4 מעבדה מס'

השפעת ריכוז הסובסטרט.א.

.PABAהשפעת מעכב ב.

בדיקת השפעת ריכוזי סובסטרט שונים ובמקביל השפעת מעכב תחרותי עלמטרה:KM -ו Vmax סובסטרט.– של הקומפלקס אנזים

הניסוי נעשה בשתי מערכות מקבילות שבאחת הוספנו מעכב ובשניה לא,שיטות :בשתיהן יש שינויים בריכוזי הסובסטרט וכל שאר הנתונים קבועים.

דק' פרהאינקובציה ע"מ להכין תנאים5לפני הוספת האנזים הכנסנו את המע' ל- מתאימים מבחינת טמפ' לאנזים בכדי שיוכל לפעול מיידית. לאחר הוספת האנזים

דק' אינקובציה, שבה התבצעה הריאקציה בין האנזים15הכנסנו את המע' ל- מ"ל חומצת חומץ.0.5לסובסטראט. הפסקנו את הריאקציה ע"י

תוצאות:

טבלת תוצאות ללא הוספת מעכב.

1/V0 1/SV0

μmol/min

בליעה∆)ממוצע

)

∆ בליעה

בליעתראקציה

בליע ת

בלנק

ריכוז סובסטרט תחילתי)מולר(

ריכוז סובסטרט

(BAPNA )M

110.132 15503.88 0.330.33

0.3330.3340.337

0.0046.45×10-5

2×10-3

68.965 9433.962 0.5340.5160.553

0.5190.556

0.0031.06×10-4

3.3×10-3

43.859 6199.628 0.8390.8850.793

0.8920.800

0.0071.613×10-

4 5×10-3

38.167 4694.83 0.0262 0.9620.9790.945

0.9900.956

0.0112.13×10-4

6.6×10-3

25.839 3105.59 0.0387 1.421.4941.347

1.5101.363

0.0163.22×10-4

1×10-2

nm 410כל הבליעות נעשו באורך גל-- *הערה

חישובים לדוגמא: - M ×10-321000 ml :1,2חישוב ריכוז סובסטרט מבחנות

0.1 ml - x x=2×10-7 M

2×10-7M - 3.1 ml 1000 ml - x

x = 6.45x10-5M ,, והם בהתאמה: 31כל הריכוזים התחילתיים נמהלים פי

,,.

(:1,2 על פי בליעת בלנק )עבור מבחנות V0חישוב V0=Ao.D×3.6 /8.8x15

= נפח כולל של תמיסת ראקציה + חומץ.3.68.8 = ε1M

410

=זמן ראקציה בדקות.15μmol/min 0.33 × 3.6/132= V0= פעילות אנזימתית

טבלת תוצאות סובסטרט בנוכחות מעכב:

1/V0 1/SV0

μmol/min בליעה∆

)ממוצע(∆

בליעה בליעתראקציה

בליעתבלנק

ריכוז סובסטרט תחילתי)מולר(

300.571 15503.88 0.1220.1230.121

0.1250.123

0.0026.45×10-5

162.258 9433.962 0.2260.2190.233

0.2210.235

0.0021.06×10-4

112.486 6199.628 0.3260.34

0.3120.3570.329

0.0171.613×10-4

95.238 4694.83 0.3860.3750.398

0.3930.416

0.0182.13×10-4

64.102 3105.590.0156

0.5730.5790.568

0.5990.588

0.0203.22×10-4

: 1 גרף

2 גרף מס'

חישובים:

עבור סובסטרט ללא מעכב:

1/Vmax -נקודת החיתוך עם ציר ה = y.= Vmaxלכן y = 4.4503נקודת חיתוך עם ציר ה-

1/km -נקודת חיתוך עם ציר ה = -X

km M = - לכן 654.455 היא Xנקודת חיתוך עם ציר

ET=m/mw= 100x10-6/24000=4.17x10-9 mole = סה"כ האנזים - –עבור סובסטרט ללא מעכב

1t.o.n = K+2 = Vmax/ET = 0.2247/4.17x10-3/60 = 0.8952sec-

חישובים עבור סובסטרט עם מעכב:

=Vmax = 3.206µM/min 1/0.3119= לכן 0.3119- היא y ציר עםנקודת חיתוך

Km =0.0602M1/16.59= ולכן 16.59- - היאXנקודת החיתוך עם ציר ה-

=K+2= 12.813sec-1 3.206/4.17x10-3/60עבור סובסטרט עם מעכב

km'= km{1+[I] / KI }פי - ל– KIעבור סובסטרט עם מעכב נחשב

( 1.55=3.1/2)ריכוז המעכב נמהל פי

*Km .מבטא את האפיניות בין אנזים לסובסטרט המיוחס לאתר הקושר -

* t.o.n –מספר מולקולות סובסטרט ההופכות לתוצר ביחידת זמן בשניה על ידי אתר פעיל כאשר האנזים רווי לגמרי בסובסטרט.

