MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

MODUL PRAKTIKUM

A

DIII KESEHATAN

LINGKUNGAN

FAKULTAS KESEHATAN

DAN FARMASI

UNIVERSITAS

MUHAMMADIYAH

KALIMANTAN TIMUR

TIM PENYUSUN :

Deny Kurniawan., S. Hut. MP

Syamsir. SKM. M. Kes

i

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan

inayah-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan Modul Praktikum yang berjudul

Mikrobiologi.

Terima kasih saya ucapkan kepada seluruh Tim yang telah membantu kami baik

secara moral maupun materi. Kami menyadari, bahwa Modul Praktikum yang kami buat ini

masih jauh dari kata sempurna baik segi penyusunan, bahasa, maupun penulisannya. Oleh

karena itu, kami sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua

pembaca guna menjadi acuan agar penulis bisa menjadi lebih baik lagi di masa mendatang.

Semoga modul ini bisa menambah wawasan para pembaca dan bisa bermanfaat untuk

perkembangan dan peningkatan ilmu pengetahuan.

Samarinda, 20 Januari 2020

Penulis

ii

DAFTAR ISI

Kata Pengantar………………………………………………………………………..i

Daftar Isi……………………………………………………………………………..ii

Tata Tertib Praktikum……………………………………………………………….iii

ERGONOMI

Praktikum I Pengenalan alat…….…………………...…………………………………1

Praktikum II Sterilisasi…….……...………………………………………………….....8

Praktikum III Pembuatan medium..……..……………………………………………...11

Praktikum IV Penanaman dan Isolasi Mikroba ….…………………………………….18

Praktikum V Pengamatan Mikroba..……………………………………………………28

Praktikum VI pengamatan Mikroba…….….………………………………………...…30

Praktikum VII Analisis Kuantitatif Mikroba……………………………..………...…...38

Praktikum VIII Pengaruh Lingkungan terhadap Pertumbuhan Mikroba……...………...42

Praktikum IX Pembuatan Media dan Pemeriksaan Total Coliform……………………..48

Praktikum X Pewarnaan Pada Sel Bakteri……………………...……………………….51

iii

TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Lima menit sebelum praktikum dimulai, praktikum harus sudah siap di depan ruang

praktikum.

2. Semua praktik harus memakai jas praktikum selama berada dalam ruangan laboratorium

3. Tidak diperkenankan memakai sandal pada waktu praktikum dan selamapraktikum

berlangsung

4. Selama praktikum harap tenang dan tertib

5. Selama praktikum mahasiswa harus membawa buku panduan sendiri

6. Tidak di perkenankan meninggalkan laboran tanpa seizin asisten/dosen yang bertugas

7. Praktikan harus membawa alat tulis menulis sendiri dan perlengkapan praktikum seperti

label, lap, sikat tabung, dan lain-lain.

8. Alat-alat yang disiapkan menjadi tanggung jawab praktikan. Apabila terdapat alat yang

pecahan atau hilang maka praktikan harus sudah menggantinya pada waktu praktikum

berikutnya.

9. Setiap praktikan wajib membuat laporan praktikum dan di kumpul paling lambat satu

minggu setelah praktikum dilakukan

10. Pelanggaran dari ketentuan-ketentuan di atas dapat mengakibatkan sanksi akademik

(schorsing praktikum, tidak di perkenankan mengikuti ujian dan sebagainya)

Mikrobiologi| 1

PRATIKUM I

PENGENALAN ALAT

A. Tujuan

Untuk mengetahui jenis dan fungsi alat-alat yang digunakan serta prinsip kerja

dalam praktikum mikrobiologi.

B. Kajian Teori

Bidang ilmu Mikrobiologi (micros= sangat kecil; bios= hidup/kehidupan)

merupakan cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang bentuk, kehidupan, sifat, dan

penyebaran organisme yang tergolong mikroba (jasad renik). Untuk beberapa jenis

mikroba yang kasat mata, kita perlu menggunakan alat untuk mengamatinya.

Pengenalan alat merupakan langkah pertama sebelum memulai praktikum

mikrobiologi dengan tujuan untuk mengetahui nama, fungsi, serta cara mengoprasikan

alat-alat tersebut sehingga kegiatan praktikum menjadi mudah dan lancar. Alat-alat

praktikum mikrobiologi pada umumnya terdiri atas: alat-alat gelas, timbangan, oven,

autoklaf dan lain-lain. Kondisi dan kegunaan alat perlu diperhatikan sebelum dan setelah

alat tersebut digunakan.

Melalui pengenalan berbagai alat-alat laboratorium, kita akan lebih mudah dalam

melakukan praktikum. Selain itu kita juga dapat meminimalisir resiko kesalahan kerja

pada saat melakukan percobaan. Peralatan utama yang umumnya digunakan pada

praktikum mikrobiologi diantaranya alat-alat gelas, timbangan, oven, autoclave, serta

peralatan pendukung lainnya yang juga berkaitan dengan unit praktikum sterilisasi,

pembuatan medium, isolasi dan pengamatan mikroba.

Mikrobiologi| 2

Dalam penggunaannya ada alat-alat yang bersifat umum dan yang bersifat khusus.

Peralatan umum biasanya digunakan untuk suatu kegiatan reparasi, sedangkan peralatan

khusus lebih banyak digunakan untuk kegiatan pengukuran atau penentuan.

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi dapat dibagi menjadi: a)

Alat-alat yang terbuat dari gelas; b) Alat-alat sterilisasi; c) Mikroskop dan Alat-alat

pendukung lainnya

Adapun kegunaan peralatan praktikum yang digunakan diantaranya adalah:

a. Alat-alat gelas serta peralatan lain untuk memudahkan proses inokulasi, isolasi

maupun transfer mikroba. Peralatan ini teridiri dari :

1) Tabung reaksi adalah tabung berbahan gelas yang digunakan sebagai wadah

media kultur berupa agar tegak dan agar miring

2) Cawan petri (Petri disk) adalah cawan berbahan gelas yang digunakan sebagai

wadah media kultur dalam bentuk lempeng agar

3) Pipet tetes adalah pipet berbahan gelas yang memiliki alat penghisap berbahan

karet dan digunakan untuk memindahkan cairan dalam jumlah kecil

4) Pipet volume adalah pipet yang digunakan dengan cara dihisap sehingga cairan

akan memasuki pipet sebanyak yang diinginkan. Pipet volume dapat dihisap

langsung dengan mulut atau menggunakan pipet filler.

Mikrobiologi| 3

1 2 3 4 5 6

5) Jarum ose adalah alat berbahan kaca dengan ujung yang terbuat kawat baja tajam

atau membulat yang digunakan untuk menginokulasi mikroba atau ditransfer ke

media kultur lain.

6) Lampu bunsen adalah lampu berbahan bakar bunsen yang digunakan untuk

sterilisasi panas dan mempertahankan sterilisasi ruang inokulasi, isolasi dan

transfer mikroba

7) Penghisap pipet (pipet filler) adalah bola berbahan karet yang dipasang di bagian

pangkal pipet hisap digunakan untuk menghisap cairan yang akan dipindahkan ke

media lainnya dalam jumlah yang lebih banyak.

-

b. Alat-alat sterilisasi

Mikrobiologi| 4

1) Otoklaf adalah alat yang dilengkapi sistim peningkatan suhu sehingga dapat

mengubah air menjadi uap panas. Otoklaf dapat digunakan untuk melakukan

sterilisasi basah, baik peralatan maupun media kultur.

2) Inkubator adalah peralatan yang dilengkapi dengan sistem untuk mempertahankan

suhu dan kelembaban selama masa inkubasi sehingga mikroba dapat tumbuh

dengan baik

3) Oven adalah alat pemanas yang dapat digunakan untuk sterilisasi peralatan secara

kering.

