书书书

中国生物工程杂志!"#$%&'$()*+#%(,(-.! /011! 21"3#$14

!

/0

收稿日期$/011506506!!修回日期$/011507508

!

国家自然科学基金"8100124/#%军内&十一五'科技攻关项目

"09:1/7#%吉林省高新技术产业发展项目"/010#%长春市科技特派

员行动计划"03;<04#资助项目

!!

通讯作者!电子信箱$%$%-.$=>1/9?+(@(,$+#&%-78>192?+(@

新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证!

杜寿文1!/

!李!昌/

!!

!王宇航1!/

!任大勇1!/

!刘存霞1!/

!

孙丹丹/

!朱!娜/

!李!沂/

!秦艳青/

!金宁一/

!!

!

" 1 吉林大学畜牧兽医学院!长春!12009/#

"/ 军事医学科学院军事兽医研究所 全军基因工程重点实验室!长春!1201//#

摘要!目的! 构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体 ABCD/"并对其功能进行验证# 方

法!设计一个包含人巨细胞病毒启动子$"EBAF(@()*F%&<7启动子&信号肽基因&血凝素C表位基因

$GC%&多克隆位点区域$E"H%&+5@.+抗原表位&血小板来源的生长因子受体跨膜区域$IJ:KL<E%

及牛生长激素多腺苷酸化信号$':GA(,.C%等八种元素的表达盒"

$MNAF*OO$%-+&OO*))*

"

%"在其上下

游添加!"#

#

酶切位点后"进行人工化学合成"连接到克隆载体 A:G中得 A:G5

"

'用!"#

#

酶切 A:G5

"

"回收 1 200PA左右的片段"去磷后插入到 ABCD1的相应位点"!"#

#

及$%&

"

Q'()

#

酶切鉴定"获得新

型基因疫苗真核表达载体 ABCD/'然后以增强型绿色荧光蛋白$M:KI%为报告基因"将其分别构建至

两个不同的表达盒内"脂质体转染'G;5/1细胞"利用L<5I"L及荧光显微镜技术进行该载体的功能

验证# 结果! 两个表达盒内的M:KI基因在'G;5/1细胞均能高效表达"相互间不受影响"且新构建

的表达盒具有蛋白展示功能# 结论! 成功构建含双基因表达盒的新型基因疫苗真核表达载体

ABCD/"为多价JRC疫苗的研究奠定了坚实基础#

关键词!ABCD/!M:KI!双基因表达盒!功能验证

中图分类号!S789

!!JRC疫苗是继灭活疫苗%弱毒疫苗和亚单位疫苗

之后产生的一种新型疫苗!由于 JRC疫苗不仅能够激

活机体产生全面免疫应答"包括特异性的细胞免疫和

体液免疫应答#!而且具有较高的安全性!加之其制备%

生产工艺简单且易于储存!是当前疫苗研究的一个热

点和重点领域) 目前!已有针对 G'B

*1+

%GTB

*/+等病原

体引起的疾病及肿瘤*2+的基因疫苗的研究!有的已经

进入临床) 因为基因疫苗均是通过不同的载体运送至

机体内!从而载体是基因疫苗研究的关键) 目前常用

的真核表达载体有 A+JRC系 列 载 体% AJ$OA,&.%

ATLMH%*(等) 但上述载体或插入外源基因比较单一!

不能实现多基因表达(或含有 HB40 启动子!由于 HB40

启动子的引入!使载体可作为附加体在表达 HB40 大 <

抗原的细胞内复制!安全性降低*4+

) 为避免上述不足!