*KI –.האפיניות בין אנזים למעכב

מסקנות: אנו רואים שככל שמעלים ריכוז סובסטרטS כפונקציה של V0על פי הגרף של

, כלומר כל האנזיםVmax) בריכוז אנזים קבוע (, עולה מהירות הראקציה עד להגיעה ל- רווי בסובסטרט ותוספת סובסטרט לא תשפיע על מהירות הראקציה. כפי שמתואר

בעקומת מיכאליס- מנטל.

כי מסיסות הסובסטרט נמוכה ולכן לא יכולנו Vmaxבניסוי שלנו לא הגענו ל- מעקומתVmax ו- Kmלהשתמש בריכוז גבוה של סובסטרט. מסיבה זו חישבנו

Lineweaver – Bark . מעכב תחרותי מתחרה עם סובסטרט על הקשירה באתר הקושר ולכן נצפה לשינוי ב

km ולא ב Vmax וזאת מאחר ו- kmמודד זיקה בין אנזים לסובסטרט וזיקה זו תרד מודד מהירות קטליזה שלא תשתנה בעודף סובסטרט, מאחרVmaxבנוכחות מעכב.

.הקושרוהתחרות היא על האתר

ערך שלנו ולא vmax בניסוי שונים עבודה כתוצאה מתנאי וזאת שונה המחושב מדוייקים:

, פעילות אנזים לא מקסימלית, חוסר דיוק בזמני הניסוי,pHתנאי טמפרטורה, תנאי שגיאות במדידת הנפחים.

אכן עלה כמצופה ) אפיניות אנזים סובסטרט ירדה(. kmערך ערך )k+2עבור הספרותי מהערך גבוה שיהיה נצפה והערך מאחר )

יותר-30מעלות צלזיוס ואנחנו בדקנו ב15הספרותי נבדק ב מעלות צלזיוס )לאנזים (אנרגיה התןרמת ליותר סיבובים פר פרק זמן ואכן הערך שקיבלנו גדול יותר.

עבור סובסטראט עם מעכב יהיה נמוך יותר מערכו עבורK+2כמו כן נצפה שערך סובסטראט ללא מעכב, וזאת משום שפחות סובסטראט הופך לתוצר ביחידת זמן.

עבור סובסטראט עם מעכב גדול יותר )וגם לא כ"כ הגיוני(,K+2בניסוי זה קיבלנו ערך ויצוינו שצוינו כפי הניסוי לאורך במדידות דיוקים ואי בטעויות מסבירות אנו וזאת

בהמשך. , בניסוי קיבלנו ערך שונה, אך קרוב וזאת כתוצאה הספרותי הוא KIערך

ממדידות לא מדויקות.

Vmax

Vmax/2

Km

בדיקת פעילות טרפסין וכימוטרפסין

ים ועיכובםיבדיקת פעילות של טריפסין וכימוטריפסין על סובסטרטים ספציפ מטרה:על ידי מעכבים ספציפים בלתי הפיכים.

הכנת שיטת הניסוי: מבחנות כאשר מבחנות 24 ו 1-4 בודקות ספציפיות13-16 פעולה של טריפסין וכימוטריפסין בהתאמה.

ו- 10-7במבחנות ידי 22-19 ו TLCKתיבדק ספציפיות העיכוב על TPCKהוספת חומצת0.5mlאקציה בהוספת יתה לאחר פרה אינקובציה, הפסקנו ריהסובסטרט הי

דקות. 15חומץ לאחר 410nmנבדקה פעילות על ידי קריאה בספקטופוטומטר בבליעה של

תוצאות:פעילות בליעה

ממוצעת

אתאנול/HCl

מעכב סובסטרט

אנזים מס'מבחנה

+ 0.386 - - BAPNA טריפסין 1,2- 0.018 - TLCK BAPNA טריפסין 7,8+ 0.380 - TPCK BAPNA טריפסין 9,10+ 0.405 אתאנול - BAPNA טריפסין 11,12- 0.014 - - BTPNA טריפסין 13,14- 0.008 - - BAPNA כימוטריפס

ין3,4

+ 0.430 - - BTPNA כימוטריפסין

15,16

+ 0.375 - TLCK BTPNA כימוטריפסין

19,20

- 0.028 - TPCK BTPNA כימוטריפסין

21,22

+ 0.387 אתאנול - BTPNA כימוטריפסין

23,24

- 0.009 HCl - BAPNA - 5,6- 0.015 HCl - BTPNA - 17,18

חישובים:

פעילות ספציפית:

20x10-3mg/ml x 1ml=0.02mgכמות טריפסין - - 60x10-3mg/ml x 1ml=0.06mgכמות כימוטרפסין

SA-0.56=0.448×3.3/8.8×15×0.02טרפסין SA- 0.435×3.3/8.8x15x0.06 =0.18125כימוטרפסין

3 =0.56/0.18125 של כימוטרפסין- SA של טריפסין ל SAהיחס בין

חישוב אחוז עיכוב:

[ )בליעה ללא מעכב/)בליעה עם מעכב - בליעה ללא מעכב(] x 100% עיכוב =TLCK* מעכב הוא –x100=93.5%]0.448(/0.448-0.029[)% עיכוב טרפסין

TPCK * מעכב הוא x100=81.5%]0.435(/0.435-0.0805[) -% עיכוב כימוטרפסין העיכוב בטרפסין גבוה במעט משל הכימוטריפסין וגם הבדל זה מקורו בשוני בין

קשרים אלקטרוסטטים לבין קשרים הידרופובים בין אנזים למעכב.

