第九章 动物组织培养

第一节、动物组织培养的基础一、动物细胞 特点； 无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养 50 代即开始退化

二、 动物细胞培养定义动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。

Classification of Cell CulturesPrimary CultureCells taken directly from a tissue to a dishSecondary CultureCells taken from a primary culture and passed or divided in vitro.These cells have a limited number of divisions or passages. After the limit, they will undergo apoptosis.Apoptosis is programmed cell death

Primary Culture

retention of the 3D shape

outgrowth and migration of cells

细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。

3 、生长特性根据形态特征分类贴壁型（粘附型细胞） 上皮细胞型、 成纤维细胞型、

游走细胞型、 多形细胞形。

粘附生长本是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。

两种贴壁的培养细胞

Contact nhibitionWhen cells contact each other, they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycleTransformed cells will continue to proliferate and pile upon each other

悬浮型体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。

第二节、常用的细胞培养方法一、培养细胞的生存环境1.环境无毒和无菌；2.适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为 35－ 37℃ 。3.气体环境和氢离子浓度；需要一定量的 O2（ 1995－ 9975pa）和 CO2（ 95％空气+5%CO2）； pH7.2-7.44.渗透压； 260－ 320mOsm/kg适用于大多数细胞5.营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要 12种基本氨基酸和谷胺酰胺等

二、动物细胞培养的特殊性1 、大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。 2 、动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。

3 、对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。 4 、动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长。 对环境的影响又比微生物为大，因此常用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供氧和调节 pH 。

三、 Medium

• liquid in which cell are grown

• contains – physiologic (pH, osmolarity)– supraphysiologic (hormones, nutrients)– nonphysiologic (dyes, antibiotics)

Medium

Medium

Medium

• Dissolved gases– to control pH together with NaHCO3

H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3-

– Handerson-Hasselbach eqn predicts pH:• pH = 6.0966+log([HCO3

- ]/[CO2 ])

5-10% ambient COCO22 dissolves in the medium

decreasing pH

addition of NaHCONaHCO33 increases HCOHCO33

-- thus thus

promotes Hpromotes H22C0C033 formation formation

increasing pHincreasing pH

Medium

• Dissolved gases– What if 5% 10%?

• pH drops to 7.2 from 7.4

• Oxygen consumption by cells:– delivery is different than in vivo– diffusion as opposed to hemoglobin transport– limited by

• solubility of oxygen in media at 37 C• transport from gas phase to cell surface

– dissolution, diffusion and consumption

• Pg, Oxygen tension provided by the incubator

•Pc, Oxygen tension at the bottom of the dish

•Diffusion based on Fick’s law

•D*K*(Pg-Pc)/d

•where D: diffusivity of O2 in water at 37C

•uptake rate = diffusion rate

y solubilitoxygen :K

constant Mensten-Michaelis :Km

type) cell and# cell on (depends rate uptake oxygen maximum :Vm

d

PPDK

PK

PV cg

cm

cm

Medium

• Oxygen: pH of the medium at high cell #?– O2 consumption per unit area increases

– O2 concentration on the cell surface decreases

– shift to anaerobic metabolism

– formation of lactic acid and CO2!

– be alarmed if phenol red turns to orange!

Medium

• Pc and media height and Pg….

– Pc depends on Pg and d

Pg Pc

– note much lower Pc at the corresponding Pg…

• due to low solubility of O2 and diffusion barrier

– Cells spread with Pg, why?

d, diffusion resistance, Pc

Medium

• Serum– liquid that remains after plasma is allowed to

clot– added to medium by 1-20% v/v– calf, fetal bovine, horse, human– batch to batch variation!!– contents interfere with what cells produce (use

radiolabeling)

Solutions used in cell culture

①Phosphate Buffered Saline - Ca2+ Mg2+ Free (PBS-CMF)Used to wash/remove excess serum that inhibits the function of TRED. Calcium will also inhibit the function of TRED.Must be warmed in the water bath before use so cells are not shocked by cold liquid.

Trypsin EDTA (TRED)An enzyme used to detach the cells from a culture dish.Trypsin cleaves peptide bonds (LYS or ARG) in fibronectin of the extracellular matrix.More about fibronectin and the ECM next weekEDTA chelates calcium ions in the media that would normally inhibit trypsin.