发展了基于 A+JRC2U1 的新型载体 ABCD1!去除了对

于外源基因在大肠杆菌中复制和在动物细胞内表达无

关的序列!最大限度的减小了载体上与人类基因组同

源及整合到染色体的可能性!该载体是经 KJC批准的

可用于人体的安全性真核载体!但该载体依然存在外

源基因插入的有限性这一不足)

因此!对 ABCD1 进行改造!即在其基础上再添加

一个具有外源基因展示功能的表达盒!构建含有双基

因表达盒的真核表达载体 ABCD/!不仅可达到构建多

价疫苗的需要!而且可以使表达的外源基因展示到细

胞表面!更有利于刺激机体产生免疫应答) 新添加的

表达盒包含八种元素!即来源于人巨细胞病毒""EB#

增强型启动子% <7 启动子%分泌信号肽%血凝素C表位

"GC#%+5@.+抗原表位%血小板来源的生长因子受体跨

膜区域"IJ:KL<E#%牛生长激素多腺苷酸化信号

/011!21"3# 杜寿文 等$新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证

"':GA(,.C#!多克隆位点区域"E"H#位于 GC与 +5

@.+之间) 该表达盒具有将表达蛋白分泌并锚定在细

胞膜表面的能力) 将新设计的表达盒连到 ABCD1 上!

然后以增强型绿色荧光蛋白"M:KI#为报告蛋白!验证

新构建的载体的表达功能!为多价 JRC疫苗的研究奠

定基础)

!"材料与方法

!#!"菌种!质粒和细胞

大肠杆菌菌株 *+,-&.JG6

$

%质粒 ABCD1%ABCD15

M:KI% AEJ18<5M:KI及 'G;5/1 细胞由本研究室

保存)

!#$"试剂与仪器

限制性核酸内切酶!"#

#

%/01

#

%'2#

#

%34&

"

%'()

#

等!<4 JRC连接酶!MN<&V酶等均为<&;&L&公司产

品(碱性磷酸酶为 '$(,&PO公司(JRC凝胶回收试剂盒

为CDW:MR公司产品(EME为 G.",(%*公司产品(胎

牛血清购自天津灏洋生物制品科技有限公司(质粒小

量制备试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司(

X$A(Y*+)&@$%*

<E

/000 脂质体为 T%Z$)F(-*% 产品(反转录

酶E[EXB购自 IF(@*-&公司(总 LRC提取试剂盒为

上海生工生物工程有限公司产品(荧光显微镜为

\,.@A]O公司产品!核酸浓度测定仪购自<#*F@(公司)

!#%"表达盒的设计与合成

基于所设计表达盒的特性!选用了八种不同的结

构组分!序列如图 1 所示) 其中!7 9̂0/PA 为人巨细胞

病毒启动子 " "EB AF(@()*F#( 944 ^992PA 为 <7

AF(@()(FQAF$@$%-O$)*(742 8̂06PA 为信号肽区域!可引

导外源蛋白分泌至细胞膜(809 8̂2/PA 为血凝素 C表

位"G*@&--,])$%$% C*A$)(A*#(822 8̂3/PA 为多克隆位

点区域"E"H#!在对 ABCD1 载体序列进行分析的基础

上设计!依次为561

#

%$%&

"

%7&1

#

%/,1

#

%/01

#

%'2#

#

%/1,

"

%/1&

#

%/(6

#

%/)#

#

( 832 3̂//PA 为 +5@.+抗

原表位(3/9 1̂ 076PA 为血小板来源的生长因子受体

跨膜区域"IJ:KL<E#(1 088 1̂ 207PA 为牛生长激素

多腺苷酸化信号"':GA(,.C#基因) 并在上述基因序

列两端添加 !"#

#

酶切位点 "879793#!基因全长

1 212PA!送上海捷瑞生物工程有限公司合成!命名为

A:G5

"

)

!#&"'()*$ 的构建与鉴定

小量提取 A:G5

"

质粒!并用 5.:_

%

进行鉴定) 而

后用 !"#

#

酶切 A:G5

"

!回收 1 200PA 大小的片段

"

"

#!去磷后!将其连接至用相同酶切的 ABCD1 载体

上!转化*+,-&.JG6

$

!挑单克隆菌落!小量提取质粒!

