Molekulārās metodes mikrobioloģijā

2013.04.26. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

1

Molekulārās metodes Molekulārās metodes mikrobioloģijāmikrobioloģijā

Teorija 5.

Polimerāzes ķēdes reakcija

(PCR)


2

PCR


3

PCR


4

PCR


5

DNS izdalīšana no gela

PCR1 + PCR2 + H2O

1 : 1 : 8 =

= N2

Agarozes gels: E)


6

DNS izdalīšana no gela

PCR1 + PCR2 => PCR3

bez praimeriem

PCR3 + H2O

1 : 9 = N7

Agarozes gels: E)


7

PCR

N2 N7


8

PCR - metode noteiktu, nelielu (līdz 2 kbp) DNS fragmentu pavairošanai.

PCR pamatā ir ciklizēta DNS sintēze in vitro.

PCR tiek izmantoti dabīgo DNS replikācijas sistēmu elementi.

PCR nav noderīga visa organisma genoma pavairošanai.

PCR


9

Izmantojot PCR var:

Izdalīt un pavairot vajadzīgo DNS fragmentu no kompleksiem nukleīnskābju maisījumiem,

Analīzei nepieciešamo DNS fragmentu iegūt vajadzīgajā daudzumā no neliela apjoma vai stipri bojāta izejmateriāla.

(1 => 1 000 000)

PCR


10

Vairumā gadījumu PCR ir tikai metode DNS pavairošanai.

Lai analizētu PCR iegūto DNS fragmentu ģenētisko informāciju, nākas izmantot citas molekulārās bioloģijas metodes.

PCR


11

Riboze

Purīnu vai pirimidīnu bāzeFosfodiestera

saite

DNS pavediena uzbūves shema

Nukleotīds


12

Purīnu bāzes:

Purīns

Adenīns (A) Guanīns (G)

- ūdeņraža saite - glikozīdiskā saite


13

Pirimidīnu bāzes:

Pirimidīns

Citozīns (C) Timīns (T)


14

nodrošina DNS sintēzi pēc matrices principa.

Adenīns (A) Timīns (T)

Bāzu komplementaritāte


15

Guanīns (G) Citidīns (C)




16

A T T A

G C C G




17

5’

3’ 5’

3’



18



19

Parastos apstākļos DNS pastāv divpavedienu formā.

Ūdeņraža saišu veidošanās starp komplementārajām bāzēm ir enerģētiski izdevīga.

Ūdeņraža saišu pārraušana ir DNS denaturācijas procesa pamatā.

Ūdeņraža saišu atjaunošanos starp komplemen-tārajām bāzēm sauc par DNS renaturēšanos.

DNS


20

nukleotīdi, izmantojot ūdeņraža saišu veidošanos starp komplementārajām bāzēm,

saistās pie vienpavediena matrices un

pēc tam tiek polimerizēti, veidojot jaunu DNS pavedienu.

DNS sintēzes laikā


21

GTCCGAAGTATCGAGGAAGCTCCGTA

nepieciešama vienpavediena DNS matrice.

CAGGCTTCATAGCTCCT||| || ||| ||| ||| || || ||| || || || ||| ||| || ||| ||| || | | |||

T G

A

C

T

CT

T

T

TA

A

A

A

A

GC

C

C

C

C

C

G

G

G

G

G

Tāpēc DNS sintēzei


22

Ja pret nukleotīdu matricē nostājies tam komplementārais nukleotīds:

• Izveidojas ūdeņraža saites• Nukleotīds šajā vietā uzkavējas ilgāk• Nukleotīds atrodas pareizā telpiskā novietojumā

Šādus apstākļus izmanto DNS polimerāze, lai katalizētu jaunas fosfodiestera saites izveidi.

DNS sintēze


23

Vienpavediena DNS var iegūt (DNS var denaturēt):

• Ar stipri sārmainu vidi (pH>10)• Ar paaugstinātu temperatūru (virs 90o C)• Izmantojot molekulas, kuras ar purīna vai pirimidīna bāzēm labi veido ūdeņraža saites -

• urīnviela,• formamīds,• SSB proteīni (vienpavediena DNS saistītājproteīni)

DNS sintēze


24

DNS polimerāzes

ir enzīmi, kas

- katalizē DNS molekulas sintēzi no

- dezoksiribonukleotīdtrifosfātiem (dNTP)

- pievienojot tos jau esoša DNS pavediena 3’ gala hidroksil-grupai,

- katalizējot fosfodiestera saites izveidi.

DNS polimerāzes


25

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice5`-TGCATGCA-OH 3`

Bioloģiskajās sistēmās vienmēr:• DNS sintēze notiek virzienā no 5’ gala uz 3’ galu.

• DNS polimerāze pa matricu pārvietojas virzienā no 3’ gala uz 5’ galu.

DNS polimerāzes


26

darbības ātrums optimālos apstākļos ir

50 - 500 nt. / sekundē

E. coli genoms (4*106 bp.) replicētos 2 stundās.

Cilvēka genoms (3*109 bp.) replicētos 694 dienās

(ja nebūtu dalīts atsevišķās hromosomās).

DNS polimerāžu


27

pēc izmantotās matricas iedala:

DNS atkarīgās DNS polimerāzēs, kuras DNS sintezē uz DNS matrices.