Keterangan:

1. Tombol pengatur waktu (timer) 2. Katup uap 3. Indikator tekanan 4. Klep udara 5. Tombol on-off 6. Thermometer 7. Lempeng sumber panas 8. Aquades 9. Sekrup pengaman 10. Batas air

Mikrobiologi| 5

4) Hot plate stirrer adalah alat yang dilengkapi fasilitas pengaduk dan pemanas

sehingga dapat digunakan untuk membantu pengadukan agar suspensi tidak

mengendap dan pendistribusian mikroba dalam media kaldu atau media

fermentasi, baik pada suhu kamar maupun suhu yang lebih tinggi.

5) Electric shaker adalah alat yang dapat digerakkan kearah

depan dan belakang atau melingkar sehingga dapat

digunakan untuk membantu pengadukan larutan dan

pendistribusian mikroba dalam media kaldu atau media

fermentasi

6) Lemari pendingin adalah lemari yang dilengkapi sistem

penurunan suhu sehingga dapat digunakan untuk

Mikrobiologi| 6

mengendalikan aktivitas dan pertumbuhan mikroba dalam media kultur

c. Mikroskop adalah alat untuk memperbesar kenampakan objek sehingga

mempermudah melakukan pengamatan.

d. Timbangan analitik adalah alat ukur yang dapat digunakan untuk menentukan bobot

sampel dengan ketelitian tinggi

e. Colony counter adalah peralatan yang dilengkapi dengan kuadran penghitungan,

lampu dan kaca pembesar untuk mempermudah penghitungan mikroba.

f. Laminar Air Flow (LAF). Adalah alat yang digunakan untuk melakukan pekerjaan

secara aseptik. Alat ini mempunyai pola pengaturan dan penyaring udara sehingga

ruangan didalamnya menjadi steril dengan dipadukan

Keterangan:

1. Lensa okuler 2. Pemutar lensa objektif 3. Tabung okuler 4. Meja benda 5. Condenser 6. Lensa objektif 7. Pengatur kekuatan lampu 8. Tombol on-off 9. Cincin pengatur diopter 10. Pengatur jarak interpupillar 11. Penjepit specimen 12. Illuminator 13. Sekrup pengatur vertical 14. Sekrup pengatur horizontal 15. Sekrup fokus kasar 16. Sekrup fokus halus 17. Sekrup pengencang tabung okuler 18. Sekrup pengatur condenser

Mikrobiologi| 7

aplikasi sinar UV beberapa jam sebelum digunakan

C. Diskusi

-

-

D. Tugas Individu

- Buatlah gambar berdasarkan hasil pengamatan alat-alat praktikum dan dilengkapi

dengan prinsip kerja masing-masing alat.

d e f

Mikrobiologi| 8

PRATIKUM II

STERILISASI

A. Tujuan

Setelah melakukan praktikum, mahasiswa dapat mengetahui teknik sterilisasi yang

benar pada alat-alat laboratorium.

B. Dasar teori

Sterilisasi perlu dilakukan untuk semua tindakan diagnosa mikrobiologi, terutama

membebaskan alat-alat atau bahan dari mikroba yang tidak diharapkan. Hal ini perlu

agar hanya biakan murni saja yang terisolasi dan bebas dari kontaminasi mikroba lain.

Biakan murni merupakan biakan yang hanya terdapat satu spesies mikroba atau hasil

perbanyakan satu sel mikroba.

Sterilisasi dapat ditakukan dengan cara pemanasan, pasteurisasi, tindalisasi, filtrasi

dan dengan bahan kimia tertentu (desinfektan). Cara-cara sterilisasi tergantung jenis dan

sifat alat/bahan yang akan disterilkan.

C. Cara kerja:

1. Alat-alat yang sudah disiapkan pada unit praktikum I dicuci terlabih dahulu

2. Untuk peralatan dari bahan kaca, setelah kering dibungkus dengan Koran dan

plastik.

3. Lakukan sterilisasi sesuai dengan jenisnya.

Mikrobiologi| 9

I. Sterilisasi dengan pemanasan

1. Teknik Pemijaran.

Sterilisasi ini dilakukan dengan memijarkan pada api lampu bunsen. Misalnya

untuk jarum inokulasi, ose atau alat lainnya yang terbuat dan platina atau nikrom.

2. Udara panas (kering).

Alat-alat seperti cawan petri dibungkus dengan kertas yang tipis, untuk pipet

ujungnya ditutup dengan kapas dan kemudian dibungkus dengan kertas

kemudian dimasukkan kedalam oven

3. Uap panas bertekanan.

Untuk sterilisasi alat/bahan yang tidak tahan suhu tinggi kering dapat dilakukan

dengan menggunakan otoklaf.

II. Pasteurisasi

Cara ini dilakukan untuk mensterilkan bahan/larutan yang mudah rusak pada suhu

tinggi, misalnya susu. Pasteurisasi dilakukan dengan memanaskan bahan pada suhu

63°C selama 30 menit kemudian harus segera didinginkan.

III. Tindalisasi

Sterilisasi dengan cara ini dilakukan dengan suhu 100 °C dan diulangi 3 kali

berturut-turut (sterilisasi bertahap)

IV. Filtrasi

Teknik filtrasi adalah proses sterilisasi yang dilakukan pada bahan yang bersifat

termolabil dimana akan terurai pada suhu tinggi (antibiotik, asam amino, vitamin dll).

Bahan-bahan tersebut disaring dengan menggunakan filter yang mempunyai pori-pori

sangat kecil.

Mikrobiologi| 10

V. Desinfektan

Desinfektan atau bahan kimia (biasanya berbentuk larutan : Hidrogen peroksida, 03,

HgCI, formalin dll) yang digunakan untuk membunuh set vegetatif mikroorganisme,

tetapi tidak membunuh endospora. Penggunaan desinfektan ini biasanya hanya pada

bagian permukaan saja.

D. Rumusan masalah

-

-

E. HIPOTESIS

-

-

F. Diskusi

Mikrobiologi| 11

PRATIKUM III

PEMBUATAN MEDIUM

A. Dasar Teori

Pembiakan mikroorganisme di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara

serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroorganisme. Medium merupakan

bahan yang terdiri atas campuran nutrisi untuk pertumbuhan mikroba. Dalam kegiatan

mikrobiologi, medium diperlukan untuk kegiatan pembiakan, isolasi, pengujian sifat-

sifat fisiologis dan menghitung jumlah mikroba.

Berdasarkan susunan kimianya, medium dibedakan atas medium sintetik, dan non-

sintetik.

1. Medium sintetik yaitu medium yang bahan-bahan penyusunnya dapat diketahui

dengan pasti. Medium sintetik biasa digunakan untuk mengetahui sifat genetik

mikroba. Senyawa oraganik dan inorganik yang ditambahkan dalam media sintetik

harus murni dan harganya sangat mahal.

2. Medium non-sintetik yaitu medium yang susunan kimianya tidak dapat ditentukan

dengan pasti. Biasanya digunakan untuk menumbuhkan dan mempelajari taksonomi

mikroba. Bahan yang biasa digunakan adalah ekstrak daging, pepton, ekstrak ragi

dan kaldu daging.

Berdasarkan konsistensinya, medium dibedakan atas medium cair (liquid medium),

semi padat dan padat (solid medium).

1. Medium cair (liquid medium), yaitu medium yang berbentuk cair

Mikrobiologi| 12

2. Medium padat (solid medium), yaitu medium yang berbentuk padat

3. Bedasarkan fungsinya medium dibedakan atas medium diperkaya (enrichment

medium), medium selektif (selective medium), medium diferensiasi (diffrential

medium), medium penguji (assay medium) dan medium khusus. Medium juga

dibedakan atas medium alamiah dimana terdiri atas bahani alam dan semi alamiah

yang merupakan campuran antara bahan alamiah dan bahan sintetik.

4. Medium diperkaya (enrichment medium), yaitu medium yang ditambah zatzat

tertentu seperti serum, darah, ekstrak daging, tumbuh-tumbuhan dan lain- lain.

Medium ini dapat menumbuhkan mikroba heterotrop tertentu.

5. Medium selektif (selective medium), yaitu medium yang ditambah zat kimia yang

bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain.

