第五章分子发光分析法

东北师范大学分析化学精品课

第五章分子发光分析法

前面一章我们学习了紫外－可见吸收光谱法，分子吸收紫外可见光发生电子能级的跃迁，那么跃迁之后的情况怎么样？（如何弛豫？）

一个途径就是产生光辐射（发光）——荧光和磷光


一、基本原理

1 、分子的激发态和基态：不论是分子轨道还是原子轨道上的电子都有一套特有的描述其运动状态的量子数。根据 Pauli Exclusion Principle ，每个轨道上最多容纳2 个自旋方向相反的电子。

s 1/2 or 1/2

总自旋量子数： S si


能级的多重性： 2S ＋ 1

当 S ＝ 0 时，即 2S ＋ 1 ＝ 1 ，称为单重态；当 S ＝ 1/2 时，即 2S ＋ 1 ＝ 2 ，称为双重态（只有一个电子）；当 S ＝ 1 时，即 2S ＋ 1 ＝ 3 ，称为叁重态基态单重态 S0 基态双重态 D0

基态基态

激发态激发态


激发单重态 S1 激发叁重态 T1

Multiplicities:

S0 - common, diamagnetic (not affected by B fields)

D0 - unpaired electron, many radicals, two equal energy states

T1 - rare, paramagnetic (affected by B fields)

(T0 - doesn't exist, not ground state)

激发态激发态

基态基态


S0

S1

T1

S2

分子的电子能级示意图


注意 :

（ 1 ）没有基态叁重态；（ 2 ）从 S0 到 T1 的跃迁是禁阻的；（ 3 ） Energy(S1)>Energy(T1) (difference is energy requ

ired to flip electron spin) ；（ 4 ）多数分子含有偶数电子，分子的电子基态多为单重态；（ 5 ）叁重态有顺磁性。


2 、荧光的产生

基态分子hv 激发态

回到基态，如何回去？


S2

S0

S1

T1

分子的吸收情况


S2

S0

S1

T1

振动弛豫：在同一电子能级（激发态）…

特点：无辐射；速率快（ 10-1

4 ～ 10-12 s 内完成）


S2

S0

S1

T1

内转移（ internal conversion) ：相同多重性的两个电子能级之间的非辐射跃迁


内转移的特点（ 1 ）无辐射；（ 2 ）速率取决于两个能级之间的能量差，相邻单重激发态之间能级接近，振动能级常常发生重叠，内转移很快；（ 3 ）分子无论被激发到哪一个电子激发态，在 10-1

3 ～ 10-11 s 内经内转移和振动弛豫都会跃迁到最低的电子激发态的最低振动能级上；（ 4 ） So 到 S1 的能级差较大，内转移的速率相对较小，故 S1 的寿命较长。


S2

S0

S1

T1

荧光发射Fluorescence


Only


S2

S0

S1

T1

系间窜跃

磷光发射

Intersystem Crossing

Phosphorescence


磷光发射的特点

（ 1 ）禁阻跃迁，发光速率慢，持续时间长 10-4 ～ 10

0s ；（ 2 ）从 T1 也有回到 S1 ，然后 S1 到 S0 发出荧光，叫延迟荧光；（ 3 ）电子由 S0 到 T1 几率极小，是禁阻跃迁。

外转移：指受激分子与溶剂或其它分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。


S0

S1

T1

外转移 External Conversion


S0

S1

T1

系间窜跃

延迟荧光


二、荧光效率及其影响因素

1 、荧光效率：物质吸收了紫外可见光后，跃迁至激发态，激发态分子是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁弛豫，决定了物质能否发荧光。荧光效率指的是以辐射跃迁弛豫的分子数目占总激发态分子数目的比例。

