Instrumentālās metodes

• Kura mērķis - iepazīstināt studentus ar dažādām instrumentālām metodēm ar pielietojumu molekulārajā un šūnu bioloģijā, bioķīmijā un citās radniecīgās nozarēs

• Kurss notiks LU BF un Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā (BMC)

Instrumentālo metožu kursa saturs• Proteīnu ekspresija, attīrīšana un elektroforēze (BF,

2xlekc., lab. d.)• Mikroskopija - optiskā (BF), konfokālā (BF), elektronu

(BMC), lekc., lab.d., demonstr.• Organellu atdalīšana centrifūgas gradientā (BF, lekc.

+lab.d)• DNS sekvenēšana (BMC, lekc. +mini-lab.d.)• Masspektrometrija (BMC, lekc. + mini-lab.d.)• Reālā laika PCR (BMC, lekc. + mini-lab.d.)• Plūsmas citometrija (BMC, lekc. + demonstr.)• Radioaktīvo elementu pielietojums bioloģijā (BF, BMC,

lekc. + demonstr.)• Proteīnu struktūru noteikšanas metodes –

rentgenstruktūranalīze un KMR (BMC, BF 2xlekc., 1xmini lab.d.)

Prasības• Sekmīgi nokārtoti visi pārbaudes darbiņi• Apmeklēti visi laboratorijas darbi, par kuriem vēlāk

iesniegti protokoli• Sekmīgi nokārtots gala tests• Kavētos pārbaudes darbiņus var uzrakstīt pēc lekcijas

331. telpā vai pēc nodarbībām BMC• Sekmīgi nokārtoto pārbaudes darbiņu pārlikšana

nolūkā iegūt augstāku atzīmi netiks atbalstīta• Galīgā atzīme ir aptuveni proporcionāla nodarbību

skaitam un tiks izlikta pēc formulas (1x atzīme pirmajā testā + 2x atzīme pie Tūra Selgas + 3x atzīme noslēguma testā)/6. Atzīme pie Tūra Selgas tiek izlikta par mikroskopijas/konfokālās mikroskopijas nodarbībām.

Proteīnu ekspresija un attīrīšana

Kā iegūt proteīnu?

• No dabīgā organisma

• Mākslīgi producēt citā organismā

• Sintezēt (parasti tikai relatīvi īsus peptīdus!)

Proteīna iegūšana no dabīgā organisma

• Priekšrocības:• 1. Nav nepieciešamības veikt ģenētiskas

manipulācijas• 2. Proteīns vienmēr ir dabīgajā formā • Trūkumi• 1. Var būt grūti iegūt lielus daudzumus• 2. Var būt ētiskas problēmas• 3. Parasti grūti attīrīt• 4. Ierobežotas iespējas pētīt modificētus

proteīnus

Piemērs: Liellopu seruma albumīns (BSA)

• Asins serums satur ap 60% albumīna

• Viegli izolējams ar precipitēšanas metodi

• Liellopu asins serums ir plaši pieejams

• BSA plaši pielieto molekulārajā bioloģijā

Proteīnu producēšana (“ekspresija”) citā organismā

• Priekšrocības-Var uzproducēt praktiski jebkuru proteīnu-Dabā reti sastopamus proteīnus var uzproducēt

lielos daudzumos-Proteīnu var modificēt, lai atvieglotu tā attīrīšanu-Var vikt citas ģenētiskas modifikācijas• Trūkumi-Nepieciešams veikt laikietilpīgas manipulācijas ar

rekombinanto DNS-Proteīns var nebūt dabīgajā konformācijā vai

izrādīties nešķīstošs

Vektori

• Lai gēnu ievietotu citā organismā, lieto t.s. vektorus

• Vektori ir divu veidu:• 1. Plazmīdu vektori (vairumā gadījumu)• 2. Vīrusu vektori

Plazmīdas• Cirkulāras ārpushromosomu DNS

sekvences (pārsvarā baktērijās)• Plazmīdas parasti satur kādu gēnu,

kas baktērijai palīdz izdzīvot neordināros apstākļos – piemēram antibiotiku klātbūtnē

• Plazmīdās var ievietot svešas DNS sekvences

• Ja svešā DNS sekvence ir zem promotera, šūna sāk ražot atbilstošo proteīnu

Antibiotikas rezistences

gēns

Replikācijas oriģins

Promoters

Intersējošais gēns

Proteīnu producēšana citā organismā

• Proteīna gēnu ievieto vektorā (plazmīdā vai vīrusā)