6. Medium diferensiasi (diffrential medium), yaitu medium yang ditambahkan zat

kimia tertentu sehingga suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan

perubahan tertentu sehingga dapat dibedakan tipe-tipenya

7. Medium penguji (assay medium), yaitu medium yang digunakan untuk menguji zat-

zat atau senyawa-senyawa tertentu seperti vitamin, antibiotik dli.

8. Medium khusus, yaitu medium untuk menentukan pertumbuhan mikroba dan

kemampuannya mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu.

B. Tujuan

C. Rumusan masalah

Mikrobiologi| 13

D. Hipotesis

-

E. Alat

1. Timbangan 6. Tabung reaksi

2. Watch glass 7. Batang pengaduk

3. Gelas ukur 8. Otoklaf

4. Labu Erlenmeyer 9. kompor

5. Cawan petri 10. Laminar Air Flow

F. Bahan

I. Komposisi pembuatan media padat

1. Nutrien Agar (NA)

Bahan :

- Beef ekstrak 3 gram

- Pepton 5 gram

- Agar 15 gram

- Aquades ± 1000 ml

2. Potato Dekstrose Agar (PDA)

Bahan :

- Kentang 200 gram

- Agar 10 gram

Mikrobiologi| 14

- Dektrose 15 gram

- Akuades ± 1000 ml

II. Komposisi pembuatan media cair

1. Nutrient Broth (NB)

Bahan yang digunakan sama dengan Nutrient agar (NA), hanya tidak memakai

agar sebagai pemadat.

G. Langkah kerja

I. Pembuatan media padat Nutrien Agar (NA)

1. Timbang komponen medium menggunakan timbangan analitik sesuai dengan

formula yang telah ditentukan

2. Larutkan agar dengan aquades sebanyak 500 ml menggunakan gelas ukur dan

mengaduk secara konstan sambil dipanaskan diatas kompor

3. (catatan: panaskan menggunakan api yang sedang jangan sampai mendidih)

4. Larutkan beef extract dan peptone pada gelas ukur menggunakan aquades

sebanyak 100 ml kemudian mengaduknya hingga larutan menjadi homogen.

5. Setelah keduanya larut, tuangkan kedalam agar yang sudah dipanaskan dan

diaduk kembali hingga semua bahan menjadi homogen.

6. Ukur pH media menggunakan kertas pH indikator (pH media seharusnya 7.0).

Jika pH tidak normal, penyesuaian dapat dilakukan dengan menambahkan

HCl/NaOH.

7. Setelah semua bahan tercampur, siapkan cawan petri dan tabung reaksi

Mikrobiologi| 15

8. Tuangkan 10 ml media ke dalam cawan petri dan 10 ml ke dalam tabung reaksi.

Untuk membuat media tegak atau miring cukup tuangkan 5 ml ke dalam tabung

reaksi. Lakukan langkah ini sebelum media menjadi dingin dan mengental

9. Tutup semua cawan petri dan sumbat tabung reaksi menggunakan kapas

kemudian media di sterilisasi menggunakan outoklaf

II. Pembuatan Medium Potato Dekstrose Agar (PDA)

1. Rebus kentang dalam dengan akuades selama 1-3 jam sampai lunak, kemudian

diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan kertas

saring lalu ditampung di Beaker glass baru.

2. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 ml akuades

3. setelah larut ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi.

4. Setelah semua larut, ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan

dihomogenkan.

5. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.

6. Media dituang kedalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk

disterilisasi

III. Pembuatan media cair Nutrient Broth (NB)

Proses pembuatan media NB sama dengan NA tetapi tidak memerlukan agar

sebagai pemadat. Proses pembuatannya cukup melarutkan peptone dan beef

extract kedalam 100 ml aquades menggunakan labu Erlenmeyer atau gelas ukur

dan diaduk hingga bahan homogen. Proses ini tidak memerlukan panas karena

peptone dan beef extract mudah larut dalam air jika diaduk.

Mikrobiologi| 16

H. Mengsterilisasi media

1. Isilah otoklaf dengan air biasa hingga batas yang disarankan

2. Masukkan media yang akan disterilisasi kemudian tutuplah otoklaf tersebut

3. Nyalakan api kompor dan biarkan katup udara tetap terbuka sehingga semua

udara di dalam otoklaf terganti dengan uap. Setelah uap mulai terlihat keluar,

katup udara kemudian ditutup.

4. Tunggulah sampai jarum manometer menunjukkan angka 15 berarti tekanan

angka otoklaf telah mencapai 15 lbs. kecilkan api kompor, lalu pertahankan

tekanan agar tetap 15 lbs biarkan hingga 20 menit

5. Setelah 20 menit, matikan kompor gas, lalu biarkan sampai tekanan yang

ditunjukkan oleh manometer menjadi 0 lbs

6. (catatan: jangan membuka tutup otoklaf sebelum jarum manometer menunjukkan

angka 0 lbs)

7. Buka katup uap air sehingga uap air keluar, kemudian bukalah tutup otoklaf dan

keluarkan bahan dan alat yang telah disterikankemudian diletakkan pada di atas

nampan (baki) kayu. Medium dalam cawan petri akan digunakan sebagai’

medium lempeng, letakkan dengan posisi mendatar. Medium dalam tabung

reaksi akan dipakai sebagai medium miring, !etakkan dengan posisi agak miring,

dengan menyandarkan pada tepi nampan

8. Tunggulah sampai 2 atau 3 hari, apabila medium tetap bersih dan tidak

ditumbuhi bakteri atau jamur, berarti medium ini dapat dipakai. Medium yang

tidak segera dipakai dapat disimpan dalam lernari es.

I. Diskusi

Mikrobiologi| 17

1. Apakah yang akan terjadi jika peralatan medium tidak disterilkan terlebih

dahulu?

2. Mengapa media yang baru disterilkan harus dibiarkan selama 2 x 24 jam sebelum

digunakan?

3. Apakah bakteri dapat dibiakkan menggunakan medium lain selain bahan yang

telah dipraktekkan?

Mikrobiologi| 18

PRATIKUM IV

PENANAMAN DAN ISOLASI MIKROBA

A. Tujuan

1. Untuk mengetahui metode-metode dalam memisahkan mikroba tertentu dari

populasi campurannya dan mendapatkan kultur murni.

2. Untuk mengetahui karakteristik mikroba yang tumbuh pada kultur murni

B. Dasar Teori

Penyebaran mikroorganisme dapat kita jumpai diberbagai tempat seperti lingkungan

air, tanah, udara, tanaman maupun hewan. Mikroba yang hidup dialam terbuka jarang

ditemukan sebagai biakan murni karena pada umumnya bercampur dengan populasi

mikroba lainnya. Untuk mengetahui jenis mikroba tertentu, sebelumnya perlu dilakukan

isolasi dari habitatnya. Isolasi suatu mikroba adalah proses memindahkan mikroba dari

lingkungannya menjadi suatu biakan murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroba

lainnya. Sebagai persyaratan pertumbuhannya, mikroba memiliki kebutuhan serta

karakteristik yang berbeda-beda. Media pertumbuhan adalah substansi yang memenuhi

kebutuhan jumlah nutrisi mikroorganisme.

Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan melalui metode pengenceran

dengan menggunakan bahan cair atau bahan padat. Pada mulanya digunakan gelatin

sebagai bahan pemadat. Gelatin terdiri dari protein sehingga dapat dicerna dan ataupun

dicairkan oleh bakteri. Bahan pemadat yang kemudian ditemukan ialah agar yang

merupakan polisakarida dari rumput laut. Agar akan mencair pada suhu 100 oC,

Mikrobiologi| 19

sedangkan pada suhu 44 oC masih dalam bentuk cair. Suhu ini masih dapat

memungkinkan bakteri untuk tumbuh, sehingga prinsip ini dipakai untuk mengisolasi

bakteri dengan cara agar tuang. Pada umumnya bakteri tidak dapat mencerna atau

mencairkan agar.

Dalam praktikum kali ini akan dipelajari tiga cara untuk mendapatkan biakan murni

yaitu: 1) metode penggoresan agar; 2) metode agar tuang; dan 3) metode agar sebar.

Prinsip ketiga cara ini ialah pengenceran, sehingga pada akhirnya akan diperoleh koloni

terpisah yang mengandung satu jenis bakteri.