RNS atkarīgās DNS polimerāzes, kuras par matricēm izmanto RNS molekulas.

DNS polimerāzes


28

Kā izejas bloki DNS sintēzei tiek izmantoti dezoksiribonukleotīdu trifosfāti (dNTP), kuri satur divas makroerģiskās fosfātu anhidrīdsaites.

dNTP = dATP + dCTP + dGTP + dTTP

Makroerģiskā saite starp unfosfātu grupām tiek izmantota DNS sintēzes enerģijas iegūšanai.

DNS polimerāzes


29

OH

OH

DNS sintēze


30

O

OH

DNS sintēze


31

piemīt ne tikai DNS polimerāzes aktivitāte, bet arī eksonukleāzes aktivitātes.

Eksonukleāze DNS pavediena noārdīšanu katalizē no polimēra brīvā gala (pretstatā endonukleāzēm).

Daudzām DNS polimerāzēm


32

DNS polimerāzes

Var būt divu veidu eksonukleāzes aktivitātes:

5’=>3’ eksonukleāze

3’=>5’ eksonukleāze

Eksonukleāzes aktivitātes atkarībā no polimerāzes pielietojuma var būt gan noderīgas, gan traucējošas.


33

DNS polimerāzes

- 5’=>3’ eksonukleāzes aktivitāte

- attīra ceļu DNS polimerāzei no veciem DNS pavediena gabaliem.

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice5`-TGCATGCA-3` GGCATGCA


34

DNS polimerāzes

- 3’=>5’ eksonukleāzes (“proofreading” aktivitāte)

- labo pieļautās DNS sintēzes kļūdas.

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice5`-TGCATGCT-3`

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice5`-TGCATGC-3`

T


35

DNS sintēzes kļūdas

DNS satāvā ietilpstošajās heterocikliskajās bāzēs var notikt īslaicīga elektronu un protonu pārgrupēšanās, kā rezultātā veidojas bāzu tautomērās formas.

Tautomēro formu rašanās biežums un pastāvēšanas ilgums nosaka, ka katrā laika momentā tautomērajā formā ir:

1 no 104 līdz 1 no 105 bāzēm.


36

Bāzu tautomērās formas

A C T C

A G T G

Heterociklisko bāzu tautomēro formu pastāvēšanas laikā iespējama to nepareiza pārošanās (komplementaritāte):


37

3' => 5' eksonukleāzes aktivitāte

izlabo lielāko daļu bāzu tautomērijas radīto kļūdu.

Tomēr, lai sasniegtu in vivo vērojamo DNS sintēzes precizitāti (1 kļūda uz 109 nt.) nepieciešamas vēl citas kļūdu labošanas sistēmas.


38

3' => 5' eksonukleāzes aktivitāte

ja uz matrices uzsintezēti tikai daži nukleotīdi, polimerāzes 3’=>5’ ekzonukleāzes aktivitāte nevar veiksmīgi izpausties,

tādēļ lielākā daļa DNS polimerāžu uzsāk sintēzi tikai no labi sapārota nukleīnskābju pavediena brīva 3’ gala.


39

RNS vai DNS praimeris (ierosa)

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice5` -C-OH 3`

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrice5`-TGCATGCA-OH 3`

DNS polimerāzes


40

In vivoPar praimeri kalpo 10 - 20 nt. gara RNS molekula,

kuru sintezē īpašs enzīms -

preimāze - DNS atkarīga RNS polimerāze.

PCR

Par praimeriem izmano sintētiskus 10 - 30 nt. garus DNS oligonukleotīdus.


41

DNS replikācija In vivo


42

PCR Priekšvēsture

Pavairojot divpavediena DNS, galvenās problēmas sagādā DNS denaturācija:

• Helikāze un SSB proteīni in vitro nav veiksmīgi izmantojami - sistēma kļūst pārāk sarežģīta.

• Sārmaina vide, urīnviela, formamīds, augsta temperatūra - inaktivē DNS polimerāzes.


43

PCR Priekšvēsture

Sākotnēji DNS sintēziei in vitro raudzīja izmantot

E. coli DNS Polimerāzi I un tās atvasinājumus.

Tam vairāki iemesli: • E. coli labi raksturots mikroorganisms, ātri un viegli

savairojams, iegūtas drošas līnijas,• Enzīmu veido viena polipeptīda molekula (109 kDa).• Labi aprakstītas enzīma izdalīšanas un attīrīšanas

metodes.


44

DNS polimerāzes

E. coli DNS polimerāze I (DNS Pol I)

No viena polipeptīda sastāvošs enzīms ar molekulmasu 109 kDa.

E. coli DNA Pol I piedalās DNS reparācijā un arī replikācijā (bet nav galvenais DNS replikācijas enzīms).


45

DNS polimerāzes

DNS Pol I piemīt visas 3 aktivitātes:

- DNS polimerāzes;

- 5’=>3’ eksonukleāzes;

- 3’=>5’ eksonukleāzes (“proofreading” aktivitāte).


46

DNS polimerāzes

E. coli DNS polimerāzes I citi pielietojumi: • DNS polimerāzes aktivitāti izmanto, lai sintezētu

komplementārās DNS (cDNS) otro pavedienu.• Izmanto DNS iezīmēšanai ar nik-translācijas

(nick-translation) metodi.


