农业生物学实验教学中心

植物总植物总 DNADNA 的提取的提取及琼脂糖凝胶电泳检测及琼脂糖凝胶电泳检测

制作人：刘红梅

植物基因组 DNA的提取

琼脂糖凝胶电泳检测

脱氧核糖核酸 (DNA)、核糖核酸 (RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（ DNP）的形式存

在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。

植物总 DNA包括细胞核 DNA和细胞核外 DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体 DNA(ctDNA)。

背景知识

核酸的存在形式

DNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、 RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。

核酸的理化性质

细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸

基本过程

①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用 SDS处理细胞； ③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。

细胞破碎

SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂 , 细胞中 DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合 , SDS能够破坏这种价键。

CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的 DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使 DNA与蛋白质分离。

DNA提取

蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（ 25： 24：1 ）或氯仿：异戊醇（ 24： 1 ）抽提。

RNA 常选用 RNase消化 ，或是用 LiCl来消除大分子的 RNA。

酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。

多糖 提取液中加 1 ％ PVP。

DNA纯化（去杂质）

实验材料 新鲜蔬菜叶片 ( 去叶脉 )

试剂 2×CTAB抽提液 TE 缓冲液 (pH=8.0)

氯仿：异戊醇 (24:1)

材料与试剂

①离心机

②水浴锅

③研钵

④微量移液器

仪器用具

移液器－量程的选择

1 ．取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。

2 ．将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于 65℃水浴中保温 20min ，其间颠倒混匀 2 － 3 次。破碎细胞

3. 12000r/min 离心 5min ，取上清液 700μL 转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（ 24:1 ）混合液，充分颠倒混匀。 12000r/min ，离心 5min 。抽提去蛋白

4 ．将上清液移入新的 1.5mL 离心管内，加 600µL 异丙醇。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸

5 ． 12000r/min ，离心 1min ，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于 20µL TE 缓冲液待测。

操作步骤

1) 选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；

2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（ 2 － 5％），尽可能选取幼嫩的材料；

3 ）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；

4 ）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。

注意事项

DNA分子在高于等电点的 PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下， DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。

电泳原理

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。

琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)

线型线型 DNADNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)

0.30.3 55 ～～ 6060

0.60.6 11 ～～ 2020

0.70.7 0.80.8 ～～ 1010

0.90.9 0.50.5 ～～ 77

1.21.2 0.90.9 ～～ 66

1.51.5 0.20.2 ～～ 33

12.012.0 0.10.1 ～～ 22

仪器和试剂

仪器– 电泳仪– 电泳槽– 灌胶模具等

–Tris-硼酸（ TBE） Tris-乙酸（ TAE） Tris-磷酸（ TPE）

常用电泳缓冲液

电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成上样缓冲液。 作用：

①增加样品比重，以确保 DNA均匀沉入加样孔内。

②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。

③使样品呈色，使加样操作更方便。

上样缓冲液

溴化乙锭（ EB）是一种荧光染料， EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与 DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品 DNA浓度。

琼脂糖凝胶 EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其 DNA量一般 >5ng。

核酸染色剂

注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。

–DNA分子量标准

不同种类D

NA

Mark

er

1.凝胶制备 制备 0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至 50-60 ℃ 时，加入 EB 至终浓度 0.5µg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样 取 10µl DNA样液与 2µl 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为 1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） , 待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。4.观察拍照

四、操作步骤

紫外仪上观察电泳带及其位置。绘制核酸电泳示意图。

作业

1. 结合原理，简述 CTAB 法分离提取植物总 DNA 的基本过程。

2. 为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应注意那些问题？

What?!

How?!

思考