PCRPCR 技术介绍技术介绍

Introduction to PCR TechnologyIntroduction to PCR Technology

济南艾迪康医学检验中心有限公司济南艾迪康医学检验中心有限公司

PCRPCR 实验室 实验室 杨超杨超

一一 . . DNADNA 结构和复制结构和复制

二二 . . PCRPCR

1. PCR1. PCR 发展简史 发展简史

2. 2. PCRPCR 基本概念 基本概念

3. 3. PCRPCR 原理原理

三三 . . 荧光定量荧光定量 PCRPCR 检测检测 HBVHBV

1. 1. 荧光定量荧光定量 PCRPCR 原理 原理 2. 2. 荧光定量荧光定量 PCRPCR 工作流程工作流程

3. 3. 荧光定量荧光定量 PCRPCR 结果分析 结果分析 4. 4. 荧光定量荧光定量 PCRPCR 应用应用

四四 .. 基因芯片技术平台基因芯片技术平台

—— ——HPV23HPV23 亚型检测技术亚型检测技术

主要内容主要内容

————DNADNA 结构结构

DNADNA 结构和复制结构和复制

H

O-

O O—CH2 TO=P—

O-

3′

5′

OH

H

O-

O O—CH2 CO=P—

O-

3′

5′

OH

O O—CH2

OH H

CO=P—

O

O-

3′

5′

AA ：：腺嘌呤腺嘌呤

GG ：：鸟嘌呤鸟嘌呤

CC ：：胞嘧啶胞嘧啶

TT ：：胸腺嘧啶胸腺嘧啶

碱基

磷酸核糖

———— 细胞内细胞内 DNADNA 复制复制

DNADNA 结构和复制结构和复制

1.DNA 双链的打开

2.引物酶合成 RNA 引物

3.DNA 聚合酶

延长子链

19851985 年，美国年，美国 PE-CetusPE-Cetus 公司的公司的 MullisMullis 等人发明了聚等人发明了聚

合酶链反应（合酶链反应（ PCRPCR ））

基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的 DNADNA 复制复制 最初采用最初采用 E-coli DNAE-coli DNA 聚合酶进行聚合酶进行 PCRPCR ，，由于该酶不由于该酶不

耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热耐热 DNADNA 聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得 PCRPCR 能高效率的进行，能高效率的进行，

随后随后 PE-CetusPE-Cetus 公司推出了第一台公司推出了第一台 PCRPCR 自动化热循环自动化热循环

仪仪 19931993 年，年， MullisMullis 等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖

聚合酶链反应的发明

聚合酶链反应聚合酶链反应 ((Polymerase Chain Polymerase Chain

Reaction)Reaction) 简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量

扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

PCR ——基本概念

PCR 基本原理

基本组成：

模 板 底 物 DNA 聚合酶 引 物 缓冲液 Mg2+

基本过程：

变 性 退 火（复性） 延伸

模板 DNA

引物 2

引物 1

95℃55℃72℃

Taq 酶

Taq 酶

第 1 轮结束

第 2 轮开始

DNA 模板DNA 引物TaqDNA 聚合酶dNTP缓冲液Mg2+

PTC-100 PTC-150 PTC-200

PTC-220 PTC-225

MJ Research, Inc.

PE-2400 PE-2700

PE-9600 PE-9700

ABS, Inc.

循环参数

循环参数是指 PCR 循环中每一步骤的温度、时间以及循环次数

1 ．变性温度和时间

2. 退火温度和时间

3. 延伸温度和时间

4. 循环数

PCR 反应基本过程

1 2 3 4 5

22

55

72

94

时间（ min ）

温度

（℃）

适温延伸3

高温变性1

低温退火2

重复 1~3 步25~30 轮

目的 DNA 片段扩增 100 万倍以上

DNA 双螺旋

DNA 单链与引物复性

DN

A

变性

形成2

条单

链 子链延伸DNA 加倍

平台期效应

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

所谓实时荧光定量所谓实时荧光定量 PCRPCR 技术，是指在技术，是指在PCRPCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个号积累实时监测整个 PCRPCR 进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量 PCR (Real-time PCR)

