分子生物学

2008 实验

质粒质粒 DNADNA 的提取与电泳检的提取与电泳检测测

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一 . 实验目的

1. 通过质粒 DNA 的提取和检测，掌握提取质粒的方法以及用凝胶电泳分离鉴定质粒 DNA 的方法。

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二 . 实验原理

1. 质粒概述 : 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA 分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。

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目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是绝大多数的细菌质粒都是闭合环状闭合环状 DNADNA 分子分子 (( 简称简称cccDNA)cccDNA) 。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的为细菌染色体的 0.5%-3%,0.5%-3%, 大小在大小在 1Kb-200Kb1Kb-200Kb 之间。之间。

在基因工程中，常用在基因工程中，常用人工构建人工构建的质粒作为载体。的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。

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22 。质粒。质粒 DNADNA 的提取：的提取： 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒 DDNANA ， 这些方法都含有以下， 这些方法都含有以下 33 个步骤：个步骤：

◆ ◆ 细菌培养物的生长细菌培养物的生长。。 ◆ ◆ 细菌的收获和裂解细菌的收获和裂解 ◆ ◆ 质粒质粒 DNADNA 的纯化的纯化。。

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三 . 仪器和试剂

试剂试剂 ::11 、质粒快速提取试剂盒、质粒快速提取试剂盒 溶液溶液 11 （（ SETSET 缓冲液）、溶液缓冲液）、溶液 22 （（ Lysis BuLysis Buffer)ffer) 、溶液、溶液 33 （（ 3M NaAc,Ph4.8)3M NaAc,Ph4.8) 、结合缓冲、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集管管

22 、电泳检测、电泳检测 TAETAE 缓冲液、琼脂糖、缓冲液、琼脂糖、 Loading bufferLoading buffer 、、 EBEB仪器、耗材：仪器、耗材： 台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、移液器、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、移液器、1.5ml Eppendorf1.5ml Eppendorf 管管

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四 . 操作步骤

(1)(1) 培养细菌培养细菌 :: 大肠杆菌接种到大肠杆菌接种到 LBLB 培养基培养基 2ml-5ml2ml-5ml 中中 ,37,37度振荡培养度振荡培养 8-168-16 小时小时 ..(2)(2)收集菌体收集菌体：取培养液：取培养液 1.5ml1.5ml 于于 EppendorfEppendorf 管中管中 ,12000,12000rpmrpm 离心离心 33 分钟分钟 ,, 去掉上清液去掉上清液 ..(3)(3) 裂解裂解：加入：加入 100ul100ul 溶液溶液 11 （（用完后用完后 44 度保存度保存）） ,, 充分充分吹打混匀吹打混匀后后 , , 加入加入 150ul150ul 溶液溶液 22 （（用完立即拧紧瓶盖用完立即拧紧瓶盖）） ,,温和温和颠倒颠倒 5-105-10 次次 ,,零下零下 2020 度放置度放置 33 分钟分钟 .. 加入加入 150ul150ul 溶溶液液 3,3, 温和温和颠倒颠倒 5-105-10 次次 ,, 放置放置 55 分钟分钟 . 12000rpm. 12000rpm 离心离心 55 分分钟钟(4)(4) 收集质粒收集质粒：取：取吸附柱吸附柱，加入，加入 420ul420ul 结合缓冲液，取离结合缓冲液，取离心后的心后的上清液上清液到吸附柱中（到吸附柱中（不要吸到蛋白沉淀不要吸到蛋白沉淀），混匀），混匀 . . 12000rpm12000rpm 离心离心 3030秒秒 ,,弃去废液弃去废液 .. 吸附柱装回收集管。吸附柱装回收集管。

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(5)(5)向吸附柱加入向吸附柱加入 700ul700ul 漂洗液， 漂洗液， 12000rpm12000rpm 离离心心 3030秒。倒掉废液，装回吸附柱。秒。倒掉废液，装回吸附柱。

(6)(6)重复（重复（ 55 ），再次），再次 12000rpm12000rpm 离心离心 22 分钟以完分钟以完全去除漂洗液。全去除漂洗液。

(7)(7)回收质粒回收质粒：将吸附柱移到一个新的：将吸附柱移到一个新的 1.5ml ep1.5ml eppendorfpendorf 管中，向吸附膜中央加入管中，向吸附膜中央加入 50ul 50ul 洗脱洗脱缓冲液缓冲液（水浴（水浴预热预热至至 7070 度），溶解提取物度），溶解提取物 ,,室温放置室温放置 22 分钟，分钟， 12000rpm12000rpm 离心离心 22 分钟分钟 ..

(8)(8) 琼脂糖凝胶电泳检测提取结果琼脂糖凝胶电泳检测提取结果 ..

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五、试验结果

六、结果分析

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问 题 思 考 ？

1.说明碱裂法提取质粒的原理 ?

2.电泳结果出现几个条带 ?各是什么 ?