第五章 分子发光分析法第五章 分子发光分析法

第五章 分子发光分析法第五章 分子发光分析法

分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理 介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光介绍荧光磷光光谱的产生、主要影响因素、荧光

强度与被测物质之间的关系强度与被测物质之间的关系 荧光分析仪器荧光分析仪器 分子荧光定量分析分子荧光定量分析 简介化学发光简介化学发光

§ 5- 1 § 5- 1 概述概述一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁

到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法方法为分子发光分析法

较高激发态

基 态

吸收能量受激

光辐射退激

分子在退激过程中以光辐射形式释放能量

根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：为以下几类：

光致发光：以光致发光：以光源光源来激发而发光来激发而发光

电致发光：以电致发光：以电能电能来激发而发光—来激发而发光—原子发射光谱法原子发射光谱法 生物发光：以生物发光：以生物体释放的能量生物体释放的能量激发而发光激发而发光 化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能激发而发光—激发而发光—化学发光分析化学发光分析

法法

荧光—荧光分析法

磷光—磷光分析法

二、分子荧光分析法的特点二、分子荧光分析法的特点1. 1. 灵敏度高灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，

可提高荧光强度可提高荧光强度

采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低 2~4 个数量级

激发

发射荧光强

强

激发光 物 质激发光 物 质

2. 2. 选择性好选择性好 不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发

光波长光波长 不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光

波长波长 比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3. 3. 实验方法简单实验方法简单4. 4. 待测样品用量少待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广 具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，

广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。产品分析、卫生检疫等领域。

荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法

§ 5- 2 § 5- 2 荧光和磷光光谱法荧光和磷光光谱法一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁价电子跃迁

产生荧光和磷光产生荧光和磷光 基态分子 价电子跃迁到激发态基态分子 价电子跃迁到激发态光照激发

去激发光 * * n

基 态基 态 在光致激发和去激发光的过程中，分子中在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（ 的价电子（ 、 n 电子）处于不同的自旋状电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述态，通常用电子自旋状态的多重性来描述

1. 1. 电子自旋状态的多重性电子自旋状态的多重性 大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道

中两个电子自旋方向总是相反的中两个电子自旋方向总是相反的 ，处于基态单 ，处于基态单重态。用 “重态。用 “ SS00” ” 表示 ；当物质受光照射时，基表示 ；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 旋 = 0 .= 0 . 这种跃迁是符合光谱选律的 这种跃迁是符合光谱选律的

基态单重态 SS00

第一激发单重态 SS11

SS00, S, S11, S, S22, S, S33 分别代表基态分别代表基态 , , 第一第一 , , 二二 , , 三激发单重态三激发单重态

单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为 10-8

若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态→激发三重态，净自旋 由基态单重态→激发三重态，净自旋 00 。这种跃。这种跃迁为禁阻跃迁迁为禁阻跃迁

TT11 、、 TT22 、、 TT33 分别表示第一、二、三激发三重态 分别表示第一、二、三激发三重态

基态单重态 SS00

第一激发三重态 TT11

自旋平行

三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-4~1S

分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激方式：无辐射去激和辐射去激

2. 2. 无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去无辐射去激——不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：

内部转换（内部转换（ ICIC ））—相同的多重态之间的转换 —相同的多重态之间的转换 S-SS-S 系间窜跃（系间窜跃（ ISCISC ））—不同的多重态之间的转换 —不同的多重态之间的转换 S-T S-T 振动驰豫（振动驰豫（ VRVR ））—同一电子能级中，从较高振动能—同一电子能级中，从较高振动能

级到较低振动能级的过程级到较低振动能级的过程 外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相外部转移—指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭

发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向， SS11—T—T11 间进行，比内部间进行，比内部转换困难 转换困难

T1

S0

ISC

VR

VRIC

吸光 吸光

S0

S1

S2

VR ：振动驰豫

IC ：内部转换

ISC ：系间窜跃

3. 3. 荧光和磷光光谱的产生—辐射去激荧光和磷光光谱的产生—辐射去激 处于处于 SS11 或或 TT11 态的电子返回态的电子返回 SS00 态时，伴随有发光态时，伴随有发光

