第六章 食品添加剂分析

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第六章 食品添加剂分析. 6.1 食品添加剂的概况 食品添加剂是用于改善食品的品质、延长食品保存期、便于食品加工和增强食品营养成分的一类化学合成或天然物质。 它在食品的制造加工、包装处理及感官评定等方面起了很大的作用。 世界各国为确保食品添加剂的安全使用,制定了有关食品添加剂的法规。食品添加剂的定量、定性分析,是食品安全的一个至关重要的方面。. 食品添加剂的分类 按来源分: 天然的和化学合成的 按功能分: - PowerPoint PPT Presentation

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第六章 食品添加剂分析

61 食品添加剂的概况 食品添加剂是用于改善食品的品质延长食品

保存期便于食品加工和增强食品营养成分的一类化学合成或天然物质

它在食品的制造加工包装处理及感官评定等方面起了很大的作用

世界各国为确保食品添加剂的安全使用制定了有关食品添加剂的法规食品添加剂的定量定性分析是食品安全的一个至关重要的方面

食品添加剂的分类 按来源分天然的和化学合成的 按功能分 防腐剂漂白剂发色剂着色剂酸度调节

剂抗结剂消泡剂抗氧化剂膨松剂稳定剂和凝固剂胶姆糖基础剂乳化剂酶制剂增味剂被膜剂水分保持剂营养强化剂甜味剂增稠剂香料及其它共 22 类

几种食品添加剂举例防腐剂苯甲酸和苯甲酸钠山梨酸和山梨酸钾

漂白剂过氧化苯甲酰 SO2

发色剂亚硝酸钠(火腿肠中含有能使肉鲜红且有防腐的作用)

抗氧化剂 BHA BHT TBHQ 维生素 E 维生素 C

被膜剂紫胶(用于巧克力糖的外膜涂层防止巧克力受潮发粘)

营养强化剂食盐中的碘

氨基酸

维生素

矿物质如钙铁锌

食品添加剂的作用 食品添加剂的发展大大地促进了食品工业的发展其所以如此是因为食品添加剂具有以下作用(1) 增加食品的保藏性防止腐败变质(2) 改善食品的感官性状(3) 有利于食品加工操作适应生产的机械化和连续化(4) 保持或提高食品的营养价值(5) 满足其他特殊需要

食品添加剂的一般要求 根据多年来的工作由动物实验对添加剂已作出 毒理学的评价从而规定了添加剂的ldquo每日允许摄取量rdquo( Accepted Daily Intake) 即 ADI值ADI值是指人每天允许食用的量就是说某种化学物质某种化学物质一个人每天食用同样的数量并且长期不断食用下去对人体也不致产生危害的剂量这是通过动物试验的结果将它应用到人类而制定的 任何对人体有重要作用的不可缺少的物质都是有一定限量的超过就会对人体有害

62 某些食品添加剂的检测621 防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖防止食品腐败变质延长食品保存期常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐山梨酸及其钾盐对羟基苯甲酸酯以上三种防腐剂主要用于酱油醋果汁汽水果酱果子露和罐头等此外还有二氧化硫用于葡萄酒果酒丙酸钙主要用于面包糕点酱油醋黄油和乳制品

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 2: 第六章 食品添加剂分析

61 食品添加剂的概况 食品添加剂是用于改善食品的品质延长食品

保存期便于食品加工和增强食品营养成分的一类化学合成或天然物质

它在食品的制造加工包装处理及感官评定等方面起了很大的作用

世界各国为确保食品添加剂的安全使用制定了有关食品添加剂的法规食品添加剂的定量定性分析是食品安全的一个至关重要的方面

食品添加剂的分类 按来源分天然的和化学合成的 按功能分 防腐剂漂白剂发色剂着色剂酸度调节

剂抗结剂消泡剂抗氧化剂膨松剂稳定剂和凝固剂胶姆糖基础剂乳化剂酶制剂增味剂被膜剂水分保持剂营养强化剂甜味剂增稠剂香料及其它共 22 类

几种食品添加剂举例防腐剂苯甲酸和苯甲酸钠山梨酸和山梨酸钾

漂白剂过氧化苯甲酰 SO2

发色剂亚硝酸钠(火腿肠中含有能使肉鲜红且有防腐的作用)

抗氧化剂 BHA BHT TBHQ 维生素 E 维生素 C

被膜剂紫胶(用于巧克力糖的外膜涂层防止巧克力受潮发粘)

营养强化剂食盐中的碘

氨基酸

维生素

矿物质如钙铁锌

食品添加剂的作用 食品添加剂的发展大大地促进了食品工业的发展其所以如此是因为食品添加剂具有以下作用(1) 增加食品的保藏性防止腐败变质(2) 改善食品的感官性状(3) 有利于食品加工操作适应生产的机械化和连续化(4) 保持或提高食品的营养价值(5) 满足其他特殊需要

食品添加剂的一般要求 根据多年来的工作由动物实验对添加剂已作出 毒理学的评价从而规定了添加剂的ldquo每日允许摄取量rdquo( Accepted Daily Intake) 即 ADI值ADI值是指人每天允许食用的量就是说某种化学物质某种化学物质一个人每天食用同样的数量并且长期不断食用下去对人体也不致产生危害的剂量这是通过动物试验的结果将它应用到人类而制定的 任何对人体有重要作用的不可缺少的物质都是有一定限量的超过就会对人体有害

62 某些食品添加剂的检测621 防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖防止食品腐败变质延长食品保存期常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐山梨酸及其钾盐对羟基苯甲酸酯以上三种防腐剂主要用于酱油醋果汁汽水果酱果子露和罐头等此外还有二氧化硫用于葡萄酒果酒丙酸钙主要用于面包糕点酱油醋黄油和乳制品

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 3: 第六章 食品添加剂分析

食品添加剂的分类 按来源分天然的和化学合成的 按功能分 防腐剂漂白剂发色剂着色剂酸度调节

剂抗结剂消泡剂抗氧化剂膨松剂稳定剂和凝固剂胶姆糖基础剂乳化剂酶制剂增味剂被膜剂水分保持剂营养强化剂甜味剂增稠剂香料及其它共 22 类

几种食品添加剂举例防腐剂苯甲酸和苯甲酸钠山梨酸和山梨酸钾

漂白剂过氧化苯甲酰 SO2

发色剂亚硝酸钠(火腿肠中含有能使肉鲜红且有防腐的作用)

