SILMÄLÄÄKKEIDEN FORMULOINTI

JA TEOLLINEN VALMISTAMINEN

KOKEELLINEN OSA:

RAMAN-SPEKTROSKO-PIAN HYÖDYNTÄMINEN

JAUHESEOKSEN LÄÄKEAINEPITOISUUDEN

MÄÄRITTÄMISESSÄ

Ville Kangas Pro gradu -tutkielma Proviisorin koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto, farmasian laitos Maaliskuu 2014

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, terveystieteiden tiedekunta Farmasian laitos Proviisorin koulutusohjelma Farmasian teknologia KANGAS VILLE T: SILMÄVALMISTEIDEN TEOLLINEN FORMULOINTI JA VALMISTAMINEN Pro gradu -tutkielma, 108 s. ohjaajat: Professori, FaT Jarkko Ketolainen, Lehtori, dosentti Tapio Nurmi Maaliskuu 2014

Avainsanat: Silmälääke, formulointi, aseptiikka, valmistaminen, teknologia

Tiivistelmä

Silmälääkintä vaatii lääkevalmisteelta useanlaisia ominaisuuksia. Silmän pinta on lääkkeellä helposti saavutettavissa, mutta yleensä vain alle viisi prosenttia lääkeaineesta pääsee imeytymään silmän sisempiin osiin, jossa sen vaikutuskohta sijaitsee. Tätä ongelmaa pyritään ratkaisemaan yleensä parantamalla lääkevalmisteen kykyä pysyä silmässä. Erilaiset ainesosat, kuten imeytymisen parantajat, viskositeetin kohottajat, biokiinnitysaineet, faasin muuttajat ja suspension muodostajat, lisäävät lääkeaineen vaikutusaikaa silmässä. Perinteisten valmisteiden rinnalle on tullut myös pitempivaikutteisia ratkaisuja, kuten silmäluomitaskuun laitettavia implantti- ja sienivalmisteita, sekä teknologisempia annostelujärjestelmiä, kuten iontoforeesi. Kaikissa järjestelmissä on omat heikkoutensa, ja silmän herkkyyden takia valmisteiden muokkaaminen optimaalisiksi on hankalaa. Parhaimmillaankin silmävalmisteet ovat eri optimitilojen kompromisseja, joissa lääkeaineen imeytyminen, valmistettavuus, siedettävyys ja käyttäjän hoitomyöntyvyys yhdessä saavuttavat korkeimman tasonsa.

Silmävalmisteiden tuotanto on puhtaudeltaan parenteraalisen lääkinnän tasolla, ja valmistusolosuhteiden täytyy täyttää niille asetetut korkeat vaatimukset. Nykyaikaisten lääkeaineiden formulaatiot voivat olla monimutkaisia, mikä aiheuttaa tuotannolle omat vaikeutensa. Sterilointi ei useinkaan onnistu lopputuotteelle, jolloin joudutaan menemään täysin aseptiseen valmistukseen, jossa tasaisen korkean laadun saavuttaminen vaatii tarkkaa tuotantosuunnittelua ja toimivan ympäristön. Jokainen lisätty työvaihe aseptisessa valmistuksessa on riski tuotteen kontaminoitumiseen. Tätä varten on kehitetty erilaisia tekniikoita, kuten isolaattori, HEPA-ilmansuodatus, blow-fill-seal -teknologia, sterilization in place ja sterilointitunneli –järjestelmät. Näillä pystytään yhdistämään eri tuotantovaiheita samaan ympäristöön, jolloin tuotannon turvallisuus ja tehokkuus saadaan maksimoitua.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of health science School of Pharmacy Master of Science in Pharmacy program Pharmaceutical Technology KANGAS VILLE T: FORMULATION AND INDUSTRIAL MANUFACTURING OF OPTHALMIC PRODUCTS Master’s thesis, 108 pp, Supervisors: Professor, PhD. Jarkko Ketolainen, Lecturer, Adjunct Professor Tapio Nurmi March 2014

Keywords: Eye medicine, formulation, asepsis, manufacturing, technology

Summary

Drug administration into the eye calls for several different properties of a pharmaceutical preparation. It is relatively easy for a drug to reach the surface of the eye but usually only less than five percent of an active drug ingredient is absorbed into the inner parts of the eye, that is, into the action site. Usually formulators try to solve this problem by increasing the dwelling time of the product on the surface of the eye. Different kinds of excipients are available, such as: permeation enhancers, bioadhesive agents, phase modifiers, suspending and thickening agents. It has been developed also new kind of treatments in parallel with conventional drugs like topically administered implants and gelatin products and also more technological solutions like iontophoresis. Every system has its own downsides and because eye is so vulnerable, product optimizations are difficult to be made. Even at the best case eye medicines are compromises of different optimal modes, where the permeability of an active pharmaceutical ingredient, producibility, tolerability and users comfort for medicine are combined.

The manufacture of the eye preparations needs to be as pure as drug manufacture for parenteral applications and the facilities need to fulfill the high specifications. New drug formulations can be so complicated that that may cause problems for manufacture. Some products cannot be sterilized after manufacture, but they need to be prepared in an aseptic way. In such aseptic manufacture, spesific production planning and good facilities are needed to achieve the high and consistent quality. Every additional production step in the aseptic manufacture is a risk of contamination. To avoid the contamination risk, several techniques are developed, such as isolator, HEPA air filtration, blow-fill-seal technology, sterilization-in-place and sterilization tunnel which helps to increase manufacturing safety and efficiency.

Esipuhe

Olen tehnyt opinnäytetyöni Itä-Suomen yliopiston farmasian teknologian ja

biofarmasian osastolla. Ohjaajina opinnäytetyössä toimivat FaT Jarkko Ketolainen,

Lehtori Tapio Nurmi, FaT, dos. Ossi Korhonen ja DI Tuomas Ervasti. Haluan kiittää

heitä hyvästä ohjauksesta ja tuesta opinnäytetyöni aikana.

Haluan kiittää myös perhettäni ja ystäviäni, erityisesti Jutta ja Matti Suvantoa sekä

Katri ja Ilari Kososta tuesta ja avusta opinnäytetyössä. Lisäksi kiitokset myös

ystävilleni korppikotkille yöllisestä puhelusta opinnäytetyön teonaikana sekä Suvi

Luukolle monista hajoiluhetkistä.

Lahdessa 26.02.2014

Ville Kangas

Lyhenteet

API lääkeaine

ASA asetyylisalisyylihappo

BAK Benzalkoniumkloridi

BFS Blow-Fill-Seal

CIP Clean In Place

CW jatkuva-aaltoinen lasersäde

DCP dikalsiumfosfaatti

LAKTO laktoosimonohydraatti

MAN mannitoli

MSC multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely

OP havaitut vs. ennustetut pisteet SIMCA ohjelmassa

PARA parasetamoli

PE Polyetyleeni

PP Polypropyleeni

Q2cum Q2-summa

Q2 testijoukon vaihtelun prosenttiosuus, jonka malli voi ennustaa

RMSEE sovitetun havaintojoukon keskineliöjuuren virhe

RMSEP ennusteen keskineliöjuuren virhe ennustusjoukossa

Row rivien keskitys esikäsittely

rpm kierrosta minuutissa

SA salisyylihappo

SG Savitzky-Golay esikäsittely

SIP Sterilization In Place

SNR signaali-kohina –suhde

SNV standardi normaali variaatti esikäsittely

Sisältö

1. Johdanto ............................................................................................................... 8

2. Silmän rakenne, toiminta ja tyypillisimmät formulaatiot ................................... 9

2.1 Silmän rakenne ja toiminta ................................................................................ 9

2.2 Formulaatioiden komponentit ja niiden tehtävät .............................................. 11

2.2.1 Lääkeaine ................................................................................................. 14

2.2.2 pH:n säätö ................................................................................................. 15

2.2.3 Toonisuuden säätäjät ................................................................................ 16

2.2.4 Säilytysaineet ............................................................................................ 16

2.2.5 Kostutusaineet (humektantit) .................................................................... 17

2.2.6 Imeytymisen edistäjät ................................................................................ 17

2.2.7 Viskositeetin kohottajat ja biokiinnitysaineet ............................................. 18

2.2.8 Suspension muodostajat ........................................................................... 19

2.2.9 Faasin muuttajat........................................................................................ 19

2.3. Formulaatiotyypit silmälääkinnässä ................................................................ 20

2.3.1 Perinteiset formulaatiot ............................................................................. 20

2.3.2 Uudemmat silmälääkkeiden kuljetusmekanismit ....................................... 27

2.4 Lääkepakkaus .............................................................................................. 28

3 Valmistus .............................................................................................................. 30

3.1 Valmistuslaitteistot ........................................................................................... 32

3.1.1 Isolaattori .................................................................................................. 32

3.1.2 Tuotteiden siirtojärjestelmä ....................................................................... 35

3.1.3 Komponenttien sterilointi ........................................................................... 36

3.1.4 Pakkauksen sterilointi ja puhdistus ........................................................... 36

3.1.5 Blow-Fill-Seal -laitteisto (BFS) .................................................................. 37

3.1.6 Valmistuslinjaston puhdistus ja sterilointi .................................................. 40

4. Yhteenveto .......................................................................................................... 41

KOKEELLINEN OSA: RAMAN-SPEKTROSKO-PIAN HYÖDYNTÄMINEN

JAUHESEOKSEN LÄÄKEAINEPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMISESSÄ .................. 43

5 JOHDANTO ....................................................................................................... 47

6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ................................................................... 48

6.1 Raman-spektroskopia .................................................................................. 48

6.2 Spektrien esikäsittely ................................................................................... 51

6.2.1 Spektrin derivointi ................................................................................. 52

6.2.2 Spektrin normalisointi ............................................................................ 54

6.2.3 Spektrin tasoitus ................................................................................... 54

6.2.4 Sirontaa korjaavat esikäsittelyt.............................................................. 56

6.3 Raman-spektrometri ja PhAT anturi ............................................................ 59

6.4 Seokset ja niiden valmistus ......................................................................... 61

6.5 Näytteiden mittaus ja esikäsittely................................................................. 62

6.5.1 Mittaukset paikallaan olevista näytteistä ............................................... 62

6.5.2 Mittaukset liikkeessä olevista näytteistä ................................................ 62

6.5.3 Raman-spektrin esikäsittely .................................................................. 63

6.6 Kemiallinen lääkeainepitoisuuden määrittäminen ........................................ 65

6.7 Raman-spektrikirjasto .................................................................................. 67

7 TULOKSET ........................................................................................................ 68

7.1 Lääkeainepitoisuuden kemialliset määritykset ............................................. 68

7.2 Eri esikäsittelyiden vaikutukset malliin ja ennustettavuuteen ....................... 71

7.2.1 Asetyylisalisyylihappo-dikalsiumfosfaattiseos ....................................... 71

7.2.2 Ibuprofeeni-laktoosiseos ....................................................................... 72

7.2.3 Ibuprofeeni-mannitoliseos ..................................................................... 72

7.2.4 Parasetamoli-mannitoliseos .................................................................. 72

7.2.5 Parasetamoli-laktoosiseos .................................................................... 73

7.3 Liikkeessä tehdyt mittaukset ........................................................................ 79

7.3.1 Asetyylisalisyylihappo-dikalsiumfosfaattiseokset .................................. 79

7.3.2 Ibuprofeeni-laktoosiseokset .................................................................. 81

7.3.3 Parasetamoli-laktoosiseokset ............................................................... 82

7.4 Spektrimuutokset siirryttäessä puhdasaineesta seokseen .......................... 87

7.5 Raman-spektrikirjasto .................................................................................. 90

8 POHDINTA ........................................................................................................ 92

9 KIRJALLISUUS: ................................................................................................ 96

LIITETAULUKOT ................................................................................................... 110

8

1. Johdanto

Silmä on ihon lisäksi helpoimmin saavutettavia lääkkeen annostelukohteita

paikallisessa lääkinnässä. Silmälääkkeillä pyritään saamaan vaikutus joko silmän

pinnalle tai sen sisään. Suoraan silmään laitettavilla lääkkeillä saavutetaan monia

hyötyjä: paikallinen annostelu saavuttaa kudoksia, joiden hoitaminen systemaattisesti

olisi vaikeaa, vältetään lääkkeiden ensikierron metabolia, saadaan vähennettyä

lääkkeen systeemisiä haittavaikutuksia, lääkeaine saadaan nopeammin

kohteeseensa, annostelu on helppoa ja kivutonta sekä lääkkeessä voidaan käyttää

pienempiä lääkeainepitoisuuksia (Wilson ym. 2001, Kaur ja Kanwar 2002, Gibson

2009). Silmälääkevalmisteille on hyvin tarkat laatuvaatimukset, koska silmä on hyvin

pitkälle erikoistunutta kudosta ja sillä on uniikki asema ihmiskehon toiminnassa (Al-

Achi ym. 2013). Yksinkertaisimmillaan silmälääke voisi olla veteen liuotettu

lääkeaine, jota annostellaan silmään lääkepullosta. Silmän fysiologia tekee kuitenkin

asiasta haastavamman. Silmän kerrosmainen rakenne ja kyynelnestetoiminta

heikentävät lääkeaineiden imeytymisen olemattomiin, ja siitä huolimatta puhdas

lääkeaine voisi aiheuttaa silmässä paljon epämukavuuden, ärsytyksen tai polttelun

tunnetta. Tästä syystä silmälääkkeiden formulaatioihin käytetään monia apuaineita,

jotta haittoja saadaan vähennettyä ja hyötyjä lisättyä.

Valmisteen formulaatiota mietittäessä tulee myös miettiä kuinka valmiste saadaan

valmistettua ja toimitettua turvallisesti potilaalle (Agalloco ja Akers 2008).

Silmävalmisteiden tulee olla steriilejä, ja niiden annostelun täytyy olla tarkempaa

paikallisessa lääkinnässä, mikä monimutkaistaa tuotantoa huomattavasti.

Nykyaikaisissa valmistustiloissa täytyy ottaa huomioon vallitsevat olosuhteet

ympäristössä ja suunnitella järjestelmä toimimaan niiden mukaan tai muokata

olosuhteita. Olosuhteiden muokkaamiseen valmistukselle sopiviksi on kehitetty

erilaisia järjestelmiä, kuten isolaattorit, ilmanpuhdistimet, laminaarivirtaukset sekä

erilaiset automatisoidut järjestelmät. Aseptisen valmistusjärjestelmän

monimutkaistuminen asettaa tasaiselle tuotantolaadulle haasteita. Monien laitteiden

yhteen liittäminen toimivaksi kokonaisuudeksi kustannustehokkaan tuotannon

saamiseksi ei ole helppoa.

9

2. Silmän rakenne, toiminta ja tyypillisimmät formulaatiot

2.1 Silmän rakenne ja toiminta

Silmän rakenne koostuu erilaisista kalvoista (kuva 1). Niistä uloimmat kerrokset ovat

sarveiskalvo ja sen ympärillä oleva sidekalvo. Sarveiskalvo on läpinäkyvä,

halkaisijaltaan 11,7 mm oleva kalvo, jossa ei ole verisuonitusta, mutta paljon

hermopäätteitä (Järvinen ym. 1995, Gibson 2009). Sarveiskalvo koostuu kolmesta

kerroksesta: uloin epiteeli, keskimmäinen tukiosa ja sisin endoteeli. Sarveis- ja

sidekalvo muodostavat ensimmäisen imeytymisesteen silmään annosteltaville

lääkeaineille (kuva 2). Sarveiskalvon epiteelikerros koostuu pääosin rasva-aineista,

joiden takia se estää 90 % vesiliukoisista ja 10 % rasvaliukoisista lääkeaineista

(Wilson ym 2001, Gibson 2009). Keskimmäinen tukiosa (strooma) on kerroksista

paksuin ja voimakkaasti vesipitoinen, mikä huonontaa vuorostaan vahvasti

rasvaliukoisten aineiden imeytymistä. Sarveiskalvon sisin kerros on endoteeli, joka

koostuu yksittäisestä solukerroksesta, jonka solut ovat kiinnittyneet toisiinsa

aukkoliitoksilla. Endoteelin pinta sisältää Na/K-pumppuja, jotka ohjaavat

sarveiskalvon passiivista veden kulkeutumista ja siten myös sarveiskalvon paksuutta.

Runsas veden virtaus sarveiskalvoon vähentää lääkeaineiden kulkeutumista silmään

imeytymisreitin pidentyessä, mutta kokonaisuudessaan endoteelikerros läpäisee

lääkeaineita yli 200 kertaa enemmän kuin epiteelikerros.

Kuva 1. Silmän rakenne ja yleisimmät annostelukohdat (Wilson ym. 2001)

10

Kovakalvo toimii silmän uloimpien osien huoltojärjestelmänä ja sisältää runsaasti

verisuonia, joiden avulla alueelle tuodaan happea ja ravinteita. Kovakalvon etuosaa

peittää sidekalvo, joka jatkuu silmäluomien alle. Sidekalvo ja kovakalvo toimivat

monille lääkeaineille imeytymisesteenä, ja ne lääkeaineet, jotka pääsevätkin

kulkeutumaan tätä kautta sisään, voivat päätyä kalvojen verisuonistoihin, jotka

pyrkivät kuljettamaan lääkeaineet ulos silmästä systeemiseen verenkiertoon.

Kuva 2. Silmälääkkeiden hyötyosuuteen vaikuttavat tekijät (Kaur ja Smitha 2002)

Ulkoapäin silmää huoltaa ja suojaa kyynelneste ja silmäluomet. Kyynelnestettä

tuottavat kyynelrauhaset ja Meibomin rauhaset. Kyynelfilmi muodostuu kolmesta

kerroksesta. Alin on limakerros, joka sisältää musiinia ja asettuu sarveis- ja

sidekalvon päälle tasoittaen epiteelin ja muodostaen siihen hydrofiilisen pinnan (Holly

ja Lemp 1977, Al-achi ym. 2013). Toinen kerros koostuu kyynelrauhasten erittämästä

vesikerroksesta, joka asettuu alemman hydrofiilisen pinnan päälle. Kauimmaisena

silmän pinnasta on Meibomin rauhasten tuottama lipidikerros, joka vähentää veden

haihtumista silmästä (Holly ja Lemp 1977, Gibson 2009).

Erittynyt kyynelneste muuttaa silmään annostellun valmisteen pH:ta ja laimentaa sen

pitoisuutta, mikä voi heikentää lääkeaineen imeytymistä. Silmäluomet tasoittavat joka

kerta sulkeutuessaan erittynyttä kyynelnestettä silmän pinnalle, mutta samalla ne

11

ohjaavat kerrallaan noin kaksi mikrolitraa nestettä kyyneltiehyeeseen, josta se

kulkeutuu edelleen nenän ja kurkun kautta maha-suolikanavaan. Normaalisti

kyynelnesteen määrä silmässä on noin seitsemän mikrolitraa. Silmässä voi olla

kuitenkin nestettä kerrallaan enimmillään 20–30 µl, josta suurin osa alaluomitaskussa

(Wilson ym. 2001). Tätä suuremmat nestemäärät valuvat silmästä poskille tai

ohjautuvat kyyneltiehyeeseen. Silmään laitetusta nesteestä poistuu noin 16 %

minuutissa ja silmän sisempiin osiin pääsee imeytymään alle viisi prosenttia

annoksesta (Järvinen ym. 1995, Wilson ym. 2001, Gibson 2009). Loput annoksesta

imeytyy systeemiseen verenkiertoon tai valuu pois silmästä.

2.2 Formulaatioiden komponentit ja niiden tehtävät

Suurin ongelma silmälääkinnässä on oikean pitoisuuden saavuttaminen hoidettavalla

alueella (Järvinen ym. 1995, Kaur ja Kanwar 2002, Ali ja Lehmussaari 2006).

Sopivan lääkeainepitoisuuden saavuttaminen imeytymisalueella hyödyttää lääkintää

monella tapaa: se mahdollistaa paremman hyötyosuuden lääkkeelle, tuotetta voidaan

annostella harvemmin ja tuote aiheuttaa vähemmän silmän ärsytystä. Nämä kaikki

asiat tekevät tuotteesta potilaalle käyttäjäystävällisemmän.

Lääkkeen hyötyosuuteen silmässä vaikuttavat erityisesti sen kemialliset

ominaisuudet, annoksen koko, aineiden taipumus muodostaa komplekseja

proteiinien kanssa, silmän kyynelnesteen laimentava vaikutus, hyödytön

imeytyminen, sarveiskalvon heikko läpäisykyky ja silmien räpyttely. Näihin

ominaisuuksiin pyritään vaikuttamaan erilaisilla apuaineilla (taulukko 1), joita lisätään

tarpeiden ja mahdollisuuksien mukaan valmisteisiin. Optimaalisin lääkeaine silmän

pinnalle annosteltaessa on tehokas pienillä annoksilla, pieni molekyylipainoltaan ja

sisältää sekä vesi- että rasvaliukoista luonnetta (Al-Achi ym 2013). Hyötyosuuden

lisäksi lääkkeen formuloinnissa pitää ottaa huomioon lääke- ja apuaineiden

ominaisuuksia, kuten vesiliukoisuus, stabiilisuus ja siedettävyys, mutta myös

vaaditun annoksen konsentraatio sekä hoidettavan silmän kunto. Yleensä lopullinen

valmiste muodostuu kaikkien edellä mainittujen vaatimusten kompromissiksi.

12

Taulukko 1. Silmälääkkeen yleisimmät aineosat ja niiden tarkoitukset valmisteessa.

Aineosat Tarkoitus

Imeytymisen ja läpäisyn parantajat

Parantavat aineen imeytymistä erilaisilla tavoilla, kuten löystyttämällä solujen tiiviitä liitoksia ja lisäämällä membraanin juoksevuutta

Antimikrobiset säilöntäaineet Vähentävät valmisteen biokuormaa ja estävät mikro-organismien kasvua

Antioksidantit Vähentävät lääkkeen hapettumista hapettumalla itse helpommin

Puskurit Pitävät halutun pH-alueen, jotta tuotteen stabiilisuus ja liukoisuus säilyy

Kelatointiaineet Muodostavat komplekseja metallien kanssa, jotka voivat katalysoida hapettumisreaktiota

Ioninvaihtoaineet Kontrolloivat lääkeaineen vapautumista ioninvaihdon avulla, jota esiintyy kyyneleissä

Liukoisuuden lisääjät Lisäävät lääkeaineen liukoisuutta

Suspendointi- ja sakeuttamisaineet

Kohottavat nesteen rakennetta pienentäen partikkelien laskeutumisnopeutta sekä helpottaen aineen uudelleen sekoitettavuutta. Kohottavat lääkkeen säilyvyyttä ja vaikutusaikaa silmässä sekä vähentävät emulsion vaahtoavuutta

Toonisuuden säätäjät Mahdollistavat silmälle isotoniset valmisteet

Lääkeainekuljettimet Lääkeaineelle sopiva kuljetusväline, jolla sitä suojataan tai sen imeytymistä kohdistetaan

Lähde: Al-Achi ym. 2013

Pyrittäessä parantamaan lääkeaineen hyötyosuutta pyritään samalla kiertämään

silmän suojamekanismeja, kuten kyynelnesteen huuhtelevaa ja laimentavaa

vaikutusta. Kehitystyön oleellisin osa onkin ottaa huomioon, ettei valmiste kaikkien

näiden muutosten jälkeen vahingoita silmän kudoksia. Silmän ärsyyntyminen, pistely

ja polttelu lisäävät kyynelnestetoimintaa ja silmien räpyttelyä, jotka tehostavat

lääkeaineen poistumista silmästä ja vähentävät sen imeytymistä.

Edellä mainittujen itse lääkevalmisteen aiheuttamien rajoitteiden lisäksi

tuotekehityksessä otetaan huomioon potilaan tekemä annostelu ja käyttömukavuus

(Gibson 2009). Valmiste, joka aiheuttaa potilaalle ärsytystä, polttelua, pistelyä, näön

13

sumenemista tai epämiellyttäviä systeemisiä haittavaikutuksia, voi olla hänelle syy

hoidon lopettamiseen ennenaikaisesti. Silmävalmisteille ärsytysoireet ovat yleisiä ja

ne liittyvät yleensä suuriin lääkeainekonsentraatioihin. Näitä ongelmia on saatu

vähennettyä esimerkiksi muuttamalla lääkevalmisteita aihiolääkkeiksi. Kuitenkaan

yksistään hyvä formulaatio ei riitä, vaan myös lääkkeen ja pakkauksen

käytettävyyteen on kiinnitettävä huomiota. Silmävalmisteita käyttävät eniten

vanhukset, joille hankala pakkaus voi vaikeuttaa annostelua merkittävästi. Huono

pakkaus voi lisäksi aiheuttaa annoskoon vaihtelua, jos potilaalla on vaikeuksia laittaa

silmätippoja tai hän puristaa pakkausta esimerkiksi liian lujaa tai hiljaa.

Annosteltavan tipan suositeltavana tilavuus on 8–15 µl (Chrai ym. 1973, Wilson ym.

2001, Van Santvilet ja Ludwig 2004). Tippakokoon voidaan vaikuttaa pakkauksen

suunnittelulla – jokainen markkinoilla oleva moni- tai kerta-annospakkaus tuottaa

lähtökohtaisesti sille ominaisen tippakoon. Suurin osa kaupallisista valmisteista

tuottaa 25–70 µl:n tippoja. Silmälääkkeen tilavuuden lisäämisen yli suositeltavan

tippakoon on todettu vähentävän imeytyvän lääkeaineen määrää, koska tilavuuden

lisääntyminen kasvattaa valumisen määrää silmästä. Myöskään alle kahdeksan

mikrolitran tippoja ei yleensä valmisteta, koska se hankaloittaa silmälle sopivan

konsentraation saavuttamista tippaan.

Silmän pinnalle laitettavat lääkkeet imeytyvät kahta reittiä pitkin: sarveiskalvon läpi tai

side- ja kovakalvon läpi, joista jälkimmäistä kutsutaan myös sarveiskalvottomaksi

reitiksi (kuva 3) (Wilson ym. 2001). Suoraan sarveiskalvon läpi kulkeutuvista

lääkeaineista rasvaliukoiset menevät pääosin transsellulaarisesti ja vesiliukoiset

intrasellulaarisesti. Myös viitteitä lääkeaineiden aktiivisesta kuljetuksesta on.

Sarveiskalvoton reitti on usein tehoton, koska imeytynyt lääkeaine usein kulkeutuu

reitillä oleviin verisuoniin, jotka poistavat lääkeainetta systeemiseen verenkiertoon.

Reitti on kuitenkin tärkeä isoille vesiliukoisille molekyyleille, kuten timololimaleaatille

ja gentamisiinille, sekä peptideille.

14

Kuva 3. Lääkkeiden kulkeutumisreitit paikallisessa annostelussa (Wilson ym. 2001).

2.2.1 Lääkeaine

Lääkeaineen valintaan vaikuttavat eniten sen fysikokemialliset ominaisuudet, kuten

liukoisuus, lipofiilisyys, molekyylin paino, muoto ja varaus sekä ionisoitumisaste, jotka

vaikuttavat lääkeaineen kykyyn imeytyä (Gibson 2009). Kuten aikaisemmin todettiin,

sarveiskalvo sisältää sekä lipofiiliset epiteeli- ja endoteelikerrokset että hydrofiilisen

tukikudoskerroksen (strooma), joten parhaiten imeytyvät aineet, joilla on molemman

tyyppisiä ominaisuuksia. Suotuisin jakautumiskerroin lääkeaineelle imeytymistä

ajatellen fysiologisessa pH:ssa 7,4 on kahdesta kolmeen (log P) (Singh ja Shah

1996, Gibson 2009). Sarveiskalvon läpi parhaiten imeytyvät lääkeainemolekyylit,

jotka voivat esiintyä sekä ionisoituneessa että ionittumattomassa muodossa. Näistä

ionittumattomat molekyylit läpäisevät parhaiten lipofiilisen epiteelikerroksen.

Silmälääkinnässä lääkeaineen molekyylin koko ei yleensä toimi imeytymisen

rajoittajana. Vasta yli 500 u molekyylipainoltaan olevat yhdisteet ovat huonosti

imeytyviä silmän kalvolta (Gibson 2009). Lääkeaineen kemiallinen muoto kuitenkin

vaikuttaa sen ominaisuuksiin paljon. Yleinen tapa muokata lääkeaineen kemiallisia

15

ominaisuuksia onkin vaihtaa lääkeaineen suolamuoto, jolla voidaan muuttaa

lääkeaineen liukoisuutta ja lipofiilisyyttä (Gibson 2009).

Lääkkeen kehityskaaren alkuvaiheessa seulotaan suuri määrä lääkeainemolekyylejä

läpi ja poimitaan jatkokehitykseen soveltuvimmat lääkeainemolekyylit muun muassa

niiden fysikokemiallisten ominaisuuksien perusteella (Gibson 2009). Jos tarpeeksi

hyvää lääkeainemolekyyliä ei löydy, voidaan yrittää soveltuvimmasta molekyylistä

muokata sopiva, jäljittelevä inaktiivinen aine tai aihiolääke. Tällaisten aineiden

tarkoituksena on entsymaattisella tai kemiallisella reaktiolla hajota silmässä itse

vaikuttavaksi aineeksi. Aihiolääketeknologialla pyritään parantamaan lääkeaineen

imeytymistä muuttamalla sen liukoisuutta ja lipofiilisyyttä, mutta sillä pyritään usein

myös parantamaan lääkkeen stabiilisuutta, tehokkuutta, spesifisyyttä ja

käyttäjäystävällisyyttä tai vähentämään lääkeaineen systeemisiä sivuvaikutuksia

(Järvinen ym. 2005, Gibson 2009). Lääkeaineen puutteellisten ominaisuuksien

korjaaminen tai kiertäminen myöhemmissä formuloinnin vaiheissa on hankalaa,

mutta käytännössä tämä tilanne on melko yleinen (Gibson 2009).