现象，这种过程叫辐射去激 现象，这种过程叫辐射去激 SS11 或或 TT11 S S00

发光（（ 11 ）荧光：）荧光： 当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态 SS11 的最低振动能级回到的最低振动能级回到基态基态 SS00 各振动能级所产生的光辐射叫荧光各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 1100-9-9~10~10-6-6ss ，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到辐射去激消耗能量后到 SS11 的最低振动能级，发射荧的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。 光，荧光波长比激发光波长长。 荧荧 >> 激激

T1

S0

ISC

VR

VRIC

吸光 吸光 荧光

图 5-1 分子荧光光谱产生过程示意图

S0

S1

S2

VR ：振动驰豫

IC ：内部转换

ISC ：系间窜跃

（（ 22 ）磷光）磷光 当当受激电子降到受激电子降到 SS11 的最低振动能级后，未发射荧的最低振动能级后，未发射荧

光，而是经过系间窜跃到光，而是经过系间窜跃到 TT11 振动能级，经振动驰振动能级，经振动驰豫到 豫到 TT11最低振动能级，从最低振动能级，从 TT11最低振动能级回到最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光基态的各个振动能级所发射的光叫磷光

从从 TT1 1 SS11 要改变电子自旋，发光速度慢，约为 要改变电子自旋，发光速度慢，约为 1100-4 -4 ~ 10s~ 10s ，光照停止后，磷光仍可持续一段时间，光照停止后，磷光仍可持续一段时间

分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长波长更长

磷 磷 > > 荧荧 > > 激激 * 易产生荧光 n * 易产生磷光

T1

S0

ISC

VR

VRIC

吸光 吸光 荧光 磷光

图 5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图

S0

S1

S2

VR ：振动驰豫

IC ：内部转换

ISC ：系间窜跃

VR

二、荧光、磷光与分子结构的关系二、荧光、磷光与分子结构的关系 了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产

生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体弱荧光体变成强荧光体

（一）荧光效率 （一）荧光效率 荧光强度常用荧光量子效率荧光强度常用荧光量子效率 φφf f 来描述来描述

荧光量子效率 荧光量子效率 ff = =发荧光的分子数

激发态分子总数

ff 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力， 质发射荧光的能力， ff 越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在 0~10~1之间之间

若以各种跃迁速率常数来表示若以各种跃迁速率常数来表示

KKf f 为荧光发射过程的速率常数——取决于为荧光发射过程的速率常数——取决于物质的化学结构物质的化学结构

∑∑KKi i 为非辐射跃迁的速率常数之和——主要为非辐射跃迁的速率常数之和——主要取决于化学环境，也与化学结构有关取决于化学环境，也与化学结构有关

分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在率在 0.1~10.1~1 之间之间

if

ff KK

K

至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系述荧光与分子结构之间的关系

一般情况，一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物有机芳香族化合物及金属离子配合物是是最强最有用的荧光体最强最有用的荧光体

（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系 物质只有吸收了紫外可见光，产生物质只有吸收了紫外可见光，产生 *n *n ** 跃跃

迁，产生荧光迁，产生荧光 ** 与与 n n ** 跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大 101022~1~1

0033 ，寿命短，寿命短 ** 跃迁常产生较强的荧光， 跃迁常产生较强的荧光， n n ** 跃迁产生跃迁产生

的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光

1. 1. 共轭体系——有较强的荧光共轭体系——有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭电子共轭

程度越大，越易产生荧光程度越大，越易产生荧光 ; ; 环越多，共轭程度越环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强

ff ex ex /nm/nm emem /nm /nm

0.11 205 278

0.29 286 310

0.46 365 400

苯

萘

蒽

350菲线状环结构比非线状结构的荧光波长长

• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光• 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定• 3 ， 4 - 苯并芘是强致癌物

ex ex = 386 nm= 386 nm

emem = 430 nm = 430 nm

2. 2. 刚性平面结构—较稳定的平面结构刚性平面结构—较稳定的平面结构 具有强荧光的分子多数有刚性平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构

o

coo-

oo-

coo-

oo-

荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质

酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质

例 例 11 ，， 2 - 2 - 二苯乙烯二苯乙烯

反式：平面构型

强荧光体

顺式：非平面构型

非荧光体

C=CH H

C=CH

H

（三）金属螯合物的荧光（三）金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定的测定

不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与 MMn+n+

形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光生荧光

例：例： 8-8-羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与 MMn+n+— Al— Al3+3+ 、、 MgMg2+2+ 形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强

