos externos a
una fuente de corriente constante de frecuencia variable, y la medición de la
diferencia de potencial generada por el paso de la corriente, a través del tejido, es
medida en los dos electrodos internos. La impedancia es calculada como la
relación entre el voltaje medido y la corriente inyectada.
El espectrómetro de impedancia desarrollado en la UAM consta de un módulo de
adquisición y una interfase con la computadora para el análisis de datos.
La sonda de espectrometría de impedancia tiene cuatro electrodos, los electrodos
exteriores inyectan una corriente de excitación al tejido de 1mA. La corriente a su
vez genera un voltaje medido por los electrodos interiores. La impedancia de
entrada del sistema de medición de voltaje debe ser de magnitud mayor que la
impedancia del tejido medido y que aquella de la interfase electrodo-tejido. Así,
toda la corriente inyectada pasa a través del tejido, solamente una proporción
despreciable pasa a través de los electrodos interiores y éstos no cambian la
distribución de corriente en el tejido. Además, el voltaje de la interfase electrodo-
tejido para los electrodos interiores es despreciable y el voltaje medido es igual al
voltaje en el tejido. La impedancia total representa al tejido únicamente [6].
La técnica de espectroscopía de impedancia utiliza un barrido de frecuencias, en
este caso, con un rango de 215 Hz a 1 M Hz. Se realizan mediciones a diferentes
frecuencias debido a que se ha reportado que los tejidos no responden igual a
todas las frecuencias, presentándose diferentes regiones de dispersión. La
dispersión a bajas frecuencias está más asociada a cambios entre volumen
extracelular e intracelular por edematización, mientras que a altas frecuencias se
observan alteraciones iónicas en las membranas que llevan a la muerte del tejido.
En el presente proyecto se utilizó un método mínimamente invasivo para
determinar el estado de la mucosa gástrica, midiéndose por impedancia compleja,
la cual incluye componentes resistivos y reactivos del tejido a diferentes
frecuencias.
Sea R la resistencia del tejido al paso de la corriente inyectada, y X la reactancia
tisular. Estos parámetros miden los cambios de difusión iónica en el medio
extracelular, y las variaciones de osmolalidad ligados a la polarización de la
membrana.
Debido a que los espectros de impedancia del tejido gástrico humano presentan
dos zonas de dispersión, se calcularon 4 parámetros de impedancia para
simplificar la información: a frecuencias bajas [RL, XL] y altas [RH, XH]. Donde RL es
la resistencia a bajas frecuencias; XL es la reactancia a bajas frecuencias. RH es
la resistencia a altas frecuencias; XH es la reactancia a altas frecuencias [8].
Siendo la más importante XL, debido a que en él se mide la mayor dispersión de
los datos registrados causados por una hipovolemia.
La información del espectrómetro se almacenó en una computadora que tiene el
software precargado compatible con el dispositivo y que cuenta con una base de
datos en Access 2000 de Microsoft que se exportó y depuró en un ambiente de
trabajo de Microsoft Office Excel.
ENDOSCOPIA CONFOCAL
La microscopia confocal es utilizada para obtener imágenes de células in vivo en
los tejidos superficiales durante una endoscopia gastrointestinal. A través de un
sistema de imágenes digitales de fluorescencia que permiten visualizar
características morfológicas en el tejido vivo [9].
La endoscopia confocal es una adaptación de la microscopia óptica en la cual se
utiliza un láser de baja potencia para enfocar un punto del tejido. La luz reflejada
del láser se focaliza a través de una apertura puntual hacia un detector, mientras
que la rejilla del láser traza la imagen tridimensional. De este modo, es posible
detectar detalles microscópicos [10]. El sistema de imágenes digitales que utiliza
tiene dos plataformas; la plataforma de transmisión que funciona colocando el
extremo distal del video-endoscopio en el sitio del tejido que se va a examinar,
aquí el dispositivo utiliza un haz de fibra óptica para transmitir la luz láser azul
sobre el tejido de interés; la plataforma receptora recibe la emisión de
fluorescencia del tejido para transmitirla a un microscopio confocal en miniatura
integrado en la punta de un video-endoscopio que permitirá crear una imagen
ampliada en el sensor óptico que se visualiza en la pantalla confocal. La
fluorescencia requerida para el láser confocal, se logra con agentes de contraste
exógenos aplicados vía tópica o por vía intravenosa, para resaltar estructuras que
brillan ante un fondo oscuro con un contraste que permite observar morfologías en
las áreas o muestra del tejido que se va a examinar sin alterar su estado natural.
La aplicación de fluoresceína al 10% utilizada por vía intravenosa producirá
manchas idénticas a la matriz extracelular y al citoplasma, resaltando la estructura
y fisiología de los vasos: mostrando sus densidades y formas; está no proporciona
una visualización directa de los núcleos, pero permite una estimación de su
tamaño y posición. También se recurre a tinciónes nucleares utilizando clorhidrato
de acriflavina al 0.02% representando a los núcleos como manchas oscuras con
fondo blanco [11].
Es importante resaltar que las imágenes obtenidas a través de este dispositivo son
en forma de cortes transversales de la mucosa, a diferencia de los cortes
histológicos convencionales, los cuales pueden variar.
Las investigaciones publicadas alrededor del mundo muestran aplicaciones de la
endoscopia confocal, éstas han sugerido escalar los estudios realizados con
animales a pacientes.
Con esta tecnología se ha logrado visualizar in vivo varios órganos del cuerpo de
ratones en alta resolución, observándo los relieves de los tejidos analizados,
demostrando una excelente correlación con la histología convencional [12].
También se ha conseguido visualizar detalles celulares del tracto gastrointestinal,
así como de lesiones por perfusión en zonas hepáticas en roedores con
enfermedades humanas inducidas, estableciéndose que las imágenes in vivo
podrían permitir el análisis de la morfología y de las interacciones celulares [10].
HISTOLOGÍA Y SU TÉCNICA
La histología permite relacionar la estructura de las diferentes células, tejidos,
órganos y sistemas con las funciones realizadas por cada uno de ellos.
El conjunto de procedimientos que se emplean para la preparación del material es
aplicado para preservar la estructura, la organización de células y tejidos, a fin de
obtener una preparación microscópica que permita su examen con un microscopio
óptico. El proceso es similar tanto en tejidos normales como en el análisis de
tejidos patológicos. Los fundamentos de la obtención de cortes de muestras
histológicas sean de tejidos vivos o inertes, tienen como fin conservar la relación
estructural entre los diferentes tipos celulares y su medio, así como realizar cortes
muy finos que permitan su análisis microscópico, estos cortes deben permitir el
paso de la luz y evitar la superposición visual de sus componentes, debido a que
el grosor de un corte es menor que el diámetro de muchas células es necesario
adherirlo a una lamina de vidrio para manipularlo con facilidad y a este producto se
le conoce como corte histológico. Muchos constituyentes tisulares de los cortes
histológicos tienen aproximadamente las mismas densidades ópticas y por
consiguiente deben teñirse para observarse en microscopia de luz [12].