抗氧化剂 BHA BHT TBHQ 维生素 E 维生素 C

被膜剂紫胶(用于巧克力糖的外膜涂层防止巧克力受潮发粘)

营养强化剂食盐中的碘

氨基酸

维生素

矿物质如钙铁锌

食品添加剂的作用 食品添加剂的发展大大地促进了食品工业的发展其所以如此是因为食品添加剂具有以下作用(1) 增加食品的保藏性防止腐败变质(2) 改善食品的感官性状(3) 有利于食品加工操作适应生产的机械化和连续化(4) 保持或提高食品的营养价值(5) 满足其他特殊需要

食品添加剂的一般要求 根据多年来的工作由动物实验对添加剂已作出 毒理学的评价从而规定了添加剂的ldquo每日允许摄取量rdquo( Accepted Daily Intake) 即 ADI值ADI值是指人每天允许食用的量就是说某种化学物质某种化学物质一个人每天食用同样的数量并且长期不断食用下去对人体也不致产生危害的剂量这是通过动物试验的结果将它应用到人类而制定的 任何对人体有重要作用的不可缺少的物质都是有一定限量的超过就会对人体有害

62 某些食品添加剂的检测621 防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖防止食品腐败变质延长食品保存期常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐山梨酸及其钾盐对羟基苯甲酸酯以上三种防腐剂主要用于酱油醋果汁汽水果酱果子露和罐头等此外还有二氧化硫用于葡萄酒果酒丙酸钙主要用于面包糕点酱油醋黄油和乳制品

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 4: 第六章 食品添加剂分析

几种食品添加剂举例防腐剂苯甲酸和苯甲酸钠山梨酸和山梨酸钾

漂白剂过氧化苯甲酰 SO2

发色剂亚硝酸钠(火腿肠中含有能使肉鲜红且有防腐的作用)

抗氧化剂 BHA BHT TBHQ 维生素 E 维生素 C

被膜剂紫胶(用于巧克力糖的外膜涂层防止巧克力受潮发粘)

营养强化剂食盐中的碘

氨基酸

维生素

矿物质如钙铁锌

食品添加剂的作用 食品添加剂的发展大大地促进了食品工业的发展其所以如此是因为食品添加剂具有以下作用(1) 增加食品的保藏性防止腐败变质(2) 改善食品的感官性状(3) 有利于食品加工操作适应生产的机械化和连续化(4) 保持或提高食品的营养价值(5) 满足其他特殊需要

食品添加剂的一般要求 根据多年来的工作由动物实验对添加剂已作出 毒理学的评价从而规定了添加剂的ldquo每日允许摄取量rdquo( Accepted Daily Intake) 即 ADI值ADI值是指人每天允许食用的量就是说某种化学物质某种化学物质一个人每天食用同样的数量并且长期不断食用下去对人体也不致产生危害的剂量这是通过动物试验的结果将它应用到人类而制定的 任何对人体有重要作用的不可缺少的物质都是有一定限量的超过就会对人体有害

62 某些食品添加剂的检测621 防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖防止食品腐败变质延长食品保存期常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐山梨酸及其钾盐对羟基苯甲酸酯以上三种防腐剂主要用于酱油醋果汁汽水果酱果子露和罐头等此外还有二氧化硫用于葡萄酒果酒丙酸钙主要用于面包糕点酱油醋黄油和乳制品

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 5: 第六章 食品添加剂分析

食品添加剂的作用 食品添加剂的发展大大地促进了食品工业的发展其所以如此是因为食品添加剂具有以下作用(1) 增加食品的保藏性防止腐败变质(2) 改善食品的感官性状(3) 有利于食品加工操作适应生产的机械化和连续化(4) 保持或提高食品的营养价值(5) 满足其他特殊需要

食品添加剂的一般要求 根据多年来的工作由动物实验对添加剂已作出 毒理学的评价从而规定了添加剂的ldquo每日允许摄取量rdquo( Accepted Daily Intake) 即 ADI值ADI值是指人每天允许食用的量就是说某种化学物质某种化学物质一个人每天食用同样的数量并且长期不断食用下去对人体也不致产生危害的剂量这是通过动物试验的结果将它应用到人类而制定的 任何对人体有重要作用的不可缺少的物质都是有一定限量的超过就会对人体有害

62 某些食品添加剂的检测621 防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖防止食品腐败变质延长食品保存期常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐山梨酸及其钾盐对羟基苯甲酸酯以上三种防腐剂主要用于酱油醋果汁汽水果酱果子露和罐头等此外还有二氧化硫用于葡萄酒果酒丙酸钙主要用于面包糕点酱油醋黄油和乳制品

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 6: 第六章 食品添加剂分析

食品添加剂的一般要求 根据多年来的工作由动物实验对添加剂已作出 毒理学的评价从而规定了添加剂的ldquo每日允许摄取量rdquo( Accepted Daily Intake) 即 ADI值ADI值是指人每天允许食用的量就是说某种化学物质某种化学物质一个人每天食用同样的数量并且长期不断食用下去对人体也不致产生危害的剂量这是通过动物试验的结果将它应用到人类而制定的 任何对人体有重要作用的不可缺少的物质都是有一定限量的超过就会对人体有害

62 某些食品添加剂的检测621 防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖防止食品腐败变质延长食品保存期常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐山梨酸及其钾盐对羟基苯甲酸酯以上三种防腐剂主要用于酱油醋果汁汽水果酱果子露和罐头等此外还有二氧化硫用于葡萄酒果酒丙酸钙主要用于面包糕点酱油醋黄油和乳制品

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 7: 第六章 食品添加剂分析

62 某些食品添加剂的检测621 防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖防止食品腐败变质延长食品保存期常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐山梨酸及其钾盐对羟基苯甲酸酯以上三种防腐剂主要用于酱油醋果汁汽水果酱果子露和罐头等此外还有二氧化硫用于葡萄酒果酒丙酸钙主要用于面包糕点酱油醋黄油和乳制品