• Vektoru transformē izvēlētajās saimniekšūnās• Saimniekšūnas sāk producēt proteīnu

Šūna

Plazmīda

Vīrusu vektori

• Var būt bakteriāli (bakteriofāgi), insektu, dzīvnieku vai augu

• Parasti nebūtisku vīrusa gēnu aizvieto ar interesējošā proteīna gēnu

• Šūnas inficē ar rekombinanto vīrusu

• Vīrusa proteīni kopā ar interesējošo proteīnu tiek producēti saimniekšūnā

Piemērs: Bakulovīruss

• Insektu vīruss• Inficē gan pašus insektus, gan arī

kultivētas insektu šūnas• Polihedrīns ir proteīns, kas ietver

vairākas vīrusa daļiņas• Polihedrīns palīdz vīrusam izdzīvot

apkārtējā vidē• Laboratorijas apstākļos polihedrīns

nav būtisks un to var aizvietot

Saimniekšūnu izvēle

• Dažādas sistēmas:– Bakteriālā– Raugu– Insektu– Zīdītāju– Augu

• Saimniekšūna var ietekmēt :

– Produkcijas daudzumu

– Šķīdību

– Aminoskābju pēctranslācijas modifikācijas (glikozilēšanu, fosforilēšanu, etc)

• Saimniekšūnas izvēlas atkarībā no:

– Pielietošanas mērķa

– Nepieciešamā proteīna daudzuma

– Proteīna oriģinālā organisma

– Cenas

– Proteīna potenciālā toksiskuma

– Sistēmas vienkāršības

Saimniekšūnas izvēle atkarībā no nepieciešamā proteīna daudzuma

• Baktērijas > Raugi >> Insekti > Zīdītāji• Kristalogrāfijai vai NMR ir nepieciešams ļoti

daudz proteīna• Šī iemesla pēc ne-bakteriālās sistēmas bieži ir

nereālistiskas proteīnu strukturālajiem pētījumiem

Produkcija baktērijās (E.coli)

• Labās ziņas:• Produkcijas apjoms ir augsts• Lēti• Viekārši strādāt• Baktērijas ātri aug• Sliktās ziņas:• Proteīns bieži ir nešķīstošs• Nav pēctranslācijas modifikāciju• Ne-baktēriju membrānu proteīnus parasti nav

iespējams producēt

Raugi

• Labi:• Produkcijas apjoms ir augsts• Lēti• Samērā vienkārši strādāt (salīdzinot ar zīdītāju

šūnām )• Dažas pēctranslācijas modifikācijas ir līdzīgas

zīdītāju šūnām• Slikti:• Ne visas pēctranslācijas modifikācijas ir tādas pašas

kā zīdītāju šūnām• Proteīni bieži tiek pārglikolizēti

Insektu (Bakulovīrusa) sistēma

• Interesējošā proteīna gēnu ievieto bakulovīrusa genomā

• Insekta šūnu kultūru vai kāpurus inficē ar rekombinanto bakulovīrusu

Insektu (Bakulovīrusa) sistēma

• Labi:• Produkcijas apjoms ir salīdzinoši augsts• Lētāk nekā zīdītāju šūnās• Lielākā daļa pēctranslācijas modifikāciju ir tādas

pašas kā zīdītāju šūnās• Slikti:• Rekombinanta bakulovīrusa konstruēšana ir

samērā sarežģīta• Daudz dārgāk nekā baktērijās vai raugos

Zīdītāju šūnas

• Parasti izmanto transformētas zīdītāju šūnu kultūras

• Visbiežāk COS šūnas (oriģināli no Āfrikas zaļajiem pērtiķiem) vai HEK šūnas (human embryonic kidney)

• Šūnas transfecē ar plazmīdām vai inficē ar rekombinantajiem vīrusiem

Zīdītāju šūnas

• Labi:• Zīdītāju proteīniem ir autentiskas pēctranslācijas

modifikācijas• Proteīni ir šķīstoši• Slikti:• Produkcijas apjoms ir zems• Sarežģīti strādāt • Šūnas aug lēni• Ļoti dārgi

E.coli un zīdītāju šūnu audzēšanas salīdzinājums

E.coli HEK šūnas

Šūnas var audzēt suspensijā

+ -

Prasības pret sterilitāti Var strādāt parastajās lab. telpās

Nepieciešamas sterilas telpas (boksi) un lamināri

Šūnu dalīšanās laiks 30 min 24h

1l barotnes izmaksas 3 Ls 50 Ls

proteīna iznākums no 1l barotnes

5-20 mg 0.1-2 mg

10 mg proteīna izmaksas (tikai barotnei)

1.5 Ls 500 Ls

Kā proteīnus dabūt ārā no šūnām ?