Un ejemplo de tinción general histológica aplicada es la Hematoxilina-eosina (H-E)
ampliamente usada ya que, contiene un colorante para las estructuras ácidas
como el núcleo y otro para el citoplasma y estructuras extracelulares [13].
PROCESAMIENTO DE IMÁGENES
Mediante una previa investigación se desarrolló un algoritmo que permitió
procesar las imágenes del dispositivo confocal que se almacenaron en formato
.TIF, utilizando como herramienta de Software Matlab, teniendo como prioridad, la
cuantificación de pixeles, el detalle de morfologías y evitar alteraciones al mejorar
el contraste. Obteniéndose imágenes que puedan ser vistas en cualquier
computador.
El término procesamiento digital de imágenes (PDI) se refiere a la manipulación y
análisis de imágenes por computadora. Conceptualmente una imagen representa
una función bidimensional de intensidad de luz f(x, y), donde x, y, denotan las
coordenadas espaciales y el valor de f en cualquier punto (x, y) es proporcional al
brillo (o nivel de gris) de la imagen en ese punto. Mientras que la imagen digital es
una imagen f(x, y) que ha sido discretizada en coordenadas espaciales y en brillo,
esta f se considera como una matriz cuyos índices de renglón y columna
identifican un punto en la imagen y el correspondiente valor del elemento (pixel) de
la matriz identifica el nivel de intensidad de luz en ese punto [14].
Partiendo de la definición anterior, se consideró que en Matlab una imagen a
escala de grises también es representada por medio de una matriz bidimensional
de m x n elementos, en donde n representa el número de píxeles de ancho y m el
número de píxeles de largo, esta característica nos permite visualizar imágenes de
calidad.
Las imágenes que se obtuvieron digitalmente del dispositivo confocal estuvieron
representadas en forma raster, las cuales se visualizaron en el entorno de Matlab
utilizando la función imread, que permite trabajar con cualquier formato de imagen;
basándose en los criterios del proyecto se consideró primordial la calidad de la
imagen y el tamaño de la misma, concluyendo que el formato óptimo para las
imágenes obtenidas en este proyecto es TIF.
Para la realización del procesamiento de las imágenes se considero el siguiente
esquema.
Fig.1 Etapas a realizar para el PDI
En la figura 1 se muestra las etapas del PDI que represento el proceso de
manipulación de la imagen inducida a mejorar, se logró que resultado sea más
adecuado que la imagen original, lo que facilitó la visualización de estructuras
morfológicas de las áreas o muestras de análisis. La valoración de dicha mejora,
relativamente fácil de entender, se validó por un especialista en histología.
Preprocesamiento
En esta etapa se realizó una mejora de la imagen manteniendo las características
naturales de esta sin ecualización, acentuando el preprocesamiento solamente en
mejorar el contraste por otro medio [14]. A través de funciones dispuestas en
Matlab, se definió el Elemento Estructurante (EE), que para el presente trabajo se
basó mediante la función Strel (ø, N), en donde ø indicó la forma y N fue el radio
centrado en el origen. Mediante el EE se otorgó la posibilidad de obtener los
límites de una región y área de la imagen donde se encontraron las intensidades
máximas de los pixeles. La representación de los límites fue de nuestro mayor
interés ya que las formas dentro de la imagen representaron características
distintivas, tales como las esquinas y las flexiones. Sin menospreciar la
representación de regiones, ya que estás, aportaron información sobre la textura o
la forma.
Para mejorar el contraste de la imagen, se consideró que las variaciones en la
dirección y la intensidad de la iluminación modifican el aspecto de los objetos en
una imagen digital. El problema del realce o mejoramiento de contraste en
imágenes digitales se aborda mediante distintas metodologías, aquí se efectuó a
través de la morfología matemática.
La morfología matemática o filtros morfológicos, son métodos no lineales para
procesar imágenes digitales basándose en la forma. Mediante el trabajo de
PREPROCESADO
DE IMÁGENES
SEGMENTACIÓN: Umbralización,
Dilatación y Erosión
ETIQUETADO Y
CUANTIFICACIÓN DE OBJETOS
Mukhopadhyay y Chanda [15], se definió un esquema para el realce de contraste
local empleando una transformación tophat morfológico multiescala.
Las funciones de Matlab imbothat e imtophat, corrigieron la iluminación desigual
en el fondo oscuro utilizándolas en combinación con el EE en forma de disco.
Utilizando estas dos funciones se mejoró el contraste de la imagen, mediante el
siguiente comando:
Imagen proceso = imsubtract (imadd (Imagen original, imtophat ), imbothat );
Donde la función imsubtract restó cada elemento de la matriz generada por la
función imbothat, a la adición de la matriz generada por imadd, asignando la
diferencia a la imagen en proceso. Resulta fundamental el uso de estas funciones
ya que se diferenció el fondo y la superficie de la imagen.
Segmentación
La segmentación de imágenes digitales es de interés en estudios médicos,
biológicos computacionales y electrónicos. En nuestro caso particular la
importancia se localizó en los desórdenes provocados por la hipovolemia.
La segmentación es un proceso que permite la identificación, de regiones
individuales o conjuntos de ellas dentro de la muestra, o de la región de interés.
En general es la etapa donde se lleva el proceso hacia la solución exitosa del
problema de imagen requerida, cuanto más precisa es la segmentación, se tiene
mayor posibilidad de reconocimiento de los limites o regiones buscadas. El tipo de
segmentación referenciado [15], presentó una técnica basada en filtros
morfológicos, como anteriormente se menciono estos se encuentran disponibles
en el programa Matlab.
La aplicación de filtros específicos valoró las modas locales de la intensidad de los
pixeles, para definir los centros de clase en el espacio característico. Las
características significativas que se presentaron correspondieron a las regiones
más densas. Matlab nos permitió acentuar características de la imagen mediante
la distinción de sus intensidades.
Umbralización
Por medio de la umbralización se calculó la intensidad de gris que correspondió a
cada píxel, previamente definiendo un umbral a partir del cual se saturó el color:
cuando la intensidad fue mayor al umbral la imagen de estudio se saturó a blanco,
y cuando fue menor o igual, la saturación fue a negro. Con esta técnica se buscó
un umbral con el cual se mostraron los objetos que se identificaron posteriormente
como puntos blancos de interés, y se descarto la información que no fue útil.
Antecedentes de experimentos previos, de prueba y error, determinaron que el
punto de umbralización adecuado está representado en 2350. Una vez definidos
los límites para umbralizar, el paso siguiente, para continuar con el procesamiento,
fue transformar las imágenes en blanco y negro aplicando una binarización.