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 8: 第六章 食品添加剂分析

苯甲酸山梨酸及对羟基苯甲酸酯样品处理 从食品中提取苯甲酸山梨酸最常用的方法是蒸气蒸馏法或乙醚萃取法

当样品加酸酸化后其中的苯甲酸钠盐山梨酸钠盐转变为苯甲酸和山梨酸在酸性条件下可随水蒸气馏出导入碱性吸收液中然后酸化用乙醚萃取游离酸挥干乙醚加适当的溶剂溶解残渣便可进行测定

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 9: 第六章 食品添加剂分析

有时食品中的其它干扰物质存在时对提取会造成麻烦因此在提取苯甲酸山梨酸之前应先进行样品处理目的是为了防止提取过程中出现乳化现象而损失苯甲酸山梨酸并消除苯甲酸山梨酸以外的酸性物质给测定带来的误差具体处理方法如下

① 除二氧化碳 碳酸饮料中二氧化碳可用超声法除去

② 除酒精 因酒精既可溶于乙醚又可溶于水当用乙醚提取苯甲酸时便容易乳化故应先加热挥去酒精再将样品酸化后用乙醚提取苯甲酸

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 10: 第六章 食品添加剂分析

③ 除脂肪 因脂肪易溶于乙醚而脂肪酸也能消耗碱当用酸碱滴定法分析苯甲酸时会带来正误差通常在碱性条件下用乙醚提取出脂肪然后再加酸酸化并用乙醚提取苯甲酸

④ 除蛋白质 蛋白质是高分子化合物结构既有亲脂基团又有亲水基团当用乙醚提取苯甲酸时蛋白质的存在会导致乳化而给分离苯甲酸带来困难除蛋白质的方法很多例如盐析加蛋白质沉淀剂透析等

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 11: 第六章 食品添加剂分析

样品经酸化后蒸馏法提取山梨酸苯甲酸和对羟基苯甲酸酯这一方法在基体复杂的食品中得到广泛应用通过对大量不同样品的分析蒸馏法的提取率一般在 75 -95之间蒸馏法可以将防腐剂从含氯化钠和酒石酸的基质中提取出来导入至二氯甲烷 -

水的混合溶液( 75 25 )中防腐剂被提取到有机相中经浓缩后进行 GC 分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 12: 第六章 食品添加剂分析

(1)气相色谱法 苯甲酸和山梨酸可以被气相色谱法直接测定一般用极性固

定相进行分离如果将苯甲酸山梨酸衍生为酯(甲酯丁酯)或硅醚的形式则用非极性固定相分离

例 Graveland 用 3磷酸 -乙醚溶液提取面包里的山梨酸和苯

甲酸离心后上清液作为样液进行 GC测定色谱柱为 2mtimes

2mm 的玻璃柱内填 Carbowax 20M 对苯二甲酸固定液涂渍在 60-80目 Chromosorb W 担体上柱温以 5 min从 100升高到 210载气为氮气 65mLmin 丙酸山梨酸和苯甲酸在 25min内完成分离最低检出量为 5ng

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 13: 第六章 食品添加剂分析

( 2 )液相色谱法 苯甲酸山梨酸和对羟基苯甲酸酯可以用 HPLC直接测定添加剂 样品 提取方法 流动相及色谱柱 回收率

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸

苯甲酸山梨酸脱氢乙酸对羟基苯甲酸酯丙酸

苯甲酸山梨酸

调味品等

饮料

果酱调味品饮料腌菜人造黄油

果汁饮料乳制品酱冷食等

膜过滤

超声脱气膜过滤

饱和硫酸铵水蒸气蒸馏

膜滤及乙醚提取

25mmolL NaH2PO4- 甲醇( 3 7 ) TSKGEL ODS-80Tm 柱

甲醇- 002molL 乙酸铵( 3 7 ) C18 柱

0025molL 磷酸( pH72 ) - 甲醇( 95 5 ) Inertsil-pH 柱

甲醇 -002molL 乙酸铵( 5 95 ) ODS C18 柱

104-108

98-113

82-101

95-101

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 14: 第六章 食品添加剂分析

( 3 )薄层色谱法

苯甲酸苯甲酸钠经分离提纯后用薄层层析分离在紫外光下或显色后与标准比较定性与概略定量

( 4 )紫外分光光度法

苯甲酸苯甲酸钠在酸性溶液中蒸发出来后在重铬酸钾硫酸溶液中氧化除去挥发性的杂质及山梨酸再进行蒸馏分离蒸馏液在波长 225 nm 处测光密度与标准比较定量本法适用于酱油酱菜果汁果酱等样品

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 15: 第六章 食品添加剂分析

622 发色剂 发色作用抑菌作用 亚硝酸盐是添加剂种急性毒性较强的物质之一其次亚硝

酸盐为亚硝基化合物的前体具有致癌性因此对其用量及残留量有严格的要求

抗坏血酸与亚硝酸盐有高度亲和力在体内能防止亚硝化作用因此在肉类腌制时添加适量的抗坏血酸有可能防止生成致癌物质

虽然硝酸盐和亚硝酸盐的使用受到了很大限制但至今国内外仍在继续使用其原因是亚硝酸盐对保持腌制肉制品的色香味有特殊作用迄今未发现理想的替代物质更重要的是亚硝酸盐对肉毒梭状芽孢杆菌的抑制作用

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 16: 第六章 食品添加剂分析

硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法 主要有比色法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )盐酸萘乙二胺法(测亚硝酸盐)

样品经沉淀蛋白质除去脂肪后在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料与标准比较定量本法检出下限为 01mgkg

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 17: 第六章 食品添加剂分析

( 2 )镉柱法(测硝酸盐用) 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后溶液通过镉柱使

其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子在弱酸性条件下亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合形成红紫色染料测得亚硝酸盐总量由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量

( 3 )气相色谱法 测定前要进行衍生化以形成易挥发性的物质 硝酸盐的测定通常是将其衍生为硝基苯用热裂解检测器测定检测限为 100-200μgkg

亚硝酸根衍生物的分离一般采用非极性固定相

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 18: 第六章 食品添加剂分析

( 4 )液相色谱法 硝酸根和亚硝酸根的液相色谱测定方法大多采用阴离子交换法分离然后以抑制型电导或紫外检测用离子交换色谱法分析食品中硝酸根和亚硝酸根不仅简便快速而且选择性好准确度高