NOH

NOH

M

（四）取代基的类型（四）取代基的类型

————取代基对荧光物质的荧光特征和强取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：度也有很大影响。分成三类：

（（ 11 ）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 —— 有 —— 有 -OH-OH 、、 --OROR 、 、 -NH-NH22 、、 -NHR-NHR 、、 -NR-NR22 等给电子基团等给电子基团

由于基团的 由于基团的 n n 电子（孤对电子）的电子云与电子（孤对电子）的电子云与苯环上的 苯环上的 轨道平行，共享了共轭 轨道平行，共享了共轭 电子， 电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强度增强

（（ 22 ）减弱荧光的取代基 ）减弱荧光的取代基 ———— -COOH -COOH 、 、 -NO-NO

22 、、 -COOR -COOR 、、 -NO-NO 、、 -SH -SH 吸电子基团吸电子基团 , , 使荧光使荧光波长短移，荧光强度减弱波长短移，荧光强度减弱

• 芳环上被芳环上被 FF 、、 ClCl 、、 BrBr 、、 I I 取代后，使系间窜跃取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。重原子效应。

（（ 33 ）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 —— —— -NH-NH33++ 、、 -R-R 、、

- SO- SO33HH 等等

三、环境对荧光、磷光的影响三、环境对荧光、磷光的影响 1. 1. 溶剂的影响溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不

同的荧光性质同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，

荧光强度增大荧光强度增大 2. 2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度温度的影响——低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非

辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。减弱。

温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大

3. pH3. pH 的影响的影响 大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧

光性质受溶液光性质受溶液 pHpH 的影响很大的影响很大 共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具

有各自的荧光效率和荧光波长有各自的荧光效率和荧光波长OH O

_

OH

H+

_例： 苯酚

离子化后，荧光消失

pH≈1有荧光

pH≈13无荧光

但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光

例：—苯酚

有荧光无荧光

OH O_

另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性

四、荧光强度与荧光物质浓度的关系四、荧光强度与荧光物质浓度的关系 用强度为用强度为 II00 的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质

时，产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度 IIff 用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光浓度很稀 浓度很稀 (A(A<0.05<0.05)) 时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度IIf f 与浓度有下面的关系与浓度有下面的关系

IIff = = f f IIaa= = f f （（ II00- I - I ）） IIaa 为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度

II00 为入射光强度为入射光强度

荧光池II00 II

IIff 荧光强度检测器

I

IA 0lg

IIff = = f f （（ II00- I- I001010-A-A ）） = = f f II00 （（ 11-10-10-A-A ））

I = I = II001010-A-A

将上式展开

]!3

)3.2(

!2

)3.2(3.2[

32

0

AA

AII ff

]!3

)3.2(

!2

)3.2(3.2[

32

0

AA

AII ff • 当 A 0.05﹤ 时，方括号中其它各项与第一项相比

可忽略不计，上式简化 IIff = 2.3 = 2.3 f f II00A A

=2.3 f f II00 bcbc

当 A 0.05﹤ 时， IIff 与 与 f f 、、 II00 、、 和和 c c 有关，有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时， 对一给定物质，当激发光波长和强度一定时， f f 、、 II00 、、 和和 bb 为常数，合并为为常数，合并为 KK

IIf f = KC= KC

IIpp = KC = KC定量分析依据定量分析依据

荧光强度与物质浓度呈线形关系，荧光强度与物质浓度呈线形关系， IIff=KC=KC

只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高微量或痕量组分，灵敏度高

浓度高时， 浓度高时， IIff 与与 CC 不呈线形关系，有时不呈线形关系，有时 CC

增大， 增大， IIff 反而降低因为公式反而降低因为公式 [ ][ ] 中后面影中后面影响，有时发生荧光猝灭效应响，有时发生荧光猝灭效应

荧光猝灭荧光猝灭 —— —— 荧光物质与溶剂或其它物质之间荧光物质与溶剂或其它物质之间

发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率下降或荧光效率 f f 下降称为荧光猝灭。下降称为荧光猝灭。