• Iekššūnas proteīni : šūnu sagraušana

• Sekretējamie proteīni – proteīni ir jau sekretēti no šūnām, bet tos nepieciešams koncentrēt

• Vairumā gadījumu ir jāstrādā ar iekššūnas proteīniem

Šūnu sagraušana

Fizikālās metodes

• Ultraskaņa • Frenča prese• Lodīšu dzirnavas

Ķīmiskās un fizioķīmiskās metodes• Deterģenti• Enzīmi (lizocīms baktēriju šūnām)• Osmotiskais šoks

Proteīnu iekoncentrēšna

• Precipitēšana (ar amonija sulfātu vai polietilēnglikolu)

• Ūdens ietvaicēšana vakuumā (jāņem vērā, ka pieaug sāļu koncentrācija)

• Ultrafiltrācija

Šķīstošs vai nē?

• Šķīstošs – viss kārtībā!• Nešķīstošs (ieslēguma ķermeņi): nav labi :(

– Var izmēģināt refoldingu

• Kā mēģināt uzlabot šķīdību: Samazināt ekspresijas apjomu, pazemināt šūnu audzēšanas temperatūru

• Nekas nepalīdz?

1. Izmēģināt citu saimniekšūnu veidu

2. Pamest projektu...

Bezšūnu proteīnu sintēze• Translāciju ir iespējams veikt in vitro• Daudz sarežģītāks process, nekā, piemēram, in

vitro replikācija vai transkripcija• Nepieciešamas ribosomas, aminoskābes, tRNS,

mRNS, aminoacil-tRNA sintetāzes, translācijas faktori,...

• Izmanto šūnu lizātus• Var izmantot gan eikariotisko, gan prokariotisko

šūnu lizātus• Parasti izmanto trušu retiklocītu, kviešu dīgļu

šūnu vai E. coli lizātus

Bezšūnu proteīnu sintēze

• Pielietojumi:

• Šūnām toksisku proteīnu sintēze

• Proteīnu iezīmēšana NMR

• Membrānu proteīnu sintēze

• Trūkumi:

• Ļoti dārga metode

• Grūti optimizējama metode

Proteīnu attīrīšana

• Kāpēc?• Lai proteīnu raksturotu (enzimātiskā aktivitāte,

ligandu piesaistīšana, stabilitāte, etc)• Lai noteiktu proteīna 3D struktūru• Lai identificētu proteīnu, saistītu ar noteiktu

aktivitāti • Lai zinātniskiem, industriāliem vai medicīniskiem

mērķiem saražotu proteīnu ar zināmu aktivitāti

Proteīnu attīrīšana pamatojas uz:

• Molekulas izmēru• Virsmas lādiņu• Virsmas hidrofobitāti• Afinitāti (spēju piesaistīt citus

savienojumus)

Proteīnu hromatogrāfija

• Proteīnu attīrīšanai visbiežāk izmanto kolonnu šķidruma hromatogrāfiju

• Proteīnu maisījumu laiž caur kolonnu, piepildītu ar gelveidīgu matricu ar noteiktām īpašībām

• Procesa gaitā proteīni viens no otra atdalās

Sūknis

Kolonna

UV detektors

Frakciju kolektors

Proteīnu maisījums

Hromatogramma

Frakcijas (tilpums, laiks...)