Al realizar una operación morfológica con bwmorph aplicada solamente a
imágenes binarias y adicionadas con la función skel como se expone a
continuación:
Imagen skel= bwmorph(imagen preprocesada,'skel',Inf);
Se eliminaron los píxeles en los límites de los objetos, sin realizar una ruptura de
ellos, originando que los píxeles restantes conformen el esqueleto de la imagen,
proporcionándonos información de la topología y la estructura del objeto de
nuestro interés. Al utilizar bwmorph, se dividió la imagen en dos subcampos
distintos. Una subiteración eliminó cierta cantidad de píxeles desde el primer
subcampo, otra subiteracion eliminó otra cantidad de píxeles en el segundo
subcampo, en conjunto esto formó una iteración del algoritmo de adelgazamiento,
que cuando se especifica un número infinito de iteraciones (n = Inf), estas se
repetirán hasta que la imagen deja de cambiar.
Posterior al adelgazamiento con la operación bwmorph y skel, por referencia se
empleó la función “clean” la cual removió posibles artefactos que pudieron haber
variado nuestro análisis, es decir se eliminaron los pixeles aislados con valor de 1
rodeados por 0, que generalmente podrían ser producto del ruido de la imagen.
Dilatación y Erosión
Se denominan erosión y dilatación a dos operaciones complementarias que se
realizan sobre las imágenes binarias y que consisten en la eliminación o
incremento de una fila de pixeles alrededor de un objeto. La operación de erosión
consiste en eliminar los pixeles del anillo superficial de un objeto, el criterio para la
erosión radica en buscar los pixeles marginales con valor lógico 1 que tengan un
vecino con valor lógico 0, dando como resultado que el valor lógico cambie de 1 a
0. Así mismo se entendió a la dilatación como la adición de una fila marginal de
pixeles a los objetos de una imagen binaria, este operador es comúnmente
conocido como relleno o crecimiento. Puede ser usado para rellenar 'huecos' de
tamaño igual o menor que el EE con el que se operó, es decir se adicionan pixeles
al contorno de objetos presentes en la imagen, la función busca pixeles diferentes
de la vecindad incluido el central, definido por el tamaño y forma del EE,
sustituyendo el valor del pixel por el máximo valor, ejecutando este procedimiento
para cada uno de los pixeles existentes en la imagen de estudio [16]. Matlab
dispone de la función close, la cual ejecuta una dilatación seguida de una erosión,
utilizando el mismo EE en ambas operaciones, el resultado de aplicar dilataciones
y erosiones de manera repetida fue la eliminación del detalle específico en la
imagen menor que el EE, sin una distorsión geométrica global. Al aplicar 'close' a
la imagen con un EE en forma de disco prescindimos de pequeños agujeros y se
rellenaron huecos suavizando contornos y excluyendo pequeños huecos negros
existentes.
Etiquetado y Cuantificación de objetos
La cuantificación nos otorgó la información que permitió evaluar nuestra segunda
hipótesis, que finalmente fue corroborada con el diagnóstico arrojado después del
análisis de las biopsias histológicas.
Al realizar el etiquetado se considero que en una imagen binaria, un objeto es un
conjunto de píxeles conectados con valor 1, mientras que el resto de la imagen fue
considerada como el fondo con valor 0. La distinción de objetos depende de la
conectividad usada, si utilizamos está conectividad como un parámetro se debe
tomar en cuenta que variará el resultado final del procesamiento, puesto que
puede dar origen a objetos nuevos [16]. Lo anterior se tomo en cuenta,
concluyendo que la mejor conectividad que cumple con la perspectiva prevista fue
la 4 (usada en Matlab), debido a que proporcionó una mayor cantidad de objetos
presentes y no una aglomeración mayor de pixeles en la imagen.
Tomando como entrada una imagen con matriz (m, n), la función bwlabel de
Matlab hizo un recorrido a través de toda la imagen de manera horizontal y de
manera vertical, este recorrido se realizó tomando vecindades de 2x2 pixeles lo
cual nos dio como resultado el análisis de 4 pixeles en cada avance. Esta función
efectuó un etiquetado de los componentes existentes en la imagen binaria, así
mismo con la función max(max(numObjects)) se cuantificó el número de pixeles
por área representativa.
3. OBJETIVOS
Objetivo general
Relacionar los cambios de impedancia gástrica con el daño tisular observado en
imágenes de endoscopía confocal en un modelo de choque hemorrágico en
cerdos.
Objetivos específicos
Realizar una comparación entre el daño tisular observado a través del análisis
histológico convencional con las imágenes obtenidas del endoscopio confocal.
Generar un índice de cuantificación del daño tisular gástrico en las imágenes
obtenidas con el endoscopio confocal.
Efectuar una comparación en los cambios observados en los espectros del
dispositivo de impedancia contra el daño tisular, tras la cuantificación.
4. HIPÓTESIS
El conteo de regiones blancas observadas mediante el endoscopio confocal en
choque hipovolemico, será mayor en comparación al grupo en estado basal, y
estará relacionado con los estudios histológicos y con la variación de los espectros
de impedancia.
La cuantificación generada por el procesamiento de imágenes proporcionará un
valor indicador de lesiones derivado de infiltración por hipoperfusión e isquemia.
METODOLOGÍA
Diseño pre‐clínico de un filtro de imágenes
El conteo de regiones blancas observadas mediante un endoscopio confocal en un
choque hipovolémico asociado a isquemia, se realizó al procesar las imágenes
utilizando el paquete comercial Matlab. Se desarrolló y programó un algoritmo
para el conteo de regiones, presentado en el anexo 1 del presente. Este algoritmo
fue diseñado con imágenes obtenidas de estudios previos con el endoscopio
confocal. Las series de imágenes confocales proporcionadas, se segmentaron en
base a su intensidad de grises mediante funciones de Matlab, que también nos
permiten cuantificar el número de área representativa, diferenciando entre los
matices intensos y claros dentro de la escala de grises.
Descripción general y justificación del procedimiento experimental
Para realizar una exploración endoscópica confocal, para medir impedancia
eléctrica y caracterizar el daño en la mucosa gastrointestinal; se utilizaron dos
dispositivos con características específicas. Por un lado el endomicroscopio
confocal laser de Pentax modelo EC-3870CIFK con un diámetro de 12.8 mm, y por
otro la sonda de espectro-metría de impedancia con un diámetro de 5.3 mm,
ambos dispositivos son del tamaño necesario para ser usados en humanos; bajo
estas condiciones necesitamos un modelo animal con sistema gastrointestinal
relativamente semejante en tamaño y en sus propiedades fisiológicas al del
humano. Una óptima selección es considerar a los cerdos, dado que tienen un
sistema gastrointestinal semejante al del humano. El procedimiento quirúrgico y la
colocación de las sondas del espectrómetro requieren de un espécimen fuerte y
grande como los cerdos. Si las hipótesis planteadas en este documento se logran
confirmar, posteriormente se puede escalar a un protocolo similar en humanos.