使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化

物等都是常见的荧光猝灭剂物等都是常见的荧光猝灭剂 碰撞猝灭—— 碰撞猝灭—— M +M + 激激 → → M*M*

M* + Q → M + Q +M* + Q → M + Q + 热热 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物

质的基态分子所吸收，即自吸收现象质的基态分子所吸收，即自吸收现象

（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、（一）荧光分析仪器——主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成

光源 第一单色器 液池 检测器

第二单色器

检测器 放大器及记录器

exex

emem

与分光光度计有两点不同

①两个单色器

②检测器与激发光互成直角

II00 II

五、荧光和磷光分析仪器五、荧光和磷光分析仪器

11 、光源、光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的

发射强度；适用波长范围宽发射强度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯

利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射 365 nm365 nm 、、405 nm405 nm 、 、 436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线

以以 365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强

应用最广泛的一种光源，可发射 250~800nm很强的连续光源

22 、单色器、单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量

分析，不能获得光谱分析，不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有

较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱又可获得荧光光谱

第一单色器作用第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长最佳激发波长 exex ，用此激发光激发液池内的荧，用此激发光激发液池内的荧光物质 光物质 exex

第二单色器作用第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长的干扰光，用来选择测定用的荧光波长 emem 。 在。 在选定的选定的 emem 下测定荧光强度，定量分析下测定荧光强度，定量分析

33 、样品池、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边透光，只能用手拿棱或最上边

44 、检测器、检测器 把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号 , , 放大放大 , , 直接转成荧光强度直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，

荧光光度计采用光电倍增管荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因

为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高荧光强度可 大大提高荧光强度

55 、读出装置、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和

发射光谱发射光谱

（二）激发光谱和荧光、磷光光谱（二）激发光谱和荧光、磷光光谱 荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根

据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱

I

exex

固定 em em 荧光波长荧光波长 获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的 emem 不变，改不变，改变第一单色器波长，从变第一单色器波长，从 200~700 200~700 nm nm 扫描，让不同波长的光照在扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，荧光物质上，测定它的荧光强度，以以 I 为纵坐标， 为纵坐标， exex 为横坐标得为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱左图，即荧光物质的激发光谱

从曲线上找出从曲线上找出 exex ，实际上选波长较长的高波长峰，实际上选波长较长的高波长峰

I

emem

固定 ex ex 激发光波长激发光波长 获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的 exex 不变，不变，改变第二单色器波长，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，测定它的发光强度，以以 I I 为纵坐标， 为纵坐标， emem

为横坐标得左图，即为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱荧光物质的发射光谱

从曲线上找出最从曲线上找出最大的 大的 emem

从图中看出从图中看出

磷磷＞ ＞ 荧荧＞＞ 激激

图

吸收峰荧光峰

磷光峰

（三）磷光分析仪器（三）磷光分析仪器 与荧光分析仪器相似，主要差异如下：与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1. 1. 试样室试样室 试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（ 77K77K ，， -196℃-196℃）下测定低温）下测定低温

磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶内） 固体表面室温磷光分析需特制试样室固体表面室温磷光分析需特制试样室2. 2. 磷光镜磷光镜 有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。

六、六、 荧光、磷光分析及应用荧光、磷光分析及应用（一）定量分析方法（一）定量分析方法 定量分析依据 定量分析依据 IIff = KC I = KC Ipp = KC = KC

1. 1. 标准曲线法——最常用的定量分析方法标准曲线法——最常用的定量分析方法 将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。

以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标为横坐标

浓度 浓度 CC11 C C22 C C33 C C44 C C55 Cx Cx

荧光强度 荧光强度 IIf1f1 I If2f2 I If3f3 I If4f4 I If5f5 I Iffxx

IIff

IIffx

Cx C

2. 2. 荧光猝灭法荧光猝灭法 把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性 若荧光物质 若荧光物质 M M 与猝灭剂 与猝灭剂 Q Q 生成不发荧光的基态配合物生成不发荧光的基态配合物

MQMQ

M + Q = MQM + Q = MQ （非荧光物质）（非荧光物质）

经推导得出：经推导得出：)(1 QCK

I

If

后

前

猝灭剂加入前的荧光强度 猝灭剂加入后试

液的荧光强度

常数

猝灭剂浓度

)()(

)(

QCMC

MQCK f

II 前前 /I/I 后后与与 CC （（ QQ ）有线性关系，可求猝灭剂含量）有线性关系，可求猝灭剂含量

与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂 别加入一系列不同量的猝灭剂 Q Q ，配成一个荧，配成一个荧光物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它光物质—猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线们的荧光强度，得一曲线

