Klinikai kémia - regi.tankonyvtar.hu
Transcript of Klinikai kémia - regi.tankonyvtar.hu
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Klinikai kémia
Szarka, András Keszler, Gergely
Szerkesztette Szarka, András
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Klinikai kémia írta Szarka, András, Keszler, Gergely, és Szarka, András
Publication date 2014 Szerzői jog © 2014-2019 Dr. Szarka András, Dr. Keszler Gergely, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi
Egyetem, Semmeilweis Egyetem
iii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tartalom
Klinikai kémia .................................................................................................................................... x I. Laboratóriumi diagnosztika ............................................................................................................. 1
Előszó ........................................................................................................................................ v 1. Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk ......................................................... 6
1.1. Mintagyűjtés ............................................................................................................. 6 1.1.1.1.1. Vér (minta) ............................................................................................. 6
1.1.1.1.1.1.1.1.1. Vénás vérvétel .................................................................. 6 1.1.1.1.1.1.1.1.2. Kapilláris vérvétel ........................................................... 13 1.1.1.1.1.1.1.1.3. Artériás vérvétel .............................................................. 15 1.1.1.1.1.1.1.1.4. A vérvételt befolyásoló tényezők .................................... 16
1.1.1.1.2. Vizelet .................................................................................................. 19 1.1.1.1.2.1.1.2.1. Gyűjtött vizeletminták .................................................... 19
1.1.1.1.3. Széklet .................................................................................................. 19 1.1.1.1.4. Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis) ............................................... 19 1.1.1.1.5. Ízületi folyadék ..................................................................................... 19 1.1.1.1.6. Magzatvíz (amniotikus folyadék) ......................................................... 20 1.1.1.1.7. Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok (pleurális, perikardiális
folyadékok és ascites) .......................................................................................... 20 1.1.1.1.8. Specifikus sejtek ................................................................................... 20
1.2. A minták kezelése ................................................................................................... 20 1.2.1.2.1. A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás során ................ 20
1.3. Preanalitikai variabilitások ..................................................................................... 20 1.3.1.3.1. Kontrollálható variabilitások ................................................................ 21
1.3.1.3.1.1.3.1.1. Élettani variabilitások ..................................................... 21 1.3.1.3.2. Nem-kontrollálható variabilitások ........................................................ 21
1.3.1.3.2.1.3.2.1. Biológiai hatások ............................................................ 21 1.3.1.3.2.1.3.2.2. Környezeti hatások ......................................................... 22 1.3.1.3.2.1.3.2.3. Alapvető egészségügyi állapot ........................................ 22
2. Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában 23 2.1. A DNS, a humán DNS főbb jellemzői .................................................................... 23 2.2. DNS izolálás ........................................................................................................... 24
2.2.2.2.1. A sejt feltárása ...................................................................................... 24 2.2.2.2.2. A sejt saját nukleázainak inaktiválása .................................................. 25 2.2.2.2.3. Szennyező alkotók eltávolítása ............................................................ 25 2.2.2.2.4. A DNS szelektív kinyerése .................................................................. 25
2.3. A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel ......................................... 25 2.4. Hibridizáció, Southern blot ..................................................................................... 27 2.5. Polimeráz láncreakció (PCR) ................................................................................. 27 2.6. Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása ............................................... 29 2.7. A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai ............................................. 31
2.7.2.7.1. Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és vizsgálatuk PCR-rel .. 32 2.7.2.7.1.2.7.1.1. Huntington-kór ............................................................... 32
2.7.2.7.2. SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re ....................................... 35 2.7.2.7.2.2.7.2.1. Leiden mutáció ............................................................... 35 2.7.2.7.2.2.7.2.2. Sarlósejtes anémia .......................................................... 37
2.7.2.7.3. SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek ........................ 37 2.7.2.7.3.2.7.3.1. Cisztikus fibrózis ............................................................ 37
2.7.2.7.4. STR lókuszok, DNS ujjlenyomat ......................................................... 38 2.8. DNS chip ................................................................................................................ 39
3. Klinikai enzimológia ........................................................................................................... 42 3.1. Izoenzime ............................................................................................................... 43 3.2. Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei ................................................ 43 3.3. Kreatin-kináz .......................................................................................................... 44 3.4. Laktát dehidrogenáz (LDH) .................................................................................... 45 3.5. Aminotranszferázok ................................................................................................ 46 3.6. Gamma-glutamiltranszferáz ................................................................................... 48
Klinikai kémia