Definición de la población para experimentación
Criterios de inclusión: Cerdos criados en bioterio para experimentación con un
peso entre 20-30 Kg. Con estudios de laboratorio previos al procedimiento
experimental que demuestren que estén sanos. Y ayuno de por lo menos 12h para
asegurar que el estómago se encuentre libre de alimento para poder realizar las
mediciones de impedancia, la toma de imágenes confocales y de biopsias.
Criterios de exclusión: Los cerdos que mueran durante la inducción del estado de
choque. Cerdos que no entren en estado de choque. Cerdos con menos de 20 Kg
por la dificultad para la realización del experimento.
Criterios de eliminación: no cumplir el ayuno. Cerdos que no estén sanos o que
presenten daño de la mucosa gástrica en el estado basal.
Ubicación del procedimiento experimental
El procedimiento experimental se realizó en el quirófano del CI3M de la UAM-I, en
este centro de investigación se tuvo el apoyo clínico y técnico de personal con
experiencia en el manejo de estos especímenes.
El procesamiento de las biopsias obtenidas se realizó con la técnica de
histológica tradicional y se llevó a cabo en el Laboratorio de Neurobiología Tisular,
del Departamento de Biología de la Reproducción, División de CBS, UAM-I.
El análisis de los espectros de impedancia y el procesamiento de imágenes se
realizó en una computadora que dispone del software de Matlab y el software del
Espectrómetro.
Diseño estadístico para el muestreo
Se efectuaron 6 experimentos en cerdos. A todos los animales se les colocó una
sonda de impedancia experimental, sensores para monitoreo de signos vitales, un
Swan Ganz y un endoscopio confocal. Se realizaron perfiles hemodinámicos y
gasometrías arteriales cada hora. Cada animal de experimentación fue su propio
control.
Primeramente en el tiempo basal, se le efectuaron mediciones de impedancia y
se adquirieron imágenes de la mucosa gástrica sin la inducción de algún tipo de
choque o desestabilización hemodinámica. Durante la exploración endoscópica se
tomaron las biopsias basales antes de realizar cualquier intervención.
Posteriormente se generó un choque hemorrágico mediante el desangrado por vía
femoral, cuando los niveles de pH disminuyeron, se registraron las mediciones de
impedancia. Se llevó a cabo la adquisición de imágenes confocales y de biopsias
para análisis histológico.
Finalmente se tomaron las últimas mediciones de impedancia post mortem y las
biopsias finales, junto con sus respectivas imágenes confocales.
Preparación pre quirúrgica
Se revisó el tiempo de ayuno de todos los cerdos y las condiciones en las que
llegaron a la UAM-I, incluyendo sus análisis clínicos. A los cerdos se les conservó
en ayuno de sólidos por lo menos 12 horas previas al experimento. Se les dejó
libre acceso a agua con azúcar para disminuir el estrés.
Antes de iniciar los experimentos se bañó y se pesó a los cerdos, confirmando que
su peso fuera entre los 20-30 Kg.
Se tranquilizó a cada cerdo. La dosis del tranquilizante fue una inyección
intramuscular de Sural de 1 mL / 20 kg. Después de cinco minutos, se le aplicó
una dosis de Zoletil de 0.075 mL / kg, también vía intramuscular. Una vez que el
medicamento hizo efecto, aproximadamente después de cinco minutos, el animal
se llevó a la sala de operaciones.
Diseño experimental
Después de que el animal se inmovilizó sobre la mesa quirúrgica, se completó la
preparación:
Se insertó el tubo endotraqueal por una traqueotomía para iniciar la anestesia
inhalada y la ventilación mecánica. La ventilación mecánica fue ajustada para
mantener una PO2 alrededor de 70 mmHg.
Se introdujo el catéter Swan-Ganz por medio de la vena femoral, con el cual se
llevó a cabo la medición del gasto cardiaco y las presiones arteriales pulmonares.
Se colocó una línea arterial vía femoral.
A consecuencia de la anestesia y al procedimiento de sangrado, la temperatura
del cerdo bajó. Para evitar el enfriamiento del animal, se colocó un sistema de
calentamiento térmico abajo y alrededor del cerdo. Así como un termómetro vía
rectal.
La anestesia se mantuvo con una combinación de Isofluorano como agente
inhalado y Zoletil vía intravenosa (IV) en dosis de 0.02 mL / kg conforme se
necesitó.
Tiempo basal
Para relacionar cambios tisulares obtenidos con las diferentes técnicas utilizadas
en el proyecto fue importante que las biopsias, las mediciones de impedancia y la
captura de imágenes se realizaran de la misma área.
Cuando se estabilizó al cerdo, se tomaron las mediciones fisiológicas: signos
vitales, gasto cardíaco, gasometría arterial y venosa.
El siguiente paso fue la introducción del endoscopio confocal vía orogástrica
hasta el antro gástrico. Y se almacenaron una serie de imágenes endoscópicas de
las condiciones gástricas obtenidas durante la exploración. Y se realizaron dos
tomas de biopsias vía endoscópica, etiquetándolas para tiempo basal.
A continuación se introdujo y se colocó la sonda de espectroscopía mediante una
incisión en el estómago, y posteriormente se fijó a la pared gástrica. Gracias a las
bondades de la endoscopia se confirmó la colocación interior de la sonda, en la
imagen 1 se muestra la punta de la sonda y el contacto de los electrodos a la
pared del antro, cerca de la zona de biopsias.
Imagen 1. Confirmación vía
endoscópica de la colocación de la
punta de la sonda de espectroscopía,
en la parte del antro, cerca de la zona
de biopsias.
Los espectros de impedancia fueron almacenados en una computadora para su
posterior procesamiento.
Luego se administró el agente de contraste. La dosis que se aplicó fue de 0.02%
de acriflavina disuelta en agua salina para la administración tópica y de 10μL/g del
peso corporal de fluorosceína para la aplicación sistémica [11].
Posteriormente se posicionó el endoscopio confocal vía orogástrica hasta el antro.
Para adquirir y almacenar un paquete de imágenes.
Choque hemorrágico
Concluidos los pasos de almacenamiento de imágenes, toma de biopsias y
registro de los espectros de impedancia; se inició el sangrado por la vena femoral.
El animal fue desangrado a razón de 20 cc/min hasta que la presión arterial media
(PAM) cayó con referencia al estado basal, entre un 20 y 30%. Se consideró
como el tiempo de isquemia, cuando el pH arterial o cuando el gasto cardiaco
disminuyeron.
Se tomaron medidas fisiológicas: gasto cardíaco, presión arterial, gasometría
arterial, venosa y signos vitales.
Se identificó la zona que estuvo en contacto con la punta distal del endoscopio y
se realizó la toma de biopsias vía endoscópica, etiquetando para isquemia.
Se registraron y almacenaron los espectros de impedancia.
Tiempo de muerte
Cuando el animal estuvo en choque descompensado, se tomaron medidas
fisiológicas: signos vitales, gasto cardíaco, presión arterial, gasometría arterial y
venosa.