用!"#

#

酶切鉴定正确后再用 $%&

"

Q'()

#

双酶切鉴定

插入序列的正反向!将新构建的载体命名为 ABCD/!并

对新添加的酶切位点进行分析)

!#+"含有报告基因,-./的质粒构建与制备

用34&

"

Q'()

#

双酶切 ABCD15M:KI!用 /01

#

Q'2#

#

双酶切 AEJ18<5M:KI!分别回收约 760PA 左右的片

段!并将其分别克隆入 ABCD/ 载体对应的酶切位点之

间!即将M:KI分别连入 ABCD1 原表达盒和新构建的

表达盒中!命名为 ABCD/5M:KI1 和 ABCD/5M:KI/)

转化*+,-&.JG6

$

!挑单克隆菌落!小量提取质粒!分别

用34&

"

Q'()

#

%/01

#

Q'2#

#

对重组质粒进行鉴定)

常规方法大量制备 ABCD/5M:KI1 和 ABCD/5

M:KI/ 质粒!并用 40`IM:80005E-",

/

进行纯化) 分

光光度计法检测重组质粒的浓度及 \J

/90

Q\J

/80

值!

\J

/90

Q\J

/80

值介于 1U8 /̂U0 时质粒可用于细胞转染)

!#0"体外表达检测

用 6`胎牛血清的 EME培养 'G;5/1 细胞!转染

前于 9 孔细胞培养板中加入 'G;5/1 细胞"1 a10

6 个Q

孔#!待细胞生长至 80` 3̂0`融合时!取 4

&

-重组质

粒 " ABCD/5M:KI1% ABCD/5M:KI/ #! 利 用

X$A(Y*+)&@$%*

<E

/000 脂质体转染 'G;5/1 细胞!同时设

质粒载体 ABCD/ 对照) 27b%6`"\

/

环境下培养

48#!荧光显微镜下观察是否有绿色荧光)

!#1"234/52鉴定

重组质粒转染'G;5/1 细胞!方法同 1U9!48# 后应

用总LRC提取试剂盒提取细胞总 LRC!在反转录酶的

作用下反转录成 +JRC!以此为模板扩增 M:KI基因

"上游引物$ ---CC<<"C":":<"<<CC:C<::<:C:"

CC:::":C::C:( 下 游 引 物$ --"<:"C:":C<

":"<":C:<<C"<<:<C"C:"<":<""C<#!在转录水

平鉴定M:KI在'G;5/1 细胞中的表达)

$"结"果

$#!"'()*$ 构建与鉴定

将合成的表达盒插入到 ABCD1 载体上的!"#

#

酶

切位点处"图 /#!构建含两个基因表)

达盒的真核表达载体 ABCD/) $%&

"

Q'()

#

鉴定结

果显示"图 2#!新添加的表达盒与 ABCD1 上原表达盒

的方向一致!并用 561

#

%$%&

"

%7&1

#

%/,1

#

%/01

#

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'2#

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%/1,

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#

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#

%/)#

#

对新添加的酶切位点

61

中国生物工程杂志 "#$%&'$()*+#%(,(-. B(,U21 R(U3 /011

图 !"新设计表达盒结构模式及序列图

.678!"9:;<=:<;>?@A>BCDAE>F<>D=>@G:H>D>I>J';>EE6@D=CEE>::>A>E67D>A

"&# H)F]+)]F*@(_*,(Y)#**NAF*OO$(% +&OO*))*"P# H*V]*%+*(Y)#**NAF*OO$(% +&OO*))*

91

/011!21"3# 杜寿文 等$新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证

进行分析"图 4#!结果显示以上限制性内切酶中除 /,1

#

外均可把 ABCD/ 线性化且为单一条带!表明所设计

酶切位点有效且可用)

图 $"质粒 '()*$ 的构建图

.678$"5@DE:;<=:6@D@G'BCE?6A'()*$

图 %"'()*$ 酶切鉴定

.678%"KA>D:6G6=C:6@D@G'()*$ LM ;>E:;6=:6@D

>DNM?>A67>E:6@D

E$ JX/000 JRCE&F=*F( 1$ABCD/ _$-*O)*_ P.$%&TTQ'()T( /$

ABCD/ _$-*O)*_ P.!"# T

图 &"'()*$ 酶切位点鉴定

.678&"KA>D:6G6=C:6@D@G:H>;>E:;6=:6@D

>DNM?>E6:>E6D'()*$

E$

'

5*,-<14

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_$-*O)JRCE&F=*F( 1 1̂0$ ABCD/ _$-*O)*_ P.