f ＝ Nfluoresence/Nexcited 　（ 0.0 ～ 1.0 ）


f 越大，表示辐射跃迁的概率越大，发光强度越大！

以各种跃迁的速率常数（荧光发射， VR ， IC ， isc

等）来代替 N 表示 f ，得

f ＝ kf/ （ kf+ki ）

其中： kf 表示荧光发射过程的速率常数；

ki 表示其它非辐射跃迁过程的速率常数之和。

一般而言， kf 主要取决于分子结构。而 ki 主主主主主主主主主主


2 、荧光与分子结构的关系：

物质只有能够吸收紫外可见光，才可能发射荧光；要吸收紫外可见光，分子中必须含有共轭双键。（ 1 ）跃迁类型对荧光的影响：吸收光： n- ，

主主主主－ n ，主主 s 主主主


什么情况下有利于荧光发射？

（ i ）摩尔吸光系数大，有利于荧光：主主主主

－ n 强 1000倍；（ ii ）寿命短主主主主主主主 s 主－ n （主

s 主

主 iii 主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主


（ 2 ）共轭效应对荧光的影响

实验证明：芳香族化合物易产生荧光，且共轭体系越大，电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光（荧光效率高。注意：能够发荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。

f: 0.29 f: 0.46


再如：

f: 0.28

f: 0.68(CH CH)3

(CH CH)2

共轭体系增加，荧光效率增大！


（ 3 ）荧光物质的刚性和共平面性增加，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小（即外转移能量损失减小），有利于荧光发射。

例如：

f: 0.20f: 1.0Fluorene （芴）


再如： 8－羟基喹啉（弱荧光），当与 Mg2+络合后，为强荧光物质。又如：

红色荧光主主 BBR 主主主主

N=N

OH OH

SO3Na N=N SO3Na

Al OO

H2O OH2


（ 4 ）取代基效应

（ i ）给电子的取代基：如－ OH ，－ NH2 ，－ NR2 ，－ OR 等， p-共轭，使荧光增强。（ ii ）吸电子的取代基：如－ NO2 ，－ COOH ，－ N

O 等使荧光减弱。如：苯胺 >苯，而硝基苯为非荧光物质。（ iii ）卤素取代基随原子序数的增加，物质的荧光减弱，而磷光增强（重原子效应）。


（ iv ）空间取代基效应

O3S

N(CH3)2 N(CH3)2SO3

f ＝ 0.75 f ＝ 0.03

扭转离开了平面构型，影响了 p-共轭作用


（ v ）立体异构现象

主主主主主主

CH

CH

CH

CH


3 、环境因素对荧光的影响：

（ 1 ）溶剂的极性：电子激发态比基态的极性大，溶剂的极性增强，荧光强度增大，荧光波长红移。

溶剂相对介电常数荧光峰 nm 荧光效率乙腈 38.8 410 0.064

丙酮 21.5 405 0.055

氯仿 5.2 398 0.041

四氯化碳 2.24 390 0.002

巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率


（ 2 ）温度：温度升高， Kf 不变，但非辐射跃迁的速率常数增大，是故荧光效率降低。（ 3 ） pH值：含酸性或碱性取代基的化合物荧光性质受 pH 的影响。如：

NH2NH3

+

+ H+

pH=4.8~3.4

主主主主主主主


再如：

主主主主主主主

-O3S

O-

-O3S

OHpH=6.4-7.4

-H+


（ 4 ）表面活性剂：有利于荧光发射。

（ 5 ） O2 的存在： O2 为顺磁性分子，溶液中溶解氧

的存在，常常导致荧光降低，甚至熄灭，这可能是处

于单重激发态的荧光物质的分子相互作用，加速系间

窜跃（几率增大）所致。


三、荧光强度与溶液浓度的关系

以 If 表示荧光强度，以 Ia 表示吸收光的强度，根据荧

光效率的定义，则 :