取相同荧光物质 取相同荧光物质 CCMM C CMM C CMM C CM M …… CCM M

加不同量加不同量 Q CQ CQ0Q0 C CQ1 Q1 CCQ2 Q2 CCQ3 Q3 …… CCQx Qx (C(CQ0Q0 =0) =0)

测 测 IIff I I 前前 II 后后 11 I I 后后 22 I I 后后 33 … … I I 后后 xx

计算 计算 II 前前 /I/I 后 后 II 前前 /I/I 后后 11 II 前前 /I/I 后后 2 2 II 前前 /I/I 后后 33 …… II 前前 /I/I 后后xx

II 前前 /I/I

后后 xx

CCQxQxCCQQ

II 前前 /I/I 后后

3. 3. 比较法——比较简单比较法——比较简单 如果试样数量不多，可用比较法进行测量如果试样数量不多，可用比较法进行测量 配一标准溶液浓度为配一标准溶液浓度为 CsCs ， ， CsCs 与未知液浓度与未知液浓度 CxCx

相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度 未知液 未知液 IIff xx = KCx = KCx

标准液 标准液 IIff ss = KCs = KCs

比较 Cs

Cx

I

I

fs

fx

0

0

ffs

ffx

fs

fx

II

IICs

I

ICsCx

荧光强度减去空白后若有试剂空白，测得的

4. 4. 多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析

(1) (1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰如果两组分的荧光峰相互不干扰 ,, 可直可直接测定接测定

可分别在各自的可分别在各自的荧荧波长处测定波长处测定 ,, 求出它们求出它们的含量的含量

(2) (2) 如果两组分的荧光峰相互干扰如果两组分的荧光峰相互干扰 ,, 但激发但激发光谱有显著区别光谱有显著区别 ,, 在某一激发光下一个组在某一激发光下一个组分产生荧光峰分产生荧光峰 ,, 另一组分不产生荧光另一组分不产生荧光 ;;

可选用不同的激发光进行测定可选用不同的激发光进行测定

AlAl3+3+—8-—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液 羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ex ex =365nm =365nm emem=520nm=520nm

GaGa3+3+—8-—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液羟基喹啉配合物的氯仿溶液 ex ex =436nm =436nm emem=520nm=520nm

365nm365nm 激发光， 激发光， AlAl3+3+ 的配合物产生荧光，而的配合物产生荧光，而 GaGa3+3+

配合物不产生荧光，无荧光峰；配合物不产生荧光，无荧光峰； 436nm436nm 激发光， 激发光， GaGa3+3+ 的配合物产生荧光，而的配合物产生荧光，而 AlAl3+3+

配合物不产生荧光，无荧光峰配合物不产生荧光，无荧光峰 在在 365nm365nm条件下激发，条件下激发， 520nm520nm 处测处测 AlAl3+3+—8-—8-羟基羟基喹啉配合物，在喹啉配合物，在 436nm436nm条件下激发，条件下激发， 520nm520nm 处测处测GaGa3+3+—8-—8-羟基喹啉配合物羟基喹啉配合物

例：例：

(3) (3) 如果两组分的荧光光谱和激发光谱如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰相互干扰

利用荧光强度的加和性（利用荧光强度的加和性（ F=FF=F11+F+F22+F+F33+…+… ），），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解求解例：硫胺荧 例：硫胺荧 CCTT ex ex =385nm =385nm emem=435nm=435nm 吡啶硫胺荧吡啶硫胺荧 CCPP ex ex =410nm =410nm emem=480nm=480nm