47

DNS polimerāzesKlenova fragments

Iegūst 1974. gadā, šķeļot E. coli DNS Pol I ar proteāzi - subtilizīnu, ko iegūst no Bacillus subtilis

5’=>3’ eksonukleāzes aktivitāti nosakošais proteīna domēns atrodas N-galā un to iespējams atdalīt, saglabājot tikai C-daļu ar polimerāzes un 3’=>5’ eksonukleāzes aktivitāti, kā tas vērojams Klenova fragmenta gadījumā.


48

DNS polimerāzesKlenova fragments

Patlaban Klenova fragmentu iegūst ekspresējot E. coli klonētu DNS Pol I gēnu, kas kodē tikai nepieciešamo proteīna daļu.


49

DNS polimerāzes

Klenova fragmentu izmanto:• DNS fragmentu galu 5’ pārkaru aizpildīšai

• DNS fragmentu galu iezīmēšanai, lietojot

[-32P]dNTP


50

DNS polimerāzesKlenova fragmenta izmantošana:

• DNS nukleotīdu secības noteikšanai (sekvenēšanai) pēc Sangera didezoksiterminatoru metodes;

• 3’=>5’ eksonukleāzes aktivitāti var izmantot, lai “strupinātu” DNS fragmentu 3’ pārkares, kuras veidojas pēc DNS šķelšanas ar dažām restriktāzēm;


51

DNS polimerāzesKlenova fragmenta izmantošana:

• iezīmētu DNS fragmentu sintēzei ar nejaušo praimeru metodi (random priming);

• dažādiem mērķiem - otrā DNS pavediena sintēzei par matricu izmantojot vienpavediena DNS u.c.


52

3`-ACGTACGTA-5`5`-TGCATGCATN

DNS polimerāzesKlenova fragments exo-

Saglabāta tikai polimerāzes aktivitāte, bet trūkst abas ekzonukleāžu aktivitātes.

Neder DNS fragmentu galu 5’ pārkaru aizpildīšanai, jo nespecifiski pievieno 1 nukleotīdu 3’ galā, veidojot neprognozējama veida pārkaru.


53

DNS polimerāzesKlenova fragments exo-

Piemērots

- DNS fragmentu iezīmēšanai,

- DNS sekvenēšanai,

- komplementārās DNS (cDNS) otrā pavediena sintēzei.


54

DNS polimerāzesT4 DNS polimerāze

Tai ir:

- DNS polimerāzes un

- 3’=>5’ ekzonukleāzekāes aktivitāte.

Eksonukleāzes aktivitāte ievērojami spēcīgāka kā Klenova fragmentam.


55


Izmanto

DNS fragmentu 3’ pārkaru strupināšanai

DNS fragmentu 5’ pārkaru aizpildīšanai (līdzīgi kā Klenova fragmentu)


56


Izmanto DNS fragmentu 3’ galu iezīmēšanai ar aizvietošanas reakciju


57

DNS polimerāzes

T7 DNS polimerāze un sekvenāze

Piemīt tādas pat aktivitātes kā T4 DNS polimerāzei, bet tā ir aktīvāka (ātrdarbīgāka).

Ar T7 polimerāzes modifikāciju

izveidots DNS sekvenēšanai piemērots enzīms sekvenāze.


58

DNS polimerāzesSekvenāze

Ķīmiski vai ģenētiski modificējot izveidoti divi enzīmi:

- sekvenāze I un

- sekvenāze II.

Tiem nepiemīt ekzonukleāzes aktivitāte un

- tie labāk izmanto nukleotīdu analogus (modificētus nukleozīdtrifosfātus).


59

PCR Priekšvēsture

DNS sintēzei tika izmantots sekojošs risinājums.

Sagatavo reakcijas maisījumu:• Polimerāzei nepieciešamo vidi (Bufersistēma, sāļi,

BSA)• Praimerus• dNTP• divpavediena DNS matricu.


60

PCR PriekšvēstureMaisījumu vispirms uzkarsēja līdz 95oC temperatūrai, lai panāktu DNS

denaturēšanos un iegūtu vienpavediena matrices jaunā pavediena sintēzei.

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGTGCAAGTCT-5`5`-TGCATGCATGCATGCATGCATGCACGTTCAGA-3`

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGTGCAAGTCT-5`5`-TGCATGC

ATGCATGCAT

GCATGCACGT

TCAGA-3`


61

Tad atdzesēja, lai sāktos DNS renaturācija.

Tā kā praimeri ir īsi un pievienoti salīdzinoši lielā skaitā, tie atrod un saista sev komplimentārās sekvences ātrāk, nekā matrices DNS pagūst renaturēties.