荧光定量 PCR 标记技术

1. TaqMan 探针技术

2. LightCycler 双探针技术

3. 其他

TaqManTaqMan 探针技术探针技术

LightCycler LightCycler 双探针技术双探针技术

标本的采集

标本的运送

标本的处理

基因扩增

扩增产物分析

工

作

流

程

工

作

流

程

荧荧

光光

定定

量量

PP

CC

RR

标本的采集

• 标本采集时间对扩增检测结果的影响• 标本采集部位的准备• 标本采集的类型和采集量• 采样质量的评价• 采样及运输容器• 标本采集中的防污染

标本采集时间对扩增检测结果的影响

在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚

都可能会给出假阴性结果都可能会给出假阴性结果

标本采集部位的准备

标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物

或其他杂物，但应适度，过度的清洁消毒有可或其他杂物，但应适度，过度的清洁消毒有可

能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的

准备应由训练有素的人员进行。准备应由训练有素的人员进行。

标本采集的类型和采集量

标本的类型和采集量应根据所测病原体而定标本的类型和采集量应根据所测病原体而定

TB 痰液

HBV 血清或 EDTA抗凝血浆 200ul

HPV

CT 宫颈或尿道分泌物

采样质量的评价

主要观察有无溶血，脂浊，异物等现象主要观察有无溶血，脂浊，异物等现象

采样及运输容器

标本的采集材料如棉签、注射器应为一次性使用标本的采集材料如棉签、注射器应为一次性使用

运输容器亦应为密闭的一次性装置运输容器亦应为密闭的一次性装置

采集标本所用的防腐剂、抗凝剂及相关材料不应采集标本所用的防腐剂、抗凝剂及相关材料不应

对核酸扩增及检测过程造成干扰对核酸扩增及检测过程造成干扰

严禁使用肝素抗凝严禁使用肝素抗凝

标本采集中的防污染

标本采集最好用一次性材料，不用处理便可直标本采集最好用一次性材料，不用处理便可直接使用接使用

采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等发、表皮细胞、痰液等

如使用玻璃器皿，必须经如使用玻璃器皿，必须经 250250°°CC干烤干烤 44小时或小时或用用 DEPCDEPC水处理，以使可能存在水处理，以使可能存在 RNAaseRNAase 失活失活

标本的稳定化处理

用于用于 DNADNA 检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定

化处理，但标本应及时送至实验室化处理，但标本应及时送至实验室

用于用于 RNARNA 检测的标本，由于检测的标本，由于 RNARNA 易受易受 RNARNA 酶的降酶的降

解，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆解，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆

按按 1:41:4 的比例加至含有的比例加至含有 55mol/L GITCmol/L GITC （（异硫氰酸胍异硫氰酸胍

盐）的试管中，从而使血清盐）的试管中，从而使血清 (( 浆浆 )) 中的中的 RNARNA 酶不可逆酶不可逆

失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即

可运送可运送。。

标本的运输

标本采集后必须尽快送至实验室标本采集后必须尽快送至实验室 经过适当稳定化处理的标本可在常温下运送（如经过适当稳定化处理的标本可在常温下运送（如

用于用于 DNADNA 扩增检测的扩增检测的 EDTAEDTA 抗凝全血标本及用抗凝全血标本及用于于

RNARNA 扩增检测的经扩增检测的经 GITCGITC 稳定化处理的标本）稳定化处理的标本）通通

常在运送时应采用不易破碎的容器装载标本常在运送时应采用不易破碎的容器装载标本 用于用于 RNARNA 检测的标本，如果未经稳定化处理，检测的标本，如果未经稳定化处理，则则

必须速冻后，放在干冰中运送必须速冻后，放在干冰中运送

标本的保存

临床体液标本如血清临床体液标本如血清 // 血浆等可于血浆等可于 -70℃-70℃下长时间贮下长时间贮

存存 用于用于 DNADNA 测定的已纯化核酸样本可在测定的已纯化核酸样本可在 1010mmol/L mmol/L

TrisTris ，，

1 mmol/L EDTA1 mmol/L EDTA 缓冲液缓冲液 ((pH 7.5-8.0)pH 7.5-8.0) 中中 4℃4℃保存保存 用于用于 RNARNA 测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中 -80-80