If ＝ f×Ia

If ＝ f× （ I0－ I ）

I0 为入射光强度， I 为透射光强度。

根据比尔定律： A ＝ logI0/I 可得

I ＝ I0×10-A


I ＝ I0×10-A ＝ I0× 10-bc

If ＝ f× （ I0－ I ）＝ f× I0 （ 1－ 10-A ）

级数展开

If ＝ f× I0 （ 2.3A － (-2.3A)2/2! － (-2.3A)3/3! －

…）若溶液的浓度很稀， A<0.05 ，则高次项可忽略：

If ＝ f× I0 ×2.3A

＝ 2.3 f I0A ＝ 2.3 f I0 bc

当 I0 一定时： If ＝ KC


但在高浓度时， If ＝ KC 不成立

If

C

原因：（ 1 ）高次项（ 2 ）自熄灭现象，自吸收现象


主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主主

主主主主主主主主主主主主主主主主主

关于自猝灭：碰撞熄灭和自吸收：

主

h 主主主


四、荧光仪器：荧光光度计

PMTRecorder


五、荧光分析法的应用

1 、无机化合物：间接测定 60余种元素2 、有机物的测定：如丙三醇，蒽，多环芳烃等


六、化学发光分析法的简介

1 、概述：某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。

H

M

M*


化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光。

萤火虫发光


22 、化学发光分析的基本原理、化学发光分析的基本原理

化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤，必须满足如下条件：

（ 1 ）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓， 170 ～ 300 KJ/mol 。

（ 2 ）反应途径要有利于激发态产物的形成，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。


（ 3 ）激发态分子跃迁回基态时要释放光子，而不是以热的形式释放能量。

问题：

i 、有多少参加化学反应的分子被激发？

ii 、是不是所有的激发态分子都发光？

iii 、综合起来，参加化学反应的分子有多少发光？


i 、有多少参加化学反应的分子被激发？

定义： r 为生成激发态分子的化学效率＝激发态分子

数 / 参加反应的分子数

r 取决于化学反应，对于特定的反应在一定的实验条件

下化学效率为常数。


ii 、是不是所有的激发态分子都发光？

定义： f 为激发态分子的发光效率＝发射的光子数 /

激发态的分子数

f 的影响因素：（ 1 ）发光体本身的结构和性质；

（ 2 ）环境。


iii 、参加化学反应的分子有多少发光？

定义： cl 为化学发光效率＝发射的光子数 / 参加反应

的分子总数

cl ＝ r f

最高效率为 100％：生物发光

化学发光的效率一般小于 5 ％。


化学发光强度 Icl

化学发光反应的发光强度 Icl 是以单位时间内发射的光

子数表示。它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度有关。即：

Icl （ t ）＝ cl dc/dt

Icl （ t ）表示 t 时刻的化学发光强度， dc/dt 是分析物

参加反应的速率。


对上式积分

发光强度与分析物浓度成正比。

Cdtdt

dcdtI CLCLCL

也可以用峰高定量！


33 、化学发光反应的基本类型、化学发光反应的基本类型

按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光。

（ 1 ）气相化学发光

主要有 O3 、 NO 、 S 的化学发光反应，可用于监

测空气中的 O3 、 NO 、 SO2 、 H2S 、 CO 、 NO2 等。


例如：例如：

NO ＋ O3 ＝ NO2* ＋ O2 ，

NO2*－－ NO2 ＋ hv （ >600 nm)

CO (NO,SO2 等）＋ O－－ CO2*

CO2*－－ CO2 ＋ hv （ 300-500 nm)

灵敏度可测至 1ppb


（ 2 ）液相化学发光

用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺（ luminol) 、光泽碱、没食子酸，洛粉碱等。

OXIDANT

BASE

luminol

*

3-Aminophthalate

+

3-APA


max = 425 nm

氧化剂 : H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 [Fe(CN)6]3-.

与过氧化氢的反应可被催化 : 过氧化酶氧化血红素过渡金属离子 (Co2+ 、 Cu2+ 、 Fe3+ 、 Ni 、 Cr 、 Ag 、Mn 、 Hg 、 Os 、 Ru 、 Ir 、 Rh 、 V etc.)

利用 luminol 与过氧化氢的反应可测酶促反应的底物，如葡萄糖等。


光泽精 (lucigenin)

N

CH3

N

CH3

+

+ .2NO3-

Oxidation

OH -

N

O

CH3

*

NMA+

LIGHT

Lucigenin

N-METHYLACRIDONE (NMA)

max = 440 nm(绿色 )

氧化剂 : H2O2


萤火虫发光 (firefly BL)

Luciferin + ATP + O2luciferase

AMP + Oxyluciferin + hv

max = 562 nm

此反应重要的分析对象是 ATP ，最低可测至 2×10-17 m

ol/L ，相当于一个细菌中的 ATP 含量。


4 、化学发光分析仪器

（ 1 ）分立式进样化学发光仪

PMT

R1

R2

s


4 、化学发光分析仪器

（ 2 ）流动注射进样化学发光仪

样品 sample

waste

PMT recorder

蠕动泵

流通池 (flow cell)


进样器


发光棒

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