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGTGCAAGTCT-5`5`-TGCATGCA-OH 3`

5`-TGCATGCATGCATGCATGCATGCACGTTCAGA-3`3` OH-GCAAGTCT-5`

5`-TGCATGCA-OH 3`5`-TGCATGCA-OH 3`

3` OH-GCAAGTCT-5`

3` OH-GCAAGTCT-5`

PCR Priekšvēsture


62

Tad pievienoja kādu no E. coli DNS polimerāzēm

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGTGCAAGTCT-5`5`-TGCATGCA-OH 3`

5`-TGCATGCATGCATGCATGCATGCACGTTCAGA-3`3` OH-GCAAGTCT-5`

PCR Priekšvēsture


63

Un inkubēja polimerāzei vajadzīgajā temperatūrā (37oC)

3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGTGCAAGTCT-5`5`-TGCATGCATGCATGCATGCATGCACGTTGAGA-3`

5`-TGCATGCATGCATGCATGCATGCACGTTCAGA-3`3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGTGCAAGTCT-5`

PCR Priekšvēsture


64

Tādā veidā bija iespējams vajadzīgo DNS posmu 2x pavairot. Taču to nevarēja uzskatīt par efektīgu in vitro DNS pavairošanas metodi, jo atkārtojot DNS denaturācijas soli iepriekš pievienotā DNS polimerāze zaudēja savu aktivitāti.

Mēdza arī šādu 3 soļus ciklu atkārtot (ciklizēt), taču pēc katras denaturācijas vajadzēja pievienot jaunu polimerāzi. Tā rezultātā:

• palielinājās tilpums,• mainījās koncentrācijas,• uzkrājās denaturētā polimerāze un glicerols.

PCR Priekšvēsture


65

Apvērsums notika, kad (1983. - 1984. , Cetus Corp., ASV, K.B.

Mullis) zinātniekiem radās ideja sākt izmantot termofīlo un hiper-termofīlo mikroorganismu DNS polimerāzes, kuras veiksmīgi pārcieš augsto DNS denaturācijas temperatūru, nezaudējot savu enzimātisko aktivitāti.

PCR Priekšvēsture


66

Termostabilās DNS polimerāzes

Par PCR metodi 1993. Gadā

saņem Nobela prēmiju

ķīmijā.

Kary Mullis

Saiki et al. (1985). Enzymatic

amplification of -globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230, 1350-1354.


67


Vēsturiski pirmā termostabilā DNS polimerāze tika iegūta no eibaktērijas Thermus aquaticus 70-to gadu beigās.

Šī baktērija tika atrasta jau 1966. gadā - Jelovstonas nacionālā parka karstajos avotos.


68


T. aquaticus optimālā augšanas temperatūra ir 70 - 72o C, bet maksimālā ~80o C.


69


DNS atkarīgās DNS polimerāzes,

katalizē DNS pavedienu sintēzi paaugstinātā temperatūrā,

(termofīlo un hipertermofīlo organismu DNS polimerāzes)

Termostabilo DNS polimerāžu pielietojums strauji attīstās pēc PCR metodes izstrādes (1983. - 1984. gadi, Cetus Corp., ASV, K.B. Mullis)


70


No Thermus aquaticus iegūst Taq polimerāzi.

EC 2.7.7.7

Taq polimerāzei piemīt:

- 5’=>3’ polimerāzes aktivitāte,

- neliela 5’=>3’ ekzonukleāzes aktivitāte,

- nav 3’=>5’ ekzonukleāzes (proofreading) aktivitātes.

Vidēji 1 kļūda uz 3 500 sintezētiem nukleotīdiem.


71

T. aquaticus kultivēšana ir dārga (lēni aug, jāuztur 70oC temperatūra).

Tagad tiek piedāvāta rekombinantā Taq Pol, kuru iegūst no ģenētiski modificētām E. coli baktērijām.

Šī polimerāze identiska dabīgajai, vienīgi to neiesaka darbam ar E. coli DNS, jo polimerāzes šķīdumā varētu parādīties zīmes no E. coli DNS.



72


Taq Pol

Izmanto:

- DNS fragmentu amplificēšanai,

- DNS fragmentu iezīmēšanai,

- sekvenēšanai.


73


Taq polimerāze amplificētajiem DNS fragmentiem 3’ galā nespecifiski pievieno A nukleotīdu.

Klonējot PCR produktus, kas amplificēti ar Taq polimerāzi, tiem:

- jāstrupina gali,

- jālieto PCR praimeri ar restrikcijas saitiem,

-jāizmanto speciāli vektori ar vienpavediena T pārkarēm 3’ galos.


74


Vent polimerāze no Thermococcus litoralis (arhebaktērijas), kas dzīvo dziļūdens vulkānu atveru tuvumā.

Temperatūras optimums ir 72 - 80o C, bet maksimums ir ~98o C.


75


Vent polimerāze

Piemīt arī:

- 3’=>5’ ekzonukleāzes (proofreading) aktivitāte, kas nodrošina mazāku kļūdu skaitu

(1 kļūda no ~20 000 nt.)

Paaugstināta termostabilitāte un precizitāte, salīdzinot ar Taq Pol


76

Termostabilās DNS polimerāzesPfu polimerāze no Pyrococcus furiosus

(arhebaktērija)

Temperatūras optimums ~75o C, maksimums >98o C;

piemīt arī 3’=>5’ ekzonukleāzes aktivitāte.

Pfu polimerāze pieļauj vismazāk kļūdu DNS sintēzē

(1 kļūda no ~ 40 000 nt.)


77


Pfu polimerāze piemērota precīzai DNS fragmentu amplifikācijai.

Tā ir stabilāka par Taq polimerāzi.