2.2.2 pH:n säätö

Silmävalmisteen pH on tärkeä ominaisuus tuotteen käytettävyyden kannalta, koska

se usein määrää aineiden liukoisuuden, stabiilisuuden ja sarveiskalvon

läpäisevyyden (Ali ja Lehmusvaara 2006, Al-Achi ym. 2013). Silmässä vallitseva pH

on tavallisesti 7,4, ja valmisteen pH pyritään saamaan hyvin lähelle sitä, yleensä

välille 7,14–7,8. Usein tämä ei ole kuitenkaan mahdollista, ja tältä pH-väliltä

joudutaan poikkeamaan esimerkiksi lääkeaineen säilyvyyden tai liukoisuuden takia.

Tällainen poikkeama luonnollisesta pH:sta lisää silmään kohdistuvaa ärsytystä ja

epämukavuutta. Ne lisäävät vuorostaan silmien räpyttelyä ja kyynelnesteen

muodostumista, joka tehostaa lääkkeen poistumista silmästä vähentäen sen

imeytymisaikaa. Yleensä valmisteen lopullinen pH on asetettu parhaaseen

kompromissiin stabiilisuuden ja hyötyosuuden kanssa siten, että se aiheuttaa

mahdollisimman vähän silmän ärsyyntymistä. Valmisteen puskurointiominaisuus

pitää olla kuitenkin niin pieni, että kyynelneste voi neutralisoida valmisteen pH:n.

16

Silmävalmisteissa käytetyimpiä puskuriaineita ovat boraatti-, fosfaatti- ja

sitraattipuskurit.

2.2.3 Toonisuuden säätäjät

Silmän kyynelnesteen normaali osmolaliteetti on 290–310 mOsmkg-1, joka on lähellä

suolaliuoksen osmolaliteettia (Wilson ym. 2001). Silmä sietää osmolaliteetin vaihtelua

välillä 100–640 mOsmolkg-1 hyvin, tätä suuremmat vaihtelut osmolaliteetissa

aiheuttavat silmässä ärsytystä ja johtavat kyynelnesteen ja räpyttelyn lisääntymiseen.

Normaalisti kaupalliset valmisteet asettuvat osmolaliteetiltaan välille 260–330

mOsmkg-1. Lievästi hypotonisella lääkeaineliuoksella saadaan veden virtaus

kulkemaan kohti sarveiskalvoa, jolloin lääkeaineen kulkeutuminen silmään tehostuu.

Pinnalla vallitseva hypotoninen tila kestää kuitenkin vain minuutin tai kaksi, koska

vettä virtaa voimakkaasti sarveiskalvoon.

2.2.4 Säilytysaineet

Silmävalmisteet, jotka on pakattu moniannospakkauksiin, sisältävät antimikrobisen

säilöntäaineen (Ali ja Lehmusvaara 2006). Säilöntäaineen tarkoituksena on estää

potilasta annostelemasta mikrobiologisesti kontaminoitunutta valmistetta silmäänsä.

Hyvä säilöntäaine on tehokas jo pienillä pitoisuuksilla, tehoaa useisiin bakteereihin,

liukenee hyvin valmisteeseen, kestää valmisteen steriloinnin, on yhteensopiva

valmisteen muiden aineosien ja pakkausmateriaalien kanssa sekä stabiili ja tehokas

koko tuotteen eliniän (Gibson 2009). Soveltuvimmat säilytysaineet silmävalmisteisiin

ovat kvaternääriset ammoniumyhdisteet, kuten bentsalkoniumkloridi, parabeenit,

klooributanoli ja 2-poly(etyylialkoholi). Uudempia säilytysaineita ovat peroksidia

tuottavat yhdisteet, kuten Purite®.

17

2.2.5 Kostutusaineet (humektantit)

Kostutusaineet ovat erilaisia pinta-aktiivisia aineita, jotka laskevat nesteen ja

partikkelien kontaktikulmaa parantaen partikkelien liukenemista nesteeseen (Ali ja

Lehmusvaara 2006). Näiden käytössä tulee ottaa huomioon kyynelnesteen

pintajännitys, joka on 43,6–46,6 mNm-1 (Al-Achi ym. 2013). Suuri ero tähän voi

johtaa kyynelnesteen epävakauteen sekä vaikuttaa musiinien aineita sitovaan

vaikutukseen ja sarveiskalvon mikrovilluksiin. Nämä vaikutukset voivat tulla esiin

erityisesti mukoadhesiivisiin ominaisuuksiin perustuvissa formulaatioissa.

2.2.6 Imeytymisen edistäjät

Imeytymisen edistäjien tarkoitus on muokata solun rakenteita tai toimintaa, jotta

lääkeaineiden kulkeutuminen kalvojen läpi trans- ja parasellulaarisesti olisi

helpompaa (Al-Achi 2013). Lääkeaineet kulkeutuvat molempia reittejä pitkin, mutta

yleensä toinen niistä on pääasiallinen imeytymiskanava. Samalla tavalla imeytymisen

edistäjät voivat vaikuttaa yksittäiseen solun ominaisuuteen tai moneen

ominaisuuteen yhtä aikaa (Burstein 1984, Al-achi 2013). Vaikutuskohteina voivat olla

fosfolipidien kaksoiskerros, transmembraani-proteiinien liitokset tai solujenvälisten

tiiviiden- ja vyöliitosten rakenteet.

Esimerkiksi säilytysaineenakin tunnettu bentsalkoniumkloridi kykenee pitkän

hydrofobisen hiilivetyketjunsa avulla kiinnittymään lipidikaksoiskerrokseen ja

parantamaan varautuneiden molekyylien kykyä sen läpäisyyn (Burstein 1984).

Bentsalkoniumkloridin tapaiset aineet kykenevät myös häiritsemään solujen tiiviiden

liitosten rakenteita tai niiden ympärillä toimivaa entsyymitoimintaa. Tällöin

lääkeaineet pääsevät kulkeutumaan epiteelisolujen soluvälitilaan, josta niiden

helpompi kulkeutua sisempiin osiin, kun ohitettavana on enää strooma ja

endoteelisolukerros (Burstein 1984, Hornof ja Berkop-schnurch 2002).

Toiseen solujen väliseen liitokseen, vyöliitokseen, voidaan vaikuttaa aineilla, jotka

muodostavat kelaatteja Ca2+-ionien kanssa, joiden läsnäolo tekee vyöliitoksesta tiiviin

18

(Al-achi ym. 2013). Kaikkia imeytymisen edistäjiä tulee käyttää kuitenkin harkiten,

koska osa niistä aiheuttaa erityisesti pitkäaikaisessa käytössä ärsytystä ja vahinkoa

silmien kudoksille (Hornof ja Berkop-schnurch 2002, Furrer ja Mayer 2002).

2.2.7 Viskositeetin kohottajat ja biokiinnitysaineet

Yleisin tapa parantaa imeytyneen lääkeaineen määrää on pidentää valmisteen

vaikutusaikaa silmän pinnalla. Vaikutusaikaa voidaan pidentää esimerkiksi

kohottamalla lääkkeen viskositeettia tai lisäämällä valmisteeseen musiineihin

tarttuvia polymeerejä (Ali ja Lehmussaari 2006, Gibson 2009).

Liuosten viskositeettia kohottamaan käytetään usein niihin soveltuvia polymeerejä

(Wilson ym. 2001). Yleisimmät tähän käytetyt aineet ovat polyvinyylialkoholi (PVA) ja

erilaiset selluloosajohdokset, kuten hydroksipropyylimetyyliselluloosa (HPMC).

Kaikille valmisteille on optimaalinen viskositeetti, jossa valmisteen imeytymisaika on

pidentynyt, mutta se ei kuitenkaan hankaloita lääkeaineen vapautumista

formulaatiosta, ärsytä liikaa silmän pintaa tai sumenna näköä liikaa (Nayak ym. 2012,

Al-Achi ym. 2013). Käytetyimmistä yhdisteistä PVA:n erikoisuutena on veden

pintajännityksen laskeminen, ja eri selluloosajohdokset taas kattavat laajasti

tarvittavan viskositeettialueen (Wilson ym. 2001). Molemmat aineista ovat laajassa

käytössä, ne on todettu yhteensopiviksi useiden eri lääkeaineiden kanssa, ja lisäksi

ne stabiloivat silmän kyynelfilmiä.

Musiineihin kiinnittyvät polymeerit kuuluvat biokiinnitysaineisiin (Wilson ym 2001,

Kaur ym. 2002). Näitä molekyylejä on olemassa niin syynteettisiä, puolisynteettisiä

kuin luontaisiakin (Robinson ja Mlynek 1995). Yhteistä näille polymeereille on, että ne

sisältävät paljon hydrofiilisiä ryhmiä, kuten karboksyyli-, hydroksyyli-, amidi- ja

sulfaattiryhmiä. Näiden ryhmien tarkoitus on kiinnittyä sarveiskalvon pinnalla oleviin

musiineihin elektrostaattisten, hydrofobisten interaktioiden ja vetysidoksien avulla.

19

2.2.8 Suspension muodostajat

Suspendointiaineiden tarkoituksena on muuttaa ulkoisen faasin koostumusta siten,

että kiinteiden partikkelien sedimentaatio on mahdollisimman hidasta (Ali ja

Lehmusvaara 2006). Valmisteen formulaatiossa täytyy kuitenkin ottaa huomioon, että

valmiste pysyy myös helposti annosteltavana ja muutenkin soveltuvana

silmälääkintään. Suspendointiaineen valintaan vaikuttavat halutut vehikkelin

muodostusominaisuudet, yhteensopivuus muiden komponenttien kanssa ja

myrkyttömyys soluille. Yleisesti tähän käytettyjä aineita ovat selluloosajohdokset,

kuten metyyliselluloosa, karboksyylimetyyliselluloosa,

hydroksypropyylimetyyliselluloosa sekä synteettiset polymeerit, kuten karbomeerit,

poloksameerit ja polyvinyylialkoholit.

2.2.9 Faasin muuttajat

Faasitransitiossa jokin liuoksen komponentti pystyy muuttamaan valmisteen

olomuodon silmän pinnalla nestemäisestä geelimäiseksi tai kiinteäksi. Valmisteen

faasin muutoksella pyritään pidentämään sen vaikutusaikaa silmässä (Wilson ym.

2001). Faasin vaihto perustuu muuttuvan aineen pH:n, lämpötilan tai ionivahvuuden

vaihtumiseen.

Lämpötilaperustaisiin muutoksiin käytetään yleensä poloksameerejä ja pluronic F-

127:ää. Näillä aineilla faasitransitio tapahtuu 34 °C:ssa, joka on silmälääkintään

soveltuva lämpötila (Vadnere ym. 1984). F-127 on huoneenlämmössä liuosmaisessa

tilassa, mutta annostelun jälkeen sen lämpötila kohoaa yli 34 °C:n, jolloin se vaihtaa

olomuotoaan geelimäiseksi. F-127:n faasitransitio perustuu mekanismiin, jossa

valmisteen liuotin poistuu asteittain, misellien aggregoituminen lisääntyy ja

polymeeriverkkojen kietoutuminen lisääntyy. Lämpötilaperustaisen faasitransition

heikkous on, että valmisteessa poloksameerikonsentraation täytyy olla yli 25 %

(w/w), mikä vähentää sen siedettävyyttä silmässä (Wilson ym. 2001).

20

Faasitransitio, joka perustuu komponentin pH:n vaihtumiseen, tehdään esimerkiksi

käyttäen selluloosa-asetaatti-ftalaattia (Wilson ym. 2001). Tällä aineella on hyvin

pieni viskositeetti pH:ssa viisi, mutta se muodostaa hyvin nopeasti geelin pH:n

noustessa kyynelnesteen tasolle 7,4:ään. Carpopol 934 -polymeereillä on

samantyyppinen ominaisuus: pH:ssa 4,4 sen aiheuttama viskositeetti on 25 cps ja

pH:ssa 7,4 vastaavasti 9000 cps (Nayak ym. 2012).

Ionivahvuuteen perustuvissa faasitransitioissa käytetään usein Gellan gum -

polysakkaridia. Valmisteessa nestemäisenä oleva Gellan gum muuttuu annostelun

jälkeen kyynelnesteen vaikutuksesta kirkkaaksi geeliksi (Mazuel ym.1989, Wilson

ym. 2001). Geeliytymiseen vaikuttaa erityisesti kyynelnesteessä olevat yksi- ja

kaksiarvoiset kationit. Ionivahvuuteen perustuvan faasitransition etuna on erityisesti

helpompi varastointi, koska siinä tuotteen säilyttäminen ei vaadi yhtä tarkkaa

lämpötilaseurantaa, kuten esimerkiksi lämpötilaan perustuvan transition tuotteissa.

2.3. Formulaatiotyypit silmälääkinnässä

2.3.1 Perinteiset formulaatiot

Perinteiset annostelumuodot silmälääkevalmisteissa ovat liuokset, suspensiot, geelit

ja voiteet (Ali ja Lehmussaari 2006) (Kuva 4, taulukko 2). Niitä on kritisoitu paljon

muun muassa huonosta hyötyosuudesta, mutta ne ovat edelleen käytetyimpiä

annostelumuotoja silmälääkinnässä. Perinteisten annostelumuotojen rinnalle on

kehitetty uusia innovatiivisempia lääkemuotoja, kuten silmälamellit,

aihiolääkevalmisteet sekä mikro- ja nanopartikkelit, joiden käyttöiät voivat vaihdella

tunneista vuosiin. Näiden lisäksi on erilaisia silmän sisään annosteltavia

lääkemuotoja, mutta tässä katsauksessa keskitymme silmän ulkopuolelle

annosteltaviin valmisteisiin, jotka eivät tarvitse kirurgista toimenpidettä annosteluun.

21

Kuva 4. Silmävalmisteiden käyttöaika (Amo ja Urtti 2008)

Taulukko 2 Formulaatiokomponentit, joita käytetään yleisesti moniannossilmätippa-valmisteissa. (Y) Komponentti sisältyy, (O) Komponentti voidaan lisätä, ( ) Kompo-nenttia ei käytetä

Komponentti Liuos Suspensio Geeli Voide Lamelli

Lääkeaine Y Y Y Y Y

Lääkekuljetin O O O O O

Vesi Y Y Y O

Puskurointiaine Y Y Y

Toonisuuden säätäjä O O O

Säilytysaine Y Y Y Y

Viskositeetin säätäjä O O

Liuotin O O

Suolat O O O O

Luonnollinen kiinnitysaine O O O O

Suspensionmuodostaja Y

Faasinvaihtaja Y

Imeytymisen parantaja O O O O

Kytketyt polymeerit Y

Vaha/öljy/vaseliini Y

Lähde: Lang 1995

22

2.3.1.1 Liuokset

Vesipohjaiset liuosvalmisteet ovat edelleen yleisin silmälääkemuoto (Ali ja

Lehmussaari 2006, Gibson 2009). Suurin osa lääkeaineista on vesiliukoisia, mutta

tilanteissa, jossa lääkeaine ei itse ole vesiliukoinen, yritetään lääkeaineesta muokata

vesiliukoinen suola tai tehdä rasvapohjainen valmiste. Liuosmaisen valmisteen etuja

ovat pääsääntöisesti yksinkertaisempi valmistaminen teollisessa mittakaavassa sekä

helpompi annosteltavuus. Liuoksien heikkoutena taas on nopea poistuminen

imeytymisalueelta, jolloin lääkkeen hävikki on suurempi. Liuoksissa voidaan käyttää

muun muassa lääkekuljettimia, puskurointiaineita, toonisuuden säätäjiä,

säilytysaineita, viskositeetin säätäjiä, liuottimia, biokiinnitysaineita ja imeytymisen

parantajia (taulukko 2).

2.3.1.2 Geelit

Geelimäisillä valmisteilla saavutetaan liuoksia pidempi vaikutusaika silmässä (Gibson

2009). Monia liuosvalmisteita onkin muutettu geelimäisiksi, jotta tuotteelle saadaan

pidempi annosteluväli ja siten tuote saadaan käyttäjäystävällisemmäksi.

Geelimäisten valmisteiden etuna verrattuna esimerkiksi suspensioihin on niiden

helppo silmätippamainen annostelu (Robinson ja Mlynek 1995). Geelit muodostetaan

usein faasinsäätäjillä, joista on kerrottu aikaisemmin. Niissä muutoksen perustana

toimii valmisteen lämpötila, pH tai vallitseva ionivahvuus (Gupta ym. 2007, Gibson

2009).

2.3.1.3 Suspensiot

Jos lääkeaine on huonosti veteen liukeneva, valmisteesta muodostetaan usein

suspensio (Ali ja Lehmusvaara 2006). Suspensioissa lääkeaine pyritään saamaan

alle 10 µm kokoisiksi partikkeleiksi (Al-Achi ym. 2013). Liuosmaisiin valmisteisiin

nähden suspensiolla saavutetaan pidempi vaikutusaika silmässä suuremman

viskositeetin ansiosta, mutta lääkeaineen hyötyosuuteen vaikuttaa tämän lisäksi

myös lääkeaineen kyky liueta suspensiosta kyynelnesteeseen ja imeytyminen silmän

pinnalta (Sieg ja Robinson 1975, Wilson ym. 2001, Gibson 2009, Al-Achi ym. 2013).

23

Hyvän silmäsuspension valmistaminen on monimutkaisempaa kuin liuosmaisten

valmisteiden. Lääkeaineen parantunut kemiallinen säilyvyys voi vaihtua huonoon

fysikaalisen säilyvyyteen. Formulaatiossa on otettava huomioon suspension

laskeutuminen, kakun muodostuminen, partikkelikoon kasvaminen, kidemuodon

muutokset, uudelleensekoitettavuus, säilyvyys ja helppo tuotettavuus (Kaur ja

Kanwar 2002, Ali ja Lehmusvaara 2006, Gibson 2009). Partikkelikoolla on suuri

merkitys suspension fysikaalisessa säilyvyydessä ja hyötyosuudessa (Sieg ja

Robinson 1975, Ali ja Lehmusvaara 2006). Partikkelikoko vaikuttaa tuotteen

sedimentaatioon, kasautumiseen ja uudelleensekoitettavuuteen. Partikkelikoko ja

kidemuoto eivät kuitenkaan ole suspensiossa stabiileja, vaan niitä voivat muuttaa

erityisesti varastointiolosuhteet ja varastoinnin kesto (Kaur ja Kanwar 2002).

Muutoksissa pienet partikkelit voivat liueta ja suurimmat kasvaa edelleen, ja tällainen

partikkelikoon kasvaminen voi aiheuttaa pidentyneen vaikutuksen ja hitaamman

liukenemisen (Ali ja Lehmusvaara 2006). Formuloijan on tunnettava valmisteen

ainesosat ja niiden käyttäytymiseen vaikuttavat asiat, kuten kostuminen, zeta-

potentiaali, aggregoituminen, sedimentaatio ja virtauskäsitteet, jotta hän kykenee

muodostamaan tuotteesta tehokkaan, mutta samalla hyvin muodostuneen

suspension. Lääkeaineen partikkelikoon muuttumista voidaan vähentää esimerkiksi

oikean lääkeaineen suolamuodon valinnalla, mutta samalla sen vaikutus lääkeaineen

liukenemiseen silmässä on otettava huomioon (Gibson 2009). Yksi suspension

heikkouksista on ongelmallinen sterilointi. Lääkeaine voi sterilointiprosessissa

menettää tehoaan tai siihen voi tulla morfologisia muutoksia, jotka voivat vaikuttaa

valmisteen ominaisuuksiin. Nämä muutokset täytyy tunnistaa ja ottaa huomioon jo

suunnitteluvaiheessa.

Uudemman sukupolven suspensiot perustuvat mikropalloihin ja mikrohiukkasiin, jotka

sisältävät lääkeainetta (Kaur ja Kanwar 2002). Partikkelien toiminta

imeytymisalueella voi perustua kemiallisiin reaktioihin, partikkelin hajoamiseen tai

ionienvaihtoon. Mikropartikkeleita on yhdistetty myös muihin parannuskeinoihin,

kuten biokiinnittyviin aineisiin ja nanopartikkeleihin. Näiden yhdistelmien on todettu

lisäävän lääkeaineen määrää ja pidentävän sen vaikutusta lasiaisessa (Zimmer ja

Kreuter 1995, Genta ym. 1997). Suurimmat hankaluudet mikropartikkelisovelluksissa

liittyvät stabiilisuuteen, annoksien yhdenmukaisuuteen, lääkeaineen vapautumiseen

ja teollisen mittakaavan valmistukseen. (Kauer ja Kanwar 2002).

24

2.3.1.4 Voiteet

Silmävoiteet valitaan perinteisistä annosmuodoista yleensä, kun lääkevalmiste

sisältää vedessä epävakaita lääkeaineita, joille vaikutusaika silmässä on tärkeä (Al-

Achi ym 2013). Silmävoiteiden suurimmat ongelmat ovat niiden aiheuttama näön

sumeneminen, epätarkka annostelu ja hankala sterilointi (Ali ja Lehmussaari 2006).

Vedettömien voiteiden pohjat koostuvat yleensä valkovaseliinista ja mineraaliöljystä

tai muunnellusta vaseliinipohjasta (Gibson 2009, Al-Achi ym. 2013). Voiteiden

tarkoitus on sulaa annostelualueellaan kehon lämmön vaikutuksesta. Voiteiden

etuina usein on muita vähäisempi silmän ärsytys ja hyvä levittyminen silmän pinnalle.

Vähäisempi silmän ärsytys johtuu osittain siitä, että niiden valmistuksessa käytetään

vähemmän erilaisia komponentteja (taulukko 2). Voiteiden sterilointi on suspension

tapaan ongelmallista. Niihin voidaan käyttää lämpösterilointia tai ne voidaan

valmistaa aseptisesti steriileistä lähtöaineista (Ali ja Lehmusvaara 2006, Gibson

2009). Kuitenkin yleisimpiä tapoja steriloida silmävoiteita ovat soveltuvan

membraanin läpi suodatus tai kuivailmasterilointi.

2.2.1.5 Silmälamellit ja linssit

Silmälamellit kuuluvat valmisteryhmään, jolla haetaan jatkuvaa, pitkää ja tasaista

lääkeainepitoisuutta silmään. Tässä työssä ne jaotellaan kahteen tyyppiin:

biohajoavat (soluble, bioerodible ja biodegradable) ja liukenemattomat (insoluble,

nonerodible) (Gibson 2009). Ensimmäisiä mainintoja näiden tyyppisistä valmisteista

kuvattiin Britannian farmakopeassa vuonna 1948, kyseessä oli atropiinia sisältävä

liivatekiekko (Furrer ym. 2008). Ensimmäinen kaupallinen valmiste, liukenematon

Ocusert™ tuli myyntiin Yhdysvalloissa 1974. Silmälamelli asetetaan silmäluomen ja

sarveiskalvon väliin, josta se vapauttaa lääkeainetta tasaisesti (Amo ja Urtti 2008).

Joistakin polymeereistä voidaan tehdä myös silmän sisään laitettavia valmisteita.

Liukenemattomien silmälamellien etu on tasaisempi lääkkeen vapautuminen

valmisteesta, koska vapautumista säätelee kalvo (Furrer ym. 2008, Al-Achi ym.

2013). Liukenevissa valmisteissa rungon liukenemisnopeus on pääasiallinen

lääkeaineen vapautumisen säätelijä, minkä takia tuotteella on hankalaa saavuttaa

25

nolla-asteen kinetiikkaa. Ocusert™:n tapaiset liukenemattomat varastosilmälamellit

sisältävät kolme pääosaa: lääkeaineen, lääkkeen kuljetusyksikön ja alustan.

Kuljetusyksikkö sisältää lääkevaraston, kuljetusaineen ja vapautumisen säätelijän.

Ocusert™:n tapauksessa kuljetusaineena on algiinihappo ja vapautumisen

säätelijänä toimii etyleenivinyyliasetaatti (EVA) yhteispolymeeri -membraani.

Valmiste vapauttaa lääkeainetta seitsemän vuorokauden ajan.

Liukenevat silmälamellit ovat potilaalle helppokäyttöisempiä kuin liukenemattomat,

koska niitä ei tarvitse poistaa silmästä vaikutuksen loputtua. Liukenevat valmisteet

tehdään kiinnittämällä lääkeaine liukenevista materiaaleista valmistettuun runkoon.

Yleisimpiä rungon valmistusaineita ovat hydroksipropyyliselluloosa, hyaluronihappo,

karbomeerit ja polyakryylihappo. Tuotannollisena etuna liukenevissa silmälamelleissa

on, että osa valmisteista voidaan valmistaa puristamalla, ja ne voidaan steriloida

gammasäteilyllä (Al-Achi ym. 2013). Liukenevien valmisteiden vaikutusaika on

yleensä 12–24 tuntia, mutta on myös valmisteita, kuten Posurdex®, joiden

vaikutusaika on pitempi – jopa kuusi viikkoa (Amo ja Urtti 2008).

Molempien valmistetyyppien, liukenemattomien ja liukenevien silmälamellien,

heikkoutena on lamellin mahdollinen poistuminen silmästä esimerkiksi nukkuessa

sekä erityisesti vanhuksille hankala valmisteen asettaminen ja pois ottaminen (Furrer

ym. 2008, Al-Achi ym 2013).

Lamellien liukeneminen voi tapahtua kolmella tavalla riippuen rungon polymeereistä

(kuva 5) (Merkli ym. 1995). Liukenevissa valmisteissa lääkeaineen vapautuminen

perustuu polymeerirungon hydrolyyttiseen tai entsymaattiseen pilkkoutumiseen.

Tyypissä yksi vesiliukoiset polymeerit vapautuvat, kun niitä yhdistävät hydrolyyttisesti

epävakaat sillat hajoavat. Polymeerejä yhdistävät sillat hydrolysoituvat yleensä

nopeasti eikä menetelmä siksi sovellu nopeasti liukeneville lääkeaineille. Tyypissä

kaksi liuotettava polymeeri on tehty liukenemattomaksi vaihtamalla sopivia

sivuryhmiä polymeeriin. Polymeerin ryhmien vaihtuessa kemiallisissa reaktioissa

muuttuu polymeeri taas liukoiseksi. Järjestelmä soveltuu myös nopeammin

liukeneville valmisteille, joskin rakenteen saaminen optimaaliseksi on

haasteellisempaa näissä tapauksissa johtuen rakenteen turpoamisesta hidastetussa

vapauttamisessa. Tyypissä kolme polymeerin runko on kokonaisuutena

liukenematon, mutta siihen on lisätty vesiliukoisia molekyylejä, jotka pilkkovat sen

26

pieniksi paloiksi mahdollistaen niiden liukenemisen. Kolmostyyppiä voidaan pitää

varsinaisesti biohajoavana ja, koska sen hajoamistuotteet eivät ole toksisia, voidaan

näistä tehdä myös silmän sisään laitettavia valmisteita. Eri mekanismit voivat myös

yhdistyä valmisteissa. Lääkevalmisteen hankala käytettävyys sitä eniten tarvitsevilla

on haitannut silmälamellin suosiota, mutta eläinlääkinnässä sille on löytynyt

käyttökohteita (Furrer ym. 2008). Biokiinnitysaineita on tutkittu tehostamaan

imeytymistä myös lamellien toiminnassa. Lamellit valmistetaan pursottamalla 140–

160 °C lämpötilassa ja 200–300 kPa paineessa, mikä rajoittaa mahdollisia

lääkeaineita, joita voidaan käyttää.

Kuva 5. Lamellin rungon pilkkoutumistavat (Merkli ym. 1995)

Silmälamellien lisäksi on käytössä myös liukenemattomia piilolinssejä, jotka

sisältävät lääkeainetta (Gibson 2009). Niiden käyttöä on tutkittu jo 1960-luvulta

saakka, ja erilaisia sovelluksia tutkitaan tänäkin päivänä (Peng ja Chauhan 2011).

Yleisimmin käytetään poly-2-hydroksietyylimetakrylaatista valmistettuja pehmeitä

linssejä, joita voidaan käyttää lääkeaineen annostelun lisäksi myös näön

korjaamiseen (Kaur ja Kanwar 2002). Linssin polymeerit voivat absorboida jopa 80 %

painostaan vettä (Mundapa 2011). Lääkeaineen ei ole tarkoitus reagoida linssin

rakenteiden kanssa, vaan se varastoituu absorboituneen nesteen mukana

hetkellisesti linssiin. Lääkeaine imeytetään linssiin upottamalla se lääkeliuokseen

ennen silmään asettamista, annostelemalla lääkeliuos linssin päälle asettamisen

jälkeen tai annostelemalla lääkeliuos linssin koveralle puolelle ennen linssin

asettamista silmään (Kaur ja Kanwar 2002, Souza ym 2013). Suurin osa

27

varastoituneesta lääkeaineesta kuitenkin on poistunut linssistä muutaman tunnin

kuluttua, joten se ei muodosta vielä pitkäkestoista valmistetta. Kontrolloitu

pitkäaikainen vapautuminen linssistä vaatii, että linssin kanssa käytetään jotain

muuta kuljetussysteemiä, kuten mikroemulsioita, liposomeja tai nanopartikkeleita

(Gulsen ja Chauhan 2005, Danion ym 2007, Garbwal ym. 2012). Linssien

heikkoutena on tarkan lääkeainemäärän arvioinnin vaikeus linssissä, nopea

lääkeaineen poistuminen ilman erillistä vapautusmekanismia ja kallis valmistaminen

(Mundapa 2011).