C. Rumusan masalah

............................................................................................................................

D. Hipotesis

............................................................................................................................

E. Alat

1. Jarum inokulasi (ose)

2. Lampu bunsen

3. Bahan

4. Kultur bakteri Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococus

5. Tabung berisi NA miring

F. Langkah kerja

I. Metode Goresan

Mikrobiologi| 20

Isolasi dengan penggoresan dilakukan dengan menyiapkan cawan petri yang berisi

medium NA, Ose, lampu bunsen dan kultur bakteri. Pada metode ini diperlukan

keterampilan untuk menghasilkan koloni yang terpisah. Untuk mendapatkan koloni yang

terpisah perlu diperhatikan langkah-langkah sebagai berikut:

a) Goyangkan tabung berisi suspense biakan agar kandungan

bakteri menyebar. Lakukan aseptik Jangan sampai mengenai

kapas penutup

b) Pijarkan ose kemudian dinginkan. Gunakan ose yang telah

dingin untuk digoreskan pada permukaan lempengan agar.

c) Buka kapas penutup dan panaskan mulut tabung sambil

memegang kapas penutup. Dengan ose yang dingin, ambillah 1

mata ose suspensi biakan.

d) Panaskan kembali mulut tabung dan tutup kembali dengan kapas

penutup

e) Goreskan ose dengan cara disentuhkan pada lempengan agar, sewaktu

menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan lempengan. Jangn sampai

Mikrobiologi| 21

melukai permukaan agar karena akan mengganggu pertumbuhan mikroorganisme

sehingga sulit diperoleh koloni terpisah. Panaskan ose kembali sebelum

diletakkan.

f) Gunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan agar dari pencemaran.

g) Letakkan lempengan agar dengan posisi terbalik untuk mencegah air kondensasi

jatuh ke atas permukaan agar sehingga dapat terjadi penyebaran koloni.

I. Beberapa teknik goresan sebagai berikut:

1. Goresan Sinambung

Cara kerja :

a) Mengambil kultur campuran bakteri menggunakan ose yang telah dipijarkan

diatas lampu Bunsen kemudian Sentuhkan pada lempeng agar (medium) secara

kontinyu sampai setengah permukaan agar.

b) Kemudian putar cawan 180o dan lanjutkan goresan sampai habis.

2. Goresan T

Cara kerja :

a) Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol

b) Panaskan jarum ose terlebih dahulu

c) Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag sebanyak mungkin

Mikrobiologi| 22

d) Panaskan kembali jarum ose dan tunggu sampai dingin, gores ulang pada ujung

daerah 1 kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (perhatikan pada

gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna

e) Lakukan hal yang sama pada daerah 3

f) Panaskan ose sebelum diletakkan

3. Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Cara kerja :

a) Hampir sama dengan goresan T, hanya pola goresan yang berbeda yaitu daerah

goresan dibagi empat bagian. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih

mengandung banyak sel mikroorganisma. Goresan selanjutnya disilangkan dari

goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah

menjadi koloni tunggal

4. Goresan Radian

a) Pijarkan ose lalu dinginkan. Ambil 1 ose biakan bakteri untuk digoreskan

dimulai pada bagian tepi lempengan agar

b) putar lempeng agar 90o dan buat goresan terputus mulai dari bagian tepi lempeng

agar

c) putar lempeng agar 90o dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya

Mikrobiologi| 23

d) pijarkan kembali ose sebelum diletakkan

5. Metode sebaran

Pada metode ini biakan bakteri dimasukkan ke dalam media padat kemudian

diratakan dengan spatel dan diinkubasi dengan posisi terbalik.

Cara kerja:

- Untuk isolasi dengan metode sebar, siapkan cawan petri steril yang berisi

medium NA cair dan medium NA padat berisi biakan bakteri. Masukkari secara

aseptik 0,1 ml biakan ke dalam NA padat. Gunakan spatel untuk meratakan

biakan di atas permukaan medium. Inkubasi selama 24-48 jam dalam posisi

terbalik setelah itu amati pertumbuhan koloni.

Mikrobiologi| 24

6. Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dilakukan dengan cara pengenceran. Dasar

melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga mudah

untuk diamati. Pada cara agar tuang, dilakukan pengenceran satu mata ose suspensi

bakteri ke dalam tiga tabung yang berisi agar yang dicairkan, sehingga akan diperoleh

lempengan dengan jumlah bakteri yang optimum untuk isolasi. Teknik ini lebih mudah

karena untuk mendapatkan koloni yang terpisah tidak diperlukan keterampilan seperti

pada teknik penggoresan.

Cara kerja :

a) Berilah tanda pada tabung agar tuang I, II dan III. Kemudian kembalikan ke

penangas air sehingga agar tetap dalam keadaan cair.

b) Berilah tanda pada cawan petri I, II, dan III.

c) Inokulasikan tabung I yang berisi agar cair dengan satu ose biakan.

d) Jangan lupa memanaskan mulut tabung sewaktu membuka dan juga sewaktu

akan ditutup. Goyangkan tabung dengan teknik seperti pada penggoresan atau

Mikrobiologi| 25

putarlah tabung diantara kedua telapak tangan. Perhatikan bahwa agar tidak

boleh menyentuh kapas.

e) Inokulasikan tabung agar tuang II dengan satu mata lup campuran agar tuang I

yang telah tercampur dengan baik.

f) Kembalikan tabung agar tuang I ke dalam

penangas air.

g) Goyang atau putarlah tabung II diantara

kedua telapak tangan sehingga tercampur

dengan baik.

h) Inokulasikan tabung agar tuang III dengan

satu mata ose campuran agar tuang II

i) Goyang atau putar tabung III sehingga tercampur dengan baik, kemudian buka

tutup tabung dan panaskan mulut tabung. Tuang isi tabung ke dalam cawan petri

III sebelum agar menjadi dingin.

j) Cara yang sama dipergunakan untuk menuang tabung I ke cawan petri I dan

tabung II ke cawan petri II.

k) Setelah agar membeku, simpan dengan posisi terbalik dan masukkan ke dalam

inkubator dengan suhu (37°) selama 24-48 jam

7. Isolasi jamur

Sebelum melakukan isolasi jamur terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel.

Kali ini akan digunakan sampel dari tanah.

Mikrobiologi| 26

I. Cara mengambil sampel tanah:

a. Tanah yang diambil berasal dari sekitar perakaran pohon. Tanah kemudian

dipanaskan dengan oven pada suhu 80 oC selama 30 menit

b. Siapkan labu Erlenmeyer berisi 90 ml NaCl fisiologi dan 6 tabung reaksi berisi 9

ml NaCl fisiologi lalu beri label pada tabung reaksi dengan kode A, B, C, D, E

dan F

c. Masukkan secara aseptik 10 gram tanah yang telah di oven ke dalam labu

Erlenmeyer yang berisi 90 ml NaCl untuk diencerkan. Campuran ini mempunyai

tingkat pengenceran 10-1

d. Ambil 1 ml suspensi dari labu Erlenmeyer kedalam tabung A lalu kocoklah

dengan cara memutar diantara kedua tangan. Lanjutkan dengan mengambil 1 ml

suspensi dari tabung A ke dalam tabung B kemudian dikocok. Lakukan

pengenceran bertingkat tersebut sampai pada tabung F, hingga diperoleh

suspense dengan tingkat pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.

II. Teknik isolasi

Proses ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Untuk mengisolasi jamur

pada sampel tanah, suspensi diambil dari 3 tabung pengenceran terakhir.