561

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#

( 11$ ABCD/ A,&O@$_

$#$"'()*$4,-./!O'()*$4,-./$ 的构建与鉴定

将M:KI分别克隆到 ABCD/ 的34&

"

和'()

#

%/01

#

和 '2#

#

位点处!并用相应的限制性内切酶进行鉴

定"图 6!图 9#!条带大小均与理论值相符!表明构建

成功)

图 +"'()*$4,-./! 酶切鉴定

.678+"KA>D:6G6=C:6@D@G'()*$4,-./! LM

;>E:;6=:6@D>DNM?>A67>E:6@D

1$ ABCD/5M:KI1 _$-*O)*_ P.34&

"

Q'()

#

( E1$ JX/000 JRC

E&F=*F( E/$

'

5*,-<14

#

_$-*O)JRCE&F=*F( /$ ABCD/5M:KI1

图 0"'()*$4,-./$ 酶切鉴定

.6780"KA>D:6G6=C:6@D@G'()*$4,-./$ LM

;>E:;6=:6@D>DNM?>A67>E:6@D

E1$ JX/000 JRCE&F=*F( 1$ A BCD/5M:KI/ _$-*O)*_ P./01

#

Q

'2#

#

(E/$

'

5*,-<14

#

_$-*O)JRCE&F=*F( /$ ABCD/5M:KI/

$#%"'()*$ 的功能验证

ABCD/5M:KI1 和 ABCD/5M:KI/ 分别转染 'G;5

/1 细胞!对 ABCD/ 中两个表达盒的表达功能进行验

证!同时设 ABCD/ 阴性对照和 ABCD15M:KI阳性对

照) 荧光显微镜下!转染 ABCD/5M:KI1 和 ABCD/5

M:KI/ 质粒的细胞均有大量的绿色荧光"图 7!图 8#)

结果证明!新添加的表达盒能够成功表达外源基因!且

不影响原表达盒的表达功能) 另外!从荧光图 8 中亦

71

中国生物工程杂志 "#$%&'$()*+#%(,(-. B(,U21 R(U3 /011

可以看出!新表达盒表达的M:KI蛋白可以提呈到细胞

表面"箭头所示#!提示新添加的表达盒具有蛋白分泌

与靶向锚定作用)

图 1",-./在PQR4$! 细胞中的表达

.6781":H>>J';>EE6@D@G,-./6DPQR4$!=>BBE

"&# :F**% Y,](F*O+*%)(YABCD/5M:KI1 )F&%OY*+)*_ $%)('G;5

/1+*,,O" P# :F**% Y,](F*O+*%)(YABCD/5M:KI/ )F&%OY*+)*_ $%)(

'G;5/1+*,,O"+#:F**% Y,](F*O+*%)(YABCD15M:KI)F&%OY*+)*_

$%)('G;5/1+*,,O"_#R*-&)$Z*+(%)F(,

图 S"绿色荧光蛋白展示在细胞表面"$TT U#

.678S"V6E'BCM @G7;>>DGB<@;>E=>D:';@:>6D@D

PQR4$! =>BBE<;GC=>"$TT U#

"&# :F**% Y,](F*O+*%)(YABCD/5M:KI1 )F&%OY*+)*_ $%)('G;5

/1+*,,O" P# :F**% Y,](F*O+*%)(YABCD/5M:KI/ )F&%OY*+)*_ $%)(

'G;5/1+*,,O

$#&"234/52鉴定 ,-./基因在 PQR4$! 细胞中的

转录

提取转染重组质粒细胞的总 LRC!经逆转录反应

制备成+JRC!以此为模板扩增M:KI基因"图 3#!两种

重组质粒转染细胞L<5I"L产物与阳性产物大小相符!