2.3.2 Uudemmat silmälääkkeiden kuljetusmekanismit

2.3.2.1 Liivatesieni Gelfoam®

Gelfoam®:ia, joka on valmistettu siannahan liivatteesta, on tutkittu uutena

mahdollisuutena parantaa erityisesti suurien vesiliukoisten lääkeainemolekyylien

kulkeutumista silmään. Se asetetaan lamellien tapaan silmäluomen alle, jossa se

imee nestettä itseensä, turpoaa ja pehmenee (Hämäläinen ym. 1998, Simamora ym.

1998). Gelatiinisieni Gelfoam® voi sisältää kuluvan rungon, joka toimii lääkeaineen

vapauttajana, tai lääkeaine voidaan imeyttää suoraan liivatesieneen (Hämäläinen

ym. 1998, Simamora ym. 1998, Negvesky ym. 2000). Suurin hyöty lamelleihin

verrattuna on kostumisen aiheuttaman liivatesienen pehmentyminen silmässä, mikä

vähentää silmän ärsyyntymistä. Gelfoam® on osoittanut lupaavia merkkejä

sopivuudesta erityisesti silmän tutkimus- ja leikkauskäytössä pidentämään ja

parantamaan pupillin laajentumista sekä kuljettamaan pilokarpiinia silmään

(Simamora ym. 1998, Negvesky ym. 2000).

2.3.2.2 Iontoforeesi

Iontoforeesi on menetelmä, jossa lääkeainetta kuljetetaan aktiivisesti sarveiskalvon

läpi käyttäen hyväksi yleensä yhden tai kahden milliampeerin sähkövirtaa (Rupenthal

ja Alany 2008). Intoforeesin ideaa on tutkittu jo 1950–luvulla, ja sitä on käytetty

lääkeainekuljetukseen monissa muissa kudoksissa. Minuutista neljään minuuttiin

28

sarveis-, side- ja kovakalvon läpäisevillä iontoforeesihoidoilla pystytään

saavuttamaan jopa monikymmenkertaisia lääkeainepitoisuuksia silmän sisempiin

osiin verrattaessa perinteiseen silmätippojen annosteluun (Eljarrat-Binstock ym.

2005). Hoitomuodon soveltumista myös kotikäyttöön on tutkittu lupaavin tuloksin

(Halhal ym. 2004). 17:stä kokeiluun osallistuneesta potilaasta 15:n hoito onnistui

täysin ja lopuilla kahdella osittain, ja lisäksi hoito osoittautui hyvin siedetyksi.

Iontoforeesin turvallisuutta ja siedettävyyttä on tutkittu myös pitempiaikaisessa

käytössä, ja tulokset osoittavat hoidon olevan hyvin siedettyä ja turvallista (Patane

ym. 2013). Laitteiston hankala käyttö ja lyhytaikainen apu sekä riski kudosvaurion

syntyyn jarruttavat tekniikan laajempaa hyödyntämistä. Hoidolla on kuitenkin

potentiaalia erityisesti lyhyissä hoidoissa, joissa se tehostaa lääkkeen kulkeutumista

silmään ja vähentää annostelukertoja päivässä. Laitteiston kehittymisen myötä myös

käyttöturvallisuus ja käytettävyys varmasti parantuvat ja järjestelmän

käyttömahdollisuudet laajenevat.

2.4 Lääkepakkaus

Pakkausmateriaalit ovat tärkeässä osassa lääkevalmisteessa, koska ne määrittävät

omalta osaltaan valmisteen säilyvyyden ja käytettävyyden. Silmälääkinnässä

pakkausmateriaalit ovat kuitenkin vielä tärkeämmässä osassa, koska kaikkien

tuotteiden tulee olla steriilejä, ja niiden käyttö pitää usein soveltua erityisesti

vanhemmille ihmisille. Lääkemuoto, siinä käytetyt komponentit ja pakkauksen

käyttötarkoitus määrittävät pitkälti, millainen pakkaus tuotteelle valitaan (Gibson

2009). Silmälääkinnässä käytetään monenlaisia pakkauksia: perinteisillä

lääkemuodoilla liuoksella, suspensiolla, geelillä ja voiteella on sekä kerta- että

moniannospakkauksia niin lasisina kuin muovisina. Teollisuus on siirtynyt tiputtimilla

varustetuista lasisista pulloista ja ampulleista pääasiassa muovisiin pakkauksiin,

joissa on integroidut annostelijat. Muovisten pakkausten etuina ovat suora

annosteltavuus pullosta sekä parempi kestävyys tuotannon ja varastoinnin aikana

(Agalloco ja Akers 2008, Gibson 2009). Lasipullojen käyttö rajoittuu nykypäivänä

lähinnä tuotteisiin, joilla on stabiilius- tai yhteensopivuusongelmia nykyisten

muovipakkausten kanssa. Valitun pakkauksen tulisi täyttää ainakin seuraavat

29

ominaisuudet: pakkauksen materiaalit ovat farmakopeoiden mukaisia ja täyttävät

säädetyt vaatimukset, pakkaus on yhteensopiva valmisteen aineosien kanssa,

pakkaus pitää tuotteen stabiilina, valmiste voidaan steriloida pakkauksessa, pakkaus

säilyttää valmisteen steriiliyden sen käyttöiän, pakkaus on turvasinetöity sekä

mahdollistaa helpon annostelun potilaalle (Löfgren ym. 2003, Gibson 2009).

Muovipulloja on monenlaisia, mutta yleisimpiä ovat perinteisellä tiputinosalla

varustetut tai blow-fill-seal (BFS) -tyyppisesti valmistetut pullot ja pipetit. Ne

valmistetaan yleensä polyetyleenistä (PE) tai polypropyleenistä (PP), joita pidetään

reagoimattomina materiaaleina. Niiden tasapainoiset ominaisuudet helpottavat

teollisuuden ja käyttäjän toimintaa, koska ne mahdollistavat laajan muokattavuuden

pakkaukselle, kirkas pakkaus mahdollistaa valmisteen silmämääräisen tarkistamisen,

ja samalla kuitenkin tuote säilyttää helpon avattavuuden ja käytettävyyden (Löfgren

ym. 2003). Muovipakkausten kiinteät tippanokat ovat myös mikrobiologisesti

parempia kuin lasipullojen pipetit, koska pullosta irroitettavat pipetit kontaminoituvat

helposti annosteltaessa, jos ne lasketaan esimerkiksi pöytätasolle. Muovien etuina

teollisesta näkökulmasta ovat myös halvempi hinta, keveys, helppo valmistaminen ja

parempi kestävyys (Löfgren ym. 2003, Gibson 2009).

Muovisten pakkausten heikkoutena on, että osa muoveista absorboi joitain

formulaatioiden aineosia, kuten lääke- ja säilytysaineita (Löfgren ym. 2003, Gibson

2009). Tätä tapahtuu erityisesti lipofiilisten lääkkeiden kanssa. Yleisin pakkauksen ja

valmisteen välinen ongelma on bentsalkoniumkloridi (BAK) -säilytysaineen

absorboituminen polyetyleenimuoviin. Absorboitumisen lisäksi polymeereistä

valmistettujen muovien heikkoutena ovat mahdollinen muovin aineosien

liukeneminen lääkeaineeseen, tulostemusteen tai etiketin liiman imeytyminen

pakkauksen läpi ja formulaation hapettumisreaktio. Näitä ongelmia voidaan kiertää

valmistamalla tuote lasiseen pakkaukseen, vaihtamalla säilytysaine tai muuttamalla

tuote säilytysaineettomaksi. Säilytysaineettomat valmisteet pakataan yleensä BFS-

tekniikalla tuotettuun kerta-annospipettiin. Säilytysaineettomien tuotteiden

valmistuksessa täytyy ottaa huomioon, että valmiste pysyy steriilinä koko tuotteen

eliniän. Kerta-annospakkauksien negatiivisina puolina ovat kalliimmat

valmistuskustannukset, isommat loppupakkaukset sekä tasaisen annoksen

hankalampi saanti.

30

3 Valmistus

Nestemäinen valmiste on erittäin altis mikrobikontaminaatiolle, koska monesti se on

ideaalinen kasvualusta bakteereille, kuten Salmonella, E. coli ja Staphylococcus

aureus (Reed 2009). Tämä tekee valmistusprosessista haastavamman, kun

lopputuotteen on oltava steriili. Steriileille tuotteille on kaksi pääasiallista

valmistustapaa, loppusterilointi ja aseptinen prosessi. Loppusterilointiin päädytään

tuotteissa, jotka ovat tarpeeksi stabiileja näihin käsittelyihin (Agalloco ja Akers 2008).

Kaikista steriileistä tuotteista 5–15 % loppusteriloidaan. Loppusteriloitavassa

valmistuksessa tuotteen osien ei tarvitse olla valmiiksi steriileitä, mutta

valmistuksessa pyritään silti välttämään ylimääräisen biokuorman kertymistä

millekään tuotteen osalle (Reed 2009). Kertyvää biokuormaa pyritään vähentämään

käyttämällä puhdastilaolosuhteita, jolloin steriloinnin työ vähenee. Lopputuotteelle

valitaan sen formulaation, ominaisuuksien ja pakkauksen perusteella sopivin

sterilointitapa (EMEA 2000). Käytetyin loppusterilointi on autoklavointi, muita yleisesti

käytettyjä ovat säteily ja kuumailma (EMEA 2000, Reed 2009).

Aseptista valmistusta käytetään, kun valmiste tai pakkaus ei kestä loppusterilointi-

prosesseja. Aseptinen valmistus perustuu pitkälti lääkeaineiden, astioiden,

materiaalien ja laitteiden erillisiin sterilointeihin sopivissa kohdissa prosessia, jonka

jälkeen osaset yhdistetään (FDA 2004, Reed 2009). Aseptisessa, kuten myös

loppusteriloitavassa valmistuksessa pakkauksen täyttö ja sulkeminen ovat prosessin

herkimpiä vaiheita, ja ne tulee suorittaa mahdollisimman puhtaissa tiloissa, koska

alkusterilointien jälkeen ei tuotteen puhtautta pystytä parantamaan.

Aseptinen valmistaminen on hankalampaa ja virheherkempää kuin loppusteriloinnin

käyttö. Tämä johtuu siitä, että aseptisessa valmistuksessa käytetään monia erilaisia

sterilointitapoja, kuten kuumailmasterilointi, autoklavointi ja steriilisuodatus (Reed

2009). Jokainen erillinen sterilointi ja työvaihe monimutkaistaa valmisteen tuotantoa.

Yhdysvaltojen ruoka- ja lääkeviranomaisen (U.S. Food and Drug Administration,

FDA) takaisinkutsumista lääkkeistä, joissa oli puutteellinen steriiliys vuosina 1980–

2000, lähes kaikki oli valmistettu aseptisella prosessilla. Yleinen käsitys onkin, että

aseptista valmistusta käytetään vain tilanteissa, joissa loppusterilointi ei ole

mahdollista (FDA 2004, Gibson 2009).

31

Aseptisen valmistuksen juuret ovat 1900-luvun alkupuolella, jolloin ensimmäiset

käsinekaapit otettiin käyttöön (kuva 6) (Agalloco ja Akers 2008). Niissä ei otettu vielä

huomioon ilmankiertoa. Suurtehohiukkassuodattimien (HEPA) kehitys toi

tilanteeseen parannusta 1950–luvulla ja mahdollisti suurempien puhdastilojen

rakentamisen. Ihmistä on huonon puhdistettavuuden ja turvallisuuden takia yritetty

poistaa valmistustiloista jo alusta alkaen erilaisten este- ja ilmanvaihtomenetelmien

avulla. Fyysiset esteet kuten verhot ja seinät hankaloittavat työskentelyä, joten

väliseiniin voidaan asentaa kiinteitä käsineitä, jotka mahdollistavat työskentelyn

puhdastila-alueella. Aktiiviset ilmasulut ja puhaltimet taas perustuvat ilmavirran

ohjailuun, joka estää partikkelien kulkeutumista valmistuksen herkkiin kohtiin.

Siirryttäessä kohti nykyaikaisempia eristysjärjestelmiä on niissä alettu kiinnittämään

entistä enemmän huomiota ilmanvaihtoon, tuotteen siirtoketjuun valmistuksen

yhteydessä, laitteiston puhdistusjärjestelmiin ja näiden kaikkien toimintaan yhdessä.

Nämä järjestelmät minimoivat sisä- ja ulkotilojen vaikutukset toisiinsa ja parantavat

sekä tuotteen että valmistushenkilökunnan turvallisuutta. Jokainen järjestelmä pitää

suunnitella sopivaksi tuotteen monimutkaisuuden, ominaisuuksien ja halutun

valmistusmittakaavaan mukaan.

Kuva 6. Aseptisen prosessoinnin sukupuu (Agalloco ja Akers 2008).

32

3.1 Valmistuslaitteistot

Aseptisessa tuotannossa pyritään estämään valmisteen kontaminoituminen

tuotannon aikana, jolloin valmistetta on turvallista käyttää potilaan silmän hoitoon.

Nykyaikaisessa aseptisessa valmistuksessa käytetään mm. isolaattoreita, rajoitetun

pääsyn esteitä (RABS), blow-fill-seal (BFS) ja form-fill-seal (FFS) -järjestelmiä sekä

näiden yhdistelmiä (Whyte 2001, Chiarello 2004, Drinkwater haettu internetistä:

8.12.2013). Näillä järjestelmillä pyritään minimoimaan ihmisen läsnäolo prosessissa

ja vähentämään aseptisen valmistuksen kustannuksia. Moni lääkeaine vaikuttaa jo

pieninä pitoisuuksina, minkä takia valmistusympäristö pyritään automatisoimaan ja

ihminen poistamaan tilasta. Nykyiset lääkkeenvalmistusjärjestelmät ovatkin entistä

automatisoituneempia.

3.1.1 Isolaattori

Isolaattorit ovat voimakkaasti kasvava aseptisen valmistuksen järjestelmä (Lysfjord ja

Porter: Haettu internetistä 9.12.2013). Isolaattorin toiminta perustuu fyysisiin ja

ilmanpaine-esteisiin, jotka pyrkivät estämään bakteerien ja hiukkasten pääsyn

valmistuksen herkimpiin osiin (Drinkwater haettu internetistä: 8.12.2013). Isolaattorit

voidaan jakaa kahteen ryhmään: avoimet ja suljetut. Avoimet järjestelmät ovat

teollisuudessa käytetympiä, koska niissä isolaattoriin voidaan tuoda ulkopuolelta

esimerkiksi uusia pakkauksia (Lysfjord ja Porter: Haettu internetistä 9.12.2013).

Suljetuissa järjestelmissä prosessin aikana ainoastaan ilma siirtyy isolaattoriin ja

sieltä pois, joten avoimet järjestelmät mahdollistavat suuremmat tuotantoerät.

Isolaattorien tarkoitus on parantaa valmistusolosuhteita ja samalla pienentää

valmistuksen kustannuksia (Agalloco 2006). Isolaattoreissa saavutetaan pienemmän

käyttökustannukset, koska koko valmistustilaa ei tarvitse muokata tuotantoketjun

herkimmän osion mukaan, vaan laitteistojen ympärille voidaan suunnitella sopivan

kokoiset isolaattorit, jolloin puhdistettava tila pienenee ja laatu paranee (Whyte 2001,

Agalloco ja Akers 2008). Isolaattoreiden toimintaan kuuluu erilaisia osia, kuten

ilmastointi, tavaran kuljetus, työskentelylaitteet, erilaiset liitännät ja ilmalukot (Kuva 7)

(Whyte 2001).

33

Kuva 7. Isolaattori ja siihen vaikuttavat reitit (Whyte 2001).

Ilmastointi on tärkeässä osassa isolaattorijärjestelmässä. Se huolehtii pitkälti siitä,

että tila täyttää valmistuksen aikana vaadittavan puhtauden. Isolaattorin

ilmanvaihdosta huolehtii HEPA-suodatettu laminaarivirtaus, joka vaihtaa tilan ilman

yleensä 20–60 kertaa tunnissa (Whyte 2001, Agalloco 2006, Agalloco ja Akers

2008). Suljetuissa isolaattorissa ja käsinekaapeissa ei ilmavirtauksen tarvitse olla

laminaarinen (Euroopan komissio 2008, Agalloco 2006). Suurin osa isolaattoreista on

sijoitettu D-luokan puhdastilaan (Lysfjord ja Porter: Haettu internetistä 9.12.2013).

Ilmastoinnilla voidaan vaikuttaa tuotteen suojaamisen lisäksi myös

työskentelyhenkilöstön turvallisuuteen (Whyte 2001). Alipaineistamalla järjestelmä

estetään toksisten tai potenttien lääkeaineiden poistuminen isolaattorien ulkopuolelle

(Whyte 2001, Chiarello 2004). Lääkkeenvalmistuksen kannalta tuotteen turvaaminen

ympäristön hiukkasilta on kuitenkin oleellisinta. Partikkelien kulkeutumista

valmistustilaan voidaan estää asettamalla tilan ilmanpaine ympäristöä

korkeammaksi. Prosesseissa tavallisesti käytettävä paine on 20–70 Pa korkeampi

kuin ympäristön.

34

Isolaattorin jakaminen eri osiin mahdollistaa ilmavirran ohjailun järjestelmässä (Kuva

8) (Chiarello 2004). Laitevalmistaja SKAN suunnittelemassa järjestelmässä

isolaattorin osat on paineistettu eri tavoilla. Kuvassa 8 näkyy (+) ja (–) -symbolein

merkittyinä kyseisen osion paineistus suhteessa ympäröivän tilan paineeseen.

Ylipaine on muodostettu sterilointi-, täyttö- ja kylmäkuivausosioihin.

Viranomaisvaatimusten mukaisesti korkein paine on puhtaimman tilan vaativassa

täyttöosiossa. Kylmäkuivaimessa (FD) vallitsee täyttöosion tasoinen tai hieman

matalampi paine. Paine-erot ohjaavat ilmavirtaa kulkemaan lopulta kohti

korkitusosiota, jossa tuote on jo paremmin suojassa astiassa. Loppuvaiheen

prosessit, kuten korkitus ja pakkauksen ulkopesu, tehdään alipaineessa, jotta

prosessista ei pääse karkaamaan lääkeaineita ympäristöön. Samalla

valmistuslaitteistolla voidaan tehdä monia tuotteita, joten laitteiston ilmanpaineita

täytyy pystyä muokkaamaan kullekin prosessille sopivaksi (Whyte 2001, Chiarello

2004). Olosuhdevalvonta paineenvaihtelukonseptissa hoidetaan tietokonepohjaisesti.

Järjestelmä mittaa ilmavirtauksen jokaisesta osiosta ja säätää tilojen paineita tarpeen

mukaan. Kylmäkuivauksen tapaiset herkät vaiheet voidaan asettaa omiin

erikoisyksikköihin, kuten käsinekaappiin. Käsinekaappi mahdollistaa tuotteen

käsittelyn prosessin aikana siten, ettei se joudu tekemisiin isolaattorin ulkopuolisen

ympäristön kanssa.

35

Kuva 8. Isolaattoriin asennettu valmistuslinjasto paineenvaihtelukonseptilla (Chiarello

2004)

3.1.2 Tuotteiden siirtojärjestelmä

Tuotteiden siirtojärjestelmä on olennainen osa lääkkeenvalmistusprosessia. Hyvin

suunnitelluissa tuotantotiloissa tuote liikkuu vain yhteen suuntaan, jolloin

ristikontaminaatio voidaan välttää (Agalloco ja Akers 2008). Tavara- tai

tuoteliikenteen, jota tapahtuu isolaattorista ulos ja sisään, täytyy tapahtua siten,

etteivät tuote tai tavarat altistu kontaminaatiolle. Siirtelyyn voidaan käyttää erilaisia

apuvälineitä, kuten isolaattorin kylkeen telakoitavia kuljetusastioita tai erilaisia

liitäntöjä ja väliastioita, joita voidaan steriloida (Whyte 2001). Suuremman

mittakaavan tuotannossa tähän käytetään liukuhihnoja, jotka kulkevat

sterilointitunnelista läpi ennen isolaattoriin tuloa (Whyte 2001, Euroopan komissio

2008).

36

3.1.3 Komponenttien sterilointi

Valmisteen komponentit voidaan steriloida useammalla tavalla (FDA 2004).

Aseptisessa valmistamisessa suodatus on yksi käytetyimmistä tavoista, etenkin

lämmölle herkille aineille. Valmisteen komponentit liuotetaan haluttuun nesteeseen,

kuten Yhdysvaltojen Farmakopean (United States Pharmacopeia, USP 36)

mukaiseen injektioihin käytettävään veteen. Liuos suodatetaan tämän jälkeen

steriloivan membraanin tai suodattimen läpi. Nestemäiset valmisteet voidaan usein

steriloida myös säteilytyksellä.

3.1.4 Pakkauksen sterilointi ja puhdistus

Aseptisen valmisteen pakkauksen täytyy olla puhdistettu, steriili ja pyrogeeniton

ennen kuin valmiste voidaan annostella siihen (Agalloco ja Akers 2008, Reed 2009).

Osassa järjestelmistä pakkauksen nämä toimenpiteet on liitetty osaksi

valmistuslinjastoa, jolloin säästytään ylimääräisiltä kuljetuksilta ja varastoinneilta.

Suuren mittakaavan järjestelmissä lasisten pakkausten depyrogenointi ja sterilointi

suoritetaan lämmön avulla jatkuvatoimisessa sterilointitunnelissa. Pakkaus kulkee

sterilointitunnelissa, jonka keskivaiheilla ilman lämpötila nousee 350 ˚C:een ja laskee

siitä asteittain normilämpötilaan ennen kuin pakkaukset saavuttavat linjaston

täyttöaseman (Reed 2009). Lasipakkaus katsotaan steriloiduksi, kun se saavuttaa

180–200 ˚C lämpötilan. Osa pakkausten valmistajista voi toimittaa pakkaukset

valmiiksi käsiteltyinä, jolloin ne voidaan täyttää heti (Agalloco ja Akers 2008). Vastuu

pakkausten steriiliydestä on silloin niiden tuottajalla, kunhan lääkkeen valmistaja

täyttää ne soveltuvassa puhdastilassa.

Muovisten pakkausten sterilointiin voidaan käyttää kaasumaisia etyleenioksidi- ja

vetyperoksidi-käsittelyjä, tai pakkaukset voidaan altistaa ionisoivalle säteilylle

(Agalloco ja Akers 2008). Elektonisäde- ja kaasusterilointiin tarvittavat laitteistot

voidaan asentaa valmistuslinjaston yhteyteen, mutta gammasädesteriloinnit on

suoritettava alihankkijoilla toiminnon terveyshaittojen takia.

37

3.1.5 Blow-Fill-Seal -laitteisto (BFS)

Blow-Fill-Seal (BFS) on automatisoitu laitteisto, joka valmistaa tuotteen pakkauksen

juuri ennen sen täyttöä ja sulkee sen heti täytön jälkeen (kuva 9). BFS-laitteistoilla

valmistetaan yleensä 1–1000 ml:n nestemäisiä pullo- tai pipettivalmisteita (Reed

2002). BFS-laitteisto kehitettiin alun perin 1930-luvulla Euroopassa, mutta vasta

1970-luvulla se otettiin farmaseuttiseen käyttöön (Reed 2002, Löfgren ym. 2003).

Kuva 9. BFS-laitteisto (Reed 2002).

BFS-laitteiston pääosat ovat polymeerin varastointi- ja syöttöjärjestelmä,

kuumennettava ruuvipuristin, jossa on putkisuutin, putken katkaisuterä, steriili

täyttökammio, muotin puolikkaat pakkauksen muodostamiseen ja sulkemiseen sekä

tarkastuslaitteet esimerkiksi vuodon havaitsemiseen.

BFS-laitteisto on vain osa aseptisesta valmistusprosessista, ja se tarvitsee

ympärilleen perinteiset aseptisen valmistusprosessin välineet, joiden avulla täytettävä

neste valmistetaan (kuva 10). BFS-laitteistot käsittelevät normaalisti vain kahta

raakamateriaalia, täytettävää tuotetta ja polymeeriä, josta pakkaus valmistetaan

(Reed 2002). Molemmille materiaaleille on omat linjastonsa, jotka mahdollistavat

erittäin suurten eräkokojen valmistamisen kerralla. Laitteisto voi valmistaa

esimerkiksi 500 000 yksikön eriä, ja sen täyttöaika voi olla 120 tuntia.

38

Kuva 10. BFS-laitteiston yhteenliittäminen valmistusprosessiin (Haettu internetistä 16.12.2013 http://www.rommelag.com)

BFS-laitteistossa polymeerirakeet syötetään ruuvipuristimeen, jossa ne

kuumennetaan 160–170 ˚C tasaiseksi massaksi ja johdetaan suuttimen läpi ontoksi

polymeeriputkeksi (Reed ym. 2002). Putken rakennetta estetään romahtamasta

tukemalla sitä steriilillä ilmavirralla (Kuva 11 a). Kun putki on saavuttanut sopivan

pituuden, alempi muotti painautuu polymeeriputken ympärille ja sulkee sen alaosan

(Kuva 11 b). Samaan aikaan putken yläosa leikataan auki sähköllä kuumennetulla

terällä. Alamuotti siirtyy tämän jälkeen täyttöasemalle, jossa putki imetään ja/tai

puhalletaan kiinni muotin kylmennettyihin seinämiin. Näin saadaan muodostettua

putkesta pakkauksen alaosa. Tämän jälkeen täyttöneula annostelee oikean määrän

nestettä pakkaukseen (Kuva 11 c). Täytön jälkeen neula nostetaan pois, ja muotin

ylempi osa puristaa putken kiinni muodostaen pakkaukselle yläosan ja samalla

sulkien sen (Kuva 11 d). Tällä tavoin on saatu yhdistettyä pakkauksen muodostus,

täyttö ja sulkeminen yhteen laitteeseen, ja koko prosessin tekemiseen menee 10–15

sekuntia.

39

Kuva 11 Blow-Fill-Seal -laitteiston toimintaperiaate: a) kuumennetun polymeeriputken syöttömuoteille, b) muottien sulkeminen ja polymeeriputken katkaisu molemmista päistä ja alapään sulkeminen, c) polymmeriputken täyttö ja muotoilu muotin mukaan, d) pakkauksen yläosan sulkeminen, e) pakkauksen vapauttaminen muoteista (Reed ym. 2002).

Ilmavirtauksia käytetään hyödyksi myös BFS-laitteistossa, jotta laitteiston

ulkopuolella olevat partikkelit eivät kulkeudu täyttöalueelle, jossa tuote on

haavoittuvimmillaan (Reed 2002, FDA 2004). Laitteiston toimintakierrossa on yleensä

kolme kohtaa, jossa pakkaus on altis kontaminaatiolle: kun putki katkaistaan

kuumalla terällä, kun pakkausta siirretään täyttöasemalle ja juuri kun täyttöneula

otettu pois pakkauksesta. Katkaistaessa polymeeriputki kuumalla terällä syntyy

näkyvää savua ja siten partikkeleita, jotka poistetaan steriilillä ilmavirralla. Katkaisuun

on kehitetty uusi systeemi, KleenKut™, joka toimii yleisimmin BFS-laitteistossa

käytetyille matalan tiheyden polymeereille vähentäen partikkeleiden muodostumista

(Reed 2002, Reed 2009). KleenKut™-operaatiossa polymeeriputki katkaistaan

kuuman terän sijasta kylmällä, mikä estää näkyvän savun synnyn ja vähentää näin

syntyviä partikkeleita.

BFS-laitteistoja koskevat samat ohjeet kuin muutakin steriiliä valmistusta (FDA

2004). Laitteiston ympärillä olevan isolaattorin täytyy estää valmisteen

kontaminoitumista. Valmisteen kanssa tekemisissä olevien pintojen täytyy olla

steriilejä ja laitteistossa täytyy olla höyrysterilointi tai vastaava järjestelmä, joka

puhdistaa sen osia. Aseptisia tuotteita valmistavien BFS-laitteistojen tulee olla

asennettuja vähintään C-luokan tilaan ja henkilökunnalta vaaditaan A/B-luokan

pukeutumista (Euroopan komissio 2008). BFS-laitteistot, jolla valmistetaan

loppusteriloitavia tuotteita, voidaan kuitenkin asentaa D-luokan tilaan.

Täysin automatisoitu laitteisto parantaa aseptisen valmistuksen varmuutta tuottaa

steriiliä tuotetta perinteiseen valmistukseen nähden (Reed 2002. Schell 2010).