相互干扰荧光光谱重叠在在 385385 或或 410nm410nm 下激发，下激发，

在在 435435 和和 480nm480nm 下分别测下分别测荧光强度荧光强度

在在 385385 或或 410nm410nm 下激发，在下激发，在 435435 和和 480nm480nm 下分下分别测荧光强度别测荧光强度

IIff 435/385=26339 435/385=26339101044CCTT+210 +210 101044CCPP

IIff 480/385=9685 480/385=9685101044CCTT+1022 +1022 101044CCPP

IIff 480/410=2816 480/410=2816101044CCTT+1709 +1709 101044CCPP

IIff 435/410=6419 435/410=6419101044CCTT+252 +252 101044CCPP

硫胺素浓度 吡啶硫胺素浓度

IIff =KC——K: 纯物质在选定波长下测 IIff, 求 K

385nm385nm 激发激发

或或 410 nm410 nm 激发激发

（二）荧光分析法的应用（二）荧光分析法的应用 荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1. 1. 无机化合物的分析无机化合物的分析 无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为

数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达后，进行荧光分析的元素达 7070 多种，其中较常采用多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：荧光法测定的元素有： BeBe 、、 AlAl 、、 BB 、、 GaGa 、、 SeSe 、、MgMg 、、 ZnZn 、、 CdCd 及某些稀土元素及某些稀土元素

能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物 ，形成五元环或六元环的螯多数是芳香族化合物 ，形成五元环或六元环的螯合物，分子的刚性平面结构增大，变为强荧光体合物，分子的刚性平面结构增大，变为强荧光体荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：采用荧光猝灭法间接测定的离子有： FF-- 、、 SS2-2- 、、 CCoo2+2+ 、、 NiNi2+2+ 、、 CuCu2+2+ 等等

2. 2. 有机化合物的分析有机化合物的分析 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，

本身能发荧光的很少，一般需要与某些试本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析剂反应后才能进行荧光分析

芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法法是最主要的测定方法

为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定合物与适当试剂反应之后进行测定

可测定结构复杂的大量有机物质，如：各可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等和辅酶以及各种药物、毒物和农药等

例：例： 33 ，， 4 – 4 – 苯并芘苯并芘 33 ，， 4 – 4 – 苯并芘为强致癌物质苯并芘为强致癌物质

煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生焚烧垃圾都会产生 33 ，， 4 – 4 – 苯并芘，汽车尾气也是主苯并芘，汽车尾气也是主要来源要来源食品加工过程也会产生食品加工过程也会产生 33 ，， 4 – 4 – 苯并芘，尤其是烟苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品熏、油炸、烘烤食品分析测定：用环己烷将分析测定：用环己烷将 33 ，， 4 – 4 – 苯并芘从试样中提苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用谱法分离纯化，用 95%C95%C22HH55OHOH稀释，用荧光分光光稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量度计测定相对荧光强度进行定量

例： 例： VB2

• ——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中， VB2

易溶于强酸或强碱性溶液。• 在低浓度情况下， I= KC ，

I 与 C呈线性关系，在 pH6~7 荧光最强

• 在 430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光， em = 535 nm 下测 I ，用标准曲线法测定

CH

HO

HOHO

N

N N

NH

CH

CH

CH OH

CH

2

2

O

OH C

H C

3

3

缺 VB2 会得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎

维生素 B2

（三）磷光分析法应用（三）磷光分析法应用

能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。用。

低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含苯并芘等多环芳烃及含 OO 、、 SS 、、 NN 的杂环的杂环化合物分析化合物分析

固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。

§ 5-3§ 5-3 化学发光分析法化学发光分析法一、概述一、概述 化学发光是利用化学反应所产生的光辐射化学发光是利用化学反应所产生的光辐射

现象所建立的分析方法现象所建立的分析方法 化学发光与荧光的主要区别：受激发时所化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的需的能量来源能量来源不同，需要化学反应过程中不同，需要化学反应过程中所提供的化学能所提供的化学能

化学发光分析具有以下特点化学发光分析具有以下特点

灵敏度高——灵敏度高——例：用荧光素酶和三磷酸腺苷例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATPATP 的化学发光反应，可测定低至的化学发光反应，可测定低至 2×102×10-17-17 mol· mol·LL-1-1 ATP ATP

线性范围宽——线性范围宽——一般有一般有 5~65~6 个数量级个数量级 仪器设备简单，成本低廉仪器设备简单，成本低廉 分析速度快，易实现自动化分析速度快，易实现自动化 局限性：可供发光用的试剂有限局限性：可供发光用的试剂有限 发光机理有待进一步研究发光机理有待进一步研究