Cara kerja:

1. Masukkan 1 ml cairan dari pengenceran 10-5 sampai 10-7 menggunakan pipet

tetes ke dalam masing-masing cawan petri yang berisi medium PDA. Gunakan

spatel untuk meratakan cairan suspensi pada permukaan PDA

2. Inkubasi pada suhu 30 oC selama 5-7 hari

Mikrobiologi| 27

3. Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,

lanjutkan dengan Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari

Sampel tanah

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

Mikrobiologi| 28

PRATIKUM V

PENGAMATAN MIKROBA

A. Tujuan

Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat mengetahui bentuk morfologi

mikroba pada medium padat dan medium cair. Serta faktor-faktor yang mempengaruhi

bentuk mikroba

B. Dasar Teori

Pada agar lempengan koloni tampak berupa bulat, tidak teratur, titik-titik, serupa

akar, kumparan. Pada permukaan koloni nampak timbul datar, mendatar, melengkung,

cembung, membukit dan tonjolan tumpul Tepi koloni utuh, berombak, seperti filamen,

bergerigi, keriting.

Pada agar miring, bentuk dan tepi koloni meliputi seperti benang, seperti pohon

bercabang, titik-titik, seperti dun atau seperti akar. Bagaimana topografi, warna, elevasi

dan wama medium.

Pada medium agar tegak perhatikan pertumbuhannya, merata atau tidak bagaiman

pertumbuhan pada bekas tusukan filiform, echinulate, beaded, villois, rhizoid atau

arbescent.

Pada medium cair, perhatikan pertumbuhan pada permukaannya apakah berbentuk

seperti cincin, bentuk seperti selaput atau tidak. Perhatikan pula kekeruhannya, sedikit,

sedang atau sangat keruh. Jika ada bau, seperti apa baunya dan perhatikan pula

endapannya (granuler, berlapis-lapis, kental atau tidak ada endapan sama sekali).

Mikrobiologi| 29

C. Rumusan Masalah

-

-

D. Hipotesis

- Buatlah hipotesis berdasarkan rumusan masalah diatas

E. Langkah Kerja

- Amatilah bentuk koloni dari hasil biakan kemudian catat dan beri keterangan

mengenai bentuk, elevasi, dan bagian tepi/margin dari koloni bakteri

BENTUK

ELEVASI

TEPI

Mikrobiologi| 30

PRATIKUM VI

PEWARNAAN MIKROBA

A. Tujuan Praktikum

Setelah melaksanakan praktikum, mahasiswa dapat mengetahui bentuk-bentuk

mikroorganisme melalui teknik pewarnaan dengan cara pewarnaan negative, pewarnaan

sederhana, pewarnaan gram dan pewarnaan spora.

B. Dasar Teori

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat

yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan

kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Untuk mengamati

bentuk sel bakteri sehingga mudah diidentifikasi harus menggunakan metode-metode

tertentu. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya melalui reaksi

dinding sel bakteri.

Salah satu cara yang digunakan untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme

adalah dengan teknik pewarnaan Gram yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi.

Untuk pengamatan morfologi mikroskopik mikroorganisme dengan sifatnya yang khas

dapat menggunakan pewarnaan tertentu (pewarnaan Gram) sebagai identifikasi awal.

Metode pewarnaan ini pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu

bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat

tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.

Mikrobiologi| 31

Oleh karena itu, pewarnaan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak

mempunyai dinding sel.

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan

cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai

mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras

mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna

memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yang

mengandung zat pati dan granula fosfat.

Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk

mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pewarnaan

sederhana, pewarnaan negatif maupun pewarnaan gram serta mengetahui morfologi

mikroorganisme. Faktor-faktor penentu keberhasilan di dalam pewarnaan mikroba

adalah Fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan zat warna

penutup/warna tandingan.

Ada beberapa jenis teknik pewarnaan yang paling sering digunakan dalam

mengidentifikasi bentuk-bentuk morfologi dari mikroorganisme, diantaranya:

1. Pewarnaan Negatif

Pewarnaan ini ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, pada metode ini bukan

untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai lingkungan sekitarnya karena pada pewarnaan

ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk

menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami

Mikrobiologi| 32

perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, sehingga penentuan sel dapat

diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat asam seperti eosin atau

nigrosin.

2. Pewarnaan Sederhana

Metode ini merupakan proses pewarnaan yang paling umum digunakan. Pada

metode ini hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme.

Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena

sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk

pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat

positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan

bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan

lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Pewarnaan dilakukan dengan memakai

satu macam larutan cat.

3. Pewarnaan Gram

Pewarnaan ini dikembangkan oleh Christian Gram (1884) dan populer dengan

istilah pewarnaan Gram. Pewarnaan ini meliputi beberapa tingkatan yaitu:

Pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi

dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan

fisik dinding sel mereka.

Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya

akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan

Mikrobiologi| 33

kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat

pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak

merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.

4. Pewarnaan Spora

Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap panas dan bahan kimia.

Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak

menguntungkan bagi bakteri. Contoh bakteri yang membentuk spora adalah Bacillus,

Clostridium, Thermactinomyces dan sporosacina. Spora terbentuk di dalam sel sehingga

disebut sebagai endospora. Dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora.

Dalam lingkungan yang menguntungkan spora bergerminasi kembali menjadi sel

vegetative, jika lingkungan tidak memungkinkan maka sel vegetative aka berubah

menjadi spora.

C. Rumusan Masalah

-

D. Hipotesis

- Buatlah hipotesis berdasarkan rumusan masalah di atas

E. Alat dan Bahan Praktikum

I. Alat Praktikum

1. Tabung;

2. Rak tabung reaksi;

3. Bunsen;

4. Mikroskop;

Mikrobiologi| 34

5. Objek glass;

6. Cover glass;

7. Tissue;

8. Jarum ose;

9. Wadah pengering;

II. Bahan

1. Escherichia coli;

2. Bacillus subtilis;

3. Staphylococcus aereus;

4. Kristal violet, iodine, safranin, alkohol, Malachit Green; Akuades.

F. Cara kerja:

I. Pewarnaan Negatif

1. Bersihkan kaca objek dan kaca penutup dengan alkohol 70%, sterilkan dengan

melewatkan di atas bunsen atau lampu spiritus beberapa kali

2. Buat olesan tipis bakteri pada salah satu sudut kaca objek dengan mengambil

isolat bakteri Bacillus cereus/Bacillus subtilis menggunakan jarum ose. (lakukan

tahap ini secara aseptik)

3. Lakukan pewarnaan negatif dengan mengambil 1-2 tetes nigrosin lalu

dicampurkan. Dengan menggunakan gelas objek lain, sentuhkan sisi objek gelas

tadi hingga membentuk sudut 45° tarik objek gelas tersebut ke arah berlawanan

sehingga membentuk film tipis. Biarkan mengering dengan cara dianginkan,

jangan difiksasi pada nyala api Bunsen

4. Setelah kering, amati di bawah mikroskop.

Mikrobiologi| 35

II. Pewarnaan Sederhana

1. Bersihkan kaca preparat dengan alkohol 70%

2. Ambil 1 ose biakan (Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus) dan ratakan di

atas kaca preparat (lakukan tahap ini secara aseptic)

3. Kengeringkan dengan cara dilewatkan di atas lampu bunsen

4. Lakukan pewarnaan dengan larutan Methylen blue atau Kristal violet 1-2 tetes

5. Biarkan selama 2 menit, lalu bilas di bawah air yang mengalir sampai sisa-sisa

cat hilang

6. Lakukan fiksasi di udara, setelah kering amati hasilnya di bawah mikroskop, dan

gambar hasil pengamatan.

III. Pewarnaan Gram

1. Siapkan biakan mumi Staphylococcus aureus dan E. coil pada medium NA

berumur 24 jam, gelas benda, akuades steril, larutan kristal violet (Gram A),

larutan iodium (Gram B), Alkohol aseton (Gram C), Larutan safranin (Gram D),

alkohol 70% dan pembakar bunsen.

2. Lakukan pewarnaan Gram dengan cara menyiapkan olesan bakteri, fiksasi

dengan bunsen. Teteskan Gram A sebanyak 2-3 tetes pada olesan bakteri, biarkan

selama 1 menit. Cuci dengan air yang mengalir, keringkan dengan kertas isap

secara hati-hati.

3. Teteskan larutan Gram B, biarkan satu menit, cuci dengan air dan keringkan.

4. Tetesi larutan Gram C biarkan selama 30 detik, cuci dengan air dan keringkan.

Mikrobiologi| 36

5. Tetesi dengàn Gram D, biarkan selama 30 detik, cuci dengan air dan keringkan

dengan kertas isap. Amati dibawah mikroskop.