Järjestelmä vähentää tilantarvetta ja kustannuksia, kun pakkausten materiaali

40

toimitetaan vähän tilaa vievänä rouheena ja erillisten pakkausten varastointi ja

käsittely poistuu. Laitteen pitkälle viety automatisointi ja uuden tavaran

syöttömahdollisuudet mahdollistavat suurten eräkokojen teon, jolla pystytään

yksittäispakkauksille saamaan kilpailukykyisemmät yksikkökustannukset kuin

muuten.

BFS-laitteistojen avulla voidaan luoda myös tuoteperhekohtaisia muotoiluja, koska ne

mahdollistavat kustannustehokkaasti hyvin monenlaisten pakkausten valmistamisen

(Löfgren 2003). Pakkausten muokattavuus turvallisuuden ja käytettävyyden

takaamiseksi onkin yksi BFS-tekniikan suurimmista vahvuuksista.

3.1.6 Valmistuslinjaston puhdistus ja sterilointi

Nykyaikaisessa teollisuudessa pyritään kustannusten minimointiin, joka tarkoittaa

myös osaltaan laitteistojen käyttöasteen maksimointia. Yksittäisellä

valmistuslinjastolla tehdään usein useampia eri tuotteita, jolloin linjaston puhdistus ja

sterilointi tulee olla helppoa, nopeaa ja luotettavaa. Nykyaikaisissa aseptisissa

järjestelmissä puhutaan paikallaan steriloinnista (SIP) ja paikallaan puhdistuksesta

(CIP). Ne ovat järjestelmiä, jotka mahdollistavat laitteiston puhdistuksen ja

steriloinnin ilman että sitä tarvitsee purkaa (Agalloco 2007, Euroopan

standardisointikomitea 2011).

Isolaattoreissa toimivista sterilointijärjestelmistä vuonna 2008 92 % perustui

hapettavaan vetyperoksidisterilointiin (H2O2) (Lysfjord ja Porter: Haettu internetistä

9.12.2013). Suurin osa vetyperoksidisteriloinneista tehdään höyrystetyllä

vetyperoksidilla. Höyrystysjärjestelmän etuja ovat laaja teho erilaisiin mikro-

organismeihin, nestemäistä vetyperoksidia tehokkaampi sterilointi,

ympäristöystävällisyys, ei myrkyllisiä jäämiä pinnoille, voi toimia normaalissa

ilmanpaineessa ja lämpötilassa sekä mahdollista käsitellä suuria ja epätasaisia

pintoja (Heckert ym. 1997, Kačer ym. 2012). Steriloiva höyry muodostetaan tilaan

käyttäen 35–59 % vetyperoksidiliuosta (Lauderback ym. 2002, Keith 2012).

Järjestelmässä on erilaisia toimintaperiaatteita, mutta ne voidaan jakaa viiteen

vaiheeseen: tilan suhteellisen kosteuden laskeminen tarvittaessa 30–50 %,

41

alipaineen muodostaminen tehon parantamiseksi, vetyperoksidin konsentraation

nosto tavoitearvoon, tilan ylläpitäminen koko sterilointivaiheen ajan ja tilan

ilmaaminen suodatetulla ilmavirralla useita kertoja. Ilmaamisessa poistetaan tilassa

oleva vetyperoksidi. Vetyperoksidin konsentraatio vaihtelee tyypillisesti välillä 150–

700 ppm, siten ettei se pääse kuitenkaan tiivistymään tilassa. Prosessin syklien

määrä ja kesto määräytyvät steriloitavan laitteen koon, tyypin ja materiaalien

mukaan. Vetyperoksidin myrkyttömien hajoamistuotteiden (vesi ja ilma) takia muuta

kuivatus- tai ilmausaikaa ei tarvita. Järjestelmällä kyetään suorittamaan

sterilointiprosessi kokonaisuudessaan parissa tunnissa, riippuen järjestelmän koosta

ja luonteesta.

4. Yhteenveto

Silmälääkinnästä haasteellista tekee silmän herkkyys ja tärkeys normaalissa

arjessamme. Silmän pinta on helppo kohde lääkkeen saavuttaa, ja tuotteesta on

melko helppo valmistaa hyvin siedetty silmässä. Samaan aikaan silmän sisemmät

osat, johon lääkeaineen usein pitäisi kulkeutua, ovat erittäin vaikeasti

saavutettavissa. Alle viiden prosentin imeytymisaste tekee silmälääkinnän

huomattavan haasteelliseksi. Silmän kerroksellisuus tekeetilanteesta hankalan,

koska parhaimmassakin tilanteessa lääkevalmisteesta saadaan aikaan vain hyvä

kompromissi. Ne ominaisuudet, joita ensimmäisen kerroksen läpäisyyn vaaditaan,

eivät sovellukaan enää seuraavan kerroksen piirteille. Pyrittäessä kasvattamaan

lääkeaineen imeytymistä erilaisilla lääkeaine- ja formulaatiomuutoksilla usein

heikennetään lääkkeen siedettävyyttä silmässä.

Yleisimmin huonoa imeytymistä yritetään korjata pyrkimällä pidentämään

lääkeaineen lyhyttä vaikutusaikaa silmässä. Erilaisilla geeliytymis-, suspensio- ja

mukoadheesivisilla aineilla lääkeaineen imeytymistä onkin saatu parannettua vähän,

mutta edelleen erilaisissa hoidoissa annostelutiheys on useita kertoja päivässä.

Potilaan ja lääkehoidon tehon kannalta pidempikestoiset ja paremmin imeytyvät

valmisteet olisivat kuitenkin tärkeitä. Erilaisilla lääkeainelamelleilla onkin saavutettu

parempaa imeytymistä, mutta niiden asettaminen ja käyttäminen etenkin ikäihmisille

42

on hankalaa. Iontoforeesin kaltaiset erilaisesta lähestymiskulmasta tulevat ratkaisut,

jotka antavat positiivisia tuloksia kokeissa, ovat tervetulleita. Etenkin tekniikan

kehittyessä hoidolle, jolla saavutetaan harvoilla annosteluilla korkeita

lääkeainepitoisuuksia silmän sisemmissä osissa, on suurta kysyntää. Lyhyt,

kohdistettu ja tehokas annostelu voisi vähentää myös systeemisten vaikutusten

ilmenemistä.

Silmälääkkeillä on tarkat tuotantovaatimukset silmän herkkyyden takia. Tuotannon

suunnittelu lähtee liikkeelle formulaation komponenttien rajoittavista tekijöistä: onko

valmistetta mahdollista loppusteriloida vai täytyykö tuotantoprosessi suunnitella

täysin aseptiseksi? Nykyaikaisilla laitteistoilla pystytään tähtäämään korkeaan

puhtausasteeseen, mutta valmisteiden monimutkaistuvat formulaatiot ja suuret

mittakaavat asettavat laitteistot ja prosessit koville. Lääketeollisuuden pyrkimys

tasaiseen ja korkeaan laatuun kilpailukykyisellä hinnalla avaa ovia uusille

tuotantotekniikoille. Laadun kannalta oleellisimmat tekniikat ovat ilmastointi ja

automatisointi. Ilmastointi on oleellisessa asemassa aseptisessa valmistuksessa,

koska jokaisessa valmistusprosessissa tuote on jossain vaiheessa alttiina

ulkoympäristölle. Isolaattoreihin yhdistettynä HEPA-suodatettu ilmastointi tekee

valmistustilan olosuhteista kuitenkin niin hyvät, että lyhytaikaiset altistukset

ympäristölle eivät aiheuta laadulle vaaraa. Automatisoinnilla saadaan taas vaikeasti

puhdistettava ihminen pois tuotantotiloista, ja saadaan usein myös kasvatettua

tuotantonopeutta. Automatisointi ei korvaa ihmistä vielä kaikessa toiminnassa, koska

tekniikka ei mahdollista vielä niin hienostunutta käsittelyä, johon ihminen kykenee.

BFS- ja SIP-järjestelmien tyyliset automatisoinnit ovat kuitenkin lähes välttämättömiä

nykyaikaisissa tuotantolaitoksissa tehokkuuden lisäämiseksi huonontamatta laatua.

Lääkevalmisteiden suunnittelu on nykypäivänä kokonaisvaltaista, ja jokaisen

formulaation aineosa täytyy miettiä aineen toiminnasta tuotannon kautta aina

asiakkaan annosteluun saakka.

43

KOKEELLINEN OSA: RAMAN-SPEKTROSKO-

PIAN HYÖDYNTÄMINEN JAUHESEOKSEN

LÄÄKEAINEPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMISESSÄ

44

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, terveystieteiden tiedekunta Farmasian laitos Proviisorin koulutusohjelma Farmasian teknologia KANGAS VILLE T: Raman-spektroskopian hyödyntäminen jauheseoksen lääkeainepitoisuuden määrittämisessä Pro gradu -tutkielma, 108 s., 3 liitettä (5 s.) ohjaajat: Tutkija, diplomi-insinööri Tuomas Ervasti ja Lehtori, FaT, dosentti Ossi Korhonen Maaliskuu 2014

Avainsanat: Raman-spektroskopia, lääkeainepitoisuus, Raman-spektrikirjasto

Tiivistelmä

Tabletit ovat edelleen käytetyin lääkemuoto sairauksien hoidossa. Niiden valmistuksessa pyritään entistä enemmän jatkuvatoimisiin prosesseihin, joiden yksi suurimmista haasteista on luotettava ja tasalaatuinen lääkkeen valmistus. Sitä varten valmistuslaitteisto vaatii rinnalleen reaaliaikaisen laadunvalvontajärjestelmän, joka kykenee riittävän nopeasti ja tarkasti analysoimaan tuotetta, ja jonka tuottaman datan avulla voidaan tehdä muutoksia valmistusasetuksiin. Raman-spektroskopia on yksi lupaavista järjestelmistä reaaliaikaiseen laadunvalvontaan, koska se kykenee mittaamaan näytteet nopeasti valmistuksen aikana, sen on osoitettu kykenevän erittäin tarkkoihin pitoisuusmittauksiin ja se soveltuu käytettäväksi niin nesteiden, kiinteiden kuin kaasumaistenkin näytteiden kanssa.

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää PhAT-anturilla varustetun Raman-spektrometrin soveltuvuutta jauhemaisten näytteiden lääkeainepitoisuuksien määrittämiseen sekä paikallaan että liikkeessä olevilla näytteillä. Tutkimukseen valittiin yleisesti lääkevalmistuksessa tunnettuja lääke- ja apuaineita, joista tehtiin seoksia eri pitoisuuksilla. Seokset mitattiin Raman-spektrometrillä paikallaan yhden ja kuuden sekunnin mittausajoilla sekä liikkeessä yhden sekunnin mittausajalla. Kaikki Raman-spektrometrillä mitatut lääkeaineseossarjat esikäsiteltiin SIMCA–P 12 ohjelmalla ja niistä muodostettiin ennustusmalleja, joiden kykyä ennustaa näytteiden pitoisuuksia tutkittiin käyttämällä tunnettuja koenäytteitä. Asetyylisalisyylihapon ja dikalsiumfosfaatin seoksille määritettiin lääkeainepitoisuudet myös kemiallisesti, jotta Raman-spektrometrin antamien tulosten paikkansapitävyyttä voitiin arvioida.

Soveltuvimmat esikäsittelyt antoivat sarjoista muodostetuille malleille ennustustehoiksi arvoja välillä 0,8–4 (RMSEP). Liikkeessä tehdyissä mittauksissa osassa sarjoista Raman-spektrometri pystyi erottelemaan viiden prosentin pitoisuuserot toisistaan, jota voidaan pitää vähimmäisvaatimuksena lääkkeenvalmistuksen analyysilaitteistolle.

Tutkimus osoitti järjestelmän sisältävän potentiaalia reaaliaikaiseen jauheseoksen pitoisuusmittaukseen. Etenkin liikkeessä olevien seosmittausten toistettavuutta ja tarkkuutta pitää kuitenkin tutkia vielä lisää erilaisilla näytteen liikkumisnopeuksilla.

Tutkimuksen aikana luotiin myös Raman-kirjasto, joka auttaa tuntemattomien Raman-spektrien tunnistamista. Saadut spektrit osoittautuivat suurimmalta osin vertailukelpoisiksi kirjallisuudesta saatuihin referensseihin.

45

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Science School of Pharmacy Master of Science in Pharmacy program Pharmaceutical Technology KANGAS VILLE T: Utilization of Raman spectroscopy to determining the drug concentration of the powder mixture Master’s Thesis, 108 pp, 3 appendixies (5 pp.) Supervisors: Researcher, Master of Science Tuomas Ervasti and Lecturer, PhD, Adjunct Professor Ossi Korhonen March 2014

Keywords: Raman spectroscopy, drug concentration, Raman spectroscopy library

Summary Tablets are still the most commonly used form of medicines in treatment of diseases. The aim of medical manufacturers is to move from large batch processes to smaller continuous processes. In such processes one of the biggest challenges is to establish a reliable process for manufacturing uniform products. Manufacturing equipment requires a parallel real-time quality control system, which can quickly and accurately analyze the product and, with its analyzed data can be used to make necessary adjusts to the manufacturing equipment. Raman spectrometry is one of the most promising systems for that type of quality control, since it is capable of measuring samples rapidly during manufacturing process, it has shown to be very precise measuring concentrations and it is suitable to be used for liquid, solid or gaseous samples.

The aim of this study was to find out suitability of Raman spectrometer with PhAT probe for measuring drug concentrations for both stationary and mobile powdered drug mixture samples. All drugs and pharmaceutical excipients chosen to the study are commonly known in pharmaceutical manufacturing, and mixtures of various concentrations were used. Stationary mixtures were measured with Raman spectrometer with one and six second measurement times and mobile mixtures were measured with one second measurement time. All series were preprocessed with SIMCA-P 12 software and probability models were constructed for each series. Prediction efficiencies of the constructed models were measured on known exhibits. For acetylsalicylic acid and dicalciumphosphate drug mixtures were also tested in chemical assays to enable evaluation of results given by the Raman spectrometer.

The Raman spectrometer gave RMSEP values from 0.8 to 4 for the most suitable preprocessed models. For some of the series measured from mobile samples Raman spectrometry was able to distinguish five percent differences in drug concentration. This difference can be considered as minimum accuracy for analytical devices in pharmaceutical manufacturing.

Raman spectroscopy demonstrated good potential for real time concentration monitoring in the study. Further studies are needed to ensure the accuracy and repeatability of measurements with different sample speeds.

46

During the study a Raman spectroscopic library was created to aid the identification of unknown Raman spectrum. Most of the obtained spectra turned out to be comparable with the spectra from literature.

47

5 JOHDANTO

Tabletit ovat tämän hetken käytetyin lääkemuoto. Tabletti on stabiili lääkemuoto, joka

on teollisuudelle yksinkertainen ja edullinen valmistaa sekä asiakkaan helppo

käyttää. Perinteinen tablettivalmistus pohjautuu suuriin tuotantoeriin, joiden

laadunvarmistus tapahtuu valmistuksen jälkeen tuotteelle määritetyillä testeillä. Vasta

hyväksyttyjen testien jälkeen tuote on valmis vapautettavaksi jakeluun.

Lääketeollisuudessa tavoitteena olisi kuitenkin siirtyä eräpohjaisesta valmistuksesta

kohti jatkuvatoimista lääkkeenvalmistusta, jossa pyritään saavuttamaan pienemmät

valmistuslaitteistot, vähentämään tuotantokatkojen ja epäkelvon lopputuotteen

määrää sekä saamaan kattavampi reaaliaikainen laadunvarmistus.

Jatkuvatoimisen lääkkeenvalmistuksen tärkeimpiä kulmakiviä on saada laitteisto

tuottamaan tasalaatuista lopputuotetta. Tähän tarvitaan reaaliaikaista

analytiikkalaitteistoa, joka pystytään liittämään osaksi valmistuslaitteiston toimintaa

(De Beer ym. 2011). Yhden tai useamman analytiikkalaitteiston avulla pyritään

tarkkailemaan valmisteen kriittisiä ominaisuuksia reaaliajassa koko tuotantoketjun

ajan. Kriittisten ominaisuuksien määrityksellä pyritään seuraamaan eri prosesseja ja

niissä tapahtuvia muutoksia. Pyrkimyksenä on rakentaa valmistusjärjestelmä, jossa

analytiikkalaitteistojen datan perusteella voidaan valmistuslaitteistojen toimintaa

muuttaa siten, että lopputuote pysyy jatkuvasti sille määritettyjen parametrien sisällä.

Raman-spektroskopia on yksi lupaavista mittaustekniikoista, joita tutkitaan

reaaliaikaiseen analytiikkaan.

Raman-spektroskopia perustuu molekyyleihin kohdistettujen fotonien energian

epäelastiseen siroamiseen (Raman ja Krishnan 1928). Raman-spektroskopiaa

pyritään soveltamaan nykypäivänä pelkästään farmasian alalla moniin eri

valmistusprosesseihin, kuten sekoitus, rakeistus, kuivaus, päällystys, kylmäkuivaus

ja ekstruusio (Vergote ym. 2004, Wiksström ym. 2005, Aaltonen ym. 2007, De Beer

ym. 2007, Kogerman ym. 2008, Saerens ym. 2010, Wirges ym. 2013). Raman-

spektroskopia on kohteeseen kajoamaton mittausmenetelmä, jolla pystytään

mittaamaan niin kiinteitä, nestemäisiä kuin kaasumaisiakin näytteitä. Laitteistolla

voidaan mitata myös lasin läpi, jolloin näyte voidaan sijoittaa esimerkiksi

lasiampulliin, ja muun muassa hygroskooppisten näytteiden mittaaminen on

48

mahdollista. Raman-spektroskopiaa voidaan soveltaa erilaisten prosessien tarkkailun

lisäksi esimerkiksi eri yhdisteiden tunnistamiseen valmiiden spektrikirjastojen avulla

(Bugay ja Brush 2010).

Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään Raman-spektroskopian soveltuvuutta

jauheseoksien lääkeainepitoisuuksien tarkkailuun niin paikallaan kuin liikkeessä

olevista näytteistä. Liikkuvilla näytteillä pyrittiin tutkimuksessa mallintamaan

jatkuvatoimisen prosessin reaaliaikaista mittausta. Saatuihin spektrisarjoihin

käytettiin erilaisia esikäsittelytekniikoita parantamaan datan perusteella tehtäviä

ennustuksia. Saatujen tulosten avulla arvioitiin Raman-spektroskopian soveltuvuutta

jauheiden pitoisuuden tarkkailuun. Tutkimukseen valitut aineet ovat yleisesti

lääkkeenvalmistuksessa käytettyjä materiaaleja. Pitoisuustutkimuksen yhteydessä

luotiin myös Raman-spektrikirjasto tukemaan Itä-Suomen yliopistolle valmistuneen

jatkuvatoimisen linjaston mittaustekniikoiden tutkimusta (liitetaulukko 1).

Spektrikirjaston oikeellisuutta pyrittiin varmistamaan vertaamalla tuloksia muihin

tehtyihin tutkimuksiin.

6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT

6.1 Raman-spektroskopia

Raman-sironnaksi kutsuttua ilmiötä tutkitaan altistamalla näyte monokromaattiselle

säteilylle ja mittaamalla säteilyssä tapahtuvaa aaltolukumuutosta (Ferraro ym. 2002,

Gurtu ja Khera 2009). Säteilyn energia absorboituu näytteen molekyyleihin ja saa ne

värähtelemään. Värähtelytilan purkautuessa molekyylistä lähtevä säteily sisältää

Rayleight-säteilyksi kutsuttavan alkuperäisen taajuuden lisäksi myös matalampia

taajuuksia, joita kutsutaan Stokesin säteilyksi, ja korkeampia taajuuksia, joita

kutsutaan anti-Stokesin säteilyksi.

Raman-säteilyssä molekyylit virittyvät niin kutsutulle virtuaalitasolle, joka on

huomattavasti varsinaista elektronin virittymistilaa alhaisempi (Kuva 12) (Ferraro ym.

2002). Raman-sironta on hyvin heikkoa Rayleight-sirontaan verrattuna, sillä

49

normaalisti alle yksi sadastatuhannesta näytteeseen tulevasta fotonista aiheuttaa

Raman-sirontaa.

Kuva 12: Eri säteilyjen aiheuttamia muutoksia kaksiatomisessa molekyylissä (IR= infrapuna, R=Rayleigh, S=Stokes, A=anti-Stokes) (Ferraro ym. 2002)

Kaikki molekyylissä tapahtuva värähtely ei aiheuta Raman-sirontaa. Molekyylin

värähtely on Raman-aktiivista, jos polarisoituvan molekyylin koko, muoto tai asento

muuttuu värähtelyn aikana (kuvat 13 ja 14) (Ferraro ym 2002, Gurtu ja Khera 2009).

Raman-aktiivisessa säteilyssä värähtely tapahtuu symmetrisesti molekyylin

symmetriakeskuksen nähden, kuten kuvassa 2 värähtely V1. Värähtelyt V2 ja V3 ovat

infrapuna(IR)-aktiivisia, mutta eivät Raman-aktiivisia, koska V3-värähtely ei ole

symmetristä ja V2-värähtelyssä polaroituneiden molekyylien koko, muoto sekä asento

säilyvät muuttumattomina.

50

Raman-spektristä kullekin aineelle ominaisen tekevät niiden erilaiset

molekyylirakenteet (Ferraro ym. 2002, De Beer ym. 2011). Molekyylin värähtely

koostuu monista yksinkertaisista värähtelytiloista, joista kukin värähtelee sille

ominaisella taajuudella. Raman-spektri koostuu näiden värähtelytiloista purkautuvien

säteilyjen ja alkuperäisen säteilyn erotuksista. Kuvaan 15 on koottuna joitakin

taajuuksia, joilla ilmenee tiettyjä molekyylirakenteita. Raman-säteilyn voimakkuus, eli

intensiteetti, riippuu perustilassa olevien molekyylien määrän lisäksi värähtelevästä

sidoksesta ja värähtelytyypistä. Kovalenttiset sidokset tuottavat enemmän Raman-

säteilyä, kun taas ionisidokset tuottavat enemmän IR-säteilyä. Kovalenttisten mono-,

di- ja tri-sidosten vaikutukset Raman-spektrin intensiteettiin ovat suhteessa noin

sidoksen kerrannainen, eli esimerkiksi kolmoissidos aiheuttaa kolminkertaisen

intensiteetin yksinkertaiseen sidokseen nähden. Värähtelytyypeistä molekyyliä

venyttävä värähtely tuottaa yleensä suuremman intensiteetin kuin molekyyliä

taivuttava (Ferraro ym. 2002).

Kuva 13. CO2-molekyylissä vallitsevan polarisaation muutokset eri normaali-värähtelyissä määrittävät niiden Raman-aktiivisuuden (Ferraro ym. 2002).

Kuva 14. H2O-molekyylissä vallitsevan polarisaation muutokset eri normaali-värähtelyissä. (Ferraro ym. 2002).

51

Kuva 15. Esimerkkejä Raman-spektriä muodostavien ryhmien rakenteiden ilmenemisaaltolukualueista x-akselilla (Schwartz 2005).

6.2 Spektrien esikäsittely

Tässä tutkimuksessa mittauksissa saaduille Raman-spektreille suoritettiin erilaisia

esikäsittelyitä. Esikäsittelyt ovat erilaisia tilastollisia menetelmiä, joilla pyritään

poistamaan tutkimusdatassa esiintyviä poikkeamia, kuten mittausten olosuhteissa

tapahtuvia muutoksia tai virheitä (Gemperline ym. 2006). Näin datasta saadaan

poistettua tutkittavan muutoksen kannalta merkityksetöntä tietoa, ja todelliset

muutokset mittauksissa näkyvät selvemmin, jolloin johtopäätösten ja oikeiden

tulkintojen tekeminen on helpompaa (Naes ym. 2002, Rinnan ym. 2009).

Spektroskopiassa käytetyimmät esikäsittelytekniikat voidaan jakaa kolmeen

ryhmään: spektrin derivointi, spektriä tasoittavat esikäsittelyt ja sirontaa korjaavat

esikäsittelyt (Ferraro ym. 2002, Gemperline ym. 2006, Rinnan ym. 2009).

52

6.2.1 Spektrin derivointi

Derivointi on yksinkertainen ja usein käytetty esikäsittely spektroskopiassa. Sillä

pystytään vähentämään datan pohjatason vaihtelun lisäksi myös yhteis- ja

kerrannaisvaikutuksia (Naes ym 2002. Gemberline ym. 2006, Rinnan ym. 2009).

Derivoinnin vaikutukset havaitaan, kun tarkastellaan kahta Gaussin käyrää, joista

toiseen on lisätty kohonnut pohjataso ja toiseen sen lisäksi myös kerrannaisvaikutus

(kuva 16). Ensimmäisen asteen derivaatta on alkuperäisen spektrin jokaisen pisteen

kulmakerroin ja sillä saadaan poistettua spektriltä pohjataso. Alkuperäinen spektri

sijoittuu siten, että sen minimit ja maksimit ovat derivoidussa spektrissä x-akselin

leikkauskohdissa ja alkuperäisen spektrin suurimmat kulmakertoimet ovat

ensimmäisen asteen derivaatan maksimit ja minimit. Toinen derivaatta, joka mittaa

alkuperäisen spektrin jokaisen pisteen kaarevuutta, pystyy poistamaan

alkuperäisestä spektristä pohjatason lisäksi myös taustan kaltevuutta tai

kaareutuvuutta, joka usein johtuu fluoresenssista tai muista poikkeamista. Toisen

asteen derivoinnilla saadun spektrin rakenne on myös helpommin luettava, kuin

ensimmäisen derivoinnilla saatava. Toisen asteen derivaatalla saatavassa spektrissä

alkuperäisen spektrin positiivisella puolella ilmenevät piikit terävöityvät ja säilyttävät

maksimi kohtansa x-akselilla suhteen, vaihtaen suuntansa y-akselin suhteen

negatiiviselle puolelle (Ferraro ym. 2002, Naes ym. 2002). Piikkien terävöityminen

helpottaa eri piikkien erottamista toisistaan.

53

Kuva 16. Derivoinnin vaikutukset Gaussin käyrään, jolla on kohonnut pohjataso (vihreä) ja Gaussin käyrään, jolla on kohonnut pohjataso sekä kerrannaisvaikutus (punainen) (Rinnan ym. 2009).

Ensimmäisen asteen derivaatta saadaan kahden peräkkäisen mittauspisteen

funktioiden avulla, joista muodostetaan erotusosamäärä (kaava 1). Kaavassa 1 on

ensimmäinen mittauspiste kohdassa i ja h on mittauspisteiden välinen erotus.

Kaavassa 2 on ensimmäisen asteen derivaatta pisteessä i. Toisen asteen

derivaatta saadaan kahden peräkkäisen pisteen perusteella ensimmäisen

asteen derivaatan spektristä (kaava 3) (Rinnan ym. 2009, Etälukio 2013).

(1)

(2)

(3)

Derivoinnin heikkous on, että se hävittää datan signaalia ja huonontaa siten signaali-

kohina -suhdetta. Mitä suuremman asteen derivaatta, sitä enemmän se laskee

signaali-kohina -suhdetta (Rinnan ym. 2009 ja Gemberline ym. 2006)

54

6.2.2 Spektrin normalisointi

Normalisoinnin tarkoituksena on saada vertailtavien spektrien intensiteetit samaan

mittakaavaan ja helpottaa siten erityisesti tuntemattomien näytteiden vertailua

referenssispektreihin (Kramer 1998, Ferraro ym 2002). Normalisoinnit voidaan jakaa

karkeasti kahteen kategoriaan, globaaleihin ja paikallisiin (Listgarten ja Emili 2005).

Globaaleissa tavoissa spektrien yhteisen tekijän normalisointiin käytetään koko

spektriä, kun taas paikallisissa tavoissa siihen käytetään vain osaa spektristä.

Verrattaessa yhdisteitä, joissa on yhteinen komponentti mukana, on normalisointi

helppo suorittaa paikallisella periaatteella yhteisen piikin keskikohdan mukaan.

Tällöin normalisointi suoritetaan jakamalla kunkin spektrin yhteinen taajuus kaikkien

spektrien keskimääräisellä intensiteetillä, jolloin piikin intensiteetin vaihteluksi tulee

1,0, ja loppuosat spektreistä asettuvat sen mukaan helpommin vertailtaviksi.

Jos vertailtavilla spektreillä ei ole yhteistä rakennetta, voidaan normalisointi tehdä

spektrin alle jäävälle pinta-alalle (Ferraro ym. 2002, Meko 2013). Menetelmällä

saadaan spektrien pinta-alaksi yksi (kaava 4). Kaavassa 4 on spektrin

intensiteetti yksittäisellä taajuudella. Menetelmä mahdollistaa eri spektrien suhteiden

vertailun ja auttaa tunnistamaan tuntemattomia spektrejä. Pinta-alapohjainen

normalisointi toimii heikosti erilaisten taustojen omaavien spektrien vertailussa:

voimakkaan ja pienen taustan vertaaminen tällä normalisoinnilla voi vääristää muun

spektrin mittasuhteita siten, että spektrien tunnistaminen vaikeutuu.