Amplifikācijā sintezē DNS fragmentus ar strupiem galiem, kas derīgi tūlītējai klonēšanai.


78

Termo-izturīgā polimerāze iztur daudzkārtīgu DNS denaturēšanu.

DNS sintēzi var ciklizēt un ar katru ciklu DNS daudzums +/- pieaug pēc ģeometriskās progresijas (1-2-4-8-16-32-64-128-256-512)

PCR veikšanu var uzticēt programmējamam termostatam, kurš 1,5 - 3 stundu laikā paveic savu uzdevumu.

PCR priekšrocības


79

Mainot praimerus, reakcijas komponentu koncentrācijas un PCR programmu, iespējams vajadzīgo DNS fragmentu izdalītu no:

• liela genoma,• kompleksiem DNS maisījumiem,• ļoti maziem paraugiem.

PCR priekšrocības


80

Tipiskā PCR ciklā

izšķir 3 soļus:

1. DNS denaturācija,

2. Praimeru saistīšanās (hibridizācija, annealing)

3. DNS sintēze (extension).


81

DNS denaturācija

Nepietiekamas denaturācijas gadījumā praimeri nevarēs saistīties ar komplementāro DNS matricas vietu un sintēzes uzsākšanās būs mazefektīva.

Parasti tiek lietoti denaturācijas apstākļi:

30 sek. 95oC vai 15 sek. 97oC


82

Lieka pārkarsēšana samazina polimerāzes aktivitāti.

Taq Pol "pusdzīves laiks" (laiks, kurā zūd 50% no enzīma sākotnējās aktivitātes) atkarīgs no izmantotās DNS denaturēšanas temperatūras:

92oC tas ir 2 stundas

95oC tas ir 40 minūtes

98oC tas ir 5 minūtes

DNS denaturācija


83

Uzsākot PCR vēlams veikt garāku karsēšanu (2-5 min. 94oC), lai labāk veiktu matrices denaturāciju.

Tālākajos ciklos par sintēzes matricēm galvenokārt kalpo iepriekšējos ciklos iegūtie PCR produkti, kuri ir salīdzinoši īsi un denaturējas ātrāk.

DNS denaturācija


84

Praimeru saistīšanās

Laiks un temperatūra ļoti atkarīga no praimeru garuma, sekvences un koncentrācijas reakcijā.

Uzsākot lietot jaunu praimeru pāri, šie lielumi parasti jāoptimizē. Nereti apstākļu optimizācuja nepieciešama arī reakciju pārnesot uz citu PCR inkubatora modeli vai sākot lietot cita veida reakcijas buferi.


85

Parasti izmanto:

temperatūru no 55oC līdz 70oC,

laiku: 15 sek. līdz 1 min.

praimeru koncentrāciju reakcijā: 0,2 µM



86

Pirmajā tuvinājumā vajadzīgo temperatūru izrēķina no praimeru sekvences.

Vispirms izrēķina preimeru kušanas temperatūru (Tm):

Tm=2x[A+T]+4x[C+G]

Saistīšanās temperatūra ir ~ par 5oC zemāka nekā Tm.



87

Ja temperatūra pārāk liela, PCR iznākums samazinās vai PCR produkta vispār nav.

Ja temperatūru pārāk maza, praimeri sāk saistīties pie matrices sekvencēm, kuras ar vienu vai dažiem nukleotīdiem atšķiras no īstās mērķsekvences un parādās nespecifiski blakus produkti.



88

54oC 57oC 60oC


Dažādas praimeru hibridizācijas temperatūras


89

Sintēzes laiks atkarīgs no PCR produkta garuma un izmantotās temperatūras.

Parasti lieto 30 sek. līdz 1 min.

Taq Pol optimālā darbības temperatūra noteikta 72oC, to arī parasti lieto.

Paredzamais sintēzes ātrums 35 - 100 nt. sekundē.

DNS sintēze


90

Ja praimeru saistīšanās temperatūra ir ap- vai augstāka par 65oC, iesaka abus pēdējos soļus apvienot - izmantot divsoļu PCR. Taču nedaudz pazeminātā temperatūrā sintēzes ātrums būs mazāks un tai atvēlētais laiks jāpagarina.

Pēc pēdējā cikla iesaka veikt beigu sintēzes soli - 3-5 min. 72oC, lai līdz galam uzsintezētos visi DNS pavedieni, kuri palikuši pussintezēti.

DNS sintēze


91

Atkarīgs no tā, cik daudz amplificējamās mērķsekvences paņemtas uz PCR, un cik labi optimizēti PCR apstākļi.

Testējot jaunu PCR sistēmu vēlams pārbaudīt arī vēlamo ciklu skaitu, ik pēc noteikta ciklu skaita reakcijas iznākumu pārbaudot elektroforētiski.

Ciklu skaits


92

Mērķsekveņču Ciklu

skaits skaits

300 000 25 - 30

15 000 30 - 35

1 000 35 - 40

50 40 - 45

Ciklu skaits


93

Ciklu skaitu palielināt virs 50 nav mēķtiecīgi, jo ilgajā inkubācijas laikā būs izlietoti vai bojāti reakcijas resursi (DNS, dNTP, polimerāze).

Ja PCR produkti nav detektējami vai to iznākums neliels, vaina meklējama citā sistēmas vietā.