℃ ℃

或液氮中贮存；用乙醇沉淀的核酸样本贮存在或液氮中贮存；用乙醇沉淀的核酸样本贮存在 -20 ℃-20 ℃

即可；用即可；用 GITCGITC 处理的处理的 RNARNA 标本在室温可保存标本在室温可保存 77天天

实验室分区管理平面图

试剂准备区（Ⅰ 区）

使用所有试剂都已经准备好备用的商品试剂盒

时还需要试剂准备区吗？

试剂准备区的仪器设备主要有冰箱、超净台、

加样器、混匀器和离心机等。仪器除了要专用

外，还应有定期校准。

试剂的分装应在超净台中进行。

标本处理区（Ⅱ 区）

标本处理区内的生物安全柜、加样器、离心机、 恒温金属标本处理区内的生物安全柜、加样器、离心机、 恒温金属

浴、混匀器等设备都应使用次氯酸钠溶 液消毒，然后用蒸浴、混匀器等设备都应使用次氯酸钠溶 液消毒，然后用蒸

馏水或馏水或 70%70%乙醇洗涤去除残留的次氯酸钠乙醇洗涤去除残留的次氯酸钠

标本处理需在生物安全柜内进行，防止标本气溶胶的扩散标本处理需在生物安全柜内进行，防止标本气溶胶的扩散

在标本处理的全过程中都应戴一次性手套，并经常更换，在标本处理的全过程中都应戴一次性手套，并经常更换，

以避免因手套的污染导致的标本间的交叉污染以避免因手套的污染导致的标本间的交叉污染

实验时所用的加样器吸头都必须带有滤塞，以防止气溶胶实验时所用的加样器吸头都必须带有滤塞，以防止气溶胶

对加样器的污染对加样器的污染

基因扩增检测区（Ⅲ 区）

空白对照

阴性对照

弱阳性对照

标准品（四种不同浓度）

质控品

待测样本

结果分析

结果判断 (HBV)

1. 检测样本中 1.0× 103copies/ml≤ HBV DNA ≤4.2 × 109copies/ml ，测定结果有效，可直接报告拷贝数。

2. 检测样本中 HBVDNA> 4.2 × 109copies/ml ，既直接报告为 > 4.2 × 109copies/ml 。

3. 样本检测结果 < 1.0 × 103copies/ml ，拷贝数仅供参考，报告为 < 1.0 × copies/ml

4. 报告模式： 6.666E+06 ＝ 6.666 ×106 copies/ml

1. 传染性疾病：了解病原体对人体的感染情况，判断病 情或对某一种药物的疗效进行评估 2. 肿瘤研究：通过对癌基因或抑癌基因 mRNA 的表达数 量进行检测，来判断肿瘤的发病情况，还可以通过查 找基因的表达差异，推断发病机理 3. 其他（遗传病、环境监测、 SNP 分析等）

荧光定量 PCR 的应用

HBV DNA

乙型肝炎病毒

HBV DNA 定量检测的意义

判断肝病的病情、预后和传染性

预测抗病毒治疗的效果

监测和评价抗病毒药物的疗效

对于持续性感染的病毒性肝炎，病毒血症水平的消长与肝脏损害情况和预后相关。

随着病毒感染后肝脏病理损害的进展，病毒核酸逐渐在宿主血液中积蓄，直到发展为肝病晚期时，病毒血症也达到了最高水平，故如果病毒核酸水平升高表示病恶化，预后不良；水平降低说明向好的方向发展。