√∑ (4)

6.2.3 Spektrin tasoitus

Raman-laitteisto voi kärsiä joillakin näytteillä esimerkiksi vähäisestä sironnan

määrästä, joka aiheuttaa signaali-kohina -suhteen (SNR) huonontumista spektrissä

(Ferraro ym. 2002, Gemberline ym 2006). SNR:n huononemista voidaan vähentää

erilaisilla spektrin tasoitusmenetelmillä, jotka tasoittavat spektrin taustalla olevaa

kohinaa. Spektrin tasoittamisessa on otettava huomioon, ettei tasoituksesta tehdä

liian voimakasta, sillä se voi hävittää myös tärkeää tietoa spektristä. Tasoituksella

55

voidaan kuitenkin hävittää kohinaa niin paljon, että datan tulkinta voi onnistua ilman

suurempia esikäsittelyitä. Yleensä tasoitusta käytetään kuitenkin derivoinnin

yhteydessä, jossa SNR huononee huomattavasti.

Savitzky-Golay (SG) -käsittelyssä valitaan käsittelyyn käytettävien havaintopisteiden

määrä ja polynomin aste (Ferraro ym. 2002 ja Rinnan ym. 2009). Polynomin avulla

spektrin jokaiselle havaintopisteelle muodostetaan keskiarvo (kuva 17). Esimerkiksi

laskettaessa seitsemän pisteen mallilla, jossa on kolmijakoinen painotus, niin itse

mitattavan pisteen lisäksi otetaan huomioon kolme edeltävää pistettä ja kolme

seuraavaa havaintopistettä (Ferraro ym. 2002). Kolmijakoisessa painotuksessa

pisteet painotetaan siten, että keskipiste on painoarvoltaan 1,0, sen viereiset pisteet

0,75, niistä seuraavat pisteet 0,50 ja kauimmaiset pisteet 0,25. Tulos jaetaan sitten

summalla 4,0, josta saadaan painotetun mittauspisteen arvo. Savitzky-Golay -

menetelmässä nämä yksinkertaiset painotukset on korvattu epälineaarisilla painoilla,

jotka tietokone hakee valittujen asetusten perusteella muistista ja laskee tasoituksen.

Polynomin järjestysasteella voidaan vaikuttaa siihen, kuinka monimutkaisia käyriä

tasoituksella voidaan sovittaa (Ferraro ym. 2002 ja Microsoft excel-help 6.11.2013).

Esimerkiksi toisen asteen polynomilla laskettuna käyrä voi sisältää yhden huipun tai

pohjan, kun taas kolmannen asteen polynomilla se voi sisältää kaksi huippua tai

pohjaa.

56

Kuva 17. Käsittelemättömän spektrin tasoittaminen Savitzky-Golay -käsittelyllä. Kuvassa siniset käsittelemättömän datan havaintopisteet tasoitetaan seitsemän pisteen, toisen asteen polynomifunktion avulla punaiseksi viivaksi, josta kuvassa on vielä laskettu ensimmäisen asteen derivaatta (Rinnan ym. 2009).

6.2.4 Sirontaa korjaavat esikäsittelyt

6.2.4.1 Standard Normal Variate (SNV)

SNV on käytetyimpiä esikäsittelyitä Raman-spektroskopian yhteydessä (Rinnan ym.

2009 ja Ferraro ym. 2002). Sen avulla voidaan korjata spektrin taustojen eroja (kuva

18). Toisin kuin derivoinnissa, SNV-korjauksessa säilytetään spektrin alkuperäinen

ulkoasu, jolloin signaali-kohina -suhde pysyy parempana. Käsittely ei siis poista

spektreistä taustaa, vaan pyrkii parantamaan spektrien keskinäistä korreloivuutta.

SNV-käsittelyssä jokaisesta spektristä vähennetään näytteiden keskiarvo, jolla

yksittäisten spektrien vaihtelua saadaan vähennettyä (Ferraro ym. 2002, Naes ym.

2002, Gemberline ym. 2006). Esikäsittelyn jälkeen spektri on keskittynyt y-akselilla

nollaan ja sen intensiteetin vaihtelu on muuttunut alkuperäisestä. SNV käsittelee

spektriä kaavan 5 mukaisesti, missä Xkorjattu on SNV-korjauksen jälkeinen

intensiteetti, Xorg on alkuperäinen intensiteetti samassa kohdassa spektriä, a0 on

keskiarvo korjattavista spektreistä ja n on spektrien lukumäärä.

57

Kuva 18. SNV-käsittelyn vaikutukset spektrien pohjatasoon. (a) 20 mikrokiteisen selluloosajauhenäytteen NIR-spektriä. (b) samat näytteet SNV-esikäsiteltyinä (Gemberline ym. 2006).

√∑

(5)

6.2.4.2 Multiplicative Scatter Correction (MSC)

MSC-käsittely on periaatteeltaan läheinen SNV-käsittelylle (Gemberline ym. 2006,

Rinnan ym. 2009). Molemmilla käsittelyillä pyritään poistamaan pohjatason vaihtelua

ja partikkelikoon vaihtelun aiheuttamia siroamiseroja. MSC- ja SNV-käsittelyt eroavat

siinä, että MSC:ssä spektristä ei vähennetä keskiarvoa, vaan jokaiselle spektrille

tehdään lineaarinen regressio erillisen referenssispektrin avulla. Referenssispektrinä

käytetään yleensä, kuten tässäkin tutkimuksessa, mittausjoukon keskimääräistä

spektriä (kaava 6) tai vaihtoehtoisesti erillistä kalibrointispektriä (Naes ym. 2002,

Rinnan ym. 2009, SIMCA-P 12.0.1 User Guide). Spektrit saadaan näin

käyttäytymään lineaarisemmin keskimääräisen spektrin suhteen.

∑

(6)

(7)

58

(8)

Kaavoissa 6, 7 ja 8 Xik on yksi mitatuista spektreistä ja mk on joukon keskimääräinen

spektri, jota käytetään referenssispektrinä. Edelleen Xik korjattu on korjattu spektri ja ai

ja bi ovat skalaariparametreja, jotka kuvaavat kyseisen näytteen kerrannais- (b) ja

summautumisvaikutuksia (a) ja ne ovat kullekin näytteelle erilaiset. Parametrit

saadaan kuvan 19 tyyppisestä regressiokuvaajasta. eik kuvaa muita spektrissä

esiintyviä muutoksia, jotka eivät selity a:n tai b:n perusteella. MSC-käsittely ei ole

yhtä herkkä häiriöpitoiselle spektrille kuin SNV, koska MSC-käsittely sisältää

pienimmän neliösummasovituksen (Naes ym. 2002, Rinnan ym. 2009).

Kuva 19. Skalaariparametrit saadaan piirrettäessä näytespektri referenssin suhteen, jolloin ne saadaan pienimmän neliösumman regression avulla piirretyn suoran leikkauspisteestä ja kulmakertoimesta (Rinnan ym. 2009).

59

6.2.4.3 Row center (Row)

Row center -käsittelyä ei voida pitää sirontaa korjaavana käsittelynä, vaikka se

keskittääkin näytteiden vaihtelua. Row center -käsittelyssä jokaisesta pitoisuudesta

vähennetään kaikkien pitoisuuksien keskiarvo (SIMCA-P 12.0.1 User Guide).

6.3 Raman-spektrometri ja PhAT anturi

Raman-spektrometrin tärkeimmät osat ovat säteilylähde, jollaisena toimii yleensä

jatkuva-aaltoinen (CW) laser, säteilyn näytteeseen kuljettava ja sieltä keräävä

järjestelmä, aallonpituuden valitsin sekä tunnistin ja ohjausyksikkö, eli tietokone ja

käyttöohjelmisto (Ferraro ym. 2002). Kuva 20 antaa yhdenlaisen läpileikkauksen

laitteistoon.

Tutkimuksessa käytettiin Raman-spektrometriä (Kaiser Optical systems, RXN1-785,

Michigan, Yhdysvallat) ja valokuitukaapelilla varustettua PhAT-anturia. Laitteiston

säteilylähteenä toimiva laser asetettiin 200 mW teholle ja tuottamaan 785 nm

aallonpituudella olevaa säteilyä (kuva 21 ja 22). PhAT-anturi eroaa perinteisestä

anturista suuremman mittausalan takia (Kaiser Optical systems, haettu internetistä

21.2.2013). Normaalin Raman-spektrometrin lasersäteen koko on 2–500 µm, kun

taas mittauksissa käytetyssä PhAT-anturissa mittausalue on vakiona 6 mm (kuva

21). PhAT-anturin oikea mittausetäisyys 6 mm:n lasersäteelle on 25 cm, joka on

sama kuin anturin suojaputken pituus. Suurempi mittausalue antaa näytteestä

keskimääräisemmän kuvan, joka tasoittaa eri mittausten välisiä eroja varsinkin

liikkuvassa näytteessä. Säteen koko lisää tulosten toistettavuutta, mutta ei anna yhtä

tarkkaa kuvaa vaihtelusta (Kim ym. 2006). Lisäksi PhAT-anturin suurempi

mittausalue vähentää laserin aiheuttamaa paikallista lämmöntuottoa näytteeseen ja

täten näytteessä tapahtuvia mahdollisia muutoksia. Tämä on tärkeää erityisesti

mitattaessa aineita, jotka ovat lämmölle herkkiä.

60

Kuva 20. Raman-spektrometrin tärkeimmät osat (Ferraro ym. 2002).

61

6.4 Seokset ja niiden valmistus

Tutkimukseen valittiin kolme lääkeainetta: asetyylisalisyylihappo (ASA) (Sigma-

aldrich, Steinheim, Saksa), parasetamoli (PARA) (Sigma-aldrich, Steinheim, Saksa)

ja ibuprofeeni (IBU) (BASF, Ludwigshafen, Saksa) sekä kolme apuainetta

dikalsiumfosfaatti (DCP) (Emcopress Premium, Rosenberg, Germany),

laktoosimonohydraatti 90 M (LAKTO) (DFE pharma, Veghel, Alankomaat) ja D-

mannitoli (MAN) (Merck eurolab, Briare, Ranska). Aineista tehtiin taulukon 3

mukaiset m/m-% -seossarjat punnitsemalla aineet vaa’alla (Mettler-Toledo PB3002-

S/PH Langacher Greifensee, Sveitsi) ja sekoittamalla ne geometrisessä sarjassa.

Kuva 21. PhAT-anturin lasersäteen halkaisijaksi on asetettu 6 mm ja mittausetäisyys on säädetty 25 cm:iin. Vertailuksi FT-Ramanin mikroanturin halkaisijaltaan 2–5 µm (Haettu internetistä 21.3.2013 ja muokattu www.kosi.com)

Kuva 22. Raman-spektrometri kuituoptisella PhAT-mittapäällä ja ohjausyksikkö (Haettu inter-netistä 12.2.2013 www.kosi.com)

62

Taulukko 3. Seossarjojen lääkeainepitoisuudet (m/m-%)

Mitattava seos Mitattavat lääkeainepitoisuudet (m/m-%)

IBU–MAN 0 10 15 20 30 40 50 60 70 80 85 90 100

PARA–MAN 0 10 15 20 30 40 50 60 70 80 85 90 100

IBU–LAKTO 0 5 10 15 20 30 50 45 50 55 60 70 80 85 90 95 100

PARA–LAKTO 0 5 10 15 20 30 50 45 50 55 60 70 80 85 90 95 100

ASA–DCP 0 5 10 12,5 15 17,5 20 30 40 100

6.5 Näytteiden mittaus ja esikäsittely

6.5.1 Mittaukset paikallaan olevista näytteistä

Lasinen petrimalja laitettiin täyteen näytettä ja asetettiin metalliseen kaappiin

säädettävälle tasolle. Tason avulla näyte asetettiin Raman-spektrometrin

suojaputken läheisyyteen, jolloin mittausetäisyys oli noin 25 cm. Laitteiston

asetuksina käytettiin kaksoismittausta yhden ja kuuden sekunnin mittausajoilla.

Mittausajat valittiin siten, että yhden sekunnin mittauksella liikkeessä olevista

näytteistä saadaan pistemäisempi spektri, joka kuvaa paremmin paikallista näytteen

pitoisuusvaihtelua. Kuuden sekunnin mittaus valittiin, jotta voitiin tarkastella

lyhyemmän mittausajan luotettavuutta.

6.5.2 Mittaukset liikkeessä olevista näytteistä

Liikkeessä tehdyt mittaukset suoritettiin pyörivän alustan päällä, jonka halkaisija oli

30 cm. Alusta oli jaettu kuuteen yhtä suureen osioon (kuva 23). Jauheseokset

asetettiin mittausalustalle koesuunnitelman mukaisesti. Pyörivä alustalevy ja PhAT-

anturi suljettiin pahvilaatikkoon, jotta ulkopuolinen valo ei pääsisi vaikuttamaan

mittauksiin. Alusta pyöri mittauspään alla noin 26 cm:n etäisyydellä yhden kierroksen

minuutissa, jolloin näyte liikkui nopeudella 0,016 m/s. Mittausasetuksina käytettiin

yksittäistä yhden sekunnin mittausta ja mittausten väli oli kymmenen sekuntia.

Yhdessä mittausryhmässä oli 16 mittausta. Mittaustuloksia tutkittiin kolmella tavalla:

63

omana ryhmänään, yhdistämällä pisteet sekä paikallaan otettujen näytteiden malliin

että osaan siitä.

Kuva 23. PhAT-anturi asetettuna liikkuvan alustan yläpuolelle, alustan pyörimis-nopeutena käytettiin yhtä kierrosta minuutissa.

6.5.3 Raman-spektrin esikäsittely

Raman-spektrometristä saatu data käsiteltiin Matlab (MathWorks, Yhdysvallat) -

tietojenkäsittelyohjelmalla. Mittauksissa tarkasteltiin aaltolukualuetta 250–1909.

Matlab-ohjelmalla data muutettiin Excel®-muotoon (Microsoft, Yhdysvallat), jota

SIMCA-P -mallinnusohjelma pystyy käyttämään.

Raman-spektrometrin antama data kustakin seossarjasta käsiteltiin SIMCA-P 12.0.1.

(Umetrics AB, Ruotsi) -ohjelmalla erilaisilla esikäsittelytavoilla. Esikäsitellyistä

datoista muodostettiin Partial least square (PLS) -malleja, joiden avulla on

mahdollista tunnistaa Raman-spektrometrillä mitatun näytteen lääkeaineen pitoisuus.

PLS-mallien tarkoituksena on tunnistaa X- ja Y-komponentteja yhdistäviä rakenteita

(Abdi 2003). Yhdistävillä komponenteilla pyritään selittämään mahdollisimman hyvin

halutun komponentin vaihtelua ja muodostamaan niistä malli, jonka perusteella

64

voidaan yrittää ennustaa halutun komponentin muutoksia toisen perusteella. Mitä

useampi tarkkailtava ja selittävä komponentti otetaan huomioon, sitä tarkemmaksi

malli saadaan, mutta mallin toistettavuus kärsii. Ennustusmallien monimutkaisuuden

määritysperusteeksi valittiin mallin tuottama q2-summa, joka kuvastaa mallin

ennustuskykyä uudelle datalle. Q2-summan tavoitearvoksi määriteltiin 0,93, jonka

täytyttyä mallissa oli tarpeeksi komponentteja.

Ohjelma tuottaa observed vs. predicted (OP) (kuva 24) ja ennustus (kuva 25) -

kuvaajia. OP-kuvaajat antavat Root Mean Square Error of Estimation (RMSEE) -

arvoja, jotka osoittavat, kuinka hyvin mitatut pitoisuudet (x-akseli) kuvaavat

teoreettisia pitoisuuksia (y-akseli). Pienempi arvo tarkoittaa parempaa kuvaavuutta.

Ennustuskuvaajan luonnissa mallista poistettiin joitakin mittauspisteitä ja näiden

poistettujen pisteiden avulla testattiin, kuinka hyvin jäljelle jääneen mallin avulla

pystyttiin ennustamaan poistetut mittauspisteet. Ennustus antaa tuloksen root mean

squared error of prediction (RMSEP) -arvona, jossa pienempi tulos tarkoittaa

parempaa mallin ennustustehoa eli tulokset poikkeavat nimellisarvoistaan

vähemmän. Ennen ennustuksen ja mallin tekemistä datasta poistettiin mittauspisteet,

joissa ilmeni karkeita virheitä tai jotka olivat luottamusrajojen ulkopuolella.

Kaikista seossarjoista muodostettiin taulukot, joissa eriteltiin eri esikäsittelyt ja

mittausajat. Taulukoiden avulla pystyttiin vertailemaan helpommin eri esikäsittelyiden

ja mittausaikojen vaikutusta tuloksiin.

65

Kuva 24. Asetyylisalisyylihappo-dikalsiumfosfaattiseoksen mittauspisteet ilman esikäsittelyä yhden sekunnin mittausajalla

Kuva 25. Asetyylisalisyylihappo-dikalsiumfosfaattiseoksen ennustuspisteet ilman mallin esikäsittelyä yhden sekunnin mittausajalla

6.6 Kemiallinen lääkeainepitoisuuden määrittäminen

Raman-spektroskopian tarkkuuden tarkastamiseksi päätettiin mitata yhden

seossarjan näytteiden pitoisuudet myös kemiallisesti. Mitattaviksi valittiin

asetyylisalisyylihapon ja dikalsiumfosfaatin seokset, joiden näytteillä oli pienimmät

pitoisuuserot. Menetelmäksi valittiin näytteiden liuotus ja pitoisuuksien määrittäminen

spektrofotometrillä (Shimadzu UV-1800 Kyoto, Japani) käyttäen hyödyksi

asetyylisalisyylihapon (ASA) (276 nm) ja salisyylihapon (SA) (300nm)

absorbanssiarvoja (Iwunze 2008). Mittaamalla myös salisyylihapon absorbanssi

66

haluttiin ottaa huomioon asetyylisalisyylihapon osittainen hajoaminen liuoksessa

salisyylihapoksi. Menetelmässä näytteet liuotettiin sekoituksen avulla 500 ml:aan

puhdistettua vettä, joko lämmityksessä tai ilman lämmitystä, ja liuotusaikoina

käytettiin neljää, kahdeksaa ja 24 tuntia. Liuotuksen jälkeen suodatetut ja laimennetut

liuokset mitattiin spektrofotometrin avulla. Asetyylisalisyylihapolle ja salisyylihapolle

valmistettiin pitoisuusmääritystä varten kantaliuokset puhdasaineista, joiden avulla

valmistettiin kolmet rinnakkaiset laimennossarjat (liitetaulukot 2 ja 3) standardisuorien

(kuva 26) määrittämistä varten. Kantaliuokset tehtiin punnitsemalla tarkkuusvaa’alla

(Sartorius A200S, Yhdysvallat) 0,5024 g asetyylisalisyylihappoa ja 0,5038 g

salisyylihappoa omiin 500 ml:n mittapulloihinsa ja täyttämällä mittapullot tislatulla

vedellä merkkiviivaan saakka. Kantaliuoksia sekoitettiin 24 tunnin ajan

magneettisekoittajien (Heidolph MR 3001, Saksa) päällä, ilman lämmitystä,

sekoitusnopeudella 200 kierrosta minuutissa (rpm). Valmistetut laimennokset

kantaliuoksista olivat pitoisuuksiltaan ASA: 50,2 mg/l, 101 mg/l, 201 mg/l, 301 mg/l,

402 mg/l ja 502 mg/l sekä SA 5,038 mg/l, 37,785 mg/l, 50,38 mg/l, 75,57 mg/l, 100,4

mg/l, ja yksi välilaimennos 151,14 mg/l.

ASA/DCP-näyteseoksien tutkimusliuokset valmistettiin punnitsemalla kutakin näytettä

yhden gramman verran 500 ml:n mittapulloon (liitetaulukko 4). Mittapullot täytettiin

lähelle 500 ml:n merkkiä tislatulla vedellä ja suljettiin. Tämän jälkeen mittapullot

asetettiin magneettisekoittajien (Heidolph MR 3001) päälle, jotka oli säädetty 60 ºC

lämpötilaan ja pyörimään 200 kierrosta minuutissa, jotta asetyylisalisyylihappo liukeni

nopeammin. Asetyylisalisyylihapon annettiin liueta sekoituksessa 24 tuntia.

ASA/DCP-näytteiden jauheseoksista valmistettiin myös toiset samanlaiset liuokset,

joita ei lämmitetty liuotuksen aikana, ja joiden sekoitusajat olivat lyhyemmät (neljä ja

kahdeksan tuntia). Vaihtoehtoisella liuotustavalla haluttiin vähentää ASA:n

hajoamista salisyylihapoksi liuotuksessa. Sekoituksien jälkeen kaikki mittapullot

jäähdytettiin lähelle huoneenlämpöä ja täytettiin tislatulla vedellä mittapullon

merkkiviivaan. Jokaisesta ASA/DCP-liuoksesta suodatettiin osa 20 µm (Sartorius

Minisart tai Corning Incorporated) suodattimen läpi ja laimennettiin liitetaulukon 4

mukaisesti, jotta näytteet osuisivat määritetyille kalibraatiosuoralle. Kustakin

suodatetusta ja laimennetusta ASA/DCP-liuoksesta tehtiin kolme rinnakkaista

näytettä, jotka spektrofotometri mittasi kolmeen kertaan aallonpituuksilla 276 ja 300

nm.

67

Kuva 26. Asetyylisalisyylihapon ja salisyylihapon standardisuorat

6.7 Raman-spektrikirjasto

Raman-spektrikirjastoon kerätyt aineet mitattiin käyttäen yhden ja kuuden sekunnin

mittausaikoja. Spektrit tallennettiin käsittelemättöminä aaltolukualueelta 250–1908

cm−1. Saatuja spektrejä verrattiin kirjallisuudesta löytyneisiin spektreihin, jotta

pystyttiin arvioimaan saatuja tuloksia. Spektrikirjastoon kerättiin kullekin aineelle

tunnusomaiset piikit ja kuva spektristä. Spektrit arvotettiin tunnistettavuuden mukaan

silmämääräisesti kolmeen luokkaan: huono, tyydyttävä ja hyvä. Arvotukseen vaikutti

pohjatason korkeus, piikkien korkeus pohjatasoon nähden, piikkien muoto sekä

piikkien lukumäärä.

y = 0,0056x - 0,0988 R² = 0,9995

y = 0,0244x + 0,0242 R² = 0,9997

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 100 200 300 400 500 600

Ab

so

rban

ssi

Laskennallinen pitoisuus mg/l

Asetyylisalisyylihappo

Salisyylihappo

68

7 TULOKSET

7.1 Lääkeainepitoisuuden kemialliset määritykset

Taulukossa 4 nähdään asetyylisalisyylihapon laskennalliset pitoisuudet sekä

asetyylisalisyylihappoa ja dikalsiumfosfaattia sisältävien näyteseoksien

spektrifotometrillä määritetyt pitoisuudet. Kuvissa 27 ja 28 on esitetty tulokset sekä

24 tuntia lämmitetyssä ja sekoituksessa olleille näytteille että neljä ja kahdeksan

tuntia pelkässä sekoituksessa olleille näytteille. Taulukossa 5 on esitetty

asetyylisalisyylihapon ja salisyylihapon laskennalliset ja mitatut pitoisuudet neljän ja

kahdeksan tunnin liuotuksen jälkeen. Laskennalliset pitoisuudet ylittyvät, kun

näyteseoksia on lämmitetty ja sekoitettu 24 tuntia. Pitoisuusylitykset olivat

suurimmassa osassa liuoksia 50–100 mg/l eli ne arvioitiin 2–6 % teoreettisia

pitoisuuksia vahvemmiksi. Ero korostuu, kun otetaan huomioon myös ASA:sta SA:ksi

muuttunut lääkeainemäärä. Uusituilla lyhemmillä mittauksilla näytteiden pitoisuudet

jäivät selvästi alle laskennallisten pitoisuuksien sekä neljän että kahdeksan tunnin

liuotuksilla (taulukko 5).

Taulukko 4. Asetyylisalisyylihappoa ja dikalsiumfosfaattia sisältävien seosnäytteiden teoreettiset ja kemiallisella analyysillä määritetyt pitoisuudet. Näytteitä liuotettiin 24 tuntia lämmityksessä ja sekoituksessa

ASA (m/m %)

Laskennallinen pitoisuus mg/l

Mitattu c(ASA,24h) mg/l

Mitattu ASA (m/m %)

Mitattu c(SA,24h) mg/l

5 101,67 104,43 5,14 43,354 10 204,28 280,09 13,71 128,66

12,5 250,00 345,31 17,27 157,81 15 303,54 397,13 19,62 173,47

17,5 351,05 464,65 23,16 208,44 20 404,96 454,02 22,42 175,88 30 609,00 670,94 33,05 276,75

40 808,16 818,22 40,50 321,85

69

Kuva 27. Asetyylisalisyylihapposeoksien kemiallisella analyysillä määritetyt pitoisuudet verrattuna laskennallisiin pitoisuuksiin.

Kuva 28. Salisyylihapon pitoisuus seosnäytteissä eri sekoitusolosuhteissa

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Pito

isuu

s (

mg/l)

Teoreettinen pitoisuus (mg/l)

Näytteet ilmanlämmitystä 4-5hliuotuksen jälkeen

Näytteet ilmanlämmitystä 8hliuotuksen jälkeen

Teoreettinenpitoisuus

24h Lämmitetytnäytteet

0

50

100

150

200

250

300

350

0 10 20 30 40 50

Sa

lisyylih

ap

on

pito

isu

us (

mg

/l)

Asetyylisalisyylihapon pitoisuus (%)

24 tunnialämmityksessä

4-5 tuntia ilmanlämmitystä

8 tuntia ilmanlämmitystä

70

Taulukko 5. Asetyylisalisyylihappoa ja dikalsiumfosfaattia sisältävien seosten lääkeainepitoisuudet laskennallisesti ja kemiallisen analyysin avulla määritettynä. Näytteitä sekoitettiin liuotuksen aikana ilman lämmitystä neljä ja kahdeksan tuntia.

ASA (m/m %)

Laskennallinen pitoisuus (mg/l)

c = ASA 4-5h (mg/l)

c = SA 4h (mg/l)

c = ASA 8h (mg/l)

c = SA 8h (mg/l)

5 100,75 64,30 7,95 61,77 8,68 10 200,10 132,82 11,78 138,33 16,22

12,5 250,05 171,09 14,93 179,61 20,58 15 314,28 206,79 14,05 213,88 20,31

17,5 350,81 221,10 14,69 228,69 21,41 20 400,28 243,46 13,19 251,87 20,59 30 601,02 357,95 19,84 379,99 32,11 40 800,48 454,11 23,68 483,56 38,28

Kuvassa 29 on eri sekoituskäytännöillä tehtyjen spektrofotometrimittausten

pyyhkäisyspektrit tutkitulta aallonpituusalueelta. Pyyhkäisyspektrit osoittavat, että 24

tunnin sekoituksen aikana matalia pitoisuuksia asetyylisalisyylihappoa sisältävät

näytteet hajoavat salisyylihapoksi ja peittävät asetyylisalisyylihapon aallonpituuden

alleen. Ainoastaan vahvimmalla 1000,2 mg/l pitoisuudella sekoitettujen ASA-

näytteiden spektrit vaikuttavat luotettavilta. 100,2 mg/l pitoisuuden 24 tunnin

sekoituksen kohdalla täytyy jo miettiä, kuinka paljon SA:n piikki vaikuttaa ASA:n

tulokseen.

71

Kuva 29. Liuotettavan ASA:n määrän ja hydrolysoitumisen vaikutukset spektrofotometrin spektriin eri sekoitusajoilla, kun liuotustilavuus pysyy samana. Kunkin näytteen laimennettu ASA pitoisuus oli spektrofotometrimittauksissa noin 100 mg/l.

7.2 Eri esikäsittelyiden vaikutukset malliin ja

ennustettavuuteen

7.2.1 Asetyylisalisyylihappo-dikalsiumfosfaattiseos

Taulukossa 6 on koottuna eri esikäsittelyiden vaikutukset asetyylisalisyylihapon ja

dikalsiumfosfaatin seoksien Raman-spektrometrimittauksista saataviin malleihin ja

niiden ennustavuuteen. Puhdas asetyylisalisyylihappo ei pysynyt suuren

pitoisuuseron vuoksi luotettavuusrajojen sisäpuolella, mistä johtuen se on poistettu

mittauspisteistä. Tiiviimmällä näytejoukolla saavutettiin myös parempi ennustusteho.

Asetyylisalisyylihapon ja dikalsiumfosfaatin seokset käyttäytyivät hyvin loogisesti,

mikä voidaan todeta hyvistä tuloksista ilman minkäänlaista esikäsittelyäkin. Paras

ennustettavuus numeerisesti tuli Row centering -käsittelyllä, jolla saatiin RMSEP-

arvoksi 0,77 kahdella merkitsevällä komponentilla. Ennustettavuudeltaan samalle

72

tasolle voidaan tulkita myös esikäsittelemättömän datan kahden komponentin

RMSEP-arvo 0,83 ja toisen asteen derivaatalla saatu yhden komponentin RMSEP-

arvo 0,91 niiden mallien yksinkertaisuuden vuoksi. Lyhyempi mittausaika paransi

sekä esikäsittelemättömän mallin että derivoitujen mallien ennustavuutta, kun taas

sirontaa korjaavilla käsittelyillä lyhyempi mittausaika antoi huonommat tulokset. Erot

mallien välillä eivät kuitenkaan olleet suuria.

7.2.2 Ibuprofeeni-laktoosiseos

Ibuprofeenin ja laktoosin seossarjasta poistettiin mittauspiste 55 % mittausvirheenä.