IV. Pewarnaan spora

1. Sediakan kaca benda yang bersih lalu lewatkan diatas api Bunsen

2. Teteskan aquades di sudut atas kaca benda

3. Secara aseptic inokulasi biakan bakteri yang akan diamati diatas tetesan aquades

kemudaian ratakan perlahan-lahan

4. Ambillah kaca benda lain lalu letakkan diatas kaca benda sediaan tersebut hingga

membentuk sudut 45o

5. Geserkan kaca benda kesudut lainnya sehingga sediaan menjadi rata, biarkan

sampai mongering

6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan di atas api Bunsen dengan

cepat

7. Teteskan larutan malachite green di atas sediaan lalu panaskan sediaan di atas api

Bunsen. Perhatikan jangan sampai sediaan mendidih atau mongering. Selama

melakukan pemanasan gunakan gunakan pinset untuk menjepit

8. Jika sediaan sudah dingin, bilas dengan air keran yang mengalir

9. Teteskan larutan safranin diatas sediaan tersebut dan biarkan selama 3 menit

10. Setelah 3 menit bilas dengan air yang mengalir

11. Keringkan sediaan dengan kertas penghisap atau dengan cara dianginkan dan

amatilah di bawah mikroskop

12. Catat dan gambarlah hasil pengamatan anda.

Mikrobiologi| 37

G. Diskusi

1. Bagaimana hasil pengamatan dari bakteri setelah dilakukan pewarnaan Gram?

2. Mengapa sel bakteri ada yang berwarna ungu (violet) dan merah?

3. Apakah sel yang berwarna merah selalu bakteri gram negatif?

4. Saat kondisi lingkungan menjadi ekstrim sel vegetative pada bakteri berubah

menjadi spora. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi!

Mikrobiologi| 38

PRATIKUM VII

ANALISIS KUANTITATIF MIKROBA

- Dasar Teori

Analisis mikroba secara Iangsung

Kuantitas mikroba menunjukkan jumlah koloni yang mampu dibentuk oleh

mikroba tertentu. Beberapa koloni bakteri bagi tubuh manusia akan menyebabkan

penyakit. Untuk mengetahui jumlah sel (bakteri) dan massa sel (golongan berfilamen

seperti kapang) dapat dilakukan dengan perhitungan langsung jumlah sel dengan

bantuan mikroskop. Alat yang sering digunakan adalah Colony counter atau dengan

Hemasitometer. Keuntungan dengan menggunakan hemasitometer ini adalah

menghemat waktu dan tidak memerlukan banyak alat. Adapun kelemahannya yaitu sel

hidup dan sel mati tidak dapat dibedakan, sulit menghitung Sel bakteri yang bérukuran

kecil dan sel kadang berkumpul.

Analisis mikroba secara tidak Iangsung

Sebelum dilakukan perhitungan dibuat pengenceran bertingkat untuk.

memperkecil jumlah suspensi mikroba. Perhitungan secara tidak langsung dapat

dilakukan dengan metode cawan tuang dan metode cawan permukaan/sebar. Pada

metode cawan tuang, dan pengenceran yang dikendaki, sampel dIpipet dan dimasukkan

dalam cawan Petri. Selanjutnya dituangi media yang sesuai dan kemudian diinkubasi

pada suhu dan waktu tertentu. Pada metode sebar, medium terlebih dahulu dituang pada

cawan petri dan dibiarkan membeku. Selanjutnya sampel dan pengenceran tertentu

dipipet pada permukaan agar tersebut. Sampel kemudian diratakan dengan batang geias

melengkung steril dengan memutar cawan petri di atas meja.

Mikrobiologi| 39

Selain perhitungan dengan dua metode tersebut di atas, pengukuran massa sel

dapat dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer. Prinsip kerja alat mi adalah

cahaya yang mengenai sel-sel mikroorganisme akan dihamburkan, sedangkan cahaya

yang lobs setebah melewati sampel akan mengaktifasi foto tabung yang pada gilirannya

akan mencatat persen transmitans pada galvanometer. Makin sedikit jumlah sel dalam

suspensi, makin besar intensitas cahaya yang lobs dan makin tinggi pula persen

transmitan yang tercatat.

- Tujian Praktikum

-

- Indikator Keterampilan proses sains yang akan dicapai

- Kemampuan mengamati objek yang akan diteliti

- Kemampuan membuat perkiraan atau jawaban sementara

- Kemampuan menentukan alat dan bahan serta objek yang akan diteliti

- Kemampuan melakukan percobaan

- Kemampuan mencatat hasil pengamatan

- Kemampuan menyimpulkan hasil pengamatan

- Kemampuan menerapkan konsep untuk memecahkan masalah

- Kemampuan menyampaikan hasil pengamatan kepada kelompok lain

Cara kerja:

Mikrobiologi| 40

- Untuk Analisis mikroba secara langsung, siapkan Mikroskop, hemasitometer,

pipet Pasteur dan suspensi mikroba ( Saccharomyces cerevisiae dan E. Coli),

Bersihkan permukaan lensa-lensa hemasitometer, tutup dengan kaca tutup

hemasitometer. Ambil suspensi mikroba dengan pipet Pasteur sebanyak 0,1- 0,5

ml, Ietakkan pada lekukan V pada tepi kaca tutup. Usahakan setiap ruang

dipenuhi suspensi. Letakkan hemasitometer pada mikroskop dan mulailah

dengan perbesaran rendah. Hitung jumlah sel yang terdapat pada 80 kotak buah

yang terletak di dalam bagian berukuran 1 mm2 tersebut.

- Cara menghitung : Pada hemasitometer terdapat 9 bidang (masing-masing

berukuran 1 mm). Kotak tengah dibagi menjadi 25 kotak besar. Setiap kotak

dibagi menjadi 16 kotak kecil. Jadi jumlah kotak kecil dalam kotak di tengah

adalah 400 (25x1 6).

Contoh Jika terdapat 200 Se dalam 80 kotak kecil (16x5), maka jumlah sel mikroba

yaitu:

- 80 kotak kecil atau 5 kotak tengah (luasnya = 80/400 = 1/5= 0,2 mm2) jadi setiap

mm2 terdapat 200 x 5 1000 sel/ mm2

- Kedalaman hemasitometer ada)ah 0,1 mm = 1000 sel/0, 1 mm2 = lxi 04 sel/

mm3

- 1 m1 I cm2=i000 mm3

- Jadi jumlah Se) mikroba dalam suspensi adalah = 1.104 x 103 1xi07 sel/mi atau

dengan rumus:

Mikrobiologi| 41

- Untuk analisis mikroba tidak Iangsung dilakukan dengan menyiapkan suspensi

mikroba, 5 tabung pengenceran berisi 9 ml aquades steril, 3 cawan nutrient agar,

pipet steril. Keijakan metode hitungan cawan dengan membuat Sen pengenceran

suspensi bakteri sampai 10-5. Tanam dengan metode tuang ke-3 cawan petri

steril mulal dan pengenceran 1 0, 1 dan 1 0. Inkubasi 30 °C selama 24 - 48 jam.

Amati dan hitung jumlah koloni yang tumbuh dan setiap pengenceran yang

mengandung 30-300 koloni atau sel. Jumlah mikroorganisme per ml sampel

(TPC) adalah:

Jumlah sel= V x n x l/f

V = volume sampel yang ditumbuhkan

n = Jumlah koloni dalam cawan

f = Faktor pengenceran

Mikrobiologi| 42

PRATIKUM VIII

PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP

PERTUMBUHAN MIKROBA

A. Tujuan Praktikum

Adapun tujuan yang ingin dicapai pada praktikum kali ini adalah untuk dapat

mengetahui pengaruh faktor lingkungan terhadap pertumbuhan mikroorgannisme

B. Dasar Teori

Pertumbuhan mikroorganisme pada umumnya sangat dipengaruhi oleh faktor

lingkungannya. Faktor tersebut diantaranya adalah faktor biotik dan faktor abiotik.