Se realizó la toma de biopsias vía endoscópica, posterior a la identificación de la
zona que estuvo en contacto con la punta distal, y se etiquetó para tiempo de
muerte.
También se registraron y almacenaron los espectros de impedancia.
Completados todos los registros, se realizó la eutanasia administrando vía
intravenosa solución de KCl.
Almacenamiento de información
Almacenamiento de espectrometría: La información almacenada en el software del
equipo generó una base de datos que fue exportada y depurada en un ambiente
de trabajo de Microsoft Office Excel y posteriormente se procesó con el algoritmo
para generación de parámetros de impedancia definido por Beltrán N. et al. [8].
Almacenamiento histológico: El especialista en histología sometió las biopsias a la
técnica histológica normal, teñidas con hematoxilina – eosina (H-E) para
microscopia de luz y las imágenes proporcionadas por el histólogo fueron
almacenadas en la computadora donde se realizó el procesamiento.
Análisis e interpretación de la información
La cuantificación del número de pixeles por área para las imágenes confocales se
desarrolló considerando como referencia las imágenes del modelo basal y
realizando una comparación contra las imágenes del modelo de choque y de
muerte, a través de este cotejo fue evidente y cuantificado el cambio. La aplicación
del procesamiento de imágenes se detalla en el anexo 2.
La cuantificación correspondiente a las imágenes fue relacionada con los
espectros de impedancia obtenidos en los diferentes tiempos, relacionando los
cambios de impedancia con niveles de daño tisular.
Como una aportación para el presente proyecto, se desarrolló una herramienta
para procesar imágenes histológicas, el objetivo fue realizar el conteo que permita
la comparación de regiones asociados al proceso inflamatorio, aprovechando que
una de las características que presentan estas imágenes al ser teñidas con
hematoxilina – eosina son regiones que se pintan de color rojo, producto de la
inflamación provocada por el choque hipovolémico. El algoritmo diseñado en
Matlab, realizó el conteo de las áreas de forma automática, ya que normalmente la
selección del área inflamada se realiza manualmente por un especialista la
aplicación fue satisfactoria y se detalla en el anexo 3.
5. RESULTADOS
Los cerdos incluidos en el análisis fueron 5 machos y 1 hembra. La información
relacionada a las variables fisiológicas del cerdo se registró en la hoja de registro
de eventos. Aunque los experimentos fueron controlados, dos de estos no fueron
satisfactorios por varias razones. El primero experimento fue considerado como un
estudio piloto por que el animal no estaba en ayuno por lo cual generó espectros
erróneos, y el cuarto experimento fue excluido en del análisis de espectrometría
porque tampoco se obtuvieron mediciones de impedancia. Las razones de
exclusión fueron: errores en la dieta, y el peso del animal estuvo por debajo del
mínimo, lo cual generó la muerte del animal antes de finalizar el experimento. Sin
embargo para los dos casos de exclusión se continúo con el experimento para la
toma de biopsias histológicas.
Se obtuvieron y promediaron los espectros de impedancia de la mucosa gástrica
en los diferentes tiempos: basal, isquemia y muerte.
En las siguientes gráficas (Figuras 2 y 3) se muestran los espectros de impedancia
(resistencia y reactancia) obtenidos de los experimentos bajo las 3 condiciones de
registro: basal, isquemia y muerte. Las gráficas muestran los espectros promedio
± desviación estándar (DS).
Figura 2. Resistencia promedio ± DS, para los tres tiempos.
Figura 3. Reactancia promedio ± DS, para los tres tiempos.
Con los datos de las mediciones de resistencia y reactancia, también se realizaron
los cálculos de los parámetros RL, XL, RH, XH, usando el algoritmo de cálculo de
parámetros de impedancia descrito por Beltrán N [17] y posteriormente se generó
la tabla 1 con los valores medios y desviaciones estándar por parámetro y por
tiempo.
Parámetros de
impedancia
Basal Isquemia Muerte
RL 73.52± 17.03 82.53 ± 16.20 74.55 ± 15.19
RH 41.95 ± 9.84 42.31 ± 5.96 38.52 ± 7.52
XL 4.60 ± 2.88 8.91 ± 9.02 3.99 ± 0.79
XH 10.68 ± 6.69 11.98 ± 5.75 12.05 ± 4.41
Tabla 1. Registros de los parámetros calculados en Matlab aplicando el algoritmo de
cálculo de parámetros de impedancia, con los valores medios y desviaciones
estándar por parámetro y por tiempo.
Los resultados que se realizaron de la reactancia deben considerarse como
valores negativos, esto es debido a que se invirtió el signo cuando de procesaron
lo datos con el programa Matlab.
El análisis histológico de las biopsias aún no ha finalizado, ya que es parte del
trabajo terminal de otro estudiante de biología experimental. Sin embargo aquí se
comparan cuatro de los resultados correspondientes al tiempo basal y de
isquemia, vistos con diferentes objetivos.
En la figura 4.1 se observa una microfotografía histológica del estómago de cerdo
teñida con H-E, vista con un objetivo de 40x. En la figura 4.2 se muestra la misma
imagen, pero después de que se procesó. Posterior a la aplicación del algoritmo
observamos que se removieron todas las regiones diferentes al color rojo, las
regiones prevalentes se cuantificaron para calcular su área, obteniendo 167340
pixel2 para el tiempo basal.
Figura 4.1. Imagen del estómago de
cerdo, teñida con H-E, 40x. Nótese que
el filtro detecta las regiones de mayor
intensidad al color rojo.
Figura 4.2. Imagen del estómago de
cerdo, 40x. La imagen únicamente
contiene las regiones teñidas de rojo. El
área calculada es de 167340 pixel2.
En la figura 4.3 se presenta la microfotografía del estómago de cerdo teñida con
H-E, vista a 40x y en la figura 4.4 se muestra la misma imagen, pero después de
ser procesada, el área cuantificada fue de 176940 pixel2 para isquemia.
Figura 4.3 Imagen del estómago de
cerdo, teñida con H-E, 40x. Nótese que el
filtro detecta las regiones de mayor
intensidad al color rojo.
Figura 4.4 Imagen del estómago de
cerdo, 40x. La imagen únicamente
contiene las regiones teñidas de rojo. El
área calculada es de 176940 pixel2.
En la siguiente imagen se observa en la figura 4.5 una microfotografía histológica
del estómago de cerdo teñida con H-E, vista con un objetivo de 10x, de lado
derecho se muestra la misma imagen con las regiones que se cuantificaron figura
4.6 y se obtuvo una área de 70911pixel2 para el tiempo basal
Figura 4.5 Imagen del estómago de
cerdo, teñida con H-E, 10x. Nótese que el
filtro detecta las regiones de mayor
intensidad al color rojo.
Figura 4.6 Imagen del estómago de
cerdo, 10x. La imagen únicamente
contiene las regiones teñidas de rojo. El
área calculada es de 70911pixel2.