血中 HBV 核酸定量水平的高低，也是衡量传染性强弱的最直接量化指标。

判断肝病的病情、预后和传染性

血中病毒水平，对抗病毒药物的治疗效果，有预报的作用。

病毒水平降低，治疗效果好；

病毒水平升高，治疗效果差。

预测抗病毒治疗的效果

应用抗病毒药物（如干扰素、拉米呋啶等）治疗前和治疗过程中，应定量检测血中病毒水平，以判断病人对药物的应答情况，修正治疗方案和评价疗效。

监测和评价抗病毒药物的疗效

YMDD 突变株

YMDD: 酪氨酸蛋氨酸 天门冬氨酸 天门冬氨酸

YIDD 突变：蛋氨酸 亮氨酸

YVDD 突变：蛋氨酸 缬氨酸

基 因 芯 片 技 术 平 台

DNA芯片技术

以玻璃、硅片作为载体

以膜片作为载体

PCR技术 荧光定量 PCR PCR

基因芯片的基本构造探针

支持物

外观 剖面图 平面局部放大

DNA芯片的组成：

1: 支持物：如玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜

2: 探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的

基因芯片原理采集标本

提取基因组DNA/RNA

PCR/RT-PCR扩增

探针杂交 显色 / 扫描

电泳检测

玻璃片

膜 片

电泳图

DNA样品的获取和目的片段的 PCR扩增

扩增区域Biotin

Primer downPrimer upBiotin

PCR扩增和目的片段的标记

人乳头瘤病毒分型基因检测芯片

人乳头瘤病毒（ Human Papillomaviruses, HPV ）

双链 DNA无包膜病毒环状 DNA，约 8Kb

病毒颗粒直径为 50～ 55nm。

依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。

广泛分布在高等脊椎动物 有很高的种属特异性

定向感染皮肤及粘膜的复层鳞状上皮

型别与分布 已发现 100 多种不同的亚型，其中超过 40种可以感染人类的生殖器官，约 30种与肿瘤有关。 依据不同型别 HPV与肿瘤发生的危险性高低可分

1 ）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（ HPV 6、 11、 42等） 2 ）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（ HPV 16 、18、 31、 33、 35、 39 、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66及 68 等） 某些亚型有地理位置的差异

HPV与宫颈癌宫颈癌的病因学研究进展 ：

•早在十九世纪四十年代，一位意大利医生 Regoni

Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。•1977 年 Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（ Human papillomavirus， HPV）颗粒。•至 89年左右，约翰 .霍普金斯大学教授 Keerti Shah证实子宫颈癌与 HPV感染有直接关系。•1995 年世界卫生组织国际癌症研究所（ IARC）专题讨论会认为： HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。

HPV与宫颈癌的发生有 95% 以上的相关性 高危型 HPV的持续性感染，是女性宫颈癌发生

的主要原因。潜伏期在 1.5 到 5年左右 宫颈病变 CIN3组织切片中 HPV的检出率为 99.

7 ％

目前已经确定高危型 HPV的持续性感染是宫颈癌患病的关键病因

HPV与宫颈癌

HPV的致癌机理

HPV E6蛋白间接抑制 p53活性

HPV E7蛋白与 RB蛋白结合， RB蛋白不能抑制 E2F的转录而使细胞分裂增殖

HPV16-E5通过作用 CDK抑制剂 p27调节表皮生长因子受体信号转导途径

理想的宫颈癌的筛查方案

HPV 检测（－） ＋ 细胞学检查（－）

↓ 5—8 年复查

HPV 检测（＋） ＋ 细胞学检查（＋） HPV 检测（－） ＋ 细胞学检查（＋）

↓ ↓ 阴道镜检查 每年复查 ↓ ↑ 组织学检查 HPV 检测（＋） ＋ 细胞学检查（－）

人乳头瘤病毒分型基因快速诊断试剂盒

特点 快速诊断 HPV的感染，并鉴定 HPV亚型 可用于临床诊断和女性常规体检

技术先进性 应用 PCR技术和膜杂交技术可同时检测 18 种高危型和 5 种低危型 HPV 目前国内同类产品中分析检测通量最大

HPV33 、 35

HPV16 、 43

HPV分型检测基因芯片设计原理

保守区变异区 Primer up

Primer down

HPV16

HPV58

HPV16 、 43

HPV18

子宫颈癌与人乳头瘤病毒（ HPV）的研究进展

一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展

二、 HPV 的生物学研究

三、宫颈癌的筛查

宫颈癌－－最常见的妇科恶性肿瘤

据世界范围内统计，每年大约有 50 万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的 5% ，其中 80% 的病例发生在发展中国家。我国每年宫颈癌新发病例约13.15 万，占世界宫颈癌新发病例总数的 28.8% ，发病率仅次于乳腺癌位居第二。

随着筛查制度的建立，世界宫颈癌的发病率和死亡率已经大幅下降。我国由70 年代的 10.28/10 万下降到 90 年代的 3.25/10 万，但在高发病区，死亡率仍高居不下。