UV

abs

orbc

ija (

prop

orci

onāl

a pr

oteī

nu k

once

ntrā

cija

i)

UV280 vienības

1 2 3 4 5 6 7

0.2

0.4

0.6

0.8

Kolonnas matricu materiāli- dekstrāni (sazaroti glikozes polimēri)

- agaroze (galaktozes polimēri)

- poliakrilamīds- jaukti agarozes – poliakrilamīda polimēri- pie saharīdu hidroksilgrupām var piešūt citas

funkcionālās grupas, tādejādi mainot matricas īpašības

-pie saharīdu hidroksilgrupām var pievienot citas funkcionālās grupas, tādejādi mainot matricas īpašības

DekstrānsAgaroze

Poliakrilamīds

Kolonnas matricu veidi (pēc īpašībām)

• Gēlfiltrācijas (atdala pēc molekulu izmēra)

• Jonapmaiņas (atdala pēc molekulu lādiņa)

• Hidrofobās (atdala pēc molekulu šķīdības)

• Afinitātes (atdala pēc noteiktu proteīnu spējas piesaistīties citām molekulām)

Lieluma izslēgšanas hromatogrāfija (gēlfiltrācija)

• Kolonnu piepilda ar matricu, kurā ir noteikta diametra kanāli vai iedobumi

• Mazās molekulas iekļūst kanālos un tiek uz laiku aizkavētas

• Vidējas molekulas retāk iekļūst kanālos un tādejādi kustas ātrāk

• Lielās molekulas kanālos neiekļūst un kustas visātrāk

Lieluma izslēgšanas hromatogrāfija (gēlfiltrācija)

• No matricas materiāla veido lodītes ar noteiktu poru diametru

• Atšķirīgi poru (kanālu) diametri ir piemēroti dažādu lielumu molekulu attīrīšanai

Jonapmaiņas hromatogrāfija• Matrica (parasti agaroze)

satur lādētas ķīmiskas grupas

• Proteīni uz kolonnas sadalās atkarībā no to virsmas lādiņa

Jonapmaiņas hromatogrāfija• Katjonapmaiņa:

Matrica ir negatīvi lādēta

piemēram

S (Sulfo) un CM (Carboxymethyl)• Anjonapmaiņa

Matrica ir pozitīvi lādēta, piem. Q (Quaternary ammonium) un DEAE (Diethylaminoethyl)

• Eluēšana: Ar lineāri pieaugošu sāls gradientu, pamatojas uz konkurējošiem joniem

• Lielākā daļa proteīnu ir negatīvi lādēti, tāpēc parasti izmanto anjonapmaiņu

Jonapmaiņas hromatogrammas piemērs

Hidrofobā hromatogrāfija• Pamatojas uz hidrofobajām mijiedarbībām• Kolonnas matrica satur hidrofobas grupas (fenil-,

butil-, oktil-, u.c.)• Proteīnu hidrofobās aminoskābes mijiedarojas

ar matriksa hidrofobajām grupām• Hidrofili proteīni kolonnā kustas ātrāk• Proteīnus uz kolonnas var adsorbēt augstā sāls

koncentrācijā• Proteīnus pakāpeniski eluē ar samazinošos sāls

koncentrācijas gradientu

Afinitātes hromatogrāfija

• Pie matricas ir piesaistīts ligands, kurš saistās ar kādu noteiktu proteīnu

• Ligands var būt:

-metāla joni (Visvairāk izplatītā tehnika!)

-antivielas pret noteiktu proteīnu

-proteīns, kas saista noteiktu citu proteīnu

-mazmolekulārs ligands, kas saista noteiktu proteīnu

Antivielu afinitātes hromatogrāfija

• Vispirms nepieciešams producēt antivielas pret konkrēto proteīnu

• Antivielas ķīmiski piesaista agarozes matricai

• Tikai proteīns, pret kuru izstrādātas antivielas piesaistīsies matricai

• Parasti eluē ar zemu pH (≈3)

Antivielu afinitātes hromatogrāfija

• Priekšrocības:

-Ļoti selektīva metode

• Trūkumi:

-nepieciešams producēt antivielas pret jau attīrītu proteīnu

-dārgi

-var būt grūtības eluēt proteīnu no kolonnas

MetālhromatogrāfijaPamatojas uz atsevišķu proteīnu

spēju piesaistīt divvērtīgos pārejas metālu jonus

Matrica: agaroze ar piesaistītām helatējošām grupām (IMAC agaroze)

Helatējošās grupas piesaista divvērtīgos pārejas metālu jonus

Proteīni pēc tam piesaistās pie imobilizētajiem metālu joniem

IMAC agaroze

C

Kādi proteīni piesaista pārejas metālu jonus?