iv Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3.7. Alkalikus foszfatáz ................................................................................................. 48 3.8. Kolinészteráz .......................................................................................................... 49 3.9. Amiláz .................................................................................................................... 50 3.10. Lipáz ..................................................................................................................... 51
4. A vese laboratóriumi diagnosztikája ................................................................................... 52 4.1. A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei .................................................................... 54
4.1.4.1.1. A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása ........................... 55 4.1.4.1.2. Plazma urea .......................................................................................... 57 4.1.4.1.3. Cisztatin C ............................................................................................ 58 4.1.4.1.4. Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés ........................................... 58
4.2. A vese megbetegedései ........................................................................................... 58 4.2.4.2.1. Akut veseelégtelenség .......................................................................... 58 4.2.4.2.2. Krónikus vesebetegség ......................................................................... 59 4.2.4.2.3. Urémia szindróma ................................................................................ 59 4.2.4.2.4. Vesekövek ............................................................................................ 60
5. Vizeletvizsgálat ................................................................................................................... 61 5.1. Vizeletcukor ........................................................................................................... 64 5.2. Ketontestek a vizeletben ......................................................................................... 65 5.3. Vizelet bilirubin ...................................................................................................... 65 5.4. Urobilinogén ........................................................................................................... 66 5.5. Vizelet fehérje ......................................................................................................... 66 5.6. Vizelet pH ............................................................................................................... 66 5.7. Vizelet vér/hemoglobin .......................................................................................... 67 5.8. Vizelet sűrűség ....................................................................................................... 68 5.9. Vizeletüledék .......................................................................................................... 68
6. Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata ................................................................................. 70 6.1. A máj anatómiája .................................................................................................... 70 6.2. A máj biokémiai funkciói ....................................................................................... 72 6.3. Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása ..................................... 75 6.4. Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák ............................................................... 80
6.4.6.4.1. Nem konjugált hiperbilirubinémia ....................................................... 80 6.4.6.4.2. Konjugált hiperbilirubinémia ............................................................... 81
6.5. A máj megbetegedései ............................................................................................ 81 6.5.6.5.1. A károsodás mechanizmusa és mintázata ............................................ 81 6.5.6.5.2. Vírusos májgyulladások ....................................................................... 81 6.5.6.5.3. Akut hepatitisz ..................................................................................... 82 6.5.6.5.4. Toxikus hepatitisz ................................................................................ 82 6.5.6.5.5. Isémiás hepatitisz (Májsokk) ................................................................ 83 6.5.6.5.6. Reye szindróma .................................................................................... 83 6.5.6.5.7. Krónikus hepatitisz ............................................................................... 83 6.5.6.5.8. Cirrózis ................................................................................................. 83
7. A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata ...................................................................... 85 7.1. A diabetes mellitus klasszifikációja ........................................................................ 85
7.1.7.1.1. I. típusú diabetes mellitus ..................................................................... 87 7.1.7.1.1.7.1.1.1. Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere ..................... 88 7.1.7.1.1.7.1.1.2. Az I-es típusú diabétesz patogenezise ............................. 89
7.1.7.1.2. II-es típusú diabétesz ............................................................................ 89 7.1.7.1.2.7.1.2.1. A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise ................. 90
7.1.7.1.3. Gesztációs diabetes mellitus ................................................................. 90 7.2. A diabetes mellitus diagnosztikája, differenciáldiagnosztikájuk ............................ 91
7.2.7.2.1. Glukóz meghatározások ....................................................................... 91 7.2.7.2.2. Inzulinszint meghatározás .................................................................... 93 7.2.7.2.3. C-peptid meghatározás ......................................................................... 93 7.2.7.2.4. Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A1c ............................................. 93
8. Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata ................................................ 96 8.1. Lipidek emésztése, felszívódása ............................................................................. 96 8.2. Lipidek szállítása .................................................................................................. 100 8.3. Triglicerid szint meghatározása ............................................................................ 109 8.4. Koleszterin meghatározás ..................................................................................... 109 8.5. Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása ................................................ 110
Klinikai kémia
v Created by XMLmind XSL-FO Converter.