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 19: 第六章 食品添加剂分析

623 甜味剂 甜味剂是指能赋予食品甜味的一种食品添加剂 天然甜味剂主要是从植物组织中提取出来的甜味物质近

年也采用人工合成法获得它可分为糖醇类和非糖类 糖醇类木糖醇山梨糖醇甘露糖醇乳糖醇等 非糖类甜菊糖苷甘草奇异果素索马甜等 人工甜味剂主要是一些具有甜味但又不是糖类的物质它

的品种很多其中①磺胺类有糖精甜蜜素等②二肽类有阿斯巴甜阿力甜等③蔗糖的衍生物有三氯蔗糖帕拉金糖果糖低聚糖等

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 20: 第六章 食品添加剂分析

糖精 糖精是广泛使用的人工甜味剂我国规定糖精最大使用

量为 015gkg 糖精的甜味是蔗糖的 500倍但食后会有一种金属余

味通常与甜蜜素配伍使用由于糖精对人体并无营养作用也不是食品中的天然成分应尽量少或不用对婴幼儿食品病人食品和大量食用的主食食品不得使用

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 21: 第六章 食品添加剂分析

(1)比色法 糖精经氯仿苯提取分离后与酚和硫酸于 175加热转化成酚磺酞然后用碳酸氢钠处理形成的红色在 558nm波长测定 和标准比较而定量

(2)紫外吸收光谱法 食品中的糖精钠用透析法进行透析用乙醚提取转

至N aHCO3溶液中加盐酸和锌粉进行还原生成二氧化苯并异噻唑啉此还原生成物用紫外吸收光谱法进行定性定量测定

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 22: 第六章 食品添加剂分析

(3)薄层层析法 糖精在酸性条件下用乙醚提取浓缩后经薄层层析分离自薄层板上刮下定量溶解酸化后在波长 207nm

测定(4)纳氏比色法 糖精先经薄层分离自薄层板上刮下定量溶解后加 H 2SO4 和 H2O2 消化使成为铵盐然后和碘化汞碘化钾的复盐 (HgI2middot2KI)反应生成黄色化合物用铵盐为标准间接求出糖精的含量

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 23: 第六章 食品添加剂分析

( 5 )气相色谱法 GC 法测定糖精(钠)是将样品酸化后用乙酸乙酯提取

糖精提取液浓缩后用甲基化试剂衍生成甲基化合物用 GC测定

( 6 )液相色谱法 HPLC 法测定汽水果汁配制酒类中糖精钠为我国国家标准方法中的第一法( GBT 500928-2003)样品处理相对简单将样品加温除去二氧化碳和乙醇用氨水( 1 1 )调 pH 值约 7 过滤后就可以进样分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 24: 第六章 食品添加剂分析

624 色素 食用色素按其性质和来源可分为食用天然色素和食用

合成色素两大类 天然色素安全性较高但染色力弱稳定性较差叶绿

素类胡萝卜素花色苷等目前已经有 170 多种不同原料的天然色素常见的有叶绿素类胡萝卜素花色苷紫胶胭脂虫红红花素栀子黄焦糖色等

合成色素着色能力强且稳定性好但大多数对人体有害(一般毒性致泻性和致癌性)苋菜红胭脂红日落黄柠檬黄等

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 25: 第六章 食品添加剂分析

合成色素多以苯甲苯萘等化工产品为原料经过磺化硝化偶氮化等一系列有机反应化合而成因此食用合成色素多为含有 R-N=N-Rrsquo键苯环或氧杂蒽结构化合物它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 26: 第六章 食品添加剂分析

ldquo苏丹红rdquo风波ldquo苏丹红rdquo型色素是一种人造化学制剂全球多数国家都禁止将其用于食品生产这种色素常用于工业方面比如溶解剂机油蜡和鞋油等产品的染色科学家通过实验发现ldquo苏丹红rdquo会导致鼠类患癌它在人类肝细胞研究中也显现出可能致癌的特性

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 27: 第六章 食品添加剂分析

苏丹红是一种人工合成的偶氮类油溶性的化工染色剂 1896 年科学家达迪将其命名为苏丹红并沿用至今苏丹红被大量地用在工业化学和医学领域用于机油汽车蜡和鞋油等工业产品以及生化毒理学研究的着色剂等

目前苏丹红系列常见 4 种其中二号三号和四号均为一号的化学衍生物苏丹红一号为暗红色二号为红色三号为有绿色光泽的棕红色四号为深褐色

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 28: 第六章 食品添加剂分析

1995 年欧盟和其他一些国家已开始禁止在食品中添加苏丹红一号我国 1996 年出台的《食品添加剂使用卫生标准》中不包含苏丹红及其系列色素(标准中没有公布的添加剂不准用于食品中) 2003 年 6月欧盟规定所有进口的辣椒及其制品必须检测苏丹红项目确定未添加后方可进口并要求成员国对市场上销售的辣椒及其制品进行随机抽样检测

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 29: 第六章 食品添加剂分析

2005 年 3月国内已经证实的ldquo涉红rdquo产品名单肯德基 肯德基新奥尔良烤翅新奥尔良烤鸡腿堡调料亨氏美味源 (广州 ) 食品有限公司 美味源桂林辣椒油和美味源金唛桂林辣椒酱麦当劳 麦当劳西部烧烤调味汁 调味料麦当劳地戎芥末蛋黄酱 调味料麦当劳凯馓调味汁 (普通脂肪型 ) 调味料麦当劳凯馓调味汁 (低脂肪型 ) 调味料广州田洋食品有限公司 田洋牌ldquo辣椒红一号rdquo复合食品添加剂河北邯郸中进天然色素有限公司 辣椒精珠海市ldquo公仔 DOLLrdquo牌产品 公仔日式碗面牛肉味公仔米粉 劲辣牛肉味公仔面公仔拉面屋红烧牛肉 (两种 ) 公仔拉面屋红油排骨 牛肉味公仔面长沙ldquo坛坛乡rdquo调料食品有限公司 ldquo坛坛乡rdquo牌风味辣椒萝卜含有ldquo苏丹红四号rdquo