Trypsin will self digest and become ineffective if left in water bath more than 20 minutes.Trypsinizing cells too long will reduce cell viability

Trypan BlueAn exclusion dyeLiving cells cannot take up the dye and will appear bright and refractile.Dead cells with broken membranes will absorb the dye and appear blue.Usually add 200 l of trypan blue to 200 l of cell suspension in eppendorf tube

四、常用的培养方法（ 1 ）、悬滴培养法 是最早建立的体外培养技术，是组织、器官培养的经典方法，最早是由 Harrison于 1907 年创立的。基本要点是：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片之上，最后用熔蜡密封后放入培养箱中培养。

单玻片的再培养• 1 ）用消毒剃须刀刮去盖玻

片四周的石蜡• 2 ）用镊子小心揭开盖玻片，

培养物面朝上，放入培养皿内。

• 3 ）用白内障刀切除生长晕周围部分，留下方形培养物，并切成小块。

• 4 ）将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。

（ 2 ）培养瓶培养法将拟培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。凡是可以用于培养生物结构的瓶子都可称为培养瓶。

（ 3 ）旋转管培养法将培养物接种于一管状培养器皿中，再将其固定在一可以旋转的装置上，旋转培养的一种方法。

（ 4 ）灌注小室培养法将细胞接种于一个由上下两个盖玻片（分别构成上壁与下壁）与一金属圈（构成侧壁）密封围成的小室内，保持在一定条件下培养。在小室的侧面分别有液体流入和流出的开口，供新鲜培养液流入小室和旧培养液排出。 最初是 1912 年由 Burrows尝试设计了一种简单的灌注小室培养模型。

（ 5 ）培养板培养法具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在 CO2 培养箱内培养。最常用的培养板有 6 孔、 24 孔和 96 孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。

第三节、培养细胞的生长与保存一、培养细胞的生长阶段（一）原代（初代）培养期 • 指从体内取出组织接种培养到第一次传

代培养这个阶段，一般持续 1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。

（二）传代期

• 原代培养细胞一经传代后便该称为细胞株，在全生命期中该阶段的持续时间最长。一般情况下，当传代 10-50 次后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。

（三）衰退期

• 该阶段细胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，最后开始衰退凋亡。

Kinetics of GrowthLogarithmic

scale!!!

Cells reach confluence (cover all

available surface)

二、原代培养与传代培养技术

• 原代培养 的过程图解

机械分散组织细胞方法

• 消化初代培养法基本步骤

组织块初代培养法

一般传代培养的步骤 • (1)  吸出培养瓶内旧培养液。• (2)  加入胰蛋白酶和 EDTA混合液盖满瓶底。• (3)  2 ～ 5 分钟后检查，如有细胞间隙变大，细

胞质回缩现象，终止消化。• (4)  吸出消化液，加入 Hanks 液，轻轻转动以免

细胞流失，洗去残留的消化液。如果单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。

• (5)  用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，计数后记录其浓度。

（ 6 ）重新接种培养。

消化法传代培养步骤

三、 Cryopreservation• How does freezing induce

damage?– cool too fast formation

of ice crystals inside the cell– cool too slow hypertonic

extracellular solution dehydration

– transport of water across membrane thermo dynamics of ice formation kinetics of ice growth

• Thawing rate is also important (thaw rapidly)

要点用慢冻快融的方法：标准的冷冻速度为－ 1 －－ 2 度 / 分，当温度达－ 25度时，下降率可增至－ 5 度至－ 10度 / 分，到－ 100度时，则可迅速浸入液氮中。要适当掌握下降速度，过快会影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成，但各种细胞对冻结速度要求也不一样。总之，在一开始时，下降速度不能超过－ 10/分钟。另外，用什么防护剂合适和用量多少，要依赖细胞而定。最好冻存一年后，再复苏培养一次，然后再继续冻存。

四、 Contaminants• Sterile culture practice• Signs

– cloudiness– observable colonies– change in pH (medium color changes)

• Microbes– bacteria

• rod, cocci, spheres• motile• bacterial endotoxin elicits cell response• endotoxin may damage even before visual manifestation of

colonies• commercial kits for endotoxins

• Microbes (cont.)