二、化学发光分析的基本原理二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件（一）化学发光反应的基本条件 发光反应必须满足以下条件发光反应必须满足以下条件1. 1. 化学反应必须产生足够的化学能化学反应必须产生足够的化学能 化学发光基于化学反应提供足够的能量化学发光基于化学反应提供足够的能量 A + B → C* +D A + B → C* +D 产物接受反应能被激发产物接受反应能被激发 C* → C + h C* → C + h 在可见光区观察化学发光，需在可见光区观察化学发光，需 170~300kJ·mol170~300kJ·mol-1-1 激激

发能。具有发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应过氧化物中间产物的氧化还原反应可可满足要求。化学反应多是在有满足要求。化学反应多是在有 OO33 、、 HH22OO22 等参加等参加的高能反应中的高能反应中

2. 2. 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态

（二）化学发光效率和发光强度（二）化学发光效率和发光强度 化学发光效率化学发光效率 CLCL

激发态分子数发射的光子数

参加反应的分子数激发态分子数

参加反应的分子数发射的光子数

frCL

激发态分子的化学效率

激发态分子的发光效率

r r 取决于发光所依据的化学反应本身

f f 与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体与荧光效率的影响因素相同，既取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响本身的结构和性质，也受环境的影响

化学发光强度化学发光强度 具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发

光。如：萤火虫发光反应的效率几乎接近光。如：萤火虫发光反应的效率几乎接近 100%100% 。。非生物体的化学发光效率一般不超过非生物体的化学发光效率一般不超过 1%1%

化学发光强度 化学发光强度 IICLCL （（ tt ）与反应速度、化学发光效）与反应速度、化学发光效率有如下关系率有如下关系

dt

dctI CLCL )(

对下列化学发光反应 A +B →C* +D

C + hIICLCL 随时间和反应物消耗的变化逐渐减小随时间和反应物消耗的变化逐渐减小

A + B →C* +D A 为待测物质， C 为发光物质，当反应物 B 的浓

度远远过量于待测物浓度时， B 的浓度可认为是常数。因此，发光反应可视为一级反应

Ackdt

dc1

t 时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比 化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。常用

发光总强度来定量分析

ACLCLCLcdt

dt

dcdtIS

发光总强度

ACLCLCL ckdt

dctI 1)(

三、化学发光反应的类型三、化学发光反应的类型

1. 1. 液相化学发光液相化学发光————研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（研究和应用的比较广泛的有鲁米诺（ LuminoLumino

ll ）光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。）光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。 鲁米诺是最常用的发光试剂鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定，它可以测定 ClCl22 、、 HH

OClOCl 、、 OClOCl-- 、、 HH22OO22 、、 OO22 和和 NONO22 ，产生化学发光，产生化学发光反应时量子效率为反应时量子效率为 0.01~0.050.01~0.05

鲁米诺（鲁米诺（ 3 –3 –氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和HH22OO22 等氧化剂反应生成最大波长为等氧化剂反应生成最大波长为 425 nm425 nm 的光辐的光辐射射

NH

NH

O

ONH2 2NH

COO

COO

[ ]*

OH-

COO

COO

NH2

+hv

氧化剂

425 nm

反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光

可检测低至 10-9 mol·L-1 的 H2O2

鲁米诺鲁米诺 HH22OO22 的化学反应，可以被一些痕量的过渡的化学反应，可以被一些痕量的过渡金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此可金属元素所催化，使发出的光大大增强，由此可测定测定 CoCo （（ⅡⅡ）） ,Cu,Cu （（ⅡⅡ）） , Ni, Ni （（ⅡⅡ）） , Cr, Cr（（ⅢⅢ），）， FeFe （（Ⅱ ⅢⅡ Ⅲ ）， ）， AgAg （（ⅠⅠ），）， AuAu （（ⅢⅢ ）， ），Mn (Mn (ⅡⅡ) ) ，， HgHg （（ⅡⅡ ） ） OsOs （（ⅢⅢ ⅣⅤ）， ⅣⅤ）， RuRu（Ⅵ），（Ⅵ）， VV （Ⅳ），（Ⅳ）， IrIr （Ⅳ）等金属离子，检测（Ⅳ）等金属离子，检测限由限由 0.01~40 0.01~40 g·mLg·mL-1-1 不等不等