Tälle seokselle tehokkaimmiksi käsittelyiksi osoittautui toisen asteen derivointi

RMSEP-arvolla 3,71 yhdellä vaikuttavalla komponentilla, käsittelemätön data

kahdella vaikuttavalla komponentilla (RMSEP 3,79) ja Row centering yhdellä

komponentilla (RMSEP 3,78) (taulukko 7). Mittauksen kestolla ei näytä olevan tässä

seoksessa suurta merkitystä mallien ennustavuuteen.

7.2.3 Ibuprofeeni-mannitoliseos

Ibuprofeenin ja mannitolin seosksissa kolmella komponentilla parhaimmat tulokset

antoivat tasoituspohjainen Savitzky-Golay -käsittely (RMSEP 6,24) ja ilman

esikäsittelyä suoritettu ennustus (RMSEP 7,14) (taulukko 8). Sirontaa korjaava MSC-

käsittely saavutti kahdella vaikuttavalla komponentilla RMSEP-arvon 7,76.

Mittausajoilla ei ollut vaikutusta ennustustehoon. Mittauspiste 40 % poistettiin kaikista

käsittelyistä mittausvirheenä. Myös 85 %:n näyte erottui SIMCA:ssa muista näytteistä

selvästi, mutta sirontaa korjaavat käsittelyt pystyivät korjaamaan tämän eron.

7.2.4 Parasetamoli-mannitoliseos

Parasetamolin ja mannitolin seoksissa 90 % näyte poistettiin malleista

mittausvirheenä (taulukko 9). Myös 60 %:n näyte erottui muista näytteistä

73

SIMCA:ssa. Sirontaa korjaavat esikäsittelyt pystyivät kuitenkin korjaamaan tämän

eron näytteissä, toisin kuin derivointipohjaiset esikäsittelyt. SNV- ja MSC-käsittelyt

toimivat parhaiten tälle seossarjalle antaen RMSEP-tulokset SNV 3,24 ja MSC 3,14

kolmella vaikuttavalla komponentilla. Vertailukelpoisena tuloksena voidaan pitää

ensimmäisen asteen derivaatan kahden komponentin RMSEP-arvoa 4,72.

Mittausajan pituudella ei ollut vaikutusta seossarjan ennustettavuuteen.

7.2.5 Parasetamoli-laktoosiseos

Parasetamolin ja laktoosin seoksilla hajontaa korjaavat MSC ja SNV nousevat

soveltuvimmiksi esikäsittelyiksi (taulukko 10). MSC antaa RMSEP-arvon 2,14 ja

SNV-käsittely 2,28. Mittausajan vaikutus jäi pieneksi tällä seoksella. Ainoastaan

esikäsittely-yhdistelmät MSC-dydx ja SNV-dydx aiheuttavat eroa yhden ja kuuden

sekunnin mittauksien välille. Yhden sekunnin mittauksessa MSC-dydx -esikäsittelyllä

saatiin RMSEP-tulos 5,17. Vastaava tulos kuuden sekunnin mittauksessa oli 2,55.

SNV-dydx -esikäsittelyllä vastaavat RMSEP-arvot olivat 4,82 ja 2,77.

74

Taulukko 6. Esikäsittelyiden vaikutukset acetyylisalisyylihapon ja dikalsiumfosfaatin seoksiin. dydx: ensimmäisen asteen derivaatta esikäsittely, dydx2: toisen asteen derivaatta esikäsittely, SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, Row: rivien keskitys esikäsittely.

Asetyylisalisyylihappo ja dikalsiumfosfaatti 5–40%

Malli Ennuste Ennuste

(q2≥0,93)

Yhden sekunnin sarjat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustus- pisteet

q2- summa

Ilman käsittelyä 1,29 1,91 0,83 425;550;750;784;985;1044;1191;1293;1606 2 100 5:12,5;17,5;30 0,99

dydx 1,46 1,84 1,02 750;784;1044;1191;1293;1606 1 100 5:12,5;17,5;30 0,983

SNV-dydx 1,57 - 4,83 550;750;784;985;1044;1191;1293;1606 4 100 5:12,5;17,5;30 0,962

MSC-dydx 1,12 - 3,48 550;750;784;1044;1191;1293;1606 4 100 5:12,5;17,5;30 0,974

Savitzky-Golay 1,29 1,91 0,83 425;550;750;784;1044;1191;1293;1606 2 100 5:12,5;17,5;30 0,984

dydx2 1,29 1,66 0,91 750;784;1044;1191;1293;1606 1 100 5:12,5;17,5;30 0,995

MSC 3,47 4,93 3,78 425,550;750;784;1191;1293; 3 100 5:12,5;17,5;30 0,94

SNV 2,20 - 4,81 425;550;750;784;1044;1293;1606 4 100 5:12,5;17,5;30 0,973

Row 1,20 1,78 0,77 425;550;750;784;985;1044;1191;1293;1606 2 100 5:12,5;17,5;30 0,979

Kuuden sekunnin sarjat

Ilman käsittelyä 1,26 1,79 0,90 425;550;750;784,5;1044;1293;1606 2 100 5:12,5;17,5;30 0,986

dydx 1,45 1,70 1,07 425;550;750;784;1044;1191;1293;1606 1 100 5:12,5;17,5;30 0,993

dydx2 1,29 1,61 0,98 287,425,550,639,702,750,784,1044,1150,1191,1257,1043,1606 1 100 5:12,5;17,5;30 0,988

SNV-dydx 1,72 - 3,97 550;750;784;1044;1191;1293;1606 4 100 5:12,5;17,5;30 0,973

MSC-dydx (4,34) - 2,86 750;784;1044;1191;1606 (3)4 100 5:12,5;17,5;30 0,977

SNV (4,41) - 3,26 425;550;750;784;1044;1293;1606 (3)5 100 5:12,5;17,5;30 1,0

MSC (3,29) - 1,91 425;550;750;784;1044;1191;1293;1606 (3)4 100 5:12,5;17,5;30 0,945

Row 1,21 1,73 0,84 425;550;750;784;1044;1293;1606 2 100 5:12,5;17,5;30 0,981

Row-dydx 1,45 1,80 1,07 425;550;750;784;1044;1191;1293;1606 1 100 5:12,5;17,5;30 0,983

75

Taulukko 7. Esikäsittelyiden vaikutukset ibuprofeenin ja laktoosin seoksiin. dydx: ensimmäisen asteen derivaatta esikäsittely, dydx2: toisen asteen derivaatta esikäsittely, SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, Row: rivien keskitys esikäsittely.

Ibuprofeeni ja laktoosi 5–95 %

Malli Ennuste Ennuste (q2≥0,93)

Yhden sekunnin sarjat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustus- pisteet

q2- summa

Ilman käsittelyä 7,48 9,14 3,79 636,744,820,833,1115,1181,957,1608 2 55 10,20,40,70,90 0,978

dydx 7,82 9,36 3,78 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,974

dydx2 7,77 9,33 3,71 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,974

SNV 11,94 13,27 9,52 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 2 55 10,20,40,70,90 0,953

SNV-dydx 11,90 16,25 13,61 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,93

dydx-SNV 6,95 7,48 5,44 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 5 55 10,20,10,70,90 0,96

MSC 10,27 11,43 8,36 636;744;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 2 55 10,20,40,70,90 0,966

MSC-dydx 14,51 14,61 13,65 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,949

dydx-Row 7,82 9,36 3,78 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,974

Kuuden sekunnin sarjat

Ilman käsittelyä 7,50 9,16 3,78 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 2 55 10,20,40,70,90 0,977

dydx 7,80 9,37 3,65 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,974

dydx2 7,76 9,34 3,61 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,974

SNV-dydx 15,51 16,12 13,95 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 1 55 10,20,40,70,90 0,931

SNV 11,95 13,19 9,71 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 2 55 10,20,40,70,90 0,954

dydx-SNV (0,92) 6,12 11,22 636;744;783;820;833;1007;1115;1181;1207;1608 (6)5 55 10,20,40,70,90 0,94

MSC 10,32 11,39 8,66 636;744;783;820;833;1007;1115; 1181;1207;1452;1608 2 55 10,20,40,70,90 0,964

76

Taulukko 8. Esikäsittelyiden vaikutukset ibuprofeenin ja mannitolin seoksiin. dydx: ensimmäisen asteen derivaatta esikäsittely, SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely.

Ibuprofeeni ja mannitoli 10–90 % malli ennuste ennuste (q2≥0,93)

Yhden sekunnin sarjat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustus- pisteet

q2-summa

Ilman käsittelyä 7,29 11,08 7,14 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 3 40 10,20,50,70,80 0,976

dydx (8,34) 9,95 8,47 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1608 (1)2 40 10,20,50,70,80 0,965

MSC-dydx (7,52) 17,24 15,23 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1608 (2)1 40 10,20,50,70,80 0,934

Savitzky-Golay 7,29 9,38 6,24 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 3 40 10,20,50,70,80 0,976

SNV-dydx 10,93 12,52 10,98 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1608 2 40 10,20,50,70,80 0,931

SNV 10,95 12,49 11,08 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 2 40 10,20,50,70,80 0,932

MSC 7,53 8,53 7,76 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452:1608 2 40 10,20,50,70,80 0,978

Kuuden sekunnin sarjat

Ilman käsittelyä 6,72 8,10 6,35 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 3 40 10,20,50,70,80 0,978

dydx 8,04 9,57 8,28 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 3 40 10,20,50,70,80 0,971

MSC-dydx (7,47) 17,11 15,14 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 (2)1 40 10,02,50,70,80 0,935

Savitzky-Golay 6,72 8,10 6,35 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 3 40 10,20,50,70,80 0,978

SNV-dydx 10,93 12,52 10,97 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 2 40 10,20,50,70,80 0,931

MSC 7,46 8,45 7,70 636;745;783;820;833;876;1007;1115;1181;1206;1452;1608 2 40 10,20,50,70,80 0,979

77

Taulukko 9. Esikäsittelyiden vaikutukset parasetamolin ja mannitolin seoksiin. dydx: ensimmäisen asteen derivaatta esikäsittely, SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, SG: Savitzky-Golay esikäsittely

Parasetamoli ja mannitoli 10–90 %

malli ennuste ennuste (q2≥0,93)

Yhden sekunnin sarjat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustus- pisteet

q2- summa

Ilman käsittelyä (12,18) 8,84 9,04 391;651;797;858;1168;1237;1324;1610 (2)3 90 10,20,40,70,85 0,967

dydx (6,97) 3,95 4,72 391;651;797;608;1168;1237;1324;1371;1313;1610;1398 (1)2 90 10,20,40,70,85 0,975

SNV 2,69 2,42 3,24 391;651;797;608;1168;1237;1324;1371;1313;1610;1398 3 90 10,20,40,70,85 0,995

SNV-dydx 4,55 4,37 5,61 391;651;797;858;1168;1237;1277;1324;1371;1610;1649 3 90 10,20,40,70,85 0,988

MSC 2,44 1,94 3,14 391;651;797;858;1168;1237;1277;1324;1371;1610;1649 3 90 10,20,40,70,85 0,996

MSC-dydx 5,42 3,94 5,72 327;391;651;797;858;1168;1237;1277;1324;1371;1561;1610;1649 3 90 10,20,40,70,85 0,991

Savitzky-Golay 12,18 8,84 9,04 327;391;651;797;858;1168;1237;1277;1324;1371;1561;1610;1649 1 90 10,20,40,70,85 0,967

SG-dydx (5,57) 8,38 12,50 327;391;651;797;858;1168;1237;1277;1324;1371;1561;1610;1649 (1)3 90 10,20,40,70,85 0,994

Kuuden sekunnin sarjat

Ilman käsittelyä (12,01) 10,45 10,75 391,651,797,858,1168,1237,1324,1371,1610,1649 (2)3 90 10,20,40,70,85 0,961

dydx 12,59 9,06 12,79 391,651,797,858,1168,1237,1277,1324,1610,1649 1 90 10,20,40,70,85 0,952

SNV 2,90 2,24 3,46 391,651,797,858,1168,1237,1324,1371,1610 3 90 10,20,40,70,85 0,997

SNV-dydx 4,16 4,12 4,85 391,651,797,858,1168,1237,1324,1371,1610,1649 3 90 10,20,40,70,85 0,991

SNV-SG 2,90 2,24 3,46 391,651,797,858,1168,1237,1324,1371,1610 3 90 10,20,40,70,85 0,997

MSC 2,55 2,13 3,07 391,651,797,858,1168,1237,1324,1610 3 90 10,20,40,70,85 0,997

MSC-dydx 3,56 2,93 4,61 391,651,797,858,1168,1237,1324,1610 3 90 10,20,40,70,85 0,996

Savitzky-Golay (12,01) 10,45 10,75 327;391;651;797;858;1168;1237;1277;1324;1371;1561;1610;1649 (2)3 90 10,20,40,70,85 0,961

78

Taulukko 10. Parasetamolin ja laktoosin esikäsittelyn vaikutukset yhden ja kuuden sekunnin mittauksissa. dydx: ensimmäisen asteen derivaatta esikäsittely, SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, SG: Savitzky-Golay esikäsittely

Parasetamoli ja laktoosi 5–95 %

malli ennuste ennuste (q2≥0,93)

Yhden sekunnin sarjat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustuspisteet q2-

summa

Ilman käsittelyä 8,67 10,50 5,91 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 2 100 5,15,30,45,80,85 0,964

dydx 9,78 11,30 7,22 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 1 100 5,15,30,45,80,85 0,959

SNV 4,89 6,61 2,28 391;651;797;1168;1237;1237;1324;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,982

SNV-dydx 7,35 10,05 4,82 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,959

SNV-SG 4,89 6,60 2,28 391;651;797;858;1168;1237;1324;1609 3 100 5,15,30,45,80,85 0,982

MSC-dydx 7,42 10,07 5,17 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,963

MSC 4,59 6,23 2,14 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,983

Kuuden sekunnin sarjat

Ilman käsittelyä 8,72 10,46 6,13 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 2 100 5,15,30,45,80,85 0,964

dydx 9,83 11,28 7,40 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 1 100 5,15,30,45,80,85 0,959

SNV 4,94 6,27 2,75 391;651;797;858;1168;1237;1324;1609 3 100 5,15,30,45,80,85 0,984

SNV-dydx 6,14 7,12 2,77 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,974

SNV-SG 4,94 6,27 2,75 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,984

MSC 4,54 5,80 2,51 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,972

MSC-SG 4,54 5,80 2,51 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,985

MSC-dydx 6,31 7,76 2,55 391;651;797;858;1168;1237;1324;1370;1609;1648 3 100 5,15,30,45,80,85 0,985

79

7.3 Liikkeessä tehdyt mittaukset

7.3.1 Asetyylisalisyylihappo-dikalsiumfosfaattiseokset

ASA:n ja DCP:n seoksilla tehtiin mittaukset kahdelle erilaiselle mittausjoukolle.

Mittausjoukossa 1 käytettiin ASA:n pitoisuuksia 10 %, 15 % ja 20 % (taulukko 11).

Mittausjoukossa 2 ASA:n pitoisuudet olivat lähempänä toisiaan – 12,5 %, 15 % ja 17,5 %

(taulukko 12). Näin saatiin tarkasteltua laitteiston erotuskykyä paremmin. Tutkittaessa

mittausjoukon 1 näytteitä omana ryhmänään, jossa ennustusmalli muodostettiin osasta

mittauspisteistä, saavutettiin hyviä ennustustuloksia mallilla. Eri esikäsittelyillä saavutettiin

0,96–1,53 RMSEP-arvoja yhdellä tai kahdella komponentilla. Mittausjoukolla 2 saavutettiin

vastaavalla järjestelyllä RMSEP-arvoiksi 1,2–1,96. Mittausjoukon 1 mittaukset pysyivät

esikäsittelemättömässä datassa omina ryhminään, eikä ohjelma arvioinut niitä observed

vs. predicted kuvaajassa sekaisin (kuva 30). 10 % näytteet (n=3) asettuivat välille 11,7–12

%, 15 % näytteet (n=11) taas välille 13,2–17,1 % ja 20 % näytteet (n=2) välille 18,2–18,3

%. Mittausjoukossa 2 ryhmät eivät pysyneet samoilla asetuksilla omina ryhminään. 12,5 %

näytteet (n=3) asettuivat ohjelman arvioinnissa 14,3–15 % välille. 15 % näytteet (n=11)

arvioitiin 12,7–16,4 % välille ja 17,5 % näytteet (n=2) 16,7–17,4 % välille (kuva 31). SNV-

ja MSC-esikäsittelyiden mallit täyttivät tutkimuksen määritysrajan q2≥0,93 jo yhdellä

komponentilla. Muodostetut mallit eivät osanneet kuitenkaan määrittää eroa seoksille

vasta kuin kahdella komponentilla, joten määritysrajasta poiketaan näissä kohdissa.

Ongelma koski mittauksia, joissa liikkuvat näytteet mitattiin keskenään ja liikkuvat näytteet

oli yhdistetty paikallaan mitattujen 10 %, 12,5 %, 15 %, 17,5 % ja 20 % näytteiden kanssa.

80

Kuva 30. Mittausjoukon yksi 10, 15 ja 20 % ASA näytteet erottuivat omina ryhminään x-akselilla

Kuva 31. Mittausjoukon kaksi 12,5 %, 15 % ja 17,5 % ASA näytteet eivät erottuneet enää täysin omina ryhminään mittausjoukossa

Kun liikkuvien mittausten spektrit yhdistettiin paikallaan mitattujen kanssa, erottuivat

paikallaan mitatut spektrit selvästi korkeamman intensiteetin johdosta niin piikkien kuin

taustankin osalta. Sirontaa korjaavat esikäsittelyt kykenivät poistamaan pääosin liikkeestä

81

johtuvan eron mittausten välillä. Tämä oli havaittavissa sarjoista muodostettujen mallien

antamista ennustustuloksista. Muut kuin sirontaa korjaavat esikäsittelyt antoivat

huonompia RMSEP-arvoja, kun niitä verrattiin pelkästään liikkeessä mitattuihin ryhmiin.

Sama ilmiö havaittiin molemmilla mittausjoukoilla.

Liikkuvat näytteet sovitettiin myös laajempiin, koko pitoisuusvaihtelun omaaviin, paikallaan

mitattuihin malleihin. Ainoastaan sirontaa korjaavat esikäsittelyt ja niiden yhdistelmät

antoivat järkeviä tuloksia, joten muut esikäsittelyt jätettiin tässä huomioimatta.

Tehokkaimmiksi esikäsittelyiksi sopivat SNV (RMSEP=2,96) ja MSC (RMSEP=3,10)

kahdella vaikuttavalla komponentilla. SNV-käsittelyllä RMSEP-kuvaajassa 10 % näytteet

(n=3) olivat 11,8–12,4 %, 15 % näytteet (n=11) sijoittuivat mallin avulla 15,1–19,4 % ja

20 % näytteet (n=2) vastaavasti 23,6–23,8 %.

7.3.2 Ibuprofeeni-laktoosiseokset

Ibuprofeenin ja laktoosin seoksilla tehtiin sama mittaus ja vastaavat esikäsittelyt

ibuprofeenin pitoisuuksilla 10 %, 15 % ja 20 % (taulukko 13). Tällä seoksella paras

RMSEP-tulos saavutettiin esikäsittely-yhdistelmällä SNV ja toisen asteen derivaatta, joka

antoi tuloksen 1,84 liikkuvien näytteiden keskinäisessä vertailussa ja 1,82 yhdistettynä

samojen pitoisuuksien paikallaan oleviin näytteisiin. MSC- ja SNV-käsittelyt antoivat

pienimmät RMSEP-arvot (0,45 ja 0,50). Arvot eivät kuitenkaan ole vertailukelpoisia muihin

esikäsittelyihin, koska näissä jouduttiin poikkeamaan mittauskäytännöistä. q2-summa

täyttyi mallilla jo ensimmäisellä komponentilla, mutta malli tunnisti vasta kahdella

komponentilla näytteiden eri pitoisuudet. Ohjelmisto arvioi esikäsittelemättömässä datassa

näytevahvuudet omiksi ryhmiksensä. 10 % näytteet (n=3) sijoittuivat 10,7–10,9 % arvoille,

15 % näytteet (n=11) taas 11,7–17,5 % arvoille ja 20 % näytteet (n=2) välille 20–20,4 %.

SNV-dydx2 -esikäsittelyillä vastaavat arvot olivat 12,8–13,3 (10 % näytteet), 13,8–15,5 (15

% näytteet) ja 16,9–17 (20 % näytteet).

Käytettäessä laajempaa paikallaan olevien näytteiden mallia pohjana paras sovitus saatiin

MSC-esikäsittelyllä. Se antaa RMSEP-arvoksi 2,83 kahdella komponentilla ja arvioi

näytteiden paikat selvästi omiksi ryhmikseen. 10 % näytteet (n=3) sijoittuivat 4–5 %

arvoille, 15 % näytteet (n=11) taas 12–17,5 % arvoille ja 20 % näytteet (n=2) välille 20–

82

20,4 %. Vaikka MSC-esikäsittelyn avulla ryhmät saatiin eriteltyä omiksi ryhmikseen, ei

mallilla saavutettu kaikille pitoisuuksille hyvää tarkkuutta.

7.3.3 Parasetamoli-laktoosiseokset

Pelkästään liikkuvia näytteitä arvioitaessa paras RMSEP-tulos saatiin esikäsittely-

yhdistelmällä MSC–dydx2 (2,55) ja SNV–dydx2 (2,35) yhdellä vaikuttavalla komponentilla

(taulukko 14). SNV-dydx2 -esikäsittelyllä ohjelma arvioi 10 % näytteiden (n=3) sijoittuvan

13,35–13,5 % väliin, 15 % näytteet (n=11) 14,1–15,2 % väliin ja 20 % näytteet (n=2) 15,4–

15,8 %. MSC–dydx2 -käsittelyllä ohjelma ei pystynyt arvioimaan näytteitä omiksi

ryhmikseen. 10 % näytteet sijoittuivat 13,8–14 % välille, 15 % näytteet 14–15 % välille ja

20 % näytteet sijoittuivat 15–15,4 % väliin.

Paikallaan mitattujen näytteiden käyttäminen mallina saa liikkuvien näytteiden arvioinnin

leviämään. SNV–dydx2 -käsittelyllä 10 % näytteet ennustetaan 5,8–6,6 % pitoisuuksille,

15 % näytteet 19,3–21,7 % välille ja 20 % näytteet pitoisuuksille 31,1–31,2 %

83

Taulukko 11. ASA- ja DCP-seokset liikkuvalla alustalla 1 sekunnin mittausajoilla ja 10 sekunnin väleillä, ASA-pitoisuudet näytteissä 10 %, 15 %, 20 %. dydx: ensimmäisen asteen derivaatta esikäsittely, dydx2: toisen asteen derivaatta esikäsittely, SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely.

ASA, DCP 1s, 10s välein 1RPM, 2x15_10_2x15_20

Malli Ennuste Ennuste

(q2≥0,93)

Pelkät liikkuvat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustuspisteet q2-

summa

ilman käsittelyä 1,48 1,48 1,49 424,550,751,989,1046,1192,1544,1607 1 10p,15p,20p 15,2;15,5;20,6;15,14,10,17;15,18 0,991

dydx 1,44 1,39 1,53 424,550,751,786,989,1046,1155,1192,1260,1544,1607 1 “ “ 0,991

MSC* 1,15 1,28 0,97 424,550,751,786,989,1046,1192,1544,1607 2* “ “ 0,991

SNV* 1,15 1,28 0,98 424,550,751,989,1046,1192,1544,1607 2* “ “ 0,991

Savitzky-Golay 1,48 1,48 1,49 424,550,751,989,1046,1192,1544,1607 1 “ “ 0,991

MSC-dydx2 1,55 1,61 1,49 751,786,1046,1192,1544,1607 1 “ “ 0,99

Liikkuvat ja 10, 15, 20 %

ilman käsittelyä 3,05 3,38 2,61 424,550,751,989,1046,1192,1544,1607 1 – 15,2;15,5;20,6;15,14,10,17;15,18 0,947

dydx 1,00 1,07 2,75 424,550,751,786,989,1046,1155,1192,1260,1544,1607 4 – “ 0,982

MSC* 1,08 1,13 0,98 424,550,751,786,989,1046,1192,1544,1607 2* – “ 0,994

SNV* 1,10 1,16 0,99 424,550,751,989,1046,1192,1544,1607 2* – “ 0,994

Savitzky-Golay 3,08 3,42 2,62 424,550,751,989,1046,1192,1544,1607 3 – “ 0,946

MSC-dydx2 1,58 1,63 1,47 751,786,1046,1192,1544,1607 1 – “ 0,99

Liikkuvat + 5–40 %

MSC 3,01 5,04 3,10 424,550,751,786,989,1046,1192,1544,1607 2 0,100 koko liikkuva näytejoukko 0,96

MSC-dydx2 2,77 4,84 3,28 751,786,1046,1192,1544,1607 2 “ “ 0,949

SNV 3,17 5,44 2,96 424,550,751,786,989,1046,1192,1544,1607 2 “ “ 0,949

SNV-dydx2 2,94 5,19 3,19 751,786,1046,1192,1544,1607 2 “ “ 0,944

* Käsittelyssä enemmän komponentteja kuin q2≥0,93 määritys ohjaisi

84

Taulukko 12. ASA- ja DCP-seokset liikkuvalla alustalla 1 sekunnin mittausajoilla ja 10 sekunnin väleillä, ASA-pitoisuudet näytteissä 12,5 %, 15 %, 17,5 %. SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, dydx2: toisen asteen derivaatta esikäsittely.

ASA, DCP 1s, 10s välein 1RPM,2x15_12,5_2x15_17,5

Malli Ennuste Ennuste

(q2≥0,93)

Pelkät liikkuvat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustuspisteet q2-

summa

ilman käsittelyä 1,55 1,69 1,37 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 1 12,5p,15p,17,5p 15b,15e,17,5f,15j,15n,12,5o 0,987

dydx2 1,87 1,81 1,96 750,784,1045,1191,1292,1606 1 “ ” 0,986

MSC* 1,15 1,18 1,20 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 2 “ ” 0,991

SNV* 1,16 1,18 1,21 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 2 “ ” 0,991

MSC-dydx2 1,15 1,11 1,26 750,784,1045,1191,1292,1606 1 “ ” 0,994

Liikkuvat ja 12,5; 15; 17,5 %

ilman käsittelyä (1,49) 0,23 1,22 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 (4)6 - 15b,15e,17,5f,15j,15n,12,5o 0,961

dydx2 1,91 2,26 1,44 750,784,1045,1191,1292,1606 3 - ” 0,935

MSC* 1,08 1,02 1,29 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 2 - ” 0,987

SNV 1,09 1,02 1,31 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 2 - ” 0,995

MSC-dydx2 1,19 1,17 1,25 750,784,1045,1191,1292,1606 1 - ” 0,994

Liikkuvat + 5–40 %

MSC 2,71 4,40 2,81 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 2 0,100 koko liikkuva näytejoukko 0,97

MSC-dydx2 (4,04) 4,13 3,10 750,784,1045,1191,1292,1606 (1)2 ” ” 0,963

SNV 3,21 5,44 3,11 423,550,750,784,985,1045,1191,1292,1606 2 ” ” 0,949

SNV-dydx2 2,99 5,19 3,38 750,784,1045,1191,1292,1606 2 ” ” 0,944

dydx2 (1,16) 1,41 10,58 750,784,1045,1191,1292,1606 (4)1 ” ” 0,995

* Käsittelyssä enemmän komponentteja kuin q2≥0,93 määritys ohjaisi

85

Taulukko 13. Ibuprofeenin ja laktoosin seokset liikkuvalla alustalla 1 sekunnin mittausajoilla ja 10 sekunnin väleillä, Ibuprofeenin pitoisuudet 10 %, 15 % ja 20 %. SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, dydx2: toisen asteen derivaatta esikäsittely.