8.6. Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin meghatározása ................. 110 8.7. A koleszterin referenciatartományával kapcsolatos polémia ................................ 111 8.8. Hiperlipidémiák .................................................................................................... 111
9. Hematológia ...................................................................................................................... 113 9.1. A vér sejtjei és a vérképzés élettana ..................................................................... 113 9.2. A vér, illetve a vérképzés sejtes elemeinek vizsgálatára szolgáló eljárások ......... 114 9.3. A vörösvérsejteket érintő legfontosabb kórképek ................................................. 121 9.4. A fehérvérsejtek rendellenességei ........................................................................ 124
10. A véralvadás laboratóriumi vizsgálata ............................................................................ 126 10.1. A vérlemezkék (trombociták) szerepe a hemosztázisban ................................... 126 10.2. A véralvadás szerin-proteáz-rendszere és annak szabályozása ........................... 127 10.3. A trombinaktivitás kontrollja .............................................................................. 130
10.3.10.3.1. Plazma proteáz-inhibitorok ............................................................ 130 10.3.10.3.2. A protein C/protein S-rendszer ...................................................... 131
10.4. A véralvadék feloldása ....................................................................................... 132 10.5. A véralvadás legfontosabb zavarai és azok laboratóriumi vizsgálata ................. 133
10.5.10.5.1. A vérlemezkék rendellenességei és vizsgálatuk ............................. 133 10.6. A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai (koagulopátiák) és kimutatásuk 134
10.6.10.6.1. A vérzékenység differenciáldiagnosztikája .................................... 134 10.6.10.6.1.10.6.1.1. Protrombin-idő (PI; Quick-teszt) ............................ 134 10.6.10.6.1.10.6.1.2. Aktivált parciális tromboplasztin-idő (aPTI) .......... 136 10.6.10.6.1.10.6.1.3. A fibrinolízis sebességének meghatározása ............ 136 10.6.10.6.1.10.6.1.4. A trombinidő mérése .............................................. 137 10.6.10.6.1.10.6.1.5. A XIII-as faktor vizsgálata ..................................... 137
10.7. A trombózisok laboratóriumi diagnosztikája ...................................................... 137 10.7.10.7.1. Az alvadási faktorok aktiválódásának kimutatása .......................... 138 10.7.10.7.2. A hiperfibrinolízis kimutatása ........................................................ 138
10.8. Az aktivált protein C (APC) rezisztencia kimutatása ......................................... 139 II. Endokrinológia ........................................................................................................................... 140
11. Immunanalitikai eljárások ............................................................................................... 142 11.1. Kompetitív immunanalitikai eljárások ................................................................ 142 11.2. Immunometrikus, vagy nem kompetitív immunanalitikai eljárások ................... 143
12. A pajzsmirigy funkciók laboratóriumi vizsgálata ........................................................... 144 12.1. Pajzsmirigy hormonok ........................................................................................ 144
12.1.12.1.1. Biológiai funkciójuk ....................................................................... 144 12.1.12.1.2. Bioszintézis .................................................................................... 144 12.1.12.1.3. Szállítás .......................................................................................... 145 12.1.12.1.4. Szabályozás .................................................................................... 146
12.2. Hipotireózis ........................................................................................................ 148 12.2.12.2.1. Primer hipotireózis ......................................................................... 149 12.2.12.2.2. Másodlagos (szekunder) hipotireózis ............................................. 149
12.3. Hipertireózis ....................................................................................................... 149 13. Mellékpajzsmirigy ........................................................................................................... 151
13.1. PTH szint reguláció ............................................................................................ 151 13.2. A PTH hatása ...................................................................................................... 152 13.3. Primer hiperparatireózis ...................................................................................... 153 13.4. Szekunder hiperparatireózis ................................................................................ 153 13.5. PTH hiány ........................................................................................................... 153 13.6. Kalcitriol – D-vitaminok ..................................................................................... 153 13.7. Kalcitonin ........................................................................................................... 154
14. Mellékvesekéreg rendellenességek laboratóriumi vizsgálata .......................................... 155 14.1. ACTH-mellékvese tengely, glükokortikoidok .................................................... 155 14.2. Selye János stressz elmélete és annak továbbfejlesztése .................................... 155 14.3. Az ACTH-kortizol napszaki ingadozása, fontosabb szabályozókörök ............... 158 14.4. Glükokortikoidok ................................................................................................ 158 14.5. Mineralokortikoidok ........................................................................................... 159 14.6. A mellékvesekéreg rendellenességei .................................................................. 160
14.6.14.6.1. A mellékvesekéreg hipofunkciói .................................................... 160 14.6.14.6.2. A mellékvesekéreg hiperfunkciói ................................................... 161 14.6.14.6.3. Congentitalis adrenális hiperplázia ................................................ 161
Klinikai kémia
vi Created by XMLmind XSL-FO Converter.
