생명과학실험 III보고서( 결과 + 예비 )

생명과학과생명과학실험 III2004422021 양창민

2009.05.21

생명과학실험 III보고서( 결과 )

생명과학과생명과학실험 III2004422021 양창민

2009.05.21

Result ( 사진 )

Discuss• 이번 보고서에 제출된 사진은 3 주전에 찍었던 것으로 이 사진이 최초의 조직배양 사진이고 그 밑에 있는 것들이 3 주가 지난 조직배양 결과 사진이다 . 우선 왼쪽에 있는 사진이 분화가 잘 된 사진이며 오른쪽의 사진은 분화 도중에 곰팡이가 자라난 사진이다 . • 이 실험이 설명해주는 바는 배지는 우리가 절단한 잎에서 세포성장이 활발하게 일어날수 있는 조건을 충족시키며 자칫 잘못한다면 그 곳에 다른 기타 곰팡이와 같은 것들이 활발하게 자라날수 있다는 점이다 .• 많은 학생들이 1 개 이상의 sample 을 제작하였음에도 불구하고 성공한 캘러스 유도는 몇 없다는 점에서 이번 실험에 많은 오점을 남겼다 . 이 원인은 살균을 하였지만 보관의 문제 혹은 살균이 제대로 이루어 지지 않은 실험기기로 사용했다는 점이 문제를 일으켰을 것이라는 가정을 하며 , 잎을 배지 위에 정착 시킬 때 잎의 모양이 모서리만 붙어서 전체에서 일어나지 않은 경우도 있었다는 점에서 아직 부족한 부분이 많았다고 생각한다 .

생명과학실험 III보고서( 예비 )

생명과학과생명과학실험 III2004422021 양창민

2009.05.21

What is PCR (Polymerase Chain Reaction)• 중합효소 연쇄반응이라고도 하며 이 실험에서 DNA 시료는 단일 가닥으로 분리되고 DNA 중합효소 , dNTPs, 그리고 염기서열이 관심 있는 DNA 조각의 측면에 위치하는 두 가지 올리고 뉴클레오타이드 시발체들과 일정한 온도로 유지시킨다 . 시발체 들은 DNA 중합효소가 목표로 하는 DNA 의 상보적인 가닥들을 합성하게 한다 .• PCR (Polymerase Chain Reaction) 은 DNA 를 복제하는 효소로 하여금 연쇄반응을 일으키게 하여 20 Cycle 반응 만에 한 개의 DNA Helix 를 백만 배로 증폭시켜 주는 획기적인 실험 기법이다 . • PCR 덕택에 우리는 Cloning 을 하지 않고도 유전자를 물리 , 화학적으로 분석하고 Sequencing 도 할 수 있게 되었다 . 이 실험 기법은 1980 년대 중반 미국 Cetus 사의 Mullis 박사가 개발하였는데 , 처음에는 E.coli 의 DNA Polymerase 를 매

Cycle 마다 heat denaturation 후 새로 첨가해 주어야 했다 .• 높은 온도에서 자라는 미생물인 Thermus aquaticus (Taq) 의

polymerase 는 94℃ 에서도 활성이 상당히 유지되기 때문에 이 효소를 이용하고부터는 PCR 실험이 간편해졌다 . 이 기법은 유전병의 원인 돌연변이 위치를 빠르고 정확하게 찾아내는 실험 등 여러 방면으로 크게 기여하였다 .• 반응 모식도를 통해서 한 개의 DNA 로부터 20 Cycle 만에 한 개의 DNA 로 부터 2 의 20 제곱 개 즉 1,048,576 개로 복사해 낼 수 있는지 쉽게 알 수 있다 .

What is PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR 반응의 모식도

About PCR (Polymerase Chain Reaction) Step.• 1. Denaturation ( 변성 )

• PCR 반응 혼합물을 95℃ 로 가열하여 DNA 를 single-strand 분자로 변성시킨다 . DNA source 를 정제할 필요는 없다 . 내열성 DNA polymerase 는 Taq polymerase(박테리아 Thermus aquaticus 에서 얻음 ) 이다 . 변성 온도를 약 1 분 동안 유지한다 .

• 2. Renaturation ( 복원 ) - Annealing

• 이 단계는 혼합물을 약 55℃ 로 냉각하는 과정을 포함하여 primer 가 single-stranded source DNA 의 상보적인 서열로 annealing 되도록 한다 . 변성 온도에서는 primer 는 DNA 에 annealing 하지 않는다 .