Ciklu skaits


94

PCR programmas piemērs

Sākuma denaturācija

Denaturācija

Praimeru

saistīšanās

Sintēze

Beigu sintēze

35 cikli

Dzesēšana


95

PCR tilpums

Lielā mērā visi PCR programmas inkubēšanas laiki atkarīgi no reakcijas tilpuma, jo daudz laika prasa tilpuma uzsilšana/atdzišana līdz vajadzīgajai temperatūrai.

Sākumā par PCR standart-tilpumu uzskatīja 100 µl. Tagad jau ļoti daudzi PCR taisa 20 vai 10 µl tilpumā.


96

Mazāks tilpums -

• īsāku laiku jāinkubē,

• procesi stobriņā notiek sinhronāk (temperatūra ātrāk izlīdzinās visā reakcijas tilpumā),

• mazākas izmaksas

• lielāka produktu specifika.

PCR tilpums


97

Parasti PCR veic 0,5 vai 0,2 ml stobriņos.

Labāk izvēlēties speciālos PCR stobriņus, jo tiem plānākas sieniņas, kuras labāk pieguļ termoblokam, ātrāk pārvada siltumu uz reakcijas tilpumu.

PCR tilpums


98

Eļļa PCR PCR PCR

Termostats 94oC

105oC

PCR ar un bez eļļas klājuma

"Karstā vāka" PCR

Liela temperatūra stobriņa augšgalā kavē ūdens iztvaikošanu, novērš tā kondensāciju pie vāciņa, neļauj palielināties sāļu koncentrācijai reakcijas maisījumā.


99

PCR maisījuma pagatavošana

Gatavojot PCR maisījumu parasti nākas kopā jaukt kādus 7 šķīdumus.

Ja gatavo 20 µl reakcijas pa vienai, var rasties lielas pipetēšanas kļūdas.

Tāpēc parasti gatavo “master miksu” vairākām reakcijām, tad to sadala pa reakciju stobriņiem un katrai reakcijai pievieno citu amplificējamo DNS matrici.


100

“Master miksa” pagatavošana

• Izrēķina reakciju kopējo tilpumu un cik kādi šķīdumi jāņem.

• Samaisa kopā šķīdumus, kuru daudzums visām reakcijām ir vienāds.

• Miksu sadala pa PCR stobriņiem.• Katram stobriņam pievieno vajadzīgo DNS

paraugu.• Miksu un reaģentus ārpus ledusskapja tur ūdens

vannā ar ledu vai dzesējošā statīvā.


101

PCR “miksa” sastāvdaļas

Savie- Sākotnējā Beigu koncentrācija

nojums koncentrācija reakcijā

H2O - līdz vajadzīgajam tilpumam

Buferis 10x 1x

MgCl2 25 mM 1-5 mM

Preimeri (katrs) 10 µM 0,2 µM

dNTP mix 10 mM 20 - 200 µM

Taq Pol. 5 U/µl 0,5 - 5 U/100µl

DNS 2 - 250 ng/100µl


102

Tā kā ar PCR palīdzību analizējamus DNS daudzumus var sintezēt no vienas vai dažām DNS matrices molekulām, visiem šķīdumiem un ūdenim jābūt absolūti tīriem no DNS pēdām.

Lai kontrolētu to tīrību, parasti katrai reakciju sērijai veic negatīvo kontroli (visas sastāvdaļas, tikai DNS vietā pievieno ūdeni).



103

• Iesaka lietot dejonizētu H2O

• PCR buferis tiek piegādāts komplektā ar DNS polimerāzi.

• MgCl2 - komplektā ar polimerāzi, sākot lietot jaunu praimeru pāri, nepieciešama MgCl2 koncentrācijas optimizēšana.



104

• Preimeru maisījumu pasūta atbilstoši amplificējamai sekvencei,

• preimerus pasūta firmās vai laboratorijās, kuras veic to sintēzi.

• Simetriskā PCR maisījumā praimeru molārajai attiecībai jābūt 1:1.



105

• dNTP maisījumu parasti pērk rūpnieciski pagatavotu.

Var gatavot saviem spēkiem, bet ir pagrūti visus četrus trifosfātus nolīdzsvarot identiskās molārajās koncentrācijās. Glabājams pie -20oC.

• Taq Pol. Iegādājas firmās.

Glabājams pie -20oC. Lai enzīmu nebojātu ledus kristāli, tas atrodas nesasalstošā glicerola šķīdumā.



106

Piesārņojuma draudi

• PCR reakcijas un reaģentus var neglābjami piesārņot ar jebkuru materiālu, kuršs satur DNS.

• Īpaši bīstami ir iepriekš iegūtie PCR produkti.

• Efektīgākaie veidi cīņai pret piesārņojumu ar nevēlamu DNS– dažādi PCR etapi veicami nošķirtās telpās,

– katrā telpā ir savs iekārtu un instrumentu komplekts,

– telpas / darba vietas regulāri apstaro ar īsviļņu UV starojumu.