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 30: 第六章 食品添加剂分析

2006 年 11月河北白洋淀的ldquo红心鸭蛋rdquo苏丹红事件

2006 年 12月陕西出产辣椒面再现苏丹红

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 31: 第六章 食品添加剂分析

食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法 (GBT 19681mdash2005)

范围 本标准适用于食品中苏丹红染料的检测 本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法

方法最低检测限苏丹红Ⅰ苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ均为 10 ugkg

方法要点 样品经溶剂提取固相萃取净化后用反相高效液相色谱mdash紫外可见光检测器进行色谱分析采用外标法定量

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 32: 第六章 食品添加剂分析

样品处理1 红辣椒粉等粉状样品 称取 1 g~ 5g (准确至 0001g )样品于三角瓶中加入 1

0mL~ 30mL正己烷超声 5min 过滤用 10mL正己烷洗涤残渣数次至洗出液无色合并正己烷液用旋转蒸发仪浓缩至 5mL 以下慢慢加入氧化铝层析柱中为保证层析效果在柱中保持正己烷液面为 2mm左右时上样在全程的层析过程中不应使柱干涸用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶一并注入层析柱控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 05cm 待样液完全流出后视样品中含油类杂质的多少用 10mL~ 30mL正己烷洗柱直至流出液无色弃去全部正己烷淋洗液用含 5丙酮的正己烷液 60mL洗脱收集浓缩后用丙酮转移并定容至 5mL 经 045μm 有机滤膜过滤后待测

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 33: 第六章 食品添加剂分析

2 红辣椒油火锅料奶油等油状样品 称取 05 g~ 2g (准确至 0001g )样品于小烧杯中加入适

量正己烷溶解(约 1 mL~ 10mL )难溶解的样品可于正己烷中加温溶解按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

3 辣椒酱番茄沙司等含水量较大的样品 称取 10 g~ 20g (准确至 001g )样品于离心管中加 10m

L~ 20mL 水将其分散成糊状含增稠剂的样品多加水加入30mL正己烷丙酮 = 3 1 匀浆 5min 3000rpm离心 10

min 吸出正己烷层于下层再加入 20mLtimes2次正己烷匀浆离心合并 3次正己烷加入无水硫酸钠 5g 脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持 5 分钟用 5mL正己烷溶解残渣后按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱⋯⋯过滤后待测rdquo操作

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 34: 第六章 食品添加剂分析

4 香肠等肉制品 称取粉碎样品 10g~ 20g (准确至 001g )于三角瓶中加入 60mL正己烷充分匀浆 5min 滤出清液再以 20mLtimes2次正己烷匀浆过滤合并 3次滤液加入 5g无水硫酸钠脱水过滤后于旋转蒸发仪上蒸至 5mL 以下按 1 中ldquo慢慢加入到氧化铝层析柱中⋯⋯过滤后待测rdquo操作

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 35: 第六章 食品添加剂分析

推荐色谱条件1 仪器条件1048708 色谱柱 Zorbax SB-C18 35 μm 46mmtimes150mm (或相当型号色谱柱)1048708 流动相溶剂 A 01 甲酸的水溶液乙腈 = 85 15 溶剂 B 01 甲酸的乙腈溶液丙酮 =80 20

1048708 梯度洗脱流速 1mLmin 柱温 30 检测波长苏丹红Ⅰ 478nm 苏丹红Ⅱ苏丹红Ⅲ苏丹红Ⅳ 520nm 于苏丹红Ⅰ出峰后切换进样量 10μl

2 标准曲线 吸取标准储备液 0 01 02 04 08 16mL 用正己烷定容至 25mL 此标准系列浓度为 0 016 032 064 128 256μgmL绘制标准曲线

3 计算 按公式( 1 )计算苏丹红含量 R=CtimesV M middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ( 1 ) Rmdash样品中苏丹红含量单位为毫克每千克( mgkg ) Cmdash 由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度 (μgmL) Vmdash样液定容体积单位为毫升( mL ) Mmdash样品质量单位为克( g )

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 36: 第六章 食品添加剂分析

苏丹红标准色谱图

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 37: 第六章 食品添加剂分析

孔雀石绿

一种带有金属光泽的绿色结晶体又名碱性绿孔雀绿易溶于水溶液呈蓝绿色孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的染料类药物具有相当好的杀真菌效果由于鱼类在运输中易发生碰撞造成鱼鳞脱落而引起鱼体真菌感染以致出现霉烂死亡等现象孔雀石绿恰恰可以治疗这些鱼类碰撞伤因价格廉容易得用量少疗效高在过去水产养殖疾病防治中曾被广泛使用一些不法商贩滥用孔雀石绿包括在运输前使用孔雀石绿溶液对车厢进行消毒不少储放活鱼的鱼池也采用这种方式进行消毒

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 38: 第六章 食品添加剂分析

科研结果表明孔雀石绿具有高毒素高残留和致癌致畸致突变等副作用有ldquo苏丹红第二rdquo之称鉴于孔雀石绿的危害性美国英国日本等许多国家已禁止将其用于水产养殖业我国也于 2002 年 5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中禁止用于所有食品动物

但是 事实上包括我国和英国在内的许多禁用孔雀石绿的国家从对市场上销售的鱼类等水产品中孔雀石绿的监测情况来看 仍有在鱼场中非法使用孔雀石绿的现象

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 39: 第六章 食品添加剂分析

被孔雀石绿浸过的甲鱼

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 40: 第六章 食品添加剂分析

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定GBT 19857mdash2005

范围 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿( Leucomalachite green )结晶紫及其代谢物隐色结晶紫 (Leucocrystal violet)残留量的液相色谱 -串联质谱和高效液相色谱的测定方法

本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿结晶紫及其代谢物隐色结晶紫残留量的检验

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 41: 第六章 食品添加剂分析

原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸铵缓冲溶液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层经中性氧化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱 -串联质谱法测定内标法定量

液相色谱 -串联质谱法

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 42: 第六章 食品添加剂分析

样品制备 1 鲜活水产品 a) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 50mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液加入 11mL乙腈超声波振荡提取2min 8000rmin 匀浆提取 30s 4000 rmin离心5min 上清液转移至 25mL比色管中另取一 50 mL

离心管加入 11mL乙腈洗涤匀浆刀头 10s 洗涤液移入前一离心管中用玻棒捣碎离心管中的沉淀漩涡混匀器上振荡 30s 超声波振荡 5min 4000rmin离心5min 上清液合并至 25mL比色管中用乙腈定容至250mL 摇匀备用