• 3. Extension ( 신장 )

• PCR cycle 에서 셋째 단계는 혼합물을 다시 가열하여 온도를 약 75℃ 로 상승시키는 과정을 포함한다 . 이 최적 온도에서 , Tag DNA polymerase 가 primer 의 3'-hydroxyl 말단에 뉴클레오타이드를 부가함으로써 primer 를 신장시키기 시작한다 . original 표적 DNA 의 복제물 (replication) 는 flanking primer region 과 , 그 이후의 제 2 cycle 에 사용될 새로 생성된 DNA strand( 소위 "long chain": 장쇄 ) 를 포함한다 .

전기영동 (Electrophoresis)• 전기영동 (electrophoresis) 은 전기장 안에서 하전된 입자 ( 이온 ) 가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다 . 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량 , 크기와 모양 , 용액의 pH 와 점성도 , 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기 , 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다 . 따라서 , 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다 . 그러므로 전기영동법은 아미노산 , 뉴클레오티드 , 단백질 들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다 .• 하전된 성분들로는 단백질과 같은 분자나 세포 또는 하전된 입자들도 있으나 분리기법으로서 전기영동은 주로 하전된 분자 (이온 ) 에 한정하며 , 유동성 매체로 액체 또는 기체가 사용되지만 생물학적 시스템에 있어서는 액체를 주로 이용한다 . 

About varies PCR (Polymerase Chain Reaction)• RAPD PCR

• RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR 은 일반적으로 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다 . PCR 할 때 primer 가 짧을 경우 genome 상에 여러 군데 달라 붙어서 여러 fragment 를 만든다 . 이렇게 해서 생겨난 여러 fragment 를 전기영동을 사용해서 확인하면 생명체마다 각각 독특한 band 를 형성하는데 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다 . 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band 의 모양이 비슷할 것이며 , 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이를 나타낼 것이다 . 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬워 genome sequencing 을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 나타내기 위해서 많이 사용된다 .

About varies PCR (Polymerase Chain Reaction)• ITS PCR

• ITS (for internal transcribed spacer) refers to a piece of non-functional RNA situated between structural ri-bosomal RNAs (rRNA) on a common precursor tran-script. Read from 5' to 3', this polycistronic rRNA pre-cursor transcript contains the 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA and finally the 3'ETS. During rRNA matura-tion, ETS and ITS pieces are excised and as non-func-tional maturation by-products rapidly degraded. Genes encoding ribosomal rRNA and spacers occur in tandem repeats that are thousands of copies long, each separated by regions of non-transcribed DNA termed intergenic spacer (IGS) or non-transcribed spacer (NTS). Sequence comparison of the ITS region is widely used in taxonomy and molecular phylogeny because it a) is (due to the high copy number of rRNA genes) easy to amplify even from small quantities of DNA, and b) has a high degree of variation even be-tween closely related species. This can be explained by the relatively low evolutionary pressure acting on such non-functional sequences[citation needed].

About varies PCR (Polymerase Chain Reaction)• ITS PCR

• For example, ITS has proven especially useful for elu-cidating relationships among congeneric species and closely related genera in Asteraceae [1](Baldwin, 1992; Baldwin et al., 1995; Kim et al., 1996) as well as clini-cally important yeast species.[2]

• The ITS region is now perhaps the most widely se-quenced DNA region in fungi.[citation needed] It has typically been most useful for molecular systematics at the species level, and even within species (e.g., to identify geographic races). Because of its higher degree of variation than other genic regions of rDNA (for small- and large-subunit rRNA), variation among individual rDNA repeats can sometimes be observed within both the ITS and IGS regions. In addition to the standard ITS1+ITS4 primers used by most labs, several taxon-specific primers have been described that allow selec-tive amplification of fungal sequences (e.g., see Gardes & Bruns 1993 paper describing amplification of basidiomycete ITS sequences from mycorrhiza sam-ples). ITS region is nowadays being used to know the genetic diversity among different strains of bacteria by sequencing the ITS gene

Reference재미있는 분자생물학 그림여행 . BioMedical Research Lab 2nd

edition. 저자 : 유 욱준 신 인철 출판사 : 분자방 (P.19)

Fundamentals of Biochemistry (life at the molecular level) 제 2판 저자 : Donald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W.Pratt (역자대표 : 양 철학 ) 출판사 : 자유아카데미 .

http://bint.kr/110004733820

http://blog.naver.com/syc0813?Redirect=Log&logNo=20024333573

http://blog.naver.com/genetic2002?Redirect=Log&logNo=30034626247

http://www.wikipedia.org

검색 ( 번역이 어려워서 하지 못했습니다 ㅠ )