107

Piesārņojuma draudi

DNS ekstrakcija

PCR mikss

PCR PCR produktu

analīze

paraugi

rezultāti

Vienvirziena plūsma laboratorijas telpās - cīņai pret piesārņojumu


108

PCR termostati

Biometra

Hybaid MJresearch

Perkin Elmer

Stratogene Eppendorf


109

PCR gēnu inženierijaiLai atvieglotu PCR iegūto DNS fragmentu klonēšanu,

un

novērstu Taq polimerāzes pievienoto 3` gala A pārkaru radītās problēmas,

bieži lieto praimerus ar 5` gala pagarinājumiem, kuros ievietots kāds rets restrikcijas enzīma saits.


110

PCR gēnu inženierijai

3`-TACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGT..5`- TGCCTGCAGGCATGCATGCATGCATGC

PstI


111

PCR gēnu inženierijaiTaču jātceras, ka daudzi restrikcijas enzīmi nav spējīgi

atpazīt savu ierasto DNS šķelšanas sekvenci, ja tā atrodas DNS molekulas galā vai tuvu tam.

Tādēļ vēlamo restrikcijas saita sekvenci nevar novietot praimera pagarinājuma pašā 5` galā.


112


3`- ACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGT..5`- TGCCTGCAGGCATGCATGCATGCATGCATGCA..

PstI


113


5`- TGCNNNNNNGCATGCATGCATGCATGC

Enzīms n % pēc 2h % pēc 20h

BamHI 1 10 25

2 >90 >90

HindIII 2 0 0

3 10 75

Restriktāžu aktivitāte atkarībā no DNS molekulas gala tuvuma.

n


114


Enzīms n %2h %20h

EcoRI 1 >90 >90

NotI 2 0 0

4 10 10

6 10 10

8 25 90

10 25 >90

% - % no parastās enzīma aktivitātes (kad šķelšanas vieta atrodas tālu no DNS molekulas galiem, aktivitāte - 100%)


115

Mutaģenēze


116

Mutaģenēze

Mutācija - iedzimstoša izmaiņa organisma ģenētiskajā materiālā.

Nejaukt ar replikācijas kļūdām.

Plašā nozīmē - jebkura DNS izmaiņa (arī hromosomu komplektācijas).

Šaurā nozīmē - dažu nukleotīdu nomaiņa, delēcija, insercija.


117

Mutaģenēze

Mutaģenēze - iedzimstošu izmaiņu veidošana organisma ģenētiskajā materiālā.

Mutagēns - viela vai faktors, kas būtiski palielina ģenētisko izmaiņu rašanās iespējas organismā.

Saitspecifiskā mutaģenēze - iepriekš izplānotu iedzimstošu izmaiņu veidošana noteiktā genoma vietā (saitā).


118

Mutaģenēze

Mutāciju iegūšana ar mutagēniem ir nespecifiska.

Šūnas tiek apstrādātas ar mutagēniem faktoriem (ķīmiskiem savienojumiem vai jonizējošo, UV starojumu)

Mutantus atlasa pēc izmaiņām to fenotipā vai genotipā.


119

Mutaģenēze

Lielākā daļa gēnu inženierijā izmantoto E. coli līniju ir cēlušies no celma K-12, tajā nespecifiski veidojot mutācijas.

Nespecifisku mutagēnu izmantošanu ierobežo:

- sarežģītā mutantu atlase,

- grūti paredzamais mutācijas raksturs (nukleotīda nomaiņa, delēcija, insercija, inversija).


120

Mutaģenēze

Gēnu inženierijas eksperimentos bieži nepieciešams iegūt noteikta veida mutācijas noteiktās genoma vietās.

Saitspecifisko mutaģenēzi izmanto:• izmainot gēnu nukleotīdu secību, lai iegūtu proteīnus

ar noteiktu aminoskābju nomaiņu;

• ieviešot jaunus restrikcijas saitus;


121

Mutaģenēze

• pētot gēnu ekspresijas regulācijas mehānismus -

- izmainot regulatoro elementu sekvences,

- izmainot regulatoro proteīnu aminoskābju

sekvences.


122

Mutaģenēze

Oligonukleotīdu virzītā mutaģenēze.

Izmanto oligonukleotīdus, kas komplementāri noteiktai genoma daļai, bet satur arī nepieciešamo mutāciju.

- Hibridizē mutāciju saturošo oligonukleotīdu ar DNS molekulu, kurā grib izveidot mutāciju un,

- izmantojot DNS polimerāzi un oligonukleotīdu kā praimeri, sintezē komplementāro pavedienu, kas saturēs mutāciju.


123

MutaģenēzeAgrāk mutaģenēzei parasti izmantoja vienpavediena

DNS, kuru ieguva no fagmīdām vai M13 bakteriofāga.

• Vienpavediena DNS hibridizē ar mutanto praimeri un sintezē otro DNS pavedienu izmantojot DNS polimerāzi;

• Jaunizveidoto DNS pavedienu cirkularizē ar ligāzi un neizmantotās vienpavediena DNS matricas sašķeļ ar vpDNS specifiskām nukleāzēm.


124

Mutaģenēze

• Transformē baktēriju šūnas ar hibrīdo DNS

(mutantais pavediens/matricas pavediens),

• DNS šūnā replicējas un izveido gan mutantas, gan izejas plazmīdas molekulas.


125

MutaģenēzeIzmantojot cirkulāru vpDNS un oligonukleotīdu.

niks


126

Mutaģenēze

Problēma varētu būt mutanto molekulu atlase.