Las siguientes microfotografías corresponden a una muestra del estómago de
cerdo teñida con H-E, vista en la figura 4.7 con un objetivo de 10x, el área
calculada en la figura 4.8 fue 87019 pixel2 para isquemia.
Figura 4.7 Imagen del estómago de
cerdo, teñida con H-E, 10x. Nótese que el
filtro detecta las regiones de mayor
intensidad al color rojo.
Figura 4.8 Imagen del estómago de
cerdo, 10x. La imagen únicamente
contiene las regiones teñidas de rojo. El
área calculada es de 87019 pixel2.
No se logró realizar la captura de imágenes confocales en estos experimentos,
porque el dispositivo solo funcionó en el primer experimento considerado como un
piloto, pero en este caso la falta de ayuno en el cerdo provocó que las imágenes
de endoscopia confocal se obtuvieran con artefactos. Como el equipo no volvió a
funcionar el algoritmo desarrollado para la cuantificación del daño fue comprobado
con imágenes obtenidas previamente en otro experimento en cerdos en donde se
generó isquemia.
La segmentación se realizó con imágenes con privación de sueño de un estudio
anterior. El umbral determinado y los resultados presentados del algoritmo de
cuantificación de imagen (ADI), parecen de acuerdo a las imágenes siguientes.
En las fotos 5.1, 5.3, se presentan la imagen que se obtuvo directamente del
dispositivo y las fotos 5.2, 5.4, son las imágenes que se procesaron, al mismo
tiempo se calculó el número de pixeles por área con el ADI. La cuantificación para
la imagen basal fue de 282 pixeles, y para muerte 1920 pixeles. Los detalles y los
resultados de la aplicación del ADI se muestran en el anexo 4.
Imagen 5.1 Región del antro gástrico de
cerdo, correspondiente a basal.
Imagen 5.2 El número de cuantificación
para esta imagen fue 282 pixeles.
Imagen 5.5 Región del antro gástrico de
cerdo, correspondiente a muerte.
Imagen 5.6 El número de cuantificación
para esta imagen fue 1920 pixeles.
Con la información obtenida se compararon los cambios de impedancia, con los
cambios en endoscopia confocal e histología, integrando la tabla 2.
Parámetros de impedancia ± DS Confocal Histología
10x 40x
RL XL RH XH [Pixeles] [Pixeles2] [Pixeles
2]
Basal 73.52 ± 7.03 4.60 ± 2.88 41.95 ± 9.84 10.68 ± 6.69 282 70911 167340
Isquemia 82.53±16.20 8.91 ± 9.02 42.31 ± 5.96 11.98 ± 5.75 87019 176940
Muerte 74.55±15.19 3.99 ± 0.79 38.52 ± 7.52 12.05 ± 4.41 1920
Tabla 2. Relación de los resultados obtenidos de la espectrometría, de la endoscopia confocal y de
las imágenes histológicas.
DISCUSIÓN
Los parámetros RL, XL, RH, XH, miden las propiedades eléctricas de los tejidos
biológicos usados para representar los valores de espectroscopia de impedancia.
Cuando la impedancia cambia rápidamente en un pequeño rango de frecuencia,
se dice que se ocasiona una región de dispersión del tejido biológico, en donde
RL, XL significan el máximo local a bajas frecuencias, así mismo que RH, XH es el
máximo local a altas frecuencias en el diagrama de Nyquist. Considerando que R
es la resistencia del tejido al paso de la corriente inyectada, y X es la reactancia
tisular la cual mide la capacitancia existente en la membrana. La espectroscopia
de impedancia puede utilizarse para supervisar cambios de volumen. La
impedancia del tejido a frecuencias bajas sólo es influenciada por el flujo
extracelular, mientras que la impedancia del tejido a frecuencias altas es
influenciada por el flujo intercelular y extracelular [18]. Los parámetros de
resistencia y reactancia obtenidos en este trabajo para bajas frecuencias
presentaron valores de 73.52Ω ± 7.03, y 4.60Ω ± 2.8 (valor promedio ± desviación
estándar) respectivamente; y para altas frecuencias un valor de 41.95Ω ± 9.84, y
10.68Ω ± 6.69, respectivamente. Los resultados concuerdan con los valores
reportados previamente en humanos sanos [7], aun cuando la morfología no es
exactamente igual a la reportada en ese caso. Creemos que el cambio en
morfología se debe la variación de las características eléctricas convenidas a la
especie.
Los valores adquiridos de los parámetros en resistencia y reactancia en la etapa
de isquemia, a bajas frecuencias fueron de 82.53Ω ± 16.20 y 8.91 Ω ± 9.02, y a
altas frecuencias de 42.31 Ω ± 5.96 y 11.98 Ω ± 5.75, respectivamente.
Considerando que estos valores representan un cambio significativo, este
incremento fue por alteraciones inducidas por el proceso hipovolémico que
provocó que aumentara la resistencia a nivel celular. Las variaciones de los
parámetros de impedancia se apreciaron en dos regiones de frecuencias
específicas, lo que demostró que el daño por isquemia no progresa linealmente a
lo largo de toda la pared gástrica, observando que la región de mayor dispersión
se centra a bajas frecuencias, este comportamiento se observó gráficamente en
las figuras 2 y 3, su cuantificación fue representada con el promedio de los valores
para los cuatro parámetros de impedancia. Aún cuando XL aumentó casi al doble
respecto al valor basal, es un valor considerado como “normal” en el caso de
humanos [7]. Observamos que el los espectros en cerdos, los valores más bajos
de reactancias se observan a altas frecuencias, a diferencia del tejido humano en
donde las reactancias más bajas ocurren a bajas frecuencias. Esto ya había sido
reportado por el grupo de investigación previamente y es claro que en el modelo
animal los cambios asociados a edematización son menores que los reportados
para humanos.
Se piensa que las muestras histológicas tomadas durante la etapa de isquemia
presentarán manifestaciones de un proceso inflamatorio provocado por el choque
hipovolémico, debido a una reacción aguda causada por la relajación vascular de
los músculos que recubren el estómago. Las muestras histológicas teñidas con
hematoxilina – eosina reflejarán: incremento de la permeabilidad endotelial,
aumento de la dilatación vascular en comparación a la etapa basal, adherencias
moleculares, y un incremento en la motilidad de sangre vascular [19].
En las microfotografías de cortes longitudinales presentadas en este proyecto, se
observa un incremento (18.5 %) de la cuantificación de área realizada con el
algoritmo para imágenes histológicas con un objetivo de 10X, mientras que para el
objetivo de 40X fue del 5.1 % iniciando en tiempo basal y alcanzando un máximo
para el tiempo de isquemia. Lo que nos permitió considerar como un patrón
estándar al comparar imágenes vistas con el mismo objetivo del reporte
histológico.
Es importante resaltar que dentro de los incrementos comparados de los
parámetros de impedancia entre la etapa basal y de isquemia, la reactancia a baja
frecuencia (XL) fue la más sensible, registrando el inicio de la etapa de edema
celular. XL mide el volumen de la capacitancia de la membrana celular, siendo una
medida indirecta del volumen intracelular, por ende es sensible a los cambios en
volumen.