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 43: 第六章 食品添加剂分析

b) 净化 移取 500mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上用 KD浓缩瓶接收流出液 4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱收集全部流出液 45旋转蒸发至约 1mL 残液用乙腈定容至 100mL 超声振荡 5min 加入 10mL5mmolL乙酸铵超声振荡 1min 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 44: 第六章 食品添加剂分析

2 加工水产品 c) 提取 称取 500g 已捣碎样品于 100mL离心管中加入 200μL

混合内标标准溶液依次加入 1mL 盐酸羟胺 2mL 对 -

甲苯磺酸 2mL 乙酸铵缓冲溶液和 40mL乙腈匀浆 2

min(10000rmin) 离心 3min(3000rmin) 将上清液转移到 250mL 分液漏斗中用 20mL乙腈重复提取残渣一次合并上清液于分液漏斗中加入 30mL二氯甲烷35mL 水振摇 2min 静置分层收集下层有机层于 15

0mL 梨形瓶中再用 20mL二氯甲烷萃取一次合并二氯甲烷层 45旋转蒸发近干

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 45: 第六章 食品添加剂分析

d) 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方 6mL乙腈分三次(每次 2mL )用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物并依次过柱控制阳离子交换柱流速不超过 06mLmin 再用 2mL乙腈淋洗中性氧化铝柱后弃去中性氧化铝柱依次用 3mL 2 ( vv )甲酸溶液 3mL乙腈淋洗阳离子交换柱弃去流出液用 4mL 5 ( vv )乙酸铵甲醇溶液 洗脱洗脱流速为 1mLmin 用 10mL刻度试管收集洗脱液用水定容至 100mL 样液经 02μm滤膜过滤后供液相色谱 -串联质谱测定

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 46: 第六章 食品添加剂分析

液相色谱 -串联质谱条件 a) 色谱柱 C18柱 50mmtimes21mm ( id )粒度 3μm b) 流动相乙腈 + 5mmolL乙酸铵 = 75+25(vv) c) 流速 02mLmin d) 柱温 35 e) 进样量 10μL f) 离子源电喷雾 ESI 正离子 g) 扫描方式多反应监测MRM h) 雾化气窗帘气辅助加热气碰撞气均为高纯氮气使用前应调节各气体流量

以使质谱灵敏度达到检测要求i) 喷雾电压去集簇电压碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 j) 监测离子对孔雀石绿mz 329313 (定量离子) 329208隐色孔雀石绿m

z 331316 (定量离子) 331239 结晶紫 mz 372356 (定量离子) 372

251隐色结晶紫 mz 374359 (定量离子) 374238氘代孔雀石绿 mz 3

34318 (定量离子) 氘代隐色孔雀石绿 mz 337322 (定量离子)

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 47: 第六章 食品添加剂分析

液相色谱 -串联质谱测定 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液以色谱峰面积按内标法定量孔雀石绿和结晶紫以氘代孔雀石绿为内标物计算隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿氘代孔雀石绿结晶紫氘代隐色孔雀石绿隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为 227

min 230min 288min 521min 531

min 561min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 48: 第六章 食品添加剂分析

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石

绿标准的离子流图

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 49: 第六章 食品添加剂分析

液相色谱 -串联质谱确证 按照液相色谱 -串联质谱条件测定样品和标准工作溶液分别计算样品和标准工作溶液中非定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值仅当两者数值的相对偏差小于 25时方可确定两者为同一物质

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 50: 第六章 食品添加剂分析

高效液相色谱法 原理 试样中的残留物用乙腈 -乙酸盐缓冲混合液

提取乙腈再次提取后液液分配到二氯甲烷层并浓缩经酸性氧化铝柱净化后高效液相色谱 -PbO2柱后衍生测定外标法定量

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 51: 第六章 食品添加剂分析

样品制备 1 提取 称取 500 g样品于 50 mL离心管内加入 15 mL 20

的盐酸羟胺溶液 25 mL 10 molL 的对 - 甲苯磺酸溶液 50 mL乙酸盐缓冲溶液用匀浆机以 10 000 rmin

的速度均质 30 s 加入 10 mL乙腈剧烈震摇 30 s 加入 5g 酸性氧化铝再次震荡 30 s 3 000 rmin离心 1

0 min 把上清液转移至装有 10 mL 水和 2 mL 二甘醇的 100 mL离心管中然后在 50 mL离心管中加入 10 m

L乙腈重复上述操作合并乙腈层

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

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孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 52: 第六章 食品添加剂分析

2 净化 在离心管中加入 15 mL 二氯甲烷 振荡 10 s 3 000 r

min离心 10 min 将二氯甲烷层转移至 100 mL 的梨形瓶中再用 5 mL乙腈 10 mL 二氯甲烷重复上述操作一次合并二氯甲烷层于 100 mL 梨形瓶中 45旋转蒸发至约 1 mL 用 25 mL乙腈溶解残渣

将酸性氧化铝柱安装在固相萃取装置上将梨形瓶中的溶液转移到柱上再用乙腈洗涤瓶两次每次 25 mL 把洗涤液依次通过柱控制流速不超过 06mLmin 收集全部流出液 45旋转蒸发至近干残液准确用 05 mL乙腈溶解过 045μm 滤膜滤液供液相色谱测定

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 53: 第六章 食品添加剂分析

液相色谱条件 a) 色谱柱 C18柱 250 mm times46mm ( id )

粒度 5μm 在 C18 色谱柱和检测器之间连接 25

PbO2 氧化柱

b) 流动相乙腈和乙酸铵缓冲溶液 c) 流速 10 mLmin

d) 柱温室温

e) 检测波长 618 nm(孔雀石绿 ) 588 nm( 结晶紫 )

f) 进样量 50 μL

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

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孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 54: 第六章 食品添加剂分析

液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶

紫或隐色结晶紫含量情况选定峰高相近的标准工作溶液标准工作溶液和样液中孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在仪器检测线性范围内对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下孔雀石绿结晶紫隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为 610min 788min 1777min 1