IBU LAKTO 1s,10s välein, 1RPM, 2x15_10_2x15_20

Malli Ennuste Ennuste

(q2≥0,93)

Pelkät liikkuvat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustuspisteet q2-

summa

ilman käsittelyä 2,25 2,42 2,23 356,377,745,833,851,876,1086,1118,

1141,1180,1207,1263,1338,1608 (2)1 – 15b,15e,20f,15j,15n,10o 0,973

dydx2 3,10 3,47 2,69 356,377,476,636,745,782,819,833,851,876,915,

1086,1118,1141,1180,1207,1608 1 “ 0,946

MSC* 0,56 0,60 0,54 356,377,476,636,745,833,851,876,915,1086,1118,

1141,1180,1207,1263,1338,1608 2* “ 0,999

SNV* 0,55 0,61 0,51 “ 2* “ 0,998

SNV-dydx2 1,89 1,96 1,84 “ 1 “ 0,981

MSC-dydx2 2,52 2,61 2,45 “ 1 “ 0,968

Liikkuvat + 10, 15 ja 20 %

ilman käsittelyä 2,38 2,57 2,85 356,377,476,636,745 ,833,851,876,915,1086,1118,

1141,1180,1207,1263,1338,1608 3 – 15b,15e,20f,15j,15n,10o 0,962

dydx2 2,99 3,22 2,72 356,377,476,636,745,782,819,833,851,876,915,

1086,1118,1141,1180,1207,1608 3 “ 0,931

MSC* 0,74 0,86 0,50 356,377,476,636,745,833,851,876,915,1086,1118,

1141,1180,1207,1263,1338,1608 2* “ 0,996

SNV* 0,73 0,85 0,45 “ 2* “ 0,997

SNV-dydx2 2,10 2,26 1,82 “ 1 “ 0,996

MSC-dydx2 2,76 2,95 2,43 “ 1 “

Liikkuvat + 5–95 %

Ilman käsittely’ 7,46 2,41 10,52 636,746,783,820,833,1008,1115,1207,1453,1608 2 0,55,100 kaikki liikkeessä olevat 0,998

MSC* 5,35 7,77 2,83 387,494,532,567,583,755,863,931,958,1357 2 “ 0,98

MSC-dydx2 (5,21) 11,77 11,84 637,746,783,819,833,1007,1115,1181,12071608 (2)1 “ 0,963

SNV 7,51 10,94 5,48 “ 2 “ 0,964

SNV-dydx2 (7,38) 14,49 10,40 “ (2)1 “ 0,943

dydx2 7,90 2,47 10,35 636,746,783,820,833,1008,1115,1181,1207,1453,1608 1 “ 0,998

* Käsittelyssä enemmän komponentteja kuin q2≥0,93 määritys ohjaisi

86

Taulukko 14. Parasetamolin ja laktoosin seokset liikkuvalla alustalla 1 sekunnin mittausajoilla ja 10 sekunnin väleillä, parasetamolin pitoisuudet 10 %, 15 % ja 20 %. SNV: standardi normaali variaatti esikäsittely, MSC: multiplikatiivinen sirontakorjaus esikäsittely, dydx2: toisen asteen derivaatta esikäsittely, SG: Savitzky-Golay esikäsittely

ParaLakto 1s_10s välein 1 RPM, 2x15_10_2x15_20

Malli Ennuste Ennuste

(q2≥0,93)

Pelkät liikkuvat RMSEE RMSEE RMSEP Vaikuttavat aaltoluvut Komp. määrä

mallissa

Mallista poistetut pisteet

Ennustuspisteet q2-

summa

ilman käsittelyä 2,26 2,18 2,41 107,228,403,548,608,837,919,987,1075,1361 2 – 15v,15e,20f,15j,15n,10o 0,992

dydx2 2,15 1,98 2,45 107,124,402,546,610,624,665,769,837,919,987,1076,1362 2 “ “ 0,97

MSC* 0,34 0,38 0,31 107,124,142,225,403,548,609,836,914,982,1072,1362 2 “ “ 0,97

MSC–dydx2 2,57 2,64 2,55 107,124,402,546,610,624,665,769,837,919,987,1076,1362 1 “ “ 0,97

SNV-dydx2 2,28 2,35 2,35 “ 1 “ “ 0,984

Liikkuvat + 10,15 ja 20 %

ilman käsittelyä 1,10 1,09 0,98 107,228,403,548,608,837,919,987,1075,1361 3 – 15v,15e,20f,15j,15n,10o 0,964

dydx2 2,22 2,25 4,18 107,124,402,546,610,624,665,769,837,919,987,1076,1362 3 “ “ 0,951

MSC* 0,54 0,62 0,36 107,124,142,225,403,548,609,836,914,982,1072,1362 2 “ “ 0,998

MSC–dydx2 2,77 2,94 2,50 107,124,402,546,610,624,665,769,837,919,987,1076,1362 1 “ “ 0,963

SNV-dydx2 2,47 2,62 2,21 “ 1 “ “ 0,991

Liikkuvat + 5–95 %

Ilman käsittelyä 9,24 8,61 9,04 107,228,403,548,608,837,919,987,1075,1361 2 0,100 Kaikki liikkeessä olevat

näytteet 0,961

MSC 9,19 12,59 6,70 141,402,548,608,919,988,1029,1075,1121,1361,1399 2 “ “ 0,924

MSC-dydx2 9,13 12,62 6,08 “ 2 “ “ 0,938

SNV 9,24 12,87 5,71 “ 2 “ “ 0,952

SNV-dydx2 9,22 12,90 5,23 “ 2 “ “ 0,95

dydx2 9,46 9,99 9,04 “ 1 “ “ 0,957

* Käsittelyssä enemmän komponentteja kuin q2≥0,93 määritys ohjaisi

87

7.4 Spektrimuutokset siirryttäessä puhdasaineesta

seokseen

Suurimmat erot yksittäisten spektrien välillä syntyvät, kun siirrytään puhdasaineesta

seoksiin. Erityisesti spektrin pohjataso saattaa laskea tai nousta huomattavasti tässä

siirtymässä (kuva 32). Ibuprofeenin ja laktoosin tapauksessa seoksissa korostuu

laktoosin aiheuttama pohjatason nouseminen. Siirryttäessä puhtaasta laktoosista

seokseen, jossa on 95 % laktoosia ja 5 % ibuprofeenia, laskee pohjan intensiteetti

1000–1500 yksikköä käsittelemättömällä datalla. Puhtaan ibuprofeenin pohjataso on

matalalla ja siirryttäessä seokseen, jossa on 95 % ibuprofeenia ja 5 % laktoosia, se

ei nouse yhtä paljon, kuin se laski siirryttäessä puhtaasta laktoosista seokseen. 95 %

ibuprofeeniseoksen piikit ovat kuitenkin vastaavia puhdasaineen piikkejä

korkeammat (kuva 32).

Esikäsittelyillä, kuten MSC (kuva 33 ja 35), saadaan pohjatasoja yhtenäistettyä, ja

erot on helpompi havaita. Silmämääräisesti spektrejä tutkittaessa siirtymä puhtaasta

laktoosista seokseen on helpompi havaita kuin siirtyminen puhtaasta ibuprofeenista

seokseen. Tämä johtuu laktoosin pienien pitoisuuksien vähäisestä piikkien

muodostuksesta. Selkeimmin ibuprofeenin osuuden aiheuttamat muutokset piikkeihin

ovat havaittavissa aallonpituuksilla 1185 ja 1210 MSC-käsitellyssä datassa (kuva

33). Muissa kohdissa spektriä puhdasaineet ja niitä lähinnä olevien seosten spektrit

muistuttavat liian paljon toisiaan eron havaitsemiseksi pelkällä spektrin visuaalisella

tulkinnalla. MSC-käsittely saa ibuprofeenin puhdasainespektrin piikit 1185 ja 1210

aaltoluvuilla seoksia korkeammiksi. Laktoosin aiheuttama fluoresenssi haittaa myös

pienten laktoosimäärien havaitsemista. Pitoisuushavainnointeja ei voi kuitenkaan

tehdä luotettavasti yksittäisen piikin perusteella. Tietokonepohjaisesti tutkittaessa,

kaikki pitoisuudet huomioon otettaessa ja vertailtaessa koko spektrin alaa

käsittelemätön data antoikin selkeästi paremman ennustettavuuden ibuprofeenin ja

laktoosin seoksille (taulukko 7). Ibuprofeenin ja mannitolin seoksissa, joissa

kumpikaan ei aiheuta puhdasaineina korkeaa pohjatasoa, piikit tulevat selvemmin

esiin spektristä (kuva 34 ja 35). Tälläkin seoksella mannitolin pienet määrät on

vaikeampi havaita kuin ibuprofeenin. Suurimman osalla aaltolukualueesta 100 % ja

90 % ibuprofeenin spektrit kulkivat päällekkäin ja seokset aiheuttavat suuremmat

piikit kuin puhdasaineet (kuva 34). Tietokonepohjaisissa pitoisuusmäärityksissä

88

tehdyissä tutkimuksissa MSC-käsittely antoi vähemmillä komponenteilla saman

ennustettavuuden kuin käsittelemätön data (taulukko 8).

Kuva 32. Ibuprofeenin ja laktoosin puhdasaineiden sekä 5 %, 50 % ja 95 % ibuprofeenia sisältävien seoksien käsittelemättömät spektrit yhden sekunnin kuvausajalla. Spektristä on otettu tarkasteluun 850–1250 aaltolukualueella cm-1.

Kuva 33. Ibuprofeenin ja laktoosin seokset 0 %, 5 %, 50 %, 95 % ja 100 % ibuprofeenin osuudella. Spektrit MSC-käsitelty aaltolukualueella 860–1240.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250

Inte

nsiteett

i

Aaltoluku (cm-1)

550951000

89

Kuva 34. Ibuprofeenin ja mannitolin puhdasaineiden ja seoksien spektrit 10 %, 50 % ja 90 % ibuprofeenin osuudella. Spektrit aaltolukualueella 800–1050.

Kuva 12. Ibuprofeenin ja mannitolin puhdasaineiden ja 10 %, 50 % ja 90 % ibuprofeenia sisältävät MSC-käsitellyt spektrit.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

800 850 900 950 1000 1050

Inte

nsiteett

i

Aaltoluku (cm-1)

10

50

90

100

0

90

7.5 Raman-spektrikirjasto

Spektrikirjastoon kerättiin 41 eri ainetta (liitetaulukko 1). Mittaukset tehtiin pääasiassa

yhden ja kuuden sekunnin mittausajoilla. Mitatuista aineista 21:llä oli matala

pohjataso, ja 20 aineista fluoresoi, joista 12 voimakkaasti. Spektreistä 23 oli

silmämääräisesti helposti tunnistettavia ja ne saivat arvon hyvä, kymmenen oli

tyydyttävästi tunnistettavissa ja kahdeksan huonosti. Eniten referenssispektrejä löytyi

parasetamolille (6), asetyylisalisyylihapolle (4), salisyylihapolle (4) ja propranololille

(4). Yhteensä 26 aineelle löytyi jonkinlainen referenssispektri aikaisemmin

julkaistuista tutkimuksista. Suurin osa tässä työssä tutkituista spektreistä oli

muodoltaan samanlaisia tai melkein samanlaisia kuin muissa tutkimuksissa

esiintyneet spektrit. Joissain tapauksissa referenssispektrien tulkintoja hankaloittivat

artikkelien erilaiset spektrien asettelut. Artikkelien säteilylähteiden tehot vaihtelivat

0,6 ja 1000 mW:n välillä ja käytetyt aallonpituudet 514 ja 1064 nm:n välillä.

Artikkelien Raman-järjestelmät perustuivat myös eri Raman-tekniikoihin, mikä saattoi

vaikuttaa spektrien muotoon ja tulkittavuuteen.

Artikkeleissa esiintyneet parasetamolin spektrit olivat hyvin lähellä tutkimuksen

mittaustuloksia. Piikkien intensiteetti vaihteli jonkin verran, mutta ne olivat hyvin

tunnistettavissa. Samoin asetyylisalisyylihapon spektrit olivat hyvin tai melko hyvin

tunnistettavissa samanlaisiksi tämän tutkimuksen mittauksen kanssa. Nikotiiniamidin

kohdalla löytyi sekä tämän tutkimuksen spektriä tukeva artikkeli, että sen spektristä

osittain eroavia artikkeleita (Kumar ym. 2010, Ramanlingman ym. 2010, Rajesh ym.

2012). Kaikki sulfaniiliamidit olivat joko hyvin hankalia tai mahdottomia tunnistaa

referenssiartikkelin perusteella (Sutherland ym. 1990). Spektrien tulkintaa

hankaloittivat artikkelin erilaiset spektrin mittakaava-asettelut ja omassa

tutkimuksessa esiintynyt voimakas sulfametasiinin fluoresointi. Mikrokiteisen

selluloosan tulkintaa haittasi voimakas fluoresenssi ja erilainen asettelu kuin

artikkeleissa (Widjaja ja Seah 2008, Maltas ym. 2013). Propranololin osalta

hankaloittava tekijä oli sen eri isomeerit. Artikkeleissa oli käytetty

peilikuvaisomeereistä potentimpaa propranolin S-muotoa, jonka spektri eroaa

raseemisen seoksen spektristä piikkien intensiteetin osalta sekä ylimääräisellä piikillä

aaltoluvulla 200 (kuva 36). Kuvasta on hyvä huomata kuitenkin, että isomeerit ja

raseeminen seos on mitattu eri Raman-tekniikoilla. Verrattaessa tutkimuksen spektriä

91

raseemiseen referenssispektriin oli tunnistettavuus parempi. Tutkimuksessa oli

mukana kahden eri valmistajan parasetamolia. Mittaukset antoivat niille hyvin

samanlaiset spektrit, mutta pohjataso mittauksissa oli jostain syystä erilainen (kuva

26).

Kuva 13. Propranololin isomeerien ja raseemisen seoksen Raman-spektrit (Bodoki ym. 2012)

Kuva 14. Kahden eri valmistajan syntetisoiman parasetamolin Raman-spektri.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

250 350 450 550 650 750 850 950 1050 1150 1250 1350 1450 1550 1650 1750 1850

Inte

nsiteett

i

Aaltoluku (cm-1)

Parasetamoli

Acetaminophen

92

8 POHDINTA

Paikallaan tehtyjen mittausten tulokset antoivat viitteitä derivointipohjaisten

esikäsittelyjen paremmasta soveltuvuudesta pitoisuuden määrittämiseen. Ne ovat

kuitenkin herkkiä taustan vaihtelulle, jonka takia tulos voi olla täysin vääränlainen.

SNV- ja MSC-esikäsittelyt sietävät paremmin taustan muutoksia, mutta antavat

huonompia ennustustuloksia mittauksilla, joissa spektreissä ei esiinny normaalien

muutoksien lisäksi poikkeamia. Paikallaan tehdyissä mittauksissa esikäsittely-

yhdistelmien käyttäminen ei osoittautunut kannattavaksi yhdelläkään seoksella, vaan

ennustustulokset pysyivät joko lähes samoina tai huonontuivat yksittäisiin

esikäsittelyihin verrattuna. Käsittelemättömässä datassa osa havaintopisteistä ei

asettunut datajoukossa oletetulle kohdalle. Mahdollisia syitä tähän saattavat olla

näytteen huono sekoitus, mittausvirhe tai mittaamista varten tehty näytteen tiheyteen

vaikuttava pinnan tasoittaminen, joka vaikuttaa Raman-spektrin muodostumiseen.

Tätä vaihtelua pystyttäisiin vähentämään standardoimalla näytteen valmistus ja

mittaus. Ongelmaa voisi vähentää myös useampien mittausten ottaminen näytteestä,

jolloin tulos saattaisi tarkentua. Paikallaan mitatuista seossarjoista tarkimmat tulokset

saavutettiin ASA–DCP -sarjalla, joka koostui 0–40 % asetyylisalisyylihappoa

sisältävistä seoksista. Tälle seossarjalle muodostetulla ennustusmallilla onnistuttiin

saavuttamaan mittaustarkkuus, jossa ennustettujen tulosten ero näytteiden

teoreettisiin pitoisuuksiin oli alle kaksi prosenttia. Kaikki seosyhdistelmät eivät

saavuttaneet kuitenkaan näin hyviä tuloksia. Paikallaankin tehdyissä mittauksissa

sekä mittausjärjestelmä että onnistuneiden ennustusmallien luominen vaativat vielä

lisää tutkimusta, jotta pystytään luomaan nopeita, tarkkoja, luotettavia ja toistettavia

malleja erilaisille lääkeaineseoksille erilaisissa tuotantoympäristöissä.

Tutkimuksen aikana mallien luotettavuuden arviointia hankaloittivat näytejoukkojen

pienuudet sekä ennustusmallin komponenttien määrän rajaavan q2-summan

arvottaminen siten, ettei se yli- tai alikäsittelisi dataa. Myös virheellisten mittausten

tunnistaminen normaalista spektrin vaihtelusta tarvitsee lisää arviointia.

Ennustemallien luotettavuutta pystyttäisiin parantamaan suurentamalla niiden

tekemiseen ja arviointiin käytettäviä näytejoukkoja. Tämä voisi auttaa myös

tunnistamaan helpommin virheelliset mittaukset. Sen lisäksi kullekin esikäsittelylle

93

soveltuvan q2-raja-arvon määrittelyperusteen luominen voisi lisätä ennustusmallin

tarkkuutta säilyttäen kuitenkin mallin toistettavuuden.

Liikkeessä tehtyjen mittausten tuloksia voidaan tutkia kahdelta suunnalta, joko

saavutetun pitoisuustarkkuuden perusteella tai järjestelmän kyvyllä erottaa eri

pitoisuusryhmät toisistaan. Tässä tutkimuksessa esikäsittely-yhdistelmät soveltuivat

paremmin liikkeessä tehtyjen mittausten esikäsittelyyn kuin aikaisempiin paikallaan

tehtyjen. Niillä saavutettiin usein parempi tai yhtä hyvä ennustettavuus vähemmillä

mallin komponenteilla kuin yksittäisillä esikäsittelyillä. Sirontaa korjaavat esikäsittelyt

sopivat paremmin näytteiden ennustamiseen, ja niiden avulla pystyttiin yhdistämään

paikallaan mitattujen näytteiden ennustusmalleja liikkeessä mitattujen näytteiden

tunnistamiseen. Paikallaan mitattujen näytteiden ennustusmallien käyttö paransi eri

pitoisuusryhmien erottelua toisistaan, mutta huononsi mallien kykyä tunnistaa

näytteiden pitoisuudet. Tämä saattoi johtua paikallisten mallien suurempi-

intensiteettisistä piikeistä, jotka painottivat siten ennustusta eri tavalla kuin liikkeessä

mitattujen ennustusmallit. Seokset, joissa laktoosi oli toisena aineena, antoivat

huonompia RMSEP-arvoja ennustuksissa, kun ne yhdistettiin paikallaan tehtyjen

mittausten kanssa. Tämä voi johtua liikkeen aiheuttamasta piikkien intensiteetin

laskusta sekä laktoosin aiheuttaman fluorisenssin yhdistelmästä, molemmat näistä

vaikuttavat spektrin muotoon merkittävästi. Liikkeessä tehtyjen mittausten

näytejoukot osoittautuivat liian pieniksi ja painottuivat mittausryhmien sisällä liikaa,

mikä esti tarkempien arviointien ja johtopäätösten tekemisen.

Mittauksissa haluttiin jäljitellä jatkuvatoimisen linjaston toimintaympäristöä.

Puutteelliset koejärjestelyt mittauksien paikannuksessa sekä näytteiden asettelussa

kuitenkin aiheuttivat, ettei kaikkea tutkimusdataa voitu käyttää Raman-spektrometrin

soveltuvuuden arviointiin reaaliaikaisessa analytiikassa. Järjestelmä vaatisikin uusia

tutkimuksia, joissa keskitytään tarkemmin jäljittelemään oikean jatkuvatoimisen

prosessin toimintaympäristöä.

Spektrikirjasto näyttää olevan pääosin vertailukelpoinen muihin tutkimuksiin nähden,

joten se antaa hyvää pohjaa myös spektreille, joille ei vertailukohtaa löytynyt.

Spektrikirjasto toimii hyvänä pohjana aineiden tunnistamiseen pienessä

mittakaavassa sekä valmistuneen jatkuvatoimisen laitteiston tutkimuksiin.

Spektrikirjaston tarkempi arviointi kaipaisi spektrien normalisointia, jotta niiden

94

tarkempaa rakennetta voitaisiin vertailla. Tarkempaan arviointia varten spektrien

käsittelyn pitäisi olla järjestelmällistä ja niiden tunnistaminen tulisi suorittaa

tietokonepohjaisesti, kuten nykyaikaiset kannettavat Raman-spektrometrit tekevät.

Kemiallinen pitoisuuden määrittäminen ei onnistunut käytetyllä menetelmällä, vaan

24 tuntia lämmitettyjen seosten pitoisuudet olivat yli laskennallisten arvojen.

Määritykset tulisi vielä toistaa, koska laimennosten tekeminen lisää helposti

epätarkkuutta tuloksissa. Eri sekoitusmenetelmillä saadut spektrofotometri spektrit

kuitenkin antavat osviittaa, että pienillä ASA-pitoisuuksilla näytteet hajoavat suurelta

osin salisyylihapoksi jo sekoituksessa, ja ASA:n aiheuttama absorbanssipiikki (276

nm) jää salisyylihapon piikin (300 nm) alle. Neljän ja kahdeksan tunnin liuotusajat

eivät kuitenkaan näyttäneet riittävän saavuttamaan täysin liuennutta tilaa liuoksissa.

Asetyylisalisyylihapon ongelmana on huono vesiliukoisuus sekä lämmön että

kosteuden nopeuttama hajoaminen salisyylihapoksi, mikä tekee koejärjestelyistä

monimutkaisempia (Lin-Li ym. 2008). Tulokset osoittavat, että kemiallista

vertailuanalyysiä varten pitää kehittää uusi paremmin soveltuva koejärjestely.

Pitoisuusmääritykset voisi suorittaa esimerkiksi vesi-etanoliliuoksella, johon ASA

liukenee paremmin, tai jollakin eri seosyhdistelmällä (Iwunze 2008). Näiden lisäksi

voisi tutkia soveltuvimpia sekoitusolosuhteita ja sekoituksen kestoa, erityisesti

pienempipitoisuuksisille ASA-seoksille.

Raman-spektrometrilaitteistojen on todettu kykenevän hyvinkin tarkkoihin

lääkeainepitoisuusmäärityksiin (Eliasson ym. 2008, Mazurek ja Szostak 2008,

Townshend ym. 2012), ja paikoitellen tässäkin tutkimuksessa laitteisto osoitti hyvää

tarkkuutta ottaen huomioon vähäisen tuntemuksen PLS-mallien muodostuksesta ja

Raman-kuvantamisesta – tutkimuksessa ilmenneistä suurista puutteista huolimatta.

Koejärjestelyiden suurimmat puutteet Raman-spektrometrian jatkuvatoimiseen

analytiikkaan soveltuvuuden arvioinnissa olivat pienet ja epätasapainossa olevat

näytemäärät liikkuvissa mittauksissa sekä nopeammin liikkuvien näytteiden puute.

Raman-spektroskopia on periaatteeltaan erittäin hyvin jatkuvatoimiseen analytiikkaan

soveltuva järjestelmä nopeutensa ja spesifisyytensä takia. Suoraan tällaista

järjestelmää ja näitä ennustusmalleja ei voisi tehtyjen testien perusteella harkita

jatkuvatoimiseen analytiikkaan. Kokeet antoivat kuitenkin viitteitä Raman-

spektrometrian potentiaalista, ja tarkemmalla perehtymisellä mallien muodostukseen

95

sekä paremmilla koejärjestelyillä voitaisiin ennustustehoa saada huomattavasti

paremmaksi.

96

9 KIRJALLISUUS:

Aaltonen J, Strachan C.J, Pöllänen K, Yliruusi J, Rantanen J: Hyphenated

spectroscopy as a polymorph screening tool. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 44: 477–483, 2007

Abdi H. Partial Least Square (PLS) Regression. Kirjassa: Encyclopedia of Social

Sciences Research Methods. Toimittajat: Lewis-Beck M., Bryman A., Futing T.

Thousand Oaks (CA): Sage. 2003

Agalloco J., ja Akers J.: Sterile Product Manufacturing, kirjassa: Pharmaceutical

Manufacturing Handbook: Production and Processes. sivut:102-120, Toimittaja: Cox

G.S, Wiley, NJ USA: 2008.

Agalloco J.: Steam sterilization-in-place technology and validation. Sivut: 201,

Kirjassa: Validation of Pharmaceutical Processes, kolmas versio. Toimittajat:

Agalloco J ja Carleton J.F. Informa Healtcare: NY USA: 2007

Agalloco J.: Thinking Inside the Box: The Application of Isolation Technology for

Aseptic Processin, Pharmaceutical Technology 8-11, 2006

Al-Achi A, Gupta M.R, Stagner W.C: Integrated Pharmaceutics: Applied

Preformulation, Product Design, and Regulatory Science sivut: 561-577. Wiley,

Somerset, NJ, USA: 2013.

Al-Ghananeem A. ja Crooks P.A: Phase I and Phase II Ocular Metabolic Activities

and the Role of Metabolism in Ophthalmic Prodrug and Codrug Design and Delivery.

Molecules 12, 373–388 2007

Ali Y. ja Lehmussaari K: Industrial perspective in ocular drug delivery. Advanced

Drug Delivery Reviews 58: 1258–1268, 2006

Alvarez-Ros M.C, Sánchez-Cortés S. García-Ramos J.V, Vibrational study of the

salicylate interaction with metallic ions and surfaces. Spectrochimica Acta Part A 56:

2471–2477, 2000

Amo E.M. ja Urtti A: Current and future ophthalmic drug delivery systems A shift to

the posterior segment. Drug Discovery Today, 13(3) 135–143, 2008

97

Boczar M, Wójcik M.J, Szczeponek K, Jamróz D, Zieba A, Kawalek B, Theoretical

modeling of infrared spectra of aspirin and its deuterated derivative. Chemical

Physics 286: 63–79, 2003

Bodoki E, Oltean M, Bodoki A, Stiufiuc R, Chiral recognition and quantification of

propranolol enantiomers by surface enhanced Raman scattering through

supramolecular interaction with b-cyclodextrin. Talanta 101: 53–58, 2012

Bompart M, Gheber L.A, De Wilde Y, Haupt K. Direct detection of analyte binding to

single molecularly imprinted polymer particles by confocal Raman spectroscopy.

Biosensors and Bioelectronics 25: 568–571, 2009

Braun D.E, Maas S.G, Zencirci N, Langes C, Urbanetz N.A, Griesser U.J,

Simultaneous quantitative analysis of ternary mixtures ofd-mannitol polymorphs by

FT-Raman spectroscopy and multivariate calibration models. International Journal of

Pharmaceutics 385: 29–36, 2010

Bregni C, Chiappetta D, Faiden N, Carlucci A, García R, Pasquali R: Release study

of diclofenac from new carbomer gels. Pakistan journal of pharmaceutical sciences

21(1), 2–16, 2008

Brizuela A.B, Bichara L.C, Romano E, Yurquina A, Locatelli S, Brandán S.A, A

complete characterization of the vibrational spectra of sucrose. Carbohydrate

Research 361: 212–218, 2012

Bugay D.E. ja Brush R.C. Chemical identity testing by remote-based dispersive

raman spectroscopy. Journal of applied spectroscopy 64(5): 468-475, 2010

Burstein N.L.: Preservative Alteration of Corneal Permeability in Humans and

Rabbits. Investigative ophthalmology & visual science, 25(12) 1453-1457, 1984

Campbell S.N, Williams A.C, Grimsey I.M, Booth S.W. Quantitative analysis of

mannitol polymorphs. FT-Raman spectroscopy. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 28: 1135–1147, 2002

98

Castro J.L, Lopez-Ramirez M.R, Arenas J.F, Soto J, Otero J,C. Evidence of

Deprotonation of Aromatic Acids and Amides Adsorbed on Silver Colloids by

Surface-Enhanced Raman Scattering. Langmuir 28: 8926−8932, 2012

Chiarello K: Pharma industry drives innovation in barrier/isolation design.

Pharmaceutical Technology, 28(3) 44–54, 2004

Chrai S.S, Patton T.F, Mehta A, Robinson J.R: Lacrimal and instilled fluid dynamics

in rabbit eye. Journal of Pharmaceutical Sciences 62, 1112–1121, 1973

Danion A., Aesenault I. ja Vermette P.: Antibacterial Activity of Contact Lenses

Bearing Surface-Immobilized Layers of Intact Liposomes Loaded with Levofloxacin.

Journal of pharmaceutical sciences, 96(9), 2350- 2363, 2007

De Beer T.R.M, Alleso M, Goethals F, ym: Implementation of a Process Analytical

Technology System in a Freeze-Drying Process Using Raman Spectroscopy for In-

Line Process Monitoring. Analytical Chemistry, 79(21): 7992-8003, 2007

De Beer T.R.M, Baeyens W.R.G, Vander Hayden Y, Remon J.P, Vervaet C, Verpoort

F, Influence of particle size on the quantitative determination of salicylic acid in a

pharmaceutical ointment using FT-Raman spectroscopy. European journal of

pharmaceutical sciences 30: 229–235, 2007

De Beer T.R.M, Burggraeve A., Fonteyne M., Saerens L., Remon J.P., Vervaet C.:

Near infrared and Raman spectroscopy for the in-process monitoring of

pharmaceutical production processes, International Journal of Pharmaceutics,

417: 32–47, 2011

Drinkwater J.L. Restricted Access Barriers - RABS definitions and performance.

http://www.pharmaceutical-int.com/article/restricted-access-barriers-rabs-definitions-

and-performance.html, haettu internetistä: 8.12.2013

Eliasson C., Macleod N.A., Jayes L.C., Clarke F.C., Hammond S.V., Smith M.R.,

Matousek P.: Non-invasive quantitative assessment of the content of pharmaceutical

capsules using transmission Raman spectroscopy. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 47: 221–229, 2008

99

Eljarrat-Binstock E, Raiskup F., Frucht-Pery J. ja Domb A.J.: Transcorneal and

transscleral iontophoresis of dexamethasone phosphate using drug loaded hydrogel.