Como se mencionó previamente, diversas circunstancias causaron pérdida de
registros de impedancia para la etapa de muerte, por tal motivo cabe la posibilidad
de buscar una técnica vía endoscopica que mejore el contacto de la punta distal
de la sonda con la mucosa gástrica para evitar errores de contacto. Los
parámetros de impedancia obtenidos en el tiempo de muerte parecieran regresar a
los valores basales, excepto para XH, en donde si se presenta un ligero aumento
en el caso de muerte. Hay que tomar estos resultados con cuidado ya que
obtuvieron menor número de registros que en los otros tiempos ya que la sonda se
movió durante el experimento. El sangrado y toma de biopsias, así como el
alimento que aún se encontraba en el estómago dificultó el proceso de toma de
datos. Al estar entrando al estómago con el endoscopio para tomar las biospias,
se llenaba el estómago de aire y agua, lo cual movía el contenido de alimento
restante dentro del animal, y cada vez dificultaba más la toma de espectros, los
cuales se ven alterados en todas estas condiciones.
El hecho de que la impedancia cambie en XH indica que si hubo un daño de la
membrana y no sólo edematización, que es lo que más se observa en el caso de
los humanos. Sería recomendable poder reproducir estos resultados para
asegurar que relamente si hay un daño de la mucosa, lo cual se espera confirmar
al finalizar los análisis histológicos.
Las necesidades asociadas al uso del endoscopio confocal en condiciones
clínicas, permitió realizar un algoritmo para procesamiento de sus imágenes y
también se logró la caracterización del algoritmo para procesamiento de imágenes
histológicas. Ambos permitieron la cuantificación de regiones y de áreas de
manera automática. Si bien se probaron con un conjunto de imágenes obtenidas
previamente, los resultados muestran que el algoritmo si detecta cambios en
condiciones clínicas diferentes. Hay que seguirlo probando y ajustarlo de ser
necesario. Para obtener mejores resultados en este procesamiento se recomienda
sólo trabajar con imágenes .tiff ya que los otros formatos que entrega el confocal
distorsionan la imagen y generan pérdida de información.
CONCLUSIÓN
En este trabajo se validó el funcionamiento del sistema de espectroscopía de
impedancia gástrica y el dispositivo de endoscopia confocal en condiciones
clínicas inducidas, observando problemas asociados a su uso, ya que es dificil
utilizar las dos herramientas de manera simultánea. Así mismo se generaron dos
algoritmos para cuantificar pixeles presentes en imágenes confocales y áreas del
proceso inflamatorio en imágenes histológicas, los cuales podrán ser utilizados en
trabajos futuros, tratando de estandarizar el proceso de interpretación de las
imágenes y cuantificación del daño de la mucosa.
Se caracterizaron los espectros de impedancia compleja, cuantificando el daño
producido por la isquemia. Se encontró repetitividad en los incrementos de las
mediciones en las mismas condiciones de registro.
La hipótesis de que el conteo de regiones blancas observadas mediante un
endoscopio confocal en un choque hipovolémico, sería mayor en comparación al
grupo en estado basal, y estaría relacionado con los estudios histológicos y con la
variación de los espectros de impedancia; no pudo ser confirmadas en este
experimento debido a las fallas del confocal, las cuales impidieron la captura de
imágenes in vivo. Sin emabrgo, la cuantificación generada por el procesamiento
de imágenes a partir de estudios previos proporcionó un indicador de lesiones
derivado de infiltración, lo cual será confirmado con los resultados histológicos que
son parte de otro proyecto de titulación.
REFERENCIAS:
[1]. Guyton C. Arthur, Hall E. John, “Shock circulatorio y fisiología de su tratamiento,”
Tratado de Fisiología Medica, 11va. ed., Ed. Elsevier, Madrid, España, 2007, pp. 278-284. [2].
Gutiérrez G. et al., “Clinical review: Hemorrhagic shock, Critical Care Medicine”,
BioMed Central Ltd, doi: 10.1186/cc2851, 2004, pp. 373 - 381.
[3]. Rigaud B. et al., “Bioelectrical impedance techniques in medicine. Part I: Bioimpedance
measurement. Second section: impedance spectrometry”, Critical Reviews in Biomedical
Engineering, 1996, pp 4-6.
[4]. Kyle A. et al., “Characterization of three-dimensional tissue cultures using electrical
impedance spectroscopy”, Biophys. J., doi: 10.1016/S0006-3495(99)77416-3, 1999, pp 2640-
8.
[5]. González CA, Villanueva C, Othman S, Narváez R, Sacristán E.Othman S.,
“Impedance spectroscopy for monitoring ischemic injury in the intestinal mucosa”, Physiol
Meas, doi:10.1088/0967-3334/24/2/304, 2003, pp. 277-289.
[6]. Sacristán Rock E. “Impedance spectroscopy method for monitoring ischemic mucosal
damage in hollow viscous organs,” U.S. Patent No. 6 965 795, 2010.
[7]. Beltran N. et al., “Gastric impedance spectroscopy in elective cardiovascular surgery
patients”, Physiol. Meas., doi:10.1088/0967-3334/27/3/005, 2006, pp 265–277.
[8]. Beltran N. et al., “Systems and methods for characteristic parameter estimation of
gastric impedance spectra in humans,” U.S. Patent 61160409, 2009.
[9]. David J. Stephens et al., “Light Microscopy Techniques for Live Cell Imagin”, American
Association for the Advancement of Science. doi: 10.1126/science.1082160
, 2003.
[10]. Goetz M., “In-vivo confocal real-time mini-microscopy in animal models of human
inflammatory and neoplastic diseases”, Endoscopy, 2007, pp 350-6.
[11]. Goetz M. et al., “In vivo subsurface morphological and functional cellular and
subcellular imaging of the gastrointestinal tract with confocal mini-microscopy”, World J.
Gastroenterol, 2007, pp. 2160-2165.
12]. Cediel Fernando J. et al., “Técnicas histológicas,” Manual de Histología tejidos
fundamentales, 1ra. ed., Bogotá, Colombia, Ed. Universidad del Rosario, 2009, pp 36.
[13]. Montuenga L., “Tinciones más utilizadas,” Técnicas en Histología y Biología Celular,
Barcelona, España, Ed. Masson, 2009, pp 75.
[14]. González Rafael C., Woods Richard. “Tratamiento digital de imágenes”, Ed. Addison-
Wesley, E.U.A., 1996, pp 1-56.
[15]. S. Mukhopadhaya and B. Chanda, “A Multiscale Morphological Approach to Local
Contrast Enhancement”, Signal Processing, vol. 80 (4), 2000, pp. 685-696,
[16]. Pertusa Grau J.F., Procesado de la imagen binaria, “Técnicas de análisis de imagen
aplicaciones en biología”, Ed. Universitat de valencia Servei de publicacions, 2003, pp 195-
202,
[17]. Beltran NE et al., “The predictive value of gastric reactance for postoperative morbidity
and mortality in cardiac surgery patients” Physiol Meas, 2010, 31(11):1423-36.
