霍乱的实验室检测

什么是霍乱什么是霍乱 ?? 霍乱是由 01 群和 0139 群霍乱弧菌（ V ． choler

ae ）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。

霍乱概述霍乱概述

古典生物型 小川型 Ogawa (AB) O1 群 稻叶型 Inaba (AC) 埃尔托生物型 彦岛型 Hikojim (ABC)

霍乱弧菌 霍乱病原菌

O139 群（ Bengal ） 非 O1 群 O2-O200 群

腹泻病原菌

毒 素 霍乱肠毒素(CT) ：前噬菌体基因编码 小带联结毒素 Zot 增加肠黏膜通透性 副霍乱肠毒素 Ace 肠段积液

侵袭力 鞭 毛 菌毛： acf 、 tcpA

致病物质

CT 的结构

B 亚单位：与小肠粘膜上皮细胞 GM1神经节苷脂受体结合；

由 1 个 A 亚单位和 5 个 B

亚单位构成的多聚体，不耐热。（前噬菌体基因编码）

1A+5B

所致疾病：烈性肠道传染病霍乱传染源 : 病人 / 无症状带菌者 , 人是霍乱弧菌的唯一易感

者传播途径：粪 - 口途径 流行特征：地方性、季节性。

霍乱典型临床特征

患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”。

并发症有血容量减少， 循环衰竭及肾功能衰竭，导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。

免疫性

感染后可获牢固免疫力；再感染少见

局部黏膜免疫；抗菌抗体（ O ）；抗毒素抗体（ B ）

O1 群与 O139 群不存在交叉免疫保护作用。

病原体 病原体 O1 群， O139 群霍乱弧菌 发病特征：发病特征： 剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到 20 － 50 ％（重症病人达 7

0 － 100 ％） 培养特性：培养特性： 营养要求不高，兼性厌氧，营养要求不高，兼性厌氧， 37℃37℃生长，怕酸嗜碱， 生长，怕酸嗜碱， pH:7.4-9.6快速

生长 检验依据：检验依据： WS 289-2008 《霍乱诊断标准》 霍乱防治手册（ 1999年第五版）

霍乱的实验室检测霍乱的实验室检测 样品的采集和运输样品的采集和运输不同样品的病原分离流程及技术要点不同样品的病原分离流程及技术要点 粪便粪便 水体水体 水产品，食品等水产品，食品等平板分离及可疑菌落挑取平板分离及可疑菌落挑取菌落鉴定菌落鉴定常用快速检测方法常用快速检测方法 胶体金检测条胶体金检测条 荧光荧光 PCRPCR 检测检测检测工作中应关注的事项检测工作中应关注的事项

样品的采集和运输样品的采集和运输采集：采集： 病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品…… 监测：水样，水产品等

运输：运输：一般要求在 3 小时内室温（ 20-25 ℃ ）条件下送达实验室检测 C-B运输培养基（ pH8.4） ; （或文腊二氏保存液） 碱性蛋白胨水（ pH8.4-9.2 ） ：不是最佳的，尤其 6小时内还不能进行培养时，尽量采用 C-B运输培养基。

粪便的采集与保存运送 粪便的采集与保存运送 以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取 1～ 3mL，成形便采取指甲大小的

粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内 3～ 5cm处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（ＰＨ8.６ -9.2 ），同时划线分离选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为 1∶5 。

分离培养要点（两管三板法）：分离培养要点（两管三板法）： 挑取粪便，直接接种于挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取 0.1～ 0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。

第二管第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第三板）。

粪便分离流程及技术要点粪便分离流程及技术要点

水体的采集与保存运送 水体的采集与保存运送 水体的采集一般用无菌的 500ml 水样瓶采集相对静止的表层水 ( 深度为 30cm以内 )500ml ，密封加盖后于室温（ 20-25 ℃ ） 3 小时内送达实

验室检测。

分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：　 取 450ml 水样，用 1M 氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2 。然后加 10倍浓缩

碱性胨水 50ml 。再加入 1%亚碲酸钾 0.25～ 0.5 ml 和 1000 单位 / ml青霉素 1 ml 。 37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸 0.1～ 0.2 ml表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌， 37℃培养 6～ 8h 再划线接种于选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。

水体分离流程及技术要点水体分离流程及技术要点

水产品的采集与保存运送水产品的采集与保存运送 通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置

涂抹采集： 使用无菌棉签涂抹 5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到 20ml 碱性蛋白胨水作为增菌液处理。

整体或局部采集： 在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物 25克剪碎后，置灭菌均质杯或均质袋中，

加入 225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入 100ml三角瓶中，加入 5-10倍的碱性蛋白胨水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入 100ml三角瓶中，加入 5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。

分离培养（两管两板法）：分离培养（两管两板法）：　 接种后的碱性蛋白胨水 37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸 0.1～ 0.2 ml表层培养物转种于 10ml 碱性胨水管中作二次增菌， 37℃培养 6～8h 再划线接种于选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。