15. Reproduktív rendellenességek laboratóriumi vizsgálata ................................................. 163 15.1. Férfi nemi működés (reprodukció) ..................................................................... 163
15.1.15.1.1. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe ........................... 163 15.1.15.1.2. Androgén transzport a vérben ........................................................ 164 15.1.15.1.3. A tesztoszteron metabolizmusa ...................................................... 164 15.1.15.1.4. Férfi nemi fejlődés ......................................................................... 165 15.1.15.1.5. Szabad és gyengén kötött tesztoszteron meghatározások ............... 166 15.1.15.1.6. 17-Ketoszteroidok meghatározása vizeletből ................................. 166 15.1.15.1.7. Anabolikus szteroid meghatározások ............................................. 167 15.1.15.1.8. Abnormalitások a férfi reprodukcióban ......................................... 167
15.2. Női reprodukciós biológia .................................................................................. 167 15.2.15.2.1. Élettani összefoglaló ...................................................................... 168 15.2.15.2.2. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe ........................... 168 15.2.15.2.3. Ösztrogének ................................................................................... 168 15.2.15.2.4. Biokémia, élettan ............................................................................ 169 15.2.15.2.5. Női nemi fejlődés ........................................................................... 170 15.2.15.2.6. Normális menstruációs ciklus ........................................................ 170 15.2.15.2.7. Női reprodukciós abnormalitások .................................................. 171
16. Utószó ............................................................................................................................. 173 17. Felhasznált és ajánlott irodalom ...................................................................................... 174
vii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az ábrák listája
1.1. Vákumos vérvétrli cső ................................................................................................................. 6 1.2. Vérvételi hely, előkészített vérvételi eszközökkel. ...................................................................... 7 1.3. Vénás vérvétel helye. ................................................................................................................... 8 1.4. Vérvételi eszközök .................................................................................................................... 10 1.5. A sejtes elemek és a plazma/szérum centrifugálással történő elválasztást követően. A két fázis között
látható a mechanikai határvonalat képező gélréteg .......................................................................... 11 1.6. Kapilláris vérvételi helyek csecsemők esetében ........................................................................ 13 1.7. Újszülöttek szűrővizsgálata ....................................................................................................... 15 1.8. Hemolizált (jobb oldalt) és nem hemolizált (bal oldalt) plazma. ............................................... 17 2.1. DNS minták (agaróz) gélelektroforézise. .................................................................................. 25 2.2. DNS minták kapilláris elektroforézise. ...................................................................................... 26 2.3. Polimeráz láncreakció ................................................................................................................ 27 2.4. A polimeráz láncreakció lépései, hőprogramja .......................................................................... 29 2.5. Real time PCR TaqMan próbával .............................................................................................. 29 2.6. Real time PCR eredménygörbék és kiértékelésü ....................................................................... 30 2.7. A kiindulási DNS kópiaszámának logaritmusa és a PCR küszöbciklusszámok között meglévő lineáris
összefüggés ...................................................................................................................................... 31 2.8. PCR primerek a Huntingtinben található CAG ismétlődések meghatározására ........................ 32 2.9. PCR termékek analízise kapilláris elektroforézissel .................................................................. 33 2.10. Allél specifikus PCR primerek ................................................................................................ 35 2.11. Allél specifikus PCR gélelektroforézis eredmények ............................................................... 36 2.12. STR lókuszok PCR analízise ................................................................................................... 38 2.13. STR lókuszok gélelektroforetogramja (DNS ujjlenyomat). ..................................................... 39 2.14. DNS chip. ................................................................................................................................ 40 3.1. ................................................................................................................................................... 43 3.2. A kreatin-kináz aktivitásának meghatározása. ........................................................................... 45 3.3. LDH enzim aktivitásának meghatározása. ................................................................................. 46 3.4. Aminotranszferáz aktivitások meghatározása. ........................................................................... 47 3.5. A GGT meghatározása. ............................................................................................................. 