Iespējas, kā palielināt mutanto molekulu atlases efektivitāti:

• sašķelt mutāciju nesaturošo matricas DNS ar nukleāzēm, apstākļos, kad mutantā DNS netiek šķelta;

• veikt mutaģenēzi ar PCR palīdzību un mutāciju

saturošo DNS fragmentu attīrīt no matricas.


127

Mutaģenēze

Populārākās mutaģenēzes metodes:• sēru saturošu (P vietā) nukleotīdu izmantošana

mutantās DNS molekulas sintēzei un matricas šķelšana ar nukleāzēm (Amersham “Sculptor” mutaģenēzes koimplekts);

• izejas DNS šķelšana ar nukleāzēm, kas šķeļ tikai metilētu DNS (Stratagene “QuickChange” mutaģenēzes kits);

• PCR mutaģenēze.


128

Ar sēru aizvietoto nukleotīdu izmantošana

• vpDNS matrica, mutāciju saturošs oligonukleotīds; dNTPS, nukleotīdi, DNS polimerāze, DNS ligāze;

• komplemetārā pavediena sintēze, neizmantotās vpDNS matricas šķelšana;

• mutāciju nesaturošās ķēdes šķelšana ar restriktāzi, kas veido vienpavediena pārrāvumus, un ExoIII;

• mutantai ķēdei komplementārās DNS sintēze un transformācija


129

Stratagene “QuickChange” mutaģenēzes kits

• izmanto 2 mutāciju saturošus komplementārus praimerus, metilētu divpavedienu plazmīdu DNS un Pfu DNS polimerāzi;

• Plazmīdu DNS denaturē, hibridizē praimerus un sintezē komplementāros pavedienus.

• Denaturāciju un sintēzi atkārto vairākkārt;

• iegūtās dpDNS molekulas satur vp pārrāvumus katrā pavedienā, kuri netraucē transformāciju;

• matricas DNS tiek šķelta ar restriktāzi DpnI, kura šķeļ tikai metilētu DNS;

• ar jaunsintezēto mutanto DNS transformē E. coli šūnas un atlasa mutantos klonus.


130

Mutaģenēze

Metožu salīdzinājums:

sēru saturošo nukleotīdu metode:

- laikietilpīga,

- nepieciešama vpDNS,

- relatīvi zema efektivitāte,

- lielas izmaksas.

Produktam bez mutācijas starp transformētajām šūnām nevajadzētu būt.


131

Mutaģenēze

Metožu salīdzinājums:

“QuickChange” metode:

- galvenais trūkums ir nepieciešamība vairākas reizes kopēt visu plazmīdu, kas var radīt nevēlamu mutāciju veidošanos plazmīdas struktūrā.

- metode ir ātra,

- iespējams veikt arī bez komerciālā kita.

Produktam bez mutācijas starp transformētajām šūnām nevajadzētu būt.


132

Mutaģenēze

PCR mutaģenēze:

Izmanto DNS amplifikāciju ar praimeriem, kas satur mutācijas;

Mutācijas tiek iegūtas, izmantojot jebkuru DNS kā matricu;

Mutāciju saturošos PCR produktus nepieciešams klonēt vektorā, kas pagarina mutācijas iegūšanu laiku.

Pastāv vairākas PCR mutaģenēzes modifikācijas, kas ļauj ieviest dažādas mutācijas jebkurā DNS molekulas vietā.


133

PCR mutaģenēze:

• Visērtāk izmantojama, ja mutācijas radīšanas vietai tuvumā ir unikāls restriktāzes saits;

• izmanto 2 praimerus, no kuriem viens ir mutants;

• veic PCR, attīra PCR fragmentu, kas satur mutāciju, šķeļ PCR fragmentu ar restriktāzēm un sašķelto fragmentu klonē atbilstošā vektorā.


134

PCR mutaģenēze:• ja izmainamā rajona tuvumā piemērotu

restrikcijas saitu nav...• izmanto 2 mutantos praimerus un divus

malējos praimerus; • paralēli veic 2 PCR reakcijas ar 2

praimeru pāriem un attīra PCR fragmentus;

• veic trešo PCR reakciju, izmantojot malējos praimerus un pirmo 2 PCR reakciju produktus kā matricas;

• Pirmo 2 PCR produktiem pārklājas mutanto praimeru rajons, tie savstarpēji hibridizējas un polimerāze pagarina DNS ķēdes;

• tālāk notiek parasta PCR reakcija, fragmentu attīra, šķeļ un klonē.


135

MutaģenēzePCR mutaģenēze:• praimeri - 5’ gals var nebūt komplementārs matricai,

bet 3’ galā vajag komplementārus 10 - 15 nt; • polimerāzes - ieteicams izmantot Pfu vai Vent

polimerāzes, kuras pieļauj mazāk kļūdu; • matricas DNS - ieteicams palielināt sākotnējo

matricas DNS skaitu un samazināt PCR ciklu skaitu, lai mazinātu kļūdainas amplifikācijas iespēju;

• PCR apstākļi - ieteicams samazināt praimeru hibridizācijas to.


136

Mutaģenēze

Molekulārās metodes mikrobioloģijā

Documents

Transcript of Molekulārās metodes mikrobioloģijā