: K+2 חישוב

K+2 = Vmax/ET

חישוב עבור טרפסין:

μmol/sec Vmax = 0.448x3.3/8.8x15 = 0.0112μmol/min/60 =

K+2= sec-10.224K+2 = 0.6114sec-1בספרות

ההבדל נובע מטעויות וסטיות בניסוי.

חישוב עבור כימוטרפסין:

Vmax = 0.435x3.3/8.8x15 = 0.0108 μmol/min/60 = 1.8125x10-4 μmol/secK+2= sec-10.0755

מסקנות:

מהתוצאות של הניסוי אפשר לראות את הספציפיות בין אנזים לסובסטרט ובין אנזים למעכב. ראיה לכך היא שהטרפסין לא הגיב עם הסובסטרט של כימוטרפסין ולא עוכב על ידי המעכב של כימוטרפסין. לעומת זאת הטרפסין הגיב עם הסובסטרט הספציפי

שלו. הספציפיות נובעת ממבנה מיוחד של האתר הפעיל ) הקושר + הקטליטי( למבנה של

סובסטרט או מעכב. מפעילות כימוטרפסין. תוצאות אלו ניתן3על סמך התוצאות פעילות טרפסין גבוה פי

להסביר על ידי השוני באתר הקושר. בטרפסין יש באתר זה חומצה אמינית טעונה

שלילית )ח.אספרטית( ולסובסטרט ולמעכב יש חומצה אמינית טעונה חיובית )למשלLys.במעכב( הקשר הנוצר הוא לכן קשר אלקטרוסטטי

או והקשר עם הסובסטרט אין חומצה אמינית טעונה בכימוטרפסין באתר הקושר נטראקציות הידרופוביות.יהמעכב הוא קשר המבוסס על א

יותר.הקשר אלקטרוסטטי חזק מקשר הידרופובי ולכן לטרפסין פעילות ספציפית גבוה

SA = μmol/mgExmin 0.75הערכים הספרותים הם: טרפסין SA = μmol/mgExmin 0.05כימוטרפסין

ניתן לראות כי ישנה סטייה מהערכים הספרותיים. סטייה זו נובעת משגיאות במדידת כמויות, בזמן וטמפ' של האינקובציה )פחות ריאקציה בין האנזים לסובסטרט(, שגיאה

במדידת הבליעה. ניתן לראות שערכי טריפסין גבוהים משל כימוטרפסין וגם דבר K +2מחישוב ה- גם

טריפסין ולכן הידרופובים. מקשרים החזקים האלקטרסטטים מהקשרים נובע זה מפרק כמות גדולה יותר של סובסטרט ליחידת זמן לאותה כמות אנזים.

סיכום: באורגניזמים החיים מתקיימות ראקציות כימיות מורכבות ביותר, אשר ביצוען מצוייעילות בעלי ביולוגיים קטליזטורים הינם אנזימים מתמיד. אנזימטי פיקוח תחת כימית ראקציה של סוג כל כמעט לזרז מסוגלים והם ביותר גבוהה ספציפית

המתקיימת בגוף. במהלך המעבדה התמקדנו באנזים טריפסין הגורם לפתיחת קשר פפטידי )אמידי או

רי( בחלבון, שייך לקבוצת ההידרוזליזות )פותחים קשרים כימיים על ידי פעילותטאסהידרוליזה(.

במהלך המעבדה, בדקנו את פעילותם של גורמים המעכבים פעילות אנזימטית: אלה(. inhibitors) ,הם מעכבים

לא כל המולקולה של האנזים משתתפת באופן פעיל בביצוע הראקציה האנזימטית, החלק המשתתף קרוי האתר הפעיל. נוהגים להבדיל בין שני חלקים: החלק הקושר,הראקציה. את המבצע הקטליטי והחלק הסובסטרט, עם הקומפלקס את היוצר כימיות. הכרה הינה קטליזה של ראקציות כאמור, התכונה הבולטת של האנזימים יסודית של התכונות הקטליטיות מוכרחה להיות מבוססת על מדידה מדויקת של קצב

הראקציה המתבצעת.ניתן ללמוד רבות על מנגנון,מהשפעת השינוי של תנאי הראקציה על הקצב שלה

.הפעולה האנזימטיהגורמים העיקריים המשפיעים על מהירות התחלתית הם:

ריכוז האנזים.א.

ריכוז סובסטרט.ב.pHג.טמפרטורה.ד.המצאות מעכבים או אקטיבטורים.ה.משך זמן הראקציה.ו.