48 3.6. Az alkalifus-foszfatáz meghatározása ........................................................................................ 49 3.7. A kolin-észteráz meghatározása. ............................................................................................... 50 4.1. A vese mint magas nyomású szűrő. ........................................................................................... 52 4.2. Transzportfolyamatok a vesében, a vesetubulusok működése. .................................................. 53 4.3. A Kreatin kreatinin átalakulás. .................................................................................................. 55 4.4. a kreatinin clearance és a plazma kreatinin szint között fennálló kapcsolat. ............................. 56 4.5. A kreatinin meghatározása szarkozin-oxidáz segítségével. ....................................................... 57 4.6. A Trinder-reakció. ..................................................................................................................... 57 4.7. Az urea enzimes meghatározása. ............................................................................................... 58 5.1. Vizelet tesztcsík több reagenspárnával. ..................................................................................... 61 5.2. Vizelet tesztcsík leolvasása remissziós fotométerrel. ................................................................ 63 5.3. Vizeletcukor meghatározása glükóz-oxidáz, peroxidáz kálium-jodid próbával. ...................... 64 5.4. Vizelet ketontest meghatározás ................................................................................................. 65 5.5. Vizelet bilirubin meghatározás. ................................................................................................. 65 5.6. Vizelet fehérje meghatározás. .................................................................................................... 66 5.7. Vizelet vér (hemoglobin) kimutatása ......................................................................................... 67 6.1. A máj mikroszkópikus felépítése. .............................................................................................. 70 6.2. A máj és az epeutak makroszkópikus anatómiája. ..................................................................... 71 6.3. A fázis I. reakciók 90%-át kitevő oxigenáció folyamata. .......................................................... 73 6.4. A hem gyűrű felnyílása .............................................................................................................. 76 6.5. a biliverdin redukálódása bilirubinná ........................................................................................ 76 6.6. A bilirubin UDP-glukuronsavas konjugálása ............................................................................ 77 6.7. A szérum bilirubin meghatározása diazotálással ....................................................................... 79 7.1. A GLUT4 transzporterek inzulin hatásra történő plazmamembránba helyeződése ................... 86 7.2. Az inzulin jelpálya. http://1.bp.blogspot.com/-
ntbIEMesVZE/ThccKz70EAI/AAAAAAAAAUU/xYiWPRC0QuM/s1600/Insulin_Receptor.jpg 86 7.3. ................................................................................................................................................... 88
Klinikai kémia
viii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
7.4. ................................................................................................................................................... 89 7.5. A vércukorszint meghatározása glükóz-oxidáz enzimmel. ........................................................ 91 7.6. A glükóz-oxidáz enzim által generált peroxidáz bontása peroxidázzal, valamint a keletkezett nascens
oxigén detektálása Trinder-reakció segítségével. ............................................................................. 91 7.7. Vércukor meghatározása hexokináz segítségével ...................................................................... 92 7.8. Orális glükóz tolerancia teszt lehetséges eredményei ................................................................ 93 7.9. Korai glikáció, Amadori termékek képződése ........................................................................... 94 7.10. Késői glikációs termékek képződése ....................................................................................... 94 8.1. A triglicerid és alkotói: glicerin és zsírsav. ................................................................................ 96 8.2. A koleszterin. ............................................................................................................................. 96 8.3. A foszfolipidek. ......................................................................................................................... 97 8.4. A trigliceridek emésztése. .......................................................................................................... 98 8.5. A foszfatidil-kolin emésztése. .................................................................................................... 99 8.6. A lipoproteinek felépítése. ....................................................................................................... 101 8.7. Lipidek emésztése és felszívódása ........................................................................................... 102 8.8. A kilomikron életútja. .............................................................................................................. 103 8.9. Triglicerid és koleszterinszállítása a májból a perifériára. ....................................................... 103 8.10. A koleszterin felvétele apo B 100 receptorokon keresztül. .................................................... 