– yeast

• round refractile particles

– fungi (molds)

• thin filamentous extensions

– mycoplasma and virus

• difficult to detect visually

• can pass through filters

• be alert for unexpected behavior in culture (morphology, growth rate etc.)

• use commercial kits

Fungus

http://www.unc.edu/depts/tcf/badbug_index.htm

http://www.unc.edu/depts/tcf/badbug_index.htm

微生物防治①多数污染无法挽救，弃之②细胞培养的关键在于无菌操作③利用抗生素，加温处理，动物体内接种等处理污染。另外：防止细胞交叉污染

第四节、器官培养一、概念从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外的一定的环境中培养。

主要强调器官组织的相对完整性。

⑴组织厚度和直径＜ 1mm ，使之能靠自然渗透来维持氧气和营养。

⑵保证内部细胞有足够的氧气渗入，可以提高氧分压或加注纯氧。

⑶附加特殊的培养基如生长因子，激素

二、培养方法１、表玻璃器官培养法

• 表玻璃器官培养法是由 Fell 和 Robinson于 1929 年建立的一种器官培养的经典技术。技术要点是：在一块表玻璃内加上鸡胚提取液和鸡血浆，凝固后将所培养的器官移植到上面，然后一起置于一培养皿内，送入培养箱内培养。

• A 上面观• B 侧面观

２、琼脂凝胶培养法• 与血凝块比较，琼脂固体培养基的优点

在于基质不液化，细胞在琼脂上的迁移受到限制。

• Wolff 和 Schneider采用改良后的琼脂培养基成功进行了胚胎器官的发育及形态发生的研究，后来又利用琼脂凝胶培养基进行了肿瘤组织的培养。由此而设计了 Wolff 器官培养法。

３、擦镜纸培养法 • Chen发现擦镜纸具有疏水性，可以漂浮

在培养液表面作为培养器官的支持物，同时，培养液可以透过擦镜纸而进入培养器官的内部，从而设计了擦镜纸培养法，这是最早的在气——液表面进行器官培养的方法。需注意的是，在将植块放于擦镜纸上面时要尽量小心，以免下沉。

４、金属格栅器官培养法 • 由于漂浮支持物很难长久地漂浮于培养

液表面，需要用坚硬的支持物替代。 1954 年 Trowell 创立了金属格栅器官培养法。

• 金属格栅要采用坚实的网格，保证平稳、安全地支托或移动大量的培养器官，而且必须平坦且与培养液平行。

５、琼脂小岛器官培养法 • 使用琼脂制成小岛状的支持物，放在液体培养

基中，然后将要培养的器官置于琼脂上面进行培养。琼脂不但具有支持作用，而且还可防止培养器官的细胞发生迁移。这种方法可以在培养过程中直接观察植块的生长状况，而且，既具有琼脂凝胶培养法能维持器官较长时间在体外生长、抑制细胞迁移的优点，又具有采用液体培养基换液简便的特点。此外，固相和液相培养基共存，从而可在同一培养体系中加入不同的营养成分，使在同一培养系统中培养不同的器官成为可能。

６、陈氏滤纸虹吸器官培养法 • 陈瑞铭 1964 年发明的。• 在一标本缸内放置一玻璃制成的架子，架子上放

置一玻璃船，船内装培养液，船边悬挂滤纸。缸盖是一张带三个孔的玻璃板，两侧的孔供气体进出，中间的孔用作向玻璃船内灌注培养液。器官可以贴在滤纸上进行培养，营养的供应主要靠滤纸的虹吸作用。优点是可持续地、适量地获得营养、一个支持面可以同时培养较多的植块、能随时收集培养液或植块进行分析、观察。

７、灌流式器官培养方法 • 很多种培养方法都需要经常更换培养液，

而且还不能保持器官生存环境的稳定。操作麻烦、易被污染，而且也不利用对代谢过程进行研究。

• 1938 年， carrel 和 Lindberg 尝试了采用无菌循环装置培养猫的甲状腺，并维持了数星期。他们用泵将营养液泵入器官内，并经过器官循环后流出，这是最早的灌注式培养器官。

睡醒了嗎？--謝謝各位 !