822min

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 55: 第六章 食品添加剂分析

孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫标准的液相色谱图

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 56: 第六章 食品添加剂分析

合成色素的检测样品的处理和吸附分离1 样品应先除去酒精脂肪蛋白质淀粉和二氧

化碳酒精可用加热法除去二氧化碳可用振摇法或超声法除去淀粉吸附的色素可用洗脱法将色素洗下来

2 然后在酸性条件下( pH4~ 5) 用脱脂羊毛或聚酰胺吸附色素

3 反复用柠檬酸酸化的 pH为 4 的热水清洗吸附物以除去水溶性杂质

4 用 10氨水 - 乙醇溶液洗脱色素收集洗脱液

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 57: 第六章 食品添加剂分析

( 1 )薄层色谱法(定性) 是目前国家标准方法 GBT 500935-2003推荐

的色素的吸附与解吸附方法在酸性条件下聚酰胺或脱脂羊毛能与水溶性酸性色素结合在碱性条件下又能解吸附将解析下来的色素用纸色谱或薄层色谱进行分离

将跑出来的色素斑点与标准品进行对照 Rf相同的为同一色素

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 58: 第六章 食品添加剂分析

( 2 )光度法 将薄层色谱的条状色带分别用刮刀刮下用乙醇 - 氨溶液解吸色素过滤后真空浓缩至干用适当的溶剂溶解后于最大吸收波长处测定吸光值便可知道其含量通过其吸收光谱可判断为何种色素

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 59: 第六章 食品添加剂分析

根据物质对光的吸收具有选择性应用紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描发现胭脂红苋菜红柠檬黄日落黄和亮蓝等 5 种不同的色素具有不同的吸收谱图与标准谱图对照即可直观快速地定性且一定浓度下峰高与含量成正比故可定量从而建立了紫外可见吸收光谱法测定食用合成色素

( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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( 3 ) HPLC法 HPLC 法测定合成色素具有方法灵敏重现

性好准确度高等特点已成为色素分析的主要方法 HPLC 法已列入我国色素国家标准方法 (GBT500935-2003) 的第一法

采用具有二极管阵列检测器的 HPLC可以通过比较各峰的保留时间和紫外可见吸收光谱与标准品的是否相同来定性通过峰面积来定量

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 61: 第六章 食品添加剂分析

625 酸度调节剂 有机酸广泛存在于水果蔬菜中它能使食品具

有一定的风味质地和色泽具有防腐和抗氧化作用

食品中的主要有机酸为乙酸乳酸丁二酸柠檬酸酒石酸苹果酸等食品中有机酸的种类含量与构成对食品的味道有很大的影响因此有机酸的定性与定量分析不仅对食品营养学研究意义重大而且在食品生产过程的质量管理中也必不可少

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 62: 第六章 食品添加剂分析

用于有机酸分析的方法很多滴定法和 pH 酸度计一般用于食品中总酸度的测定气相色谱法分析时需要先衍生再进行测定而高效液相色谱没有这种限制因此在有机酸分析中得到广泛应用

( 1 )气相色谱法 气相色谱分析有机酸时需要衍生化后再进行测定这是

因为①有机酸的沸点较高不容易气化②有机酸具有极强的吸附性极性和较强的反应活性在进样器内衬管柱管和检测器连接处都容易被吸附形成严重的拖尾峰难以准确定量

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 63: 第六章 食品添加剂分析

测定有机酸一般利用羧基与醇的酰基化作用生成易挥发性的甲酯乙酯正(异)丙酯和正(异)丁酯等采用非极性固定相的色谱柱分离快速程序升温得到很好的效果

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 64: 第六章 食品添加剂分析

( 2 )高效液相色谱法 HPLC 分析有机酸不仅简便快速而且选择性好准确度高

根据分离机理有机酸的 HPLC可以分成离子色谱 (IC) R

P-HPLC 和凝胶渗透色谱 (GPC)三大类 RP-HPLC 一般使用弱极性 ODS 固定相和极性比 ODS 固定相要强的流动相有机酸分子可直接在两相中分配各种有机酸因分配系数不同而被分离为了使有机酸尽可能地以分子形式存在一般使用酸性流动相来抑制有机酸的离解磷酸氢盐是典型的淋洗液有时为了改善峰的形状在流动相中加入适量的有机溶剂如甲醇通常采用 UV检测

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 65: 第六章 食品添加剂分析

用 RP-HPLC 分析食品中有机酸时最常遇到的问题就是来自食品中其它有机物质的干扰近几年人们已经开始探讨用 RP-HPLC同时分离有机酸和其它有机化合物例如有机酸和酚类有机酸氨基酸和糖有机酸和糖精的同时分离等等随着 ODS柱的研究开发今后在有机酸和其它有机物的同时分离方面还将有进一步的研究和应用

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 66: 第六章 食品添加剂分析

二氧化硫亚硫酸及其盐类 SO2 亚硫酸及其盐类具有漂白脱色抗氧化

和防腐作用其在食品中的残留量以二氧化硫计亚硫酸及其盐类毒性较小人少量摄取时在体内迅速氧化成硫酸盐排出体外 1d 摄取 1g未发现任何障碍 1d 摄取 4-6g 对胃肠有损害能造成激烈腹泻慢性影响可引起头痛对肝脏有一定损害使红血球血红蛋白减少因此我国对其采取限量使用在食用淀粉中规定其二氧化硫残留量不能超过 30mgkg

626 食品漂白剂

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 67: 第六章 食品添加剂分析

亚硫酸盐这类化合物不适用于动物性食品以免产生不愉快的气味亚硫酸盐对维生素 B1 有破坏作用故维生素 B1 含量较多的食品如肉类谷物乳制品及坚果类食品也不适合

经常用于白糖饼干粉丝葡萄酒果脯蜜饯等产品中

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 68: 第六章 食品添加剂分析

二氧化硫分析方法主要有滴定法吸光光度法顶空气相色谱法及高效液相色谱法等其中光度分析是目前检测的主要手段

( 1 )滴定法 滴定法的测定原理是样品用 1molL 盐酸或 2m

olL磷酸酸化后加热回流同时样液通氮保护防止亚硫酸盐的氧化亚硫酸盐迅速转化为 SO2 S

O2随水汽导入 3 H2O2吸收液中被氧化成 H2S

O4 然后用标准碱液进行滴定

灵敏度有限不能检出低于 10mgL 的 SO2

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 69: 第六章 食品添加剂分析

( 2 )盐酸副玫瑰苯胺比色法

原理二氧化硫被四氯汞钠吸收液吸收后形成一种稳定的配合物再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质其颜色深浅与二氧化硫含量成正比通过比色可以计算出样品中二氧化硫的含量此法是国内外广泛采用的较成熟的吸光光度法