Perubahan faktor lingkungan dapat mengakibatkan perubahan sifat morfologi maupun

fisiologi. Faktor biotik merupakan faktor yang mempengaruhi pertumbuhan

mikroorganisme dari dalam tubuh mikroorganisme itu sendiri, sedangkan factor abiotik

adalah factor yang mempengaruhi dari luar

Faktor-faktor biotik tersebut meliputi faktor fisik (suhu, pH, tekanan osmotik) faktor

kimia (senyawa logam/racun), dan faktor biologi (antibiotic dan interaksi dengan

mikroorganisme lainnya). Faktor inilah yang sering terjadi dan dialami di dalam

pertumbuhan suatu mikroorganisme. Oleh karena itu dilakukan percobaan ini, untuk

mengetahui bagaimana pengaruh lingkungan terhadap pertumbuhan mikroorganisme

tersebut untuk melangsungkan kehidupannya.

C. Rumusan Masalah

D. Hipotesis

Mikrobiologi| 43

E. Alat dan bahan

I. Pengaruh suhu

a. Alat:

1. Tabung reaksi 7. Jarum Ose

2. Paper disc 8. Jangka sorong

3. Lemari pendingin 9. Laminar air flow

4. Incubator

5. oven

6. Water bath

b. Bahan:

1. Nutrient Broth

2. Escerichia coli

3. Bacillus subtilis

4. Pseudomonas sp

II. Pengaruh pH

a. Alat:

1. Tabung reaksi

2. Kertas pH indikator

3. Laminar air flow

4. Incubator

Mikrobiologi| 44

5. oven

b. Bahan:

1. Nutrient Broth

2. HCL/NaOH

3. Escerichia coli

4. Bacillus subtilis

5. Pseudomonas sp

III. Pengaruh disenfektan

a. Alat:

1. Tabung reaksi 6. Jangka sorong

2. Cawan petri 7. Jarum Ose

3. Paper disc 8. Laminar air flow

4. Incubator

5. Oven

b. Bahan:

1. Nutrient Agar (NA) 5. Antibiotic 1%

2. Escerichia coli 6. Alkohol 70%

3. Bacillus subtilis 7. Iodium

4. Pseudomonas sp 8. Sabun Detol

Mikrobiologi| 45

F. Cara kerja:

I. Pengaruh suhu

1. Siapkan 4 tebung reaksi untuk masing-masing biakan dan beri label untuk

tiap suhu 50C, 250C, 370C, dan 440C. tandai pula dengan nama biakan yang

akan diinokulasi

2. Tuangkan medium NB ke dalam tiap tabung reaksi

3. Inokulasi tiap tabung dengan biakan yang telah disediakan sesuai dengan

tanda yang sudah diberikan. Lakukan secara aseptik

4. Inkubasi tiap biakan selama 2 x 24 jam pada suhu yang telah ditentukan:

5. Setelah 2 x 24 jam, kocok keempat tabung dengan cara diputar-putar dengan

kedua tangan dan bandingkan derajat kekeruhannya.

6. Laporkan hasil pertumbuhan sebagai berikut:

a. Tidak ada pertumbuhan : -

b. Pertumbuhan sedikit : +

c. Pertumbuhan sedang : ++

d. Pertumbuhan banyak : +++

II. Pengaruh pH

1. Siapkan 3 tabung reaksi dan beri label dengan pH sebagai berikut:

a. 3 tabung dengan pH 3.0

b. 3 tabung dengan pH 7.0

c. 3 tabung dengan pH 9.0

2. Tuangkan media nutrient Broth (NB) ke dalam tiap tabung reaksi

Mikrobiologi| 46

3. Inokulasi 3 tabung (pH 3.0) masing-masing dengan biakan yang telah

disediakan.

4. Lakukan hal yang sama untuk ketiga tabung dengan pH 7.0 dan pH 9.0

5. Inkubasi tabung berisi biakan dengan suhu 370C selama 2 x 24 jam

6. Laporkan derajat pertumbuhan tiap bakteri

III. Pengaruh desinfektan

1. Sediakan 3 tabung reaksi berisi media NA yang telah dicairkan

2. Beri label masing-masing tabung dengan nama bakteri yang telah disediakan

3. Inokulasikan tiap tabung dengan biakan yang telah disediakan kemudian

kocok hingga biakan bakteri larut. Lakukan langkah ini secara aseptik

4. Tuangkan media yang berisi biakan ke dalam cawan petri yang telah diberi

label dengan nama biakan dan biarkan hingga media memadat

5. Sambil menunggu media memadat, siapkan paper disc kemudian dicelupkan

masing-masing kedalam cairan desinfektan

6. Setelah media memadat, bagi permukaan media menjadi 4 bagian, letakkan

paper disc pada permukaan media agar. Perhatikan bahwa jarak antara paper

disc yang mengandung desinfektan harus cukup berjauhan

7. Inkubasi biakan pada suhu 370C selama 2 x 24 jam

8. Bandingkan diameter zona penghambatan masing-masing desinfektan

terhadap pertumbuhan ketiga jenis bakteri menggunakan jangka sorong.

Pengukuran dilakukan dari dasar cawan petri.

Betadin

Iodium

Alkohol

Sabun detol

Biakan bakteri

Zona hambat

Mikrobiologi| 47

G. Diskusi

1. Adakah pengaruh masing-masing desinfektan yang digunakan terhadap ketiga

jenis bakteri? Jelaskan!

2. Mengapa setiap desinfektan dibuat dengan konssentrasi tertentu?

Mikrobiologi| 48

PRAKTIKUM IX

PEMBUATAN MEDIA DAN PEMERIKSAAN TOTAL COLIFORM

1. Ditimbang 1,3 gram Lactose Broth dimasukkan dalam wadah gelas piala

dilarutkan dengan 100 mL aquades. Dipipet masing-masing 10mL ke dalam 10

tabung reaksi.

2. Ditimbang 0.65 gram media Lactose Broth dimasukkan ke dalam wadah gelas

piala dilarutkan dengan 25 mL aquades. Dipipet masing-masing 5 mL ke dalam 5

tabung reaksi.

3. Ditimbang 6 gram media BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth)

dimasukkan dalam gelas piala yang dilarutkan dengan 150 mL aquades. Dipipet

masing-masing 10 mL ke dalam 15 tabung reaksi.

4. Dimasukkan 1 tabung durham secara terbalik ke dalam tiap tabung.

5. Ditutup mulut tabung reaksi dengan disumbat kapas, dan sumbat tersebut harus

sedemikian kuat sehingga dapat dicabut dari tabungnya dengan menggunakan

kelingking.

6. Dimasukkan tabung-tabung tersebut ke dalam beaker glass, ditutup bagian

atasnya dengan kertas kemudian diikat erat-erat dengan karet.

7. Media siap untuk disterelisasi.

Pemerikasaan Total coliform

Berikut ini adalah cara kerja pemeriksaan Total colifrom dan E. coli. Untuk Total

coliform dengan beberapa tahap pengujian yaitu : uji pedugaan dan uji penegasan.

a) Uji Pendugaan

1. Pengerjaan contoh dilakukan secara aseptik, dengan cara didekatkan dengan api.

2. Dipipet contoh masing-masing 10 mL ke dalam tabung medium.

3. Dipipet contoh masing-masing 1 mL ke dalam tabung medium.

4. Dipipet contoh masing-masing 0,1 mL ke dalam tabung medium.

5. Tabung digoyang-goyangkan sehingga contoh tercampur dengan medium secara

merata.

6. Diinkubasi semua tabung pada suhu 35°C selama 24 jam.

Mikrobiologi| 49

7. Dicatat tabung-tabung yang menujukkan reaksi positif , yaitu terbentuk asam dan

gelembung gas.

8. Tabung-tabung yang belum menunjukkan adanya gelembung gas diinkubasikan

kembali pada suhu 35°C selama 24 jam.

-

-

b) Uji Penegasan

1. Pengerjaan inokulasi dilakukan secara aseptis, dengan cara di dekatkan dengan

api.

2. Digoyang-goyangkan tabung dari hasil uji pendugaan yang menunjukkan reaksi

positif.