Journal of Controlled Release, 106, 386 – 390, 2005

EMEA: Decision trees for the selection of sterilisation methods (cpmp/qwp/054/98)

Lontoo 2000

Etälukio, Pitkä matematiikka Derivaatta. Haettu internetistä: 26.11.2013.

http://www.edu.fi/etalukioetusivu

Euroopan komissio: EU Guidelines to Good Manufacturing Practice Medicinal

Products for Human and Veterinary Use: Annex 1 Manufacture of Sterile Medicinal

Products, Brysseli 2008

Ferraro J.R, Nakamoto K, Brown C.W: Introductory Raman Spectroscopy sivut: 1-

16,18-27,95-97,105,106,112-115,267-274 , 2. painos. Academic Press, Burlington,

MA, USA, 2002

FDA Food and Drug Administration: Guidance for industry, sterile drug products

produced by aseptic processing – current good manufacturing practice.2004

Frucht-Pery, J. , Mechoulam, H. , Siganos, C. S. , Ever-Hadani, P. , Shapiro, M. , ja

Domb, A. Iontophoresis-gentamicin delivery into the rabbit cornea, using a hydrogel

delivery probe, Experimental Eye Research.78(3), 745–749, 2004.

Furrer P. ja Mayer J.M.: Ocular Tolerance of Absorption Enhancers in Ophthalmic

Preparations. American association of pharmaceutical scientists, 4(1)1-5, 2002

Furrer P., Delie F. ja Plazonnet B.Opthalmic Drug Delivery Kirjassa: Drugs and the

Pharmaceutical Sciences, Volume 184: Modified Release Drug Delivery Technology,

painos 2 (2 versio). sivut 68-75 Toim. Hadgraft J., Lane M.E., Rathbone M. J.,

Roberts M.S. CRC Press, New York 2008

Garbwal R., Sbady S.F., Ellis E.J., ym. Sustained Ocular Delivery of Ciprofloxacin

Using Nanospheres and Conventional Contact Lens Material. Investigative

Ophthalmology & Visual Science, 53(3), 1341-1352, 2012

100

Gemperline P.J, Principal Component Analysis Kirjassa: Practical guide to

chemometrics, sivut: 2-3, 77-86, 2. painos. Toim. Gemberline P.J, Taylor&Francis,

Boca Raton, 2006

Genta I, Conti B, Perugini P, Pavanetto F, Spadaro A,Puglisi G: Bioadhesive

Microspheres for Ophthalmic Administration of Acyclovir. Journal of Pharmacy and

Pharmacology, 49(8), 737-742, 1997

Gibson M: Opthalmic Dosage Forms. Kirjassa: Pharmaceutical Preformulation and

Formulation, 2. painos. sivut: 431-453, Toim. Gibson M, informa healthcare, New

York 2009

Gulsen D. ja Chauhan A. Dispersion of microemulsion drops in HEMA hydrogel: a

potential ophthalmic drug delivery vehicle. International Journal of Pharmaceutics,

292, 95–117, 2005

Gupta H, Jain S, Rashi M, Mishra P, Mishra AK: Sustained ocular drug delivery from

a temperature and pH triggered novel in situ gel system. Drug Delivery, 14: 507–515,

2007

Gurtu, J.N. Khera H.C: Physical Chemistry, Volume III, sivut: 53,54,58,59 1. painos.

Global Media, Meerut, IND, 2008

Haaser M, Windbergs M, Mcfoverin C.M, ym. Analysis of Matrix Dosage Forms

During Dissolution Testing Using Raman Microscopy, Journal of pharmaceutical

sciences, 100: 4452–4459, 2011

Halhal M., Renard G., Courtois Y., BenEzra D., Behar-Cohen F.: Iontophoresis: from

the lab to the bed side. Experimental Eye Research, 78, 751–757, 2004

Heckert R.A., Best M., Jordan L.T., Dulac G.,C., Eddinton D.L. ja Sterritt W.G.:

Efficacy of Vaporized Hydrogen Peroxide against Exotic Animal Viruses. Applied

andenvironmentalmicrobiology,63(10), 3916–3918, 1997

Holly F.J. ja Lemp M.A.: Tear physiology and dry eyes. Survey of ophthalmology,

22(2) 69-87, 1977

101

Hornof M.D. ja Bernkop-Schnürch A.: In VitroEvaluation of the Permeation

Enhancing Effect of Polycarbophil–Cysteine Conjugates on the Cornea of Rabbits

Journal of pharmaceutical sciences,91(12) 2588-2592, 2002

Hämäläinen K.M., Määttä E., Piirainen H., Sarkola M., Väisänen A., Ranta V.P, Urtti

A.: Roles of acid/base nature and molecular weight in drug release from matrices of

gelfoam and monoisopropyl ester of poly vinyl methyl ether–maleic anhydride.

Journal of Controlled Release, 56, 273–283, 1998

International Organization for Standardization Eurooppalainen standardisointi

komitea: Aseptic processing of health care products - Part 5: Sterilization in place

(ISO 13408-5:2006)( EN ISO 13408-5:2011), Brysseli 2011

Jabeen S, Dines T.J, Leharne S.A, Chowdhry B.Z, Raman and IR spectroscopic

studies of fenamates – Conformational differences in polymorphs of flufenamic acid,

mefenamic acid and tolfenamic acid. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and

Biomolecular Spectroscopy 96: 972–985, 2012

Johansson j, Pettersson S, Taylor L.S, Infrared imaging of laser-induced heating

during Raman spectroscopy of pharmaceutical solids, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 30: 1223–1231, 2002

Järvinen K, Järvinen T, Urtti A: Ocular absorption following topical delivery.

Advanced Drug Delivery Reviews 16: 3–19, 1995

Järvinen T., Rautio J., Masson M. ja Loftsson T.: Design and Pharmaceutical

Applications of Prodrugs. Kirjassa: Drug discovery handbook. sivut: 738-739,

Toimittaja Gad S.C., Wiley-Interscience, NJ, USA, 2005

Kačer P., Švrček J., Syslová K., ym.: Vapor Phase Hydrogen Peroxide – Method for

Decontamination of Surfaces and Working Areas from Organic Pollutants, Kirjassa:

Organic Pollutants Ten Years After the Stockholm Convention - Environmental and

Analytical Update, sivut 404-406, Toimittaja Dr. Tomasz Puzyn, Intech, Rijeka

Croatia, 2012

102

Kachrimanis K, Braun D.E, Griesser U.J, Quantitative analysis of paracetamol

polymorphs in powder mixtures by FT-Raman spectroscopy and PLS regression.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43: 407–412, 2007

Kaiser optical systemssin internetsivut Haettu internetistä 12.2.2013:

http://www.kosi.com/Raman_Spectroscopy/rtr-ramantutorial.php?ss=800

Kaiser optical systemssin internetsivut Haettu internetistä 21.3.2013:

http://www.kosi.com/Raman_Spectroscopy/phat-probehead.php

Kantorovich K, Tsarfati I, Gheber L.A, Haupt K, Bar I, Writing Droplets of Molecularly

Imprinted Polymers by Nano Fountain Pen and Detecting Their Molecular

Interactions by Surface-Enhanced Raman Scattering. Analytical Chemistry 81: 5686–

5690, 2009

Kantorovich K, Tsarfati I, Gheber L.A, Haupt K, Bar I. Reading microdots of a

molecularly imprinted polymer by surface-enhanced Raman spectroscopy.

Biosensors and Bioelectronics 26: 809–814, 2010

Kaur I.P. ja Kanwar M.: Ocular Preparations: The Formulation Approach. Drug

Development and Industrial Pharmacy, 28(5), 473–493 2002

Keith P. Mastering VHP Sterilization. Global BioPharmaceutical Resources, Inc.

Newsletter January 2012

Kim M., Chung H., Woo Y. ja Kemper M.: New reliable Raman collection system

using the wide area illumination (WAI) scheme combined with the synchronous

intensity correction standard for the analysis of pharmaceutical tablets. Analytica

Chimica Acta 579: 209-216, 2006

Kogerman K, Aaltonen J, Strachan C. J, ym: Establishing Quantitative In-Line

Analysis of Multiple Solid-State Transformations During Dehydration. Journal Of

Pharmaceutical Sciences 97, (11): 4983-4999, 2008

Kramer, R.: Chemometric Techniques for Quantitative Analysis. sivu. 190 CRC

Press, NY, USA: 1998

103

Kumar M Jaiswal S, Singh R, ym. Ab initiostudies of molecular structures, conformers

and vibrational spectra of heterocyclic organics: I. Nicotinamide and its N-oxide.

Spectrochimica Acta Part A75: 281–292 2010

Lang J.C.: Ocular drug delivery conventional ocular formulations. Advanced Drug

Delivery Reviews 16: 39–43, 1995

Larkin P.J, Santangelo M, Šašic S. Internal Multiple-Scattering Hole-Enhanced

Raman Spectroscopy: Improved Backscattering Fourier Transform Raman Sampling

in Pharmaceutical Tablets Utilizing Cylindrical–Conical Holes. Applied Spectroscopy

66: 892–902, 2012

Lauderback J., Fraser J., Gustin E., McDonnell G., ja Williams K.: Point-of-

Manufacture Sterilization: A look at the material compatibility of Eastar 6763

copolyester with vaporized hydrogen peroxide sterilization. Haettu internetistä:

http://www.devicelink.com/pmpn/archive/02/10/005.html

Lin-Li L., Xian-Cheng Z. ja Jian-Lin T.: Evaluation of the Stability of Aspirin in Solid

State by the Programmed Humidifying and Non-isothermal Experiments. Archives of

Pharmacal Research 31 (3), 381-389, 2008

Listgarten J. ja Emili A.: Statistical and Computational Methods for Comparative

Proteomic Profiling Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.

Molecular & Cellular Proteomics 4 (4): 419-434, 2005

Liu Y, Liu J, Zhang X, Zhang R, Huang Y, Wu C: In Situ Gelling Gelrite/Alginate

Formulations as Vehicles for Ophthalmic Drug Delivery. American Association of

Pharmaceutical Scientists 11: 610–620, 2010

Lopez-Heredia M.A, Sariibrahimoglu K, Yang W, ym. Influence of the pore generator

on the evolution of the mechanical properties and the porosity and interconnectivity

of a calcium phosphate cement. Acta Biomaterialia 8: 404–414, 2012

López-Sánchez M, Ruedas-Rama M.J, Ruiz-Medina A, Molina-Díaz A, Ayora-

Cañada M.J. Pharmaceutical powders analysis using FT-Raman spectrometry:

Simultaneous determination of sulfathiazole and sulfanilamide. Talanta 74: 1603–

1607, 2008

104

Lysfjord J. ja Porter M.: Esitys: Barrier Isolation History and Trends 2008 Final Data.

Haettu internetistä 9.12.2013: http://getfinefocus.com/sites/default/files/Isolator

%20ISPE%20study%202008%20copy.pdf

Löfgren A, Brodin A, Sjönkvist-Saers E: Blow-Fill-Seal Pharmaceutical Packaging –

Towards Safe and Convenient Medical Container. Business briefing: pharmatech

may: 214–216, 2003

Maltas D.C, Kwok K, Wang P, Taylor L.S, Ben-Amotz D. Rapid classification of

pharmaceutical ingredients with Raman spectroscopy using compressive detection

strategy with PLS-DA multivariate filters. Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis 80: 63–68, 2013

Mazuel C. ja Friteyre M.-C: United States Patent Nro. 4 861 760: Ophthalmological

composition of the type which undergoes liquid-gel phase transition. 1989

Mazurek S. ja Szostak R.: Quantitative determination of diclofenac sodium in solid

dosage forms by FT-Raman spectroscopy. Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 48: 814–821, 2008

Meko D.M: Applied Time Series Analysis kurssimateriaali: Notes for week 4. Haettu

internetistä 26.11.2013: http://www.ltrr.arizona.edu/~dmeko/geos585a.html

Merkli , Cyrus T, Robert G: Use of insoluble biodegradable polymers in ophthalmic

systems for the sustained release of drugs. 41(5), 271–283, 1995

Microsoft excel help. Haettu internetistä 6.11.2013: http://office.microsoft.com/fi-

fi/excel-help/trendin-tai-keskiarvoviivan-lisaaminen-kaavioon-HA102809798.aspx.

Mundapa A.S.: Ocular inserts Kirjassa: Update on Polymers for Ocular Drug

Delivery, sivut: Toimittaja: Mundada A.S., iSmithers, Shrewsbury, GBR: 2011

Naes T, Isaksson T, Fearn T, Davies T: A user-friendly guide to Multivariate

Calibration and Classification, sivut:107,108,110,111,114,115,124,125,1. painos. NIR

Publicationas Chischester UK 2002

105

Nayak S.N, Sogali B.S, Thakur R.S: Formulation and evaluation of ph triggered in

situ ophthalmic gel of moxifloxacin hydrochloride. International Journal of Pharmacy

and Pharmaceutical Sciences. 4: 452-459, 2012

Negvesky G.J., Butrus S.I., Abifarah H.A, Yung C.L ja Yalkowsky S.H.: Ocular

Gelfoam Disc-Applicator for Pupillary Dilation in Human. Journal of ocular

pharmacology and therapeutics, 16(4) 311-316, 2000

Noonan K.Y, Beshire M, Darnell J, Frederick K.A. Qualitative and Quantitative

Analysis of Illicit Drug Mixtures on Paper Currency Using Raman Microspectroscopy.

Applied Spectroscopy 59: 1493–1497, 2005

Noonan K.Y, Tonge L.A, Fenton O.S, Damiano D.B, Frederick K.A. Rapid

Classification of Simulated Street Drug Mixtures Using Raman Spectroscopy and

Principal Component Analysis. Applied Spectroscopy 63: 742–747, 2009

Olds W.J, Sundarajoo S, Shelby M, Cletus B, Fredericks P.M, Izake E.M.

Noninvasive, Quantitative Analysis of Drug Mixtures in Containers Using Spatially

Offset Raman Spectroscopy (SORS) and Multivariate Statistical Analysis. Applied

Spectroscopy 66: 530–537, 2012

Pal I. ja Kanwar M: Ocular Preparations: The Formulation Approach. Drug

Development and industrial Pharmacy 28(5), 473–493, 2002

Patane M.A., Schubert W., Sanford T., Gee R., Burgos M., Isom W.P. ja Ruiz-Perez

B. Evaluation of Ocular and General Safety Following Repeated Dosing of

Dexamethasone Phosphate Delivered by Transscleral Iontophoresis in Rabbits.

Journal of ocular pharmacology and therapeutics, 29(8), 760-770, 2013

Peng C.-C. ja Chauhan A. Extended cyclosporine delivery by silicone–hydrogel

contact lenses. Journal of Controlled Release, 154, 267–274, 2011

Rajesh Goud N, Suresh K, Sanphui P, Nangia A. Fast dissolving eutectic

compositions of curcumin. International Journal of Pharmaceutics 439: 63–72, 2012.

Raman C.V. ja Krishnan K.S.: A New type of secondary radiation. Nature 121: 501-

502, 1928

106

Reed C. Recent technical advancements in blow-fill-seal technology. Bussines

briefing: Pharmagenerics 2002

Reed C. PharmaManufacturing.com 2008 Haettu internetistä

http://www.pharmamanufacturing.com/articles/2009/093.html

Rinnan Å, Berg, F.V.D, Engelsen S.B: Review of the most common pre-processing

techniques for near-infrared spectra. Trends in Analytical Chemistry, 28(10): 1201-

1222, 2009

Robinson J.R. ja Mlynek G.M: Bioadhesive and phase-change polymers for ocular

drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews 16: 45–50, 1995

Rudolph W.W ja Irmer G, Raman and Infrared Spectroscopic Investigations on

Aqueous Alkali Metal Phosphate Solutions and Density Functional Theory

Calculations of Phosphate–Water Clusters. Applied Spectroscopy 61: 1312–1327,

2007

Rupenthal, I.A. ja Alany R.G Ocular Drug Delivery Kirjassa: Pharmaceutical

Manufacturing Handbook: Production and Processes. Sivut: 750 Toimittaja Cox.

S.C., Wiley,Hoboken, NJ, USA: 2008.

Saerens L, Dierickx L, Lenain B, Vervaet C, Remon J.P, De Beer T: Raman

spectroscopy for the in-line polymer–drug quantification and solid state

characterization during a pharmaceutical hot-melt extrusion process. European

Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77: 158–163, 2011

Saettone M.F. Salminen L: Ocular inserts for topical delivery. Advanced Drug

Delivery Reviews. 16 95–106, 1995

Schell D: What You Should Know About Blow-Fill-Seal Technology. Pharmaceutical

online Haettu internetistä 17.12.2013: http://www.pharmaceuticalonline.com/doc/

what-you-should-know-about-blow-fill-seal-0001: 2010

Schwartz D.T: Raman Spectroscopy: Introductory Tutorial. haettu internetistä

23.11.2013: https://depts.washington.edu/ntuf/facility/docs/NTUF-Raman-Tutorial.pdf

2005

107

Sieg J.W. ja Robinson J.R.: Vehicle effects on ocular drug bioavailability I: Evalution

of fluorometholone. Journal of pharmaceutical sciences 64(6), 631-936, 1975

Simamora P., Nadkarni S.R., Lee Y.C. ja Yalkosky S.H.: Controlled delivery of

pilocarpine. 2. In-vivo evaluation of Gelfoam® device, International Journal of

Pharmaceutics, 170, 209–214, 1998

Singh ja Shah: Surface chemical aspects of ocular drug delivery systems. Kirjassa:

Ocular Therapeutics and Drug Delivery. Toimittaja Reddy I.K. sivut 40-41, Technomic

publication, Pensylvania, USA: 1996

Souza J.G., Dias K., Pereira A.T., Bernardi D.S. ja Lopez R.F.V: Topical delivery of

ocular therapeutics: carrier systems and physical methods. Journal of pharmacy and

pharmacology 1-24, 2013

Sutherland W.S, Laserna J.J, Angebranndt M.J, Winefordner J.D, Surface-Enhanced

Raman Analysis of Sulfa Drugs on Colloidal Silver Dispersion. Analytical Chemistry

62: 689–693, 1990

Townshend N., Nordon A., Littlejohn D., Myrick M., Andrews J. ja Dallin P.:

Comparison of the Determination of a Low-Concentration Active Ingredient in

Pharmaceutical Tablets by Backscatter and Transmission Raman Spectrometry.

Analytical Chemistry 82: 4671–4676, 2012

Vadnere M., Amoidon G., Lindenbaum S.,ja Haslam J.L. Thermodynamic studies on

the gel-sol transition of some pluronic polyols. International journal of Pharmaceutics,

22, 207-218, 1984

Van Santvilet L. ja Ludwig A: Determinants of eye drop size, Survey of

ophthalmology, 49(2), 198-213, 2004

Wang C, Vickers T.J, Mann C.K, Direct assay and shelf-life monitoring of aspirin

tablets using Raman spectroscopy. Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis 16: 87–94, 1997

Wang Y, Li YS, Zhang Z, An D, Surface-enhanced Raman scattering of some water

insoluble drugs in silver hydrosols. Spectrochimica Acta Part A 59: 589–594, 2003

108

Varghese H.T, Panicker C.Y, Philip D. Vibrational spectroscopic studies and ab initio

calculations of sulfanilamide. Spectrochimica Acta Part A 65: 155–158, 2006

Vergote G.J, De Beer T.R.M, Vervaet C. ym: In-line monitoring of a pharmaceutical

blending process using FT-Raman spectroscopy. European Journal of

Pharmaceutical Sciences 21: 479–485, 2004

Whyte W: Cleanroom Technology: Fundamentals of design, testing and operation

John Wiley & Sons Ltd, Baffins Lane 2001

Widjaja E ja Seah R.K.H. Application of Raman microscopy and band-target entropy

minimization to identify minor components in model pharmaceutical tablets. Journal

of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 46: 274–281, 2008

Wikström H, Lewis I.R, Taylor Lynne: Comparison of Sampling Techniques for In-

Line Monitoring Using Raman Spectroscopy. Applied spectroscopy, 59(7): 934-941

2005

Wilson CG, Zhu YP, Kurmala P, Rao LS, Dhillon B. Ophthalmic drug delivery.

Kirjassa: Drug Delivery and Targeting for Pharmacists and Pharmaceutical Scientists

sivut: 298–318. 300,301: Toimittajat Hillery AM, Lloyd AW, Swarbrick J. CRC Press,

Boca Raton, FL, USA: 2001.

Windbergs M, Haaser M, Mcgoverin C.M, Gordon K.C, Kleinbudde P, Strachan C.J.

Investigating the Relationship between Drug Distribution in Solid Lipid Matrices and

Dissolution Behaviour Using Raman Spectroscopy and Mapping. Journal of

Pharmaceutical Sciences 99: 1464–1475, 2010

Wirges M, Funke A, Serno P, Knop K, Kleinebudde P: Development and in-line

validation of a Process Analytical Technology to facilitate the scale up of

coating processes. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 78–79: 57–

64, 2013

Vueba M.L, Pina M.E, Batista de Carvalho L.A.E. Conformational Stability of

Ibuprofen: Assessed by DFT Calculations and Optical Vibrational Spectroscopy.

Journal of Pharmaceutical Sciences 97, 845–859, 2008

109

Zimmer A. ja Kreuter J.: Microspheres and nanoparticles used in ocular delivery

systems. Advanced Drug Delivery Reviews, 16, 61-73, 1995

110

LIITETAULUKOT Liitetaulukko 1. Raman-spektrikirjasto

Aine Erä Mittausajat Fluoresoi Spektri Valmistaja R* Tunnusomaiset piikit

Acetaminophen (Parasetamoli) 020M0203V 1,6 ei Hyvä Sigma-

Aldrich

X 390,651,797,857,1168,1237,1324,1370,1609,1647

Asetyylisalisyyliahappo 048K0015 1,6,12 ei Hyvä Sigma X 424,549,750,784,1044,1190,1292,1606

Bentsokaiini 116K0017 1,3,6 ei Hyvä Sigma X 862,1172,1280,1604,1681

Carbopoli 971P NF CC69LAJ260 1,6 osittain Tyydyttävä Noveon 499,837,1080,1320,1452,1663 (pyöreät piikit)

Carbopoli 974P NF CC76NAB668 1,6 osittain Tyydyttävä Noveon 492,828,10821318,1452,1659

(pyöreät matalat piikit korkea pohja)

Hydroksietyyliselluloosa 282553988 1,6 on Huono Fluka Ei tunnuspiikkejä

Ibuprofeeni IB1M485 1,6 ei Hyvä BASF corp X 636,745,833,1180,1206,1607

Kalsiumfosfaatti-dihydraatti pHEur B10941A 1,6,12 ei Tyydyttävä Emcopress

premium

389,415,587,896,983,1087,1127

Kalsiumsilikaatti 1344-95-2 1,6,30 osittain Tyydyttävä Huber 966,1350,1411

Klooripropamidi 031H0722 1,6 ei Hyvä Sigma 259,625,754,911,1084,1159,1587

Klotrimatsoli BCBB5668 1,6 ei Hyvä Sigma 266,317,446,620,659,1001,1033,1079,1156,1585

111

Kofeiini (vedetön) 81612 1,6 ei Hyvä Cheminent X 482,554,642,740,1327

Laktoosi Pharmatose 90M pH.Eur 10407255 1,3,6 osittain Hyvä DFE Pharma X 356,361,382,475,850,875,1085,1119,1140,1260,

Magnesiumkloridi 8xH2O 12341983420

5143 1,6 osittain Huono Fluka

572,1000,1583(Ei selkeitä vahvoja piikkejä)

Magnesiumstearaatti pH Eur 15883 1,2,3,4,

6,1AdVp osittain Hyvä

X 1062,1129,1295,1436,1456

Maissitärkkelys 129K0076V 1,6 Osittain Tyydyttävä Sigma-

Aldrich

477,865,937,1049,1079,1125,1335,1457

Mannitoli D (-) K262 1,6 ei Hyvä Prolabo X 475,875,1036,1132

Mefenaamihappo 055K1555 1,6 on Huono Sigma X 621,772,807,1037,1159,1243,1332(ei selkeitä

tunnistepiikkejä)

Methocel® MC 2864831289 1,6 on Huono Fluka 937,1095,1358,1446(ei selkeitä tunnistepiikkejä)

Mikrokiteinen selluloosa 50M pH.Eur 5S8571 1,3,6 on Huono EMCOCEL X 1091 (ei kunnollisia piikkejä)

Mikrokiteinen selluloosa 90M pH.Eur 9S1191 1,3,6 on Huono EMCOCEL X 1092 (ei kunnollisia piikkejä) isoin piikki

Mikrokiteinen selluloosa PH101

pH.Eur 60935C 1,3,6Vp on Huono Avicel

X 1092 (ei kunnollisia piikkejä)

Nikotiiniamidi 1380397 1,6 ei Hyvä Fluka X 385,785,1041,1596

Nitrofurantoiini 067K0737 1,6 on Hyvä Sigma X 1017,1169,1247,1348,1378,1492,1609

112

Parasetamoli 1005402-

2002 1,3,6 ei Hyvä Oriola

X 390,651,797,857,1168,1237,1324,1370,1609,1647

Polyetyleeniglykoli 044K0092 1,6 ei Hyvä Sigma X 277,361,533,843,(858),1061,(1124),1140,1231,1279,147

9

Polyvinyylipyrrolidoni BCBb7859 1,6 ei Hyvä Fluka 752,850,933,1018,1226,1424,1670

Propranololi HCL 95.334 1,6 ei Hyvä S.I.M.S X 488,736,760,1385,1443,1578

Pyratsiinikarboksamidi 068K1129 1,6 ei Hyvä Sigma 413,806,1024,1052,1453,1524,1577

Salisyyliamidi S51885-358 1,6 ei Hyvä Sigma-

Aldrich

X 562,746,1039,1125,1143,1166,1246,1432,1622

Salisyylihappo 097K3401 1,6 ei Hyvä Sigma-

Aldrich

X 451,566,772,1030,1153,1247,1323,1634

Sukroosi 40K0201 1,6 Osittain Hyvä Sigma X 401,524,548,639,849,920,1037,1124,1237,1461

Sulfadiatsiini 027k2064 1,3,6 ei Hyvä Sigma X 285,544,633,824,847,993,1097,1149,1598

Sulfameratsiini 068K1130 1,6 ei Hyvä Sigma X 546,633,819,838,998,1093,1151,1594

Sulfametasiini 118K0898 1,3,6 on Tyydyttävä Sigma X 577,635,823,840,996,1088,1142,1593

Sulfametoksatsoli 048K0124 1,6 on Tyydyttävä Sigma 291,544,687,830,924,1092,1142,1156,1507,1592

Sulfaniiliamidi 126K001 1,3,6 on Tyydyttävä Sigma X 296,561,633,819,840,897,1090,1134,1155,1593

113

Teofylliini vedetön 057K0691 1,6 ei Hyvä Sigma X 445,502,554,666,926,968,1248,1285,1314,1425,1663,17

04

Tiosalisyylihappo 106K3671 1,6 on Huono Sigma 801,1043,1121,1307,1562,1585(1043 piikki kunnollinen)

Tolbutamidi 058K1071 1,6 ei Hyvä Sigma 290,634,796,811,881,1093,1147,1159,1599

Trikalsiumfosfaatti 605044 1,6 ei Tyydyttävä Prolabo X 426,586,961 (ainoastaan 961 voimakas piikki.)

TriNatriumfosfaatti-dodekahydraatti A326478133 1,6 on Tyydyttävä Merck X 408,544,939,1000

*R: Aineelle löytyy kirjallisuudesta verrattava Ramanspektri

Liitetaulukko 3. Asetyylisalisyylihapon standardiliuosten valmistus kantaliuoksesta, suluissa laimennokseen käytetty pitoisuus ja lisätyn tislatun veden määrä.

Standardi ASA 0 ASA 1 ASA 2 ASA 3 ASA 4 ASA 5

Pitoisuus 50,2 mg/l 101 mg/l 201 mg/l 301 mg/l 402 mg/l 502 mg/l

Laimennusohje 1ml

(1004,8mg/l) + 19ml

1ml (1004,8mg/l)

+9 ml

2ml (1004,8mg/l)

+8 ml

3ml (1004,8mg/l)

+7 ml

4ml (1004,8mg/l)

+6 ml

5ml (1004,8mg/l)

+5 ml

114

Liitetaulukko 4. Salisyylihapon standardiliuosten valmistus kantaliuoksesta, suluissa laimennokseen käytetty pitoisuus ja lisätyn tislatun veden määrä.

Standardi SA 0 SA 1 SA 2 SA 3 SA 4 SA 5

Pitoisuus 5,038 mg/l l

37,785 mg/l

50,38 mg/l

75,57 mg/l

100,76 mg/l

151,14 mg/l

Laimennosohje 1ml

(50,38mg/l) + 9ml

5ml (151,14mg/l)

+ 15ml

1ml (1007,6mg/l)

+ 19ml

5ml (151,14mg/l)

+ 5ml

1ml (1007,6mg/l)

+ 9ml

3ml (1007,6mg/l)

+17 ml

Liitetaulukko 4. Kantaliuoksen valmistaminen asetyylisalisyylihapon ja dikalsiumfosfaatin seoksista ja laimentaminen edelleen spektrofotometrillä mitattaviksi näytteiksi

Näytteen ASA (%) 5 10 12,5 15 17,5 20 30 40

Näytteen paino (g) 1,0167 1,0214 1,000 1,0118 1,0030 1,0124 1,0150 1,0102

ASA:n teoreettinen pitoisuus (mg/l)

101,67 204,28 250 303,54 351,05 404,96 609 808,16

Mittausnäytteiden laimennosohje

– 5+5 4+6 3+7 3+7 5+15 2+8 2+8

Mittausnäytteiden ASA pitoisuus (mg/l)

(3 rinnakkaista näytettä) 101,67 102,14 100 91,062 105,315 134,987 121,8 161,632