利用鲁米诺发光体系可以测定利用鲁米诺发光体系可以测定 5050 余种元素和大量余种元素和大量有机和无机化合物，灵敏度都比较高有机和无机化合物，灵敏度都比较高

鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反应研究，鲁米诺化学发光体系还可用于许多生化反应研究，常常涉及到常常涉及到 HH22OO22 的产生或的产生或 HH22OO22参加反应参加反应

2.2.气相化学发光气相化学发光———— 广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的 OO33 ；； NONO 、、

NONO22 ；； SOSO22 ；； HH22SS ；； COCO ；乙烯等。；乙烯等。 在气相中在气相中 OO33 能氧化能氧化 NONO 、乙烯等产生化学发光，原子氧、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化也能氧化 NONO 、、 SOSO22 、、 COCO 等产生化学发光等产生化学发光

例： 例： NO + ONO + O33 → NO → NO22* + O* + O22 NO NO22* → NO* → NO2 2 +h+h

（（≥≥ 600nm600nm ）） 常温下产生化学发光，灵敏度可达常温下产生化学发光，灵敏度可达 1ng·mL1ng·mL-1-1 测定范测定范

围围 0.01~10000 0.01~10000 g·mLg·mL-1-1

CO + OCO + O （原子氧） →（原子氧） → COCO22* CO* CO22* → CO* → CO2 2 +h+h

（（ =300~500nm=300~500nm ）） 灵敏度为灵敏度为 1ng·mL1ng·mL-1-1

四、化学发光分析仪器（自学）四、化学发光分析仪器（自学） 气相化学发光反应主要用于某些气体的监测，有专用的监气相化学发光反应主要用于某些气体的监测，有专用的监

测仪。主要讨论的是液相发光分析仪器测仪。主要讨论的是液相发光分析仪器 按进样方式分立取样式和流动注射式化学发光仪按进样方式分立取样式和流动注射式化学发光仪1. 1. 分立取样式分立取样式———— 是一种在静态下测量发光信号的装置，它利用移液管或是一种在静态下测量发光信号的装置，它利用移液管或注射器取一定量的试剂与试样加入发光反应池中混合，或注射器取一定量的试剂与试样加入发光反应池中混合，或把试剂与试样加入贮液管中，开启塞子使溶液流入反应池把试剂与试样加入贮液管中，开启塞子使溶液流入反应池中混合，化学发光反应立即发生，发光信号通过光电倍增中混合，化学发光反应立即发生，发光信号通过光电倍增管检测，记录下发光强度。根据发光峰面积的积分值或峰管检测，记录下发光强度。根据发光峰面积的积分值或峰高进行定量分析高进行定量分析

仪器具有设备简单，造价低，体积小，灵敏度高等优点仪器具有设备简单，造价低，体积小，灵敏度高等优点 缺点：手工进样重复性差，测定精密度不高；难以实现自缺点：手工进样重复性差，测定精密度不高；难以实现自

动化，分析效率低动化，分析效率低

2. 2. 流动注射式流动注射式

———— 是动态测量法，试液和试剂通过蠕动泵是动态测量法，试液和试剂通过蠕动泵传送，并在流动中进样混合，恰好流动至传送，并在流动中进样混合，恰好流动至盘管中反应发光，流动注射式发光分析的盘管中反应发光，流动注射式发光分析的自动化程度、精密度和准确度都比较高，自动化程度、精密度和准确度都比较高，分析速度快，适用于批量试样的测定分析速度快，适用于批量试样的测定

荧 光 形 成 机 制单重态

第二激发

态

第一激发

态

三重态

荧光 磷

光

内转换

体系跨越 振

动弛豫

基态

激发光谱和荧光光谱

荧光强度

波长（ nm)300 400 500

硫酸奎宁的两个光谱

I

λλex,max λfl,max

散 射 光 的 干 扰 示 意

I

λnm320 360

I

λnm320 448I

λnm350 400

I

λnm350 448

A B C D

A,C 为硫酸（ 0.05mol/L) 在不同激发光下的干扰峰情况

B,D 为硫酸奎宁在不同激发光下的荧光和干扰峰情况

荧 光 计 示 意 图

光源 第一单色片

样品池

第二单色片

光电管 显示器