灵敏度高选择性好但吸收液毒性较大

( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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( 3 )气相色谱法

亚硫酸盐经 Harvey 法修饰后用氢火焰检测器检测方便准确可靠

采用顶空进样技术可直接测定酒类样品中游离 SO2

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 71: 第六章 食品添加剂分析

( 4 )液相色谱法 食品中亚硫酸盐主要以亚硫酸氢盐形式存在由

于 HSO3- 化学性质不如 SO3

- 稳定因此在测定时提高溶液 pH 值使 HSO3

- 变成 SO3- 或在 pH 值

为 2-7范围内 HSO3-与甲醛反应生成稳定的羟

甲基磺酸盐( HOCH2SO3-)

3 2 3HCHO HSO HOCH SO

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 72: 第六章 食品添加剂分析

过氧化苯甲酰 过氧化苯甲酰作为漂白剂已被广泛用于面粉及其

它食品的增白加入过氧化苯甲酰后在破坏类胡萝卜素等色素的同时起到增白的作用还可以防霉变但过量的过氧化苯甲酰添加到面粉中会使营养物质受到破坏食用后还会产生苯甲酸苯甲酸的分解过程是在肝脏中进行的过量食用对肝脏功能会有不同程度的损害我国规定过氧化苯甲酰在面粉中的最大添加量为 60mgkg

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 73: 第六章 食品添加剂分析

过氧化苯甲酰的测定方法有分光光度法气相色谱法和液相色谱法

( 1 )分光光度法 在酸性条件下采用铁粉将过氧化苯甲酰还原

为苯甲酸根据苯甲酸能同水蒸气一起蒸馏出来的特点进行两次蒸馏使苯甲酸先后与不挥发性成分和被氧化分解的有机物分离依据苯甲酸钠在 225nm 处的吸光值与标准曲线比较可较准确地测得其含量

( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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( 2 )气相色谱法

样品中的过氧化苯甲酰经无水乙醇提取用碘化钾将其还原为苯甲酸在气相色谱上测定苯甲酸从而定量过氧化苯甲酰的量

FID检测器最低检出量为 05mgkg

( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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( 3 )液相色谱法 过氧化苯甲酰添加到食品中使用后会分解成苯

甲酸样品中过氧化苯甲酰和苯甲酸可用乙醚提取由于过氧化苯甲酰和苯甲酸的理化性质差别较大因此同时测定比较困难可采用两种流动相对它们进行分别测定

测定过氧化苯甲酰的流动相甲醇 - 水 (8020)

测定苯甲酸的流动相 003M磷酸盐缓冲液 (pH

65)- 甲醇 (955)

627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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627 抗氧化剂 抗氧化剂主要为了防止食品被氧化而变质延长食品的保

质期和保鲜作用的一种食品添加剂抗氧化剂的作用机理有多种可能 有的抗氧化剂是由于本身极易被氧化首先与氧反应从而保护了食

品如抗坏血酸 有的抗氧化剂可以放出氢离子将油脂在自动氧化过程中所产生的过氧

化物分解破坏使其不能形成醛或酮的产物如硫代二丙酸二月桂酯等

有些抗氧化剂可能与其所产生的过氧化物结合形成氢过氧化物使油脂氧化过程中断而本身则形成抗氧化剂自由基抗氧化自由基可形成稳定的二聚体或与过氧化自由基结合形成稳定的化合物如 B

HA BHT TBHQ PG 和茶多酚等

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 77: 第六章 食品添加剂分析

抗氧化剂有天然物质和化学合成物质两大类天然抗氧化剂主要有维生素 C 维生素 E 和茶多酚等常用的合成抗氧化剂有

BHA 加热后效果保持性好它是目前国际上广泛使用的抗氧化剂之一毒性很小较为安全

BHT 稳定性较高耐热性好是目前国际上特别是在水产加工方面广泛应用的廉价抗氧化剂毒性比 BHA 高

PG 对热比较稳定对猪油的抗氧化作用比 BHA 和 BH

T 强毒性较低 TBHQ 较新的一类酚类抗氧化剂

合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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合成抗氧化剂的检测样品处理 测定抗氧化剂的样品处理并不容易特别是在低含量时从复杂基体中提取时其它干扰组分同时被提取出来从脂肪中提取抗氧化剂最常用的溶剂是乙腈和甲醇水溶液脂肪通常溶解于正己烷或石油醚中用乙腈或甲醇水溶液可以把抗氧化剂抽提出来

( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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( 1 )气相色谱法 早期气相色谱法测定食品中 BHA 和 BHT 样品

处理包括匀浆柱层析用二硫化碳洗脱柱子上的抗氧化剂而后将洗脱液注入气相色谱中

采用蒸汽蒸馏法提取油脂样品中的 BHA 和 BHT 可除去大量干扰物质馏出物冷凝后导入丁醇溶液中然后导入气相色谱中

毛细管色谱柱具有高的分离效率适用于基体复杂的样品分析而且可以提供准确定量因此在抗氧化剂分析中得到广泛应用

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 80: 第六章 食品添加剂分析

( 2 )液相色谱法

HPLC 分析抗氧化剂适用范围很广用梯度洗脱时一次进样分析可同时分离极性和非极性的所有抗氧化剂在 280nm 处UV检测或 315nm 处荧光检测

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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Page 81: 第六章 食品添加剂分析

例 Page 等建立了脂肪和油脂中 GA THBP TBHQ NDGA BHA BHT 等的 HPLC测定方法该法也适用于干货食品的分析取 10g

样品分别加 25ml正己烷 5ml 水和 75ml乙腈均质离心过滤正己烷相和样品再用乙腈提取两次将合并的乙腈溶液浓缩至 10ml 用 C18柱分离对固体样品如薯片蜜饯等样品需要重复提取两次对干酪谷物食品糕点等食品提取一次便可以

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