地区 死亡率 (/10 万）世界 8.00

中国 3.25

北京 2.54

上海 3.8

山西阳城 36.00

患病年龄更趋于年轻化（发病年龄提前到 45 岁），发病史缩短。如吉林省在 80 年代统计宫颈癌患者中小于 35 岁的妇女占 4.8 ％，而 2000 年已经占到 34.1 ％

子宫颈癌的危险因素：

行为危险因素：如性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、营养不良等；

生物学因素：如细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染。

目前仅有少量研究表明宫颈癌可能存在着家族聚集现象。

型别与分布

型别：已发现 100 多种不同的亚型（如果 DNA 序列同源性小于 90 ％，则定为新的亚

型）。其中超过 35 种可以感染人类的生殖器官，约 30 种与肿瘤有关。 11－ 37 ％的女性一生中会感染至少一次 HPV 。1 ）低危型：宫颈上皮内低度病变，引 起外生殖器湿疣等良性性病（ HPV

6 、 11 、 42 、 43 、 44 ） ；

2 ）高危型： 宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有 关（ HPV 16 、 18 、 31 、 33 、 35 、

39  、 45 、 51 、 52 、 53 、 56 、 58 、 59 、 66 、 68 、 73 、 83 及 MM4 ）；

3 ）中间型：不确定型。

分布：有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。HPV45 在非洲西部很常见， HPV39 和 59 在美洲中部和南部常见， HPV52 ， 58 在中国常见。在宫颈鳞状上皮细胞癌中以 HPV16 （占 51 ％），在腺癌和腺鳞癌中 HPV18 分别占 56％和 39 ％。

表 HPV 型别与宫颈病变

常见 HPV 型别 宫颈病变6， 11 湿疣， CIN I

16 CIN,

18 CIN

30 ， 40 ， 58， 69 CIN

31 ， 33 ， 35 ， 39 CIN

45 ， 51 ， 52 ， 56 CIN I

42 ， 43 ， 44 CIN I

53 正常宫颈上皮54 尖锐湿疣55 鲍温样丘疹病59 VIN

61 ， 62 ， 64 ， 67 VaIN

66 鳞癌70 外阴乳头状瘤

HPV 感染率

53%

15%

9%

6%

3% 14%

HPV16

HPV18

HPV45

HPV31

HPV33 Other

最常见的低危型（ HPV6 、 11

）

最常见的高危型（ HPV16 、 18

、 31 、 33 、 4

5 、 58 ）

宫颈癌患者中高危型 HPV 感染率

表 不同 HPV 亚型的检出频率统计表

 

注： 1.本表统计样本数为 1153 例，其中阳性样本数为 119 例； 由于检测样本中存在复合感染，故亚型的检出频率＝（该亚型的检出次数 / 所有亚型的检出次数） ×100

％，所有亚型检出次数为 226 。 2. 本表统计数据由深圳市计生中心提供， HPV 分型基因检测试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司提供。

2001 年版 TBS （ The Bethesda System)报告分类中常见的细胞学诊断宫颈癌前病变的几个术语解释：未见上皮内病变－－鳞状上皮细胞异常－－腺上皮细胞异常ASCUS （ Atypical Squamous Cells) ：非典型鳞状上皮细胞ASC-US:意义不明确的非典型鳞状上皮细胞ASC-H ：意义不明确的非典型鳞状上皮细胞不除外高度鳞状上皮内病变L-SIL ：低度鳞状上皮内病变－－－－ HPV 感染、 CIN I

H-SIL ：高度鳞状上皮内病变－－－－与 CIN II 、 CIN III或原位癌含义一致SCC ：鳞状细胞癌AGC （ Atypical Glandular Cells) ：非典型腺上皮细胞AIS （ Adenocarcinoma In Situ) ：腺原位癌CS ：腺癌

组织学检查的分类：CIN （ Cervical Intraepithelial Neoplasm) ：宫颈上皮内瘤变CIN I ：轻度不 典型增生 CIN II ：中度不 典型增生 CINIII ：重度不 典型增生、原位癌