[18]. González CA et al., “Análisis biomédico de la espectroscopia de impedancia: Una
nueva herramienta en cuidado crítico” Rev Sanid Milit Mex 2004; 58(5): 404-410.
[19]. Barbara Young, et al., “Wheater's Basic Pathology: A Text, Atlas, and Review of
Histopathology”, Livingstone/Elsevier, 2011 pp 10.
6. ANEXOS
Anexo 1
A continuación se presenta el algoritmo para filtrar imágenes digitales.
Se observa el código a usar en la plataforma Matlab, aplicado a imágenes
endoscópicas confocales. Nombrado como algoritmo de Imagen (ADI).
afm = imread('experimento.tif'); se = strel('disk', 70); Itop = imtophat(afm, se); Ibot = imbothat(afm, se); Ienhance = imsubtract(imadd(Itop, afm), Ibot); figure, imagesc([afm Ienhance]), colormap gray, colorbar It1=Ienhance>2350; figure, imagesc(It1), colormap gray, colorbar BW3 = bwmorph(It1,'skel',Inf); figure, imagesc(BW3), colormap gray, colorbar BW4 = bwmorph(BW3,'clean',Inf); figure, imagesc(BW4), colormap gray, colorbar BW5 = bwmorph(BW4,'close',Inf); figure, imagesc(BW5), colormap gray, colorbar [labeled,numObjects] = bwlabel(BW5,4); max(labeled(:))
Anexo2
Aplicación del procesamiento de imágenes confocales.
La cuantificación se inició guardando las imágenes obtenidas del endoscopio
confocal en una computadora que disponía del software Matlab. Las imágenes se
almacenaron con la ruta C:\Archivos de programa\Matlab\R2011\bin con este paso
se le indicó a Matlab la ubicación. Posteriormente abrimos Matlab para ver todas
las imágenes con extensión .TIF almacenadas, en la ventana Current Folder
ubicada de lado izquierdo de la pantalla de Matlab, donde se muestran los
nombres de las imágenes. Para ilustrar este paso en la imagen siguiente se
muestran algunos ejemplos de imágenes nombradas 4577_2_he_96_10x.tif,
4577_2_he_96_40x.tif, Rcontrol100061.tif, etc., señaladas en el marco negro.
Nos posicionamos en Command Window, copiamos y pegamos el algoritmo ADI y
corroboramos el nombre de la imagen y luego ejecutamos el algoritmo. La
siguiente imagen muestra un ejemplo que ilustra la aplicación. Señalados en
marcos negros.
Después de la aplicación obtendremos cinco figuras resultado del ADI, cada
imagen está representada en el anexo 4;
1. Las imágenes A, F, K, muestran imágenes confocales procesadas, podemos
percibir entre el fondo y la superficie de la imagen luego de aplicar Ienhance =
imsubtract (imadd (Imagen original, imtophat ), imbothat );
2. En las imágenes B, G, L, se binarizaron las imágenes en proceso, utilizando la
umbralización.
3. Las imágenes C, H, M, se obtuvieron después de aplicar el comando BW3=
bwmorph(It1,'skel',Inf); Se eliminaron los píxeles en los límites de los objetos,
sin realizar una ruptura de ellos, originando que los píxeles restantes
conformen el esqueleto de la imagen, proporcionándonos información de la
topología y la estructura del objeto de nuestro interés.
4. En las imágenes D, I, N, se eliminaron los pixeles aislados, que generalmente
podrían ser producto del ruido de la imagen. Aplicando BW4 =
bwmorph(BW3,'clean',Inf);
5. En las últimas imágenes E, J, O, se aplicó la dilatación y la erosión, mediante
BW5 = bwmorph(BW4,'close',Inf);
En la parte inferior de Command Window aparecerá el número de cuantificación
etiquetado como ans (para el ejemplo anterior ans=282) este número representa
la referencia que se desea comparar. Ver el valor en la imagen anterior dentro del
marco negro.
Anexo 3
Algoritmo para realizar el conteo de inflamación por áreas.
Se inicia el procesamiento almacenando todas las imagen en C:\Archivos de
programa\Matlab\R2011\bin, con este paso podremos visualizar el nombre de la
imagen que guardamos en la ventana Current Folder de Matlab. Luego copiamos
el código siguiente:
Se observa un ejemplo con el código a usar en la plataforma Matlab, aplicado
a imágenes histológicas.
im = imread('4579_2_he_24_10x.tif');
se = strel('disk', 70);
Itop = imtophat(im, se);
Ibot = imbothat(im, se);
I=imsubtract(imadd(Itop, im), Ibot);
gris=rgb2gray(I);
imR=double(I(:,:,1));
imG=double(I(:,:,2));
imB=double(I(:,:,3));
imR2=(imR-imG-imB);
masc=(imR2>99);
imR2=imR2.*masc;
imR2=medfilt2(imR2);
imR2=imR2/255;
imR3=imadjust(imR2,[],[],0.000001);
Area=bwarea(imR3)
figure,imshow(I,[]);title('Rata 2 HE 24 10x');
figure,imshow(imR3,[]);title('Rata 2 HE 24 10x');
Ahora abrimos Matlab y pegamos el código anterior. Debemos confirmar que el
nombre que aparece de lado izquierdo es el mismo que se señala en Command
Window. Como se marca en los cuadros negros de la imagen siguiente.
Las siguientes imágenes muestran un ejemplo para ilustrar la aplicación, de lado
izquierdo una microfotografía histológica del estómago de cerdo teñida con H-E,
vista con un objetivo de 40x, y la imagen de lado derecho muestra la misma
imagen, pero después de ser procesada, está imagen contiene las regiones que
se cuantificaron para calcular su área después de correr el algoritmo. En Matlab
obtendremos la imagen histológica (ver figura A) y en la segunda figura se
muestran las regiones teñidas de color rojo (ver figura B), este algoritmo remueve
todas las regiones que sean de otro color. El área en pixeles cuadrados se
muestra en la imagen anterior marcada en un cuadro verde en la ventana
Command Window.
Figura A. Imagen del estómago de cerdo,
teñida con H-E, 40x. Nótese que el filtro detecta
las regiones de mayor intensidad al color rojo.
Figura B. Imagen del estómago de cerdo,
40x. La imagen únicamente contiene las
regiones teñidas de rojo. El área calculada es
de 70911pixel2.
Anexo 4
A F K
B G L
C H M
D I N
E J O
La serien de imágenes A, B, C, D, E son el resultado obtenido de una imagen en tiempo
basal, y la serie F, G, H, I, J son del tiempo de isquemia, finalmente la serie K, L, M, N, O
pertenecen a el tiempo muerte.