• Tikai daži proteīnu veidi dabīgi spēj piesaistīt metāla jonus

• Metāla jonus piesaistošas sekvences var ieviest mākslīgi

• Parasti izmanto t.s. His-tag – 6 histidīnus pēc kārtas

His tag ieviešana proteīnos

• Histidīnus ievieš mākslīgi ar gēnu inženierijas metodēm

• Metodes trūkums: modificētais proteīns var būt neaktīvs

• Var ieviest proteāžu saitus, lai pēc attīrīšanas His tag sekvenci varētu viegli atšķelt

Proteīni ar His-tag tiek imobilizēti uz kolonnas

Pārējie proteīni iziet cauri

Piesaistījušos proteīnus eluē ar augstu imidazola koncentrāciju

Metālhromatogrāfija un His tag : darbības princips

Augstspiediena šķidruma hromatogrāfija (HPLC)

• Galvenā īpatnība – mazāks matriksa daļiņu izmērs

• Mazākām daļiņām ir lielāks kopējais virsmas laukums

• Proteīns vairāk laika pavada mijiedarbojoties ar matricu nekā starp matricas daļiņām

• Paaugstinās izšķirtspēja• Var izmantot jebkura tipa

matricu (gēlfiltrācijas, jonapmaiņas, u.c)

Kāpēc “augstspiediena” ?

• Samazinoties matricas daļiņu izmēram, nepieciešams augstāks spiediens, lai šķīdums tecētu cauri kolonnai

• Pieaugot daļiņu lineārajam izmēram, nepieciešamais spiediens pieaug kvadrātiski

• 10x mazākas daļiņas – 100x lielāks spiediens• Spiediens var sasniegt vairākus simtus

atmosfēru• HPLC kolonnas gatavo no tērauda vai bieza

stikla

Salīdzinājums: parastās jonapmaiņas kolonnas un “HPLC” jonapmaiņas kolonnas hromatogramma

Proteīnu selektīva precipitēšana

• Pamatojas uz dažādu proteīnu atšķirīgu hidrofobitāti

– Organiskie precipitanti (piem. polietilēnglikols)– Neorganiskie precipitanti (piem., amonija sulfāts)– Nav pārāk selektīva metode, var tik izmantota kā

pirmais solis attīrīšanā– Efektīvāka, ja proteīns ir ļoti labi vai ļoti slikti šķīstošs

Elektroforēze• Proteīnu migrācija elektriskajā laukā• Parasti veic poliakrialamīda vai agarozes gēlā• Plaši izmanto analītiskiem mērķiem• Grūti eluēt proteīnus no gēliem

Ultracentrifugēšana gradientā• Proteīnu maisījums tiek spiests caur blīvuma gradientu• Proteīnu molekulas kustas atkarībā no to masas, formas un

blīvuma • Parasti izmanto saharozes vai CsCl gradientu• Pārsvarā izmanto lielu molekulu (vīrusu, ribosomu) vai šūnu

organellu atdalīšanai

g force% saharoze

Izopiknogrāfija: molekulas sasniedz gradienta (parasti CsCl) blīvumu, kas atbilst pašas molekulas blīvumam

Sedimentācija: Gradients ir ar zemāku blīvumu (parasti izmanto saharozi) un visas molekulas ar laiku nosēžas centrifūgas stobra apakšā (bet ar atšķirīgu ātrumu).

Ultrafiltrēšana

• Lieto filtru ar noteiktu poru izmēru, salīdzināmu ar makromolekulu izmēriem

• Nav pārāk selektīva metode

• Noderīga proteīnu koncentrēšanai un atsāļošanai

Siltuma izturība

• Dažādiem proteīniem ir dažāda denaturēšanās temperatūra

• Metode ir ļoti noderīga termostabilu proteīnu attīrīšanai

• Piemērs: Thermus aquaticus DNS polimerāze, producēta E.coli

-Karsē šūnu lizātu pie 80oC 15 min-Lielākā daļa E.coli proteīnu (ap 90 %)

denaturēsies un izkritīs nogulsnēs

Kā uzzināt, kurā frakcijā ir attīrāmais proteīns?

• Pēc pīķiem hromatogrammā

• Pēc molmasas analītiskajā elektroforēzē

• Detektēšana ar antivielām (proteīnu-specifiskām vai anti-His tag)

• Proteīna enzimātiskā aktivitāte

• Nav pārliecības?

• Var veikt masas spektrometriju vai N–gala sekvenēšanu