提示M:KI基因在'G;/1 细胞中得到有效转录)

图 W",-./基因?2X)234/52产物

.678W"3H>234/52';@A<=:@G,-./?2X)

1$ L<5I"LAF(_]+))#&)ABCD/5M:KI1 c&O)F&%OY*+)*_ $%)('G;5

/1+*,,O( /$ L<5I"LAF(_]+))#&)ABCD/5M:KI/ c&O)F&%OY*+)*_

$%)('G;5/1+*,,O( 2$ M:KIA(O$)$Z*+(%)F(,( 4$ ABCD/ %*-&)$Z*

+(%)F(,( 6$ R*-&)$Z*+(%)F(,( E$ JX/000 JRCE&F=*F

%"讨"论

JRC疫苗即基因本身!在体内表达目的抗原!诱发

机体的细胞和体液免疫应答) 研究表明!表达分支杆

菌属抗原"MHC<59#JRC疫苗免疫小鼠可激发<#1Q<#/

混合型免疫应答反应!表达$

[晶体蛋白和超氧化物歧

化酶C的 JRC疫苗可诱导小鼠分泌高水平的 TKR5

(

!

上述两种疫苗免疫土拔鼠之后可有效抵抗结核菌

G27LZ的感染*6+

) 以 ABCD1 为载体构建的含TX518 的

KEJBJRC疫苗 ABTL5I1/CTX18 [2"免疫小鼠和猪!

可刺激机体产生针对KEJB的特异性中和抗体和 "<X

杀伤效应!对于 KEJB感染具有保护能力*9+

) 以

A+JRC2U1 为载体在小鼠体内表达胰岛素样生长因子

结合蛋白 7"T:K'I7#通过促进细胞凋亡和降低血管内

皮细胞生长因子"BM:K#的表达量而抑制黑色素瘤的

生长*7+

) 目前!已有多种 JRC疫苗进入临床试验研究

阶段!如 HCLH JRC疫苗 " BL"5HLHJRC016 [005

BI#

*8+

%流感 JRC疫苗"B"X5479/%B"X54786 等#

*3+

%

GTBJRC疫苗"MI5GTB51030#

*10+等在#

期临床试验中

显示出较好的免疫或治疗效果!JRC疫苗能发挥其作

用!载体是必可或缺的)

然而!目前常用的载体普遍存在外源基因插入限

制性!安全性低等弊端!因此为了适应多价 JRC疫苗

的构建及增强其免疫效果!多构建双启动子的表达载

体!然而启动子之间的相互干扰可能影响所携带的不

同基因的转录%表达*11+

) 研究中构建的真核表达载体!

81

/011!21"3# 杜寿文 等$新型双基因表达盒真核载体的构建及功能验证

含有两个相互独立的表达框!各自具有其独有的启动

子!可插入不同的抗原基因或基因佐剂!也避免了原质

粒载体限制性酶切位点的限制!实现了不同的抗原基

因和基因佐剂在同一个质粒上在细胞内表达!而互不

影响!从而保证了不同表达蛋白构象的正确性!且可将

抗原展示在细胞表面) 图 1 中显示!新构建的表达盒

由 8 种组分构成!"EB增强Q启动子来自于人巨细胞病

毒的启动子!是一种安全性较高的真核启动子!使目的

蛋白得到高水平有效表达*1/+

(<7 启动子序列有利于基

因体外定向转录(E"H 上游融合有鼠 T-

)

链前导序列!

指引靶向蛋白进入分泌途径*12+

(另外E"H 上下游还分

别插入了血凝素C附加表位"GC#和原癌基因表位"+5

@.+#!与目的蛋白构成融合蛋白!便于通过免疫印迹和

免疫荧光技术用 1/"C6 单克隆抗体和抗 @.+抗体检测

目的蛋白*14516+

(血小板来源的生长因子受体"IJ:KL#

跨膜区将表达蛋白锚定在细胞膜上!展示在细胞外

侧*19+

("末端为牛生长激素"':G#多腺苷酸化信号!有

利于基因的转录终止*17+

) 图 7 以M:KI作为报告基因

对两个表达盒的功能进行了验证!均具有高效的蛋白

表达能力!图 8 显示出新设计的表达盒具有蛋白分泌

及靶向锚定于细胞膜的作用)

研究成功构建了双基因表达盒的真核表达载体

ABCD/!且具有蛋白展示和锚定于细胞表面的功能!目

前正在利用该载体进行多价艾滋病治疗性疫苗及流感

通用核酸疫苗的相关研究)

参考文献

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A+JRC2U15T:K'I7 $%#$P$)O@*,&%(@&-F(c)# $% @$+*)#F(]-#

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