104 8.11. A koleszterin bioszintézise és annak gátlása statinokkal. ...................................................... 105 8.12. A koleszterinszintézis szabályozása, esetleges beavatkozési lehetőségek. ............................ 107 8.13. Reverz koleszterintranszport, a HDL életútja. ....................................................................... 107 8.14. A lipdszállítás összefoglalása. ............................................................................................... 108 8.15. A koleszterin enzimes meghatározása. .................................................................................. 109 9.1. Bürker-kamra. .......................................................................................................................... 114 9.2. Coulter-számláló. ..................................................................................................................... 115 9.3. Optikai elven működő áramlási citométer ............................................................................... 116 9.4. Hematológiai automata ............................................................................................................ 117 9.5. Bazofil granulociták meghatározása fényszórás méréssel ....................................................... 118 9.6. Az egyes fehérvérsejt frakciók meghatározása fluoreszcens technikával ................................ 118 9.7. A hematológiai automata által szolgáltatott eredmények ........................................................ 119 9.8. Vérkenet készítése ................................................................................................................... 120 9.9. A glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz szerepe a reaktív oxigénvegyületek eltávolításában ........... 123 9.10. Agglutináció .......................................................................................................................... 123 10.1. A fehér trombus létrejötte ...................................................................................................... 126 10.2. Gla-kalcium-foszfatidil-szerin kapcsolat .............................................................................. 127 10.3. K-vitamin és warfarin ............................................................................................................ 128 10.4. A véralvadási kaszkád ........................................................................................................... 129 10.5. A fibrinogén ........................................................................................................................... 130 10.6. A heparin hatásmechanizmusa. .............................................................................................. 131 10.7. ............................................................................................................................................... 132 10.8. A fibrinolítikus rendszer szabályozása .................................................................................. 132 10.9. Összecsapzódott vérlemezkék ............................................................................................... 134 10.10. A protrombin idő által jellemzett véralvadási komponensek. .............................................. 135 10.11. A DIC kialakulásának mechanizmusa ................................................................................. 138 11.1. Kompetitív immunanalitikai eljárás ....................................................................................... 142 11.2. Az immounometrikus eljárás ................................................................................................. 143 12.1. Pajzsmirigyhormonok és szintézisük. .................................................................................... 145 12.2. A TRH: tireoid releasing hormone ........................................................................................ 146 12.3. ............................................................................................................................................... 147 13.1. A PTH szekréció szabályozása (Az ábra az alábbi link alapján készült: http://dualibra.com/wp-
content/uploads/2012/04/037800~1/Part%2015.%20Endocrinology%20and%20Metabolism/
Section%202.%20Disorders%20of%20Bone%20and%20Mineral%20Metabolism/346.htm) ..... 151 14.1. A POMC és hasítási termékei ................................................................................................ 155 14.2. A CRH-ACTH-glükokortikoid tengely (Az ábra az alábbi link alapján készült:
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/adrenal/gluco.html) .......................... 156 14.3. Szteroid hormon szintézis (Az ábra az alábbi link alapján
készült:http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg) ..................................................... 159 14.4. 21-hidroxiláz defektus a szteroid hormon szintézisben. (Az ábra az alábbi link alapján
készült:http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg) ..................................................... 162 15.1. a tesztoszteron metabolizmusa ............................................................................................... 164
Klinikai kémia
ix Created by XMLmind XSL-FO Converter.
15.2. Az ösztrogének ...................................................................................................................... 168 15.3. Normális menstruációs ciklus ................................................................................................ 170
x Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Klinikai kémia
Szarka András, Keszler Gergely
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014
© Szarka András, Keszler Gergely
Typotex Kiadó
ISBN: 978-963-279-176-0
Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerzők nevének feltüntetése mellett
nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható.
Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, „Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért” című
projekt keretében.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
I. rész - Laboratóriumi diagnosztika
2 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tartalom
Előszó ................................................................................................................................................. v 1. Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk ................................................................... 6
1.1. Mintagyűjtés ....................................................................................................................... 6 1.1.1.1.1. Vér (minta) ...................................................................................................... 6
1.1.1.1.1.1.1.1.1. Vénás vérvétel ............................................................................ 6 1.1.1.1.1.1.1.1.2. Kapilláris vérvétel .................................................................... 13 1.1.1.1.1.1.1.1.3. Artériás vérvétel ....................................................................... 15 1.1.1.1.1.1.1.1.4. A vérvételt befolyásoló tényezők ............................................. 16
1.1.1.1.2. Vizelet ............................................................................................................ 19 1.1.1.1.2.1.1.2.1. Gyűjtött vizeletminták .............................................................. 19
1.1.1.1.3. Széklet ........................................................................................................... 19 1.1.1.1.4. Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis) ........................................................ 19 1.1.1.1.5. Ízületi folyadék .............................................................................................. 19 1.1.1.1.6. Magzatvíz (amniotikus folyadék) .................................................................. 20 1.1.1.1.7. Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok (pleurális, perikardiális folyadékok és
ascites) ........................................................................................................................... 20 1.1.1.1.8. Specifikus sejtek ............................................................................................ 20
1.2. A minták kezelése ............................................................................................................ 20 1.2.1.2.1. A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás során .......................... 20
1.3. Preanalitikai variabilitások ............................................................................................... 20 1.3.1.3.1. Kontrollálható variabilitások ......................................................................... 21
1.3.1.3.1.1.3.1.1. Élettani variabilitások ............................................................... 21 1.3.1.3.2. Nem-kontrollálható variabilitások ................................................................. 21
1.3.1.3.2.1.3.2.1. Biológiai hatások ...................................................................... 21 1.3.1.3.2.1.3.2.2. Környezeti hatások ................................................................... 22 1.3.1.3.2.1.3.2.3. Alapvető egészségügyi állapot ................................................. 22
2. Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában ....... 23 2.1. A DNS, a humán DNS főbb jellemzői ............................................................................. 23 2.2. DNS izolálás .................................................................................................................... 24
2.2.2.2.1. A sejt feltárása ............................................................................................... 24 2.2.2.2.2. A sejt saját nukleázainak inaktiválása ............................................................ 25 2.2.2.2.3. Szennyező alkotók eltávolítása ...................................................................... 25 2.2.2.2.4. A DNS szelektív kinyerése ............................................................................ 25
2.3. A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel ................................................... 25 2.4. Hibridizáció, Southern blot .............................................................................................. 27 2.5. Polimeráz láncreakció (PCR) ........................................................................................... 27 2.6. Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása ......................................................... 29 2.7. A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai ....................................................... 31
2.7.2.7.1. Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és vizsgálatuk PCR-rel ........... 32 2.7.2.7.1.2.7.1.1. Huntington-kór ......................................................................... 32
2.7.2.7.2. SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re ................................................. 35 2.7.2.7.2.2.7.2.1. Leiden mutáció ......................................................................... 35 2.7.2.7.2.2.7.2.2. Sarlósejtes anémia .................................................................... 37
2.7.2.7.3. SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek .................................. 37 2.7.2.7.3.2.7.3.1. Cisztikus fibrózis ...................................................................... 37
2.7.2.7.4. STR lókuszok, DNS ujjlenyomat ................................................................... 38 2.8. DNS chip .......................................................................................................................... 39
3. Klinikai enzimológia .................................................................................................................... 42 3.1. Izoenzime ......................................................................................................................... 43 3.2. Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei ......................................................... 43 3.3. Kreatin-kináz .................................................................................................................... 44 3.4. Laktát dehidrogenáz (LDH) ............................................................................................. 45 3.5. Aminotranszferázok ......................................................................................................... 46 3.6. Gamma-glutamiltranszferáz ............................................................................................. 48 3.7. Alkalikus foszfatáz ........................................................................................................... 48 3.8. Kolinészteráz .................................................................................................................... 49
Laboratóriumi diagnosztika
3 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3.9. Amiláz .............................................................................................................................. 50 3.10. Lipáz .............................................................................................................................. 51