3. Dari tabung-tabung tersebut, diinokulasikan sebanyak 1 mL ke dalam tabung

reaksi medium BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) untuk uji Total

coliform.

4. Tabung-tabung tersebut diinkubasikan pada suhu 35°C selama 48 jam

5. Adanya gelembung gas menunjukkan Total coliform positif.

6. Dihitung jumlah Total coliform per 100 mL contoh dengan menggunakkan daftar

jumlah Perkiraan Terdekat (JPT)

Apabila hasil tabung tidak terdapat pada kombinasi tabung yang positif pada

tabel JPT, maka jumlah bakteri per 100 mL harus dihitung dengan menggunakkan rumus

:

- Jumlah bakteri (JPT/100 mL) = A x 100

- √B x C

- Keterangan : A : jumlah tabung yang positif

- B : jumlah (mL) contoh dalam tabung negatif

- C : Volume (mL) contoh dalam semua tabung

Apabila volume semua contoh tidak sesuai dngan ketentuan tabel JPT, maka

jumlah bakteri per 100 mL dihitung dengan rumus :

- Jumlah bakteri (JPT/100 mL) = Z x 100

- Y

Mikrobiologi| 50

- Keterangan : Z : jumlah bakteri dari tabel JPT

Y : Volume (mL) contoh terbesar

Mikrobiologi| 51

PRAKTIKUM X

PEWARNAAN PADA SEL BAKTERI

I. TUJUAN

- Untuk mengamati morfologi bakteri melalui pewarnaan sederhana dan

pewarnaan gram.

II. DASAR TEORI

Bakteri merupakan organism yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Bakteri

rata-rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron (1 mikron = 10-3).

Hal ini berarti bahwa jasad renik sangat tipis sehingga dapat tembus cahaya.Akibatnya

pada mikroskop tidak tampak jelas dan sukar untuk melihat bagian-bagiannya. Untuk

melihat bakteridengan jelas, permukaan selnya perlu diisi dengan warna, pewarnaan ini

disebut dengan pewarnaan bakteri.

Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya

mikrobiologi di pertengahan abad ke-19 oleh Louis Pasteur dan Robert Koch. Terdapat

dua macam zat warna yang sering dipakai, yaitu:

1. Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam

bentuk garam natrium.

2. Zat warna yang bersifat alkalis; dengan komponen warna kation, biasanya dalam

bentuk klorida.

Untuk mendapatkan hasil pengewarnaan yang lebih baik, tidak jarang diperlukan

bahan penolong, yang biasanya disebut pemantek (mordant). Bahan yang sering

digunakan sebagai pemantek diantaranya: ammonium oksalat, fenol, asam tanat, garam

alumunium, besi, timah, krom, dll.

A. Pengewarnaan Sederhana

Tujuan pengewarnaan ini adalah untuk membedakan bakteri dari benda-benda

mati lain yang bukan bakteri dan untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan warna

hanya terdiri dari satu bahan warna yang dilarutkan dalam suatu pelarut.Bahan yang

banyak dipakai untuk keperluan ini adalah karbol fuksin, Kristal violet dan methylen

Blue.

Mikrobiologi| 52

B. Pengewarnaan diferensial

Untuk pengewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam bahan warna. Dengan

cara ini bahan-bahan warna yang dipakai ada kalanya terpisah atau tercampur dan

digunakan dalam satu larutan. Dua macam pengecatan yang terpenting dari golongan ini

adalah pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

Sediaan (preparat) untuk proses pewarnaan dibuat sebagai berikut:

1. Kaca objek dibersihkan, sehingga bebas lemak.

2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah permukaan yang

tidak dicat.

3. Dengan ose dibuat goresan tipis pada permukaan yang telah dibersihkan.

4. Goresan dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat dari api gas.

5. Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan kaca objek tiga kali

berturu-turut pada ujung api Bunsen.

6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat.

Yang dimaksud dengan fiksasi adalah meletakkan bakteri pada kaca objek,

mamatikan bakteri dengan cepat agar sifat-sifatnya tidak banyak berubah.Fiksasi harus

dilakukan setelah preparat kering.

Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram pertama kali dikemukakan oleh Christian Gram (1884). Dengan

pewarnaan ini goresan tipis bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol

gentinviolet (karbol kristal violet, karbol metal violet) dan didiamkan beberapa saat,

kemudian disiram dengan larutan iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang

agak lama. Sampai tingkat pewarnaan ini selesai, semua sel bakteri akan berwarna ungu.

Selajutnya preparat didekolorisasi dengan alcohol atau campuran alcohol atau

aseton sampai semua zat warna tampak launtur dari film bakteri.Setelah dicuci dengan

air, preparat diberi warna kontras (counterstain) seperti safranin atau karbolfuksin encer,

air fuksin, atau pironin B.

Mikrobiologi| 53

Mikrobiologi| 54

Diantara bermacam-macam bakteri yang diwarnai, ada yang dapat menahan

warna ungu (metil violet, Kristal violet, gentian violet) dalam selnya meskipun telah

didekolorisasi dengan alcohol atau aseton. Bakteri yang memberi reaksi demikian

dinamakan Bakteri Gram Positif. Sebaliknya bakteri yang tidak dapat menahan zat

warna setelah didekolorisasi dengan alcohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan

bila diberikan pengecatan dengan dengan zat warna kontras akan berwarna sesuai

dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan reaksi semacam ini dinamakan

bakteri gram negatif.Atas dasar pewarnaan Gram ini dunia bakteri dibagi dalam dua

golongan besar, yaitu bakteri gram posistif dan bakteri gram negatif (Koes Irianto,

2006).

Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di

dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.Jenis bakteri

berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram

negatif.Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel

selapis.Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di

antara dua lapis membran sel.

III. ALAT DAN BAHAN

- Pewarnaan Sederhana

Alat Jumlah Bahan Jumlah

Object glass 1 Buah Sampel bakteri Secukupnya

Ose 1 Buah Methylene Blue Secukupnya

Bunsen 1 Buah Kapas Secukupnya

Korek api 1 Buah Air Secukupnya

Spidol Marker 1 Buah Spirtus Secukupnya

Rak Pengecatan 1 Buah Secukupnya

-

- Pewarnaan Gram

Mikrobiologi| 55

Alat Jumlah Bahan Jumlah

Object glass 1 Buah Sampel bakteri Secukupnya

Ose 1 Buah Larutan gentian

violet

Secukupnya

Bunsen 1 Buah Larutan iodium Secukupnya

Korek api 1 Buah Alkohol Secukupnya

Spidol Marker 1 Buah Safranin Secukupnya

Rak Pengecatan 1 Buah Kapas Secukupnya

Air Secukuonya

Spirtus Secukupnya

IV. CARA KERJA

a. Pembuatan preparat

1. Kaca objek (object glass) dibersihkan, sehingga bebas lemak

2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah

permukaan yang tidak dicat

3. Dengan ose dibuat goresan tipis dari biakan bakteri pada permukaan

yang telah dibersihkan

4. Goresan dikeringkan di udara atau dengan hawa panas dengan api gas

5. Fiksasi dilakukan dengan cara meneyentuhkan permukaan kaca objek

tiga kali berturut-turut pada ujung api Bunsen

6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat

b. Pewarnaan preparat

1. Pewarnaan sederhana

- Genangi preparat yang sudah jadi dengan larutan zat warna

(methylene blue)

- Cuci dengan air mengalir, keringkan

- Amati dibawah mikroskop

Mikrobiologi| 56

2. Pewarnaan Gram

- Genangi preparat yang sudah jadi dengan larutan zat warna gentian

violet selama 2-5 menit

- Buang sisa cat

- Genangi preparat dengan larutan iodium selama 30 detik sampai 1

menit

- Buang sisa cat

- Decolorisasi preparat dengan alkohol atau aseton sampai warna

ungu pada preparat memudar

- Cuci dengan air mengalir

- Genangi preparat dengan larutan safari selama 2-5 menit

- Cucu dengan air mengalir, keringkan

- Amati dibawah mikroskop