正常妇女 HPV暴露

主要是性传播

感染几率： 4～ 15％

HPV

年龄 <30 岁

一过性， 80％

平均 8个月

年龄 >30 岁平均 6~24 个月

CIN I （组织学）

CIN II/III （组织学）

无细胞学改变 /HPV消除

子宫颈浸润癌

机体免疫机制

辅助致癌因素

潜伏感染期 亚临床感染期 临床症状期 HPV相关肿瘤期

5－ 10 年

图 HPV感染与宫颈病变的自然过程

病变

进展（恶化）持续（稳定）消退（逆转）

级别 单纯HPV CIN I CIN II CIN III

风险率 (%) 5 15 30 45

持续率 (%) 15 37 35 <56

消退率 (%) 80 57 43 32

表 CIN 级别发展为 CC 的风险评估

说明： CIN级别越高，其消退和逆转的机会越小。

筛查是早诊早治关键

临床提示，从 HPV 的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要 5-10 年。因此，必须采取适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有望最终根治。

美国肿瘤临床指导：性行为开始三年左右，不晚于 21 岁开始。每年筛一次。若 2～ 3 次 HPV 和细胞学筛查均为正常者，可延长筛查时间至 5-8 年。大于 70 岁，在 10 年内已有 3 次以上满意的细胞学检查和 HPV检查正常者，可停止

筛查。良性子宫切除患者不需要检查，否则，连续 3 年检查，可终止。

中国：筛查起始年龄可考虑为 25-30 岁， 65 岁以上可停止筛查。

表：筛查间隔时间与阳性病变风险系数表

筛查间隔时间（年）

1 2 3 3～ 5 5～ 10 >10

阳性病变风险系数

1 2 2.5 3 4 9

备注： 1～ 3 年筛查间隔比较安全，随着筛查间隔的增加，风险大幅度增加。

临床检查：如肉眼观察、阴道镜等 操作简便，但准确率和特异性有待提高（ 50-70 ％） 细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂

片、 LCT 、 TCT 等1 ）长期宫颈糜烂可导致宫颈上皮细胞形态变异，但非 HPV 引起的细胞形态异常与宫颈癌病

变没有直接联系。2 ）在感染早期，细胞往往不会出现形态变化，但此时 HPV 对细胞内遗传物质的损伤可能已

经产生。 病毒学检测： HPV DNA检测（ PCR 方法），常见方法有：基因芯 片

分型检测、荧光 PCR 等特异性强、灵敏度高， 操作简便快捷 (98%)

宫颈癌的常规临床检测方法

基本方案：肉眼观察＋冰醋酸试验（碘液试验）

一般方案： pap smear+HPV检测

最佳方案： TCT+HPV检测

中国癌症研究基金会（ CCRF ）筛查和早诊早治指南：

HPV 检测的应用领域：

一、宫颈癌的筛查

二、评估宫颈癌的治疗疗效

没有 HPV感染在 3 － 5 年内不会得宫颈癌

HPV感染＝宫颈癌

高危型 HPV持续感染是导致宫颈癌的主要原因

二、评估宫颈癌的治疗疗效

CIN 患者： 成功治疗率达 90～ 95 ％，复发率 10 ％；

比正常人发生浸润癌的几率高 4－ 5 倍；

危险期： 8年左右；

常规复查要求： 4－ 6个月，复查 HPV 、细胞学、阴道镜等。

　　一、过早有性生活的女性； 　　二、即使没有性生活，但年龄超过 21 岁的女性； 　　三、只要保持有性生活的女性，特别是年龄过了 30 岁以后的女性； 　　四、性伴侣超过 1 个的女性； 　　五、配偶有其他性伴侣的女性； 　　六、吸烟的女性； 　　七、 HIV （艾滋病病毒）感染者； 　　八、患有其他性传染疾病者； 　　九、正在接受免疫抑制剂治疗者； 　　十、有宫颈病变、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌等病史者。

宫颈癌的筛查是非常重要的，筛查的对象包括如下人群：

上述人群应该每年做一次宫颈癌筛查，在做筛查前要注意如下问题：

　　一、不要在月经期间做筛查；

　　二、注意在检查前 3天内不要冲洗阴道或使用阴道内药物；

　　三、 24 小时内不要有性生活，以免影响检查结果的准确性。