水产品分离流程及技术要点水产品分离流程及技术要点

可疑菌落挑取可疑菌落挑取 经典的鉴定步骤要求每个平板应经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取挑取 55 个以上个以上可疑菌落可疑菌落 ,,转种于克氏双糖斜面或者转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后普通琼脂斜面待分纯培养后 ,, 再进行再进行 O1O1 、、 O139O139 群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱群血清玻片凝集试验，鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑疫情应急处理的考虑 ,, 现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法 ,,作为快速筛查的手段作为快速筛查的手段 ,,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验 ,, 出现明出现明显凝集时可做初步报告显凝集时可做初步报告 ,,对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面或者普通琼脂斜面 ,,待纯培养物生长良好后再次进行玻片凝集试验加以确证。待纯培养物生长良好后再次进行玻片凝集试验加以确证。

庆大霉素平板和庆大霉素平板和 44 号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。

TCBSTCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。稍凸起、边缘整齐。 （ TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集试验，需按玻片凝集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）

平板分离及可疑菌落挑取平板分离及可疑菌落挑取

霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。 (菌落呈现无色 、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐，由于亚碲酸钾的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）

Ｏ１３９型霍乱弧菌在４号平板和ＴＣＢＳ上的菌落形态

染色镜检染色镜检 革兰染色阴性的短杆菌革兰染色阴性的短杆菌

血清凝集试验血清凝集试验：：　 分别使用分别使用 O1O1 群，群， O139O139 群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照凝集，以排除与生理群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。盐水发生凝集的自凝菌。

生理盐水不凝集，生理盐水不凝集， O1O1 群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验，判定群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试菌落为小川型，如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些小川型菌落自身会带有少量的量的 CC抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。应维持小川型的判定。

生理盐水不凝集，生理盐水不凝集， O139O139 群血清明显凝集的菌落，一般为群血清明显凝集的菌落，一般为 O139O139 群，但其与群，但其与 O22O22 群及群及 O155O155 群甚至一群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行进一步确认。

菌落鉴定菌落鉴定

O1 群和 O139 群抗原构造与血清分型

型 别 群特异性抗原 型特异性抗原

A O139 B C

小川 + + + 少量

稻叶 + — +

彦岛 + + +

O139 — + — —

国内商品化的霍乱检测血清

国外血清：日本生研，泰国S&A 血清等

进一步实验进一步实验

氧化酶试验1 ％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液

粘丝试验0.5 ％去氧胆酸钠水溶液

生化鉴定 生化鉴定 生化鉴定管：生化鉴定管： 发酵葡萄糖、甘露醇、 蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（ + ） 精氨酸双水解酶（ - ） 霍乱弧菌生化鉴定管（霍乱弧菌生化鉴定管（ 1111种生化种生化 ,,套装，环凯）；套装，环凯）； 生化鉴定条：梅里埃生化鉴定条：梅里埃 API 20EAPI 20E鉴定条等鉴定条等 全自动生化检测仪检测：梅里埃全自动生化检测仪检测：梅里埃 VITEK2 COMP VITEK2 COMP 全自动生化鉴定卡等全自动生化鉴定卡等 进一步分型鉴定进一步分型鉴定 ((省省 CDCCDC 进行进行 )) 噬菌体分型噬菌体分型 PFGEPFGE 脉冲场分型脉冲场分型

进一步实验进一步实验

针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测

胶体金快速检测卡胶体金快速检测卡 O1 群霍乱胶体金标记快诊卡 O139 群霍乱胶体金标记快诊卡 荧光 PCR快速检测试剂盒 O1 群、 O139 群双色荧光检测试剂盒 霍乱 CTX毒力基因荧光检测试剂盒

注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只是作为辅助检测的一种手段

霍乱快速检测技术的应用

霍乱弧菌胶体金免疫层析检测霍乱弧菌胶体金免疫层析检测

荧光 PCR检测霍乱弧菌病例标本检测

环境和食品调查的初筛方法

O1 群、 O139 群双色荧光检测试剂盒 深圳生科源生物技术有限公司

O1 群和 O139 群霍乱弧菌的检验程序

鉴定分型 确诊报告

胶体金、荧光 PCR快速诊断

增菌培养（碱胨水）

分离培养庆大霉素、 4 号、 TCBS 琼脂

标本（粪便等）

玻片凝集阳性（结合菌落、菌体形态）

凝集菌落或可疑菌落

纯培养（营养琼脂或克氏双糖培养）

第二次

增菌

（碱胨水）

初步报告

10-20 小时

6-8 小时

10-20 小时

直

接

检测工作中应关注的事项检测工作中应关注的事项 生物安全与个人防护（生物安全 2级实验室操作，做好个人防护，整个培养

流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒） 培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、 PH值、保存条件是否达标，分离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使用等）

可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！！）

做好样品的相关登记记录。