4. A vese laboratóriumi diagnosztikája ............................................................................................. 52 4.1. A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei ............................................................................. 54
4.1.4.1.1. A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása .................................... 55 4.1.4.1.2. Plazma urea .................................................................................................... 57 4.1.4.1.3. Cisztatin C ..................................................................................................... 58 4.1.4.1.4. Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés ..................................................... 58
4.2. A vese megbetegedései .................................................................................................... 58 4.2.4.2.1. Akut veseelégtelenség ................................................................................... 58 4.2.4.2.2. Krónikus vesebetegség .................................................................................. 59 4.2.4.2.3. Urémia szindróma .......................................................................................... 59 4.2.4.2.4. Vesekövek ..................................................................................................... 60
5. Vizeletvizsgálat ............................................................................................................................ 61 5.1. Vizeletcukor ..................................................................................................................... 64 5.2. Ketontestek a vizeletben .................................................................................................. 65 5.3. Vizelet bilirubin ............................................................................................................... 65 5.4. Urobilinogén .................................................................................................................... 66 5.5. Vizelet fehérje .................................................................................................................. 66 5.6. Vizelet pH ........................................................................................................................ 66 5.7. Vizelet vér/hemoglobin .................................................................................................... 67 5.8. Vizelet sűrűség ................................................................................................................. 68 5.9. Vizeletüledék ................................................................................................................... 68
6. Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata .......................................................................................... 70 6.1. A máj anatómiája ............................................................................................................. 70 6.2. A máj biokémiai funkciói ................................................................................................. 72 6.3. Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása .............................................. 75 6.4. Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák ......................................................................... 80
6.4.6.4.1. Nem konjugált hiperbilirubinémia ................................................................. 80 6.4.6.4.2. Konjugált hiperbilirubinémia ......................................................................... 81
6.5. A máj megbetegedései ..................................................................................................... 81 6.5.6.5.1. A károsodás mechanizmusa és mintázata ...................................................... 81 6.5.6.5.2. Vírusos májgyulladások ................................................................................. 81 6.5.6.5.3. Akut hepatitisz ............................................................................................... 82 6.5.6.5.4. Toxikus hepatitisz .......................................................................................... 82 6.5.6.5.5. Isémiás hepatitisz (Májsokk) ......................................................................... 83 6.5.6.5.6. Reye szindróma ............................................................................................. 83 6.5.6.5.7. Krónikus hepatitisz ........................................................................................ 83 6.5.6.5.8. Cirrózis .......................................................................................................... 83
7. A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata ................................................................................ 85 7.1. A diabetes mellitus klasszifikációja ................................................................................. 85
7.1.7.1.1. I. típusú diabetes mellitus .............................................................................. 87 7.1.7.1.1.7.1.1.1. Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere .............................. 88 7.1.7.1.1.7.1.1.2. Az I-es típusú diabétesz patogenezise ...................................... 89
7.1.7.1.2. II-es típusú diabétesz ..................................................................................... 89 7.1.7.1.2.7.1.2.1. A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise ........................... 90
7.1.7.1.3. Gesztációs diabetes mellitus .......................................................................... 90 7.2. A diabetes mellitus diagnosztikája, differenciáldiagnosztikájuk ...................................... 91
7.2.7.2.1. Glukóz meghatározások ................................................................................. 91 7.2.7.2.2. Inzulinszint meghatározás ............................................................................. 93 7.2.7.2.3. C-peptid meghatározás .................................................................................. 93 7.2.7.2.4. Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A1c ....................................................... 93
8. Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata .......................................................... 96 8.1. Lipidek emésztése, felszívódása ...................................................................................... 96 8.2. Lipidek szállítása ............................................................................................................ 100 8.3. Triglicerid szint meghatározása ..................................................................................... 109 8.4. Koleszterin meghatározás .............................................................................................. 109 8.5. Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása ......................................................... 110 8.6. Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin meghatározása ........................... 110 8.7. A koleszterin referenciatartományával kapcsolatos polémia ......................................... 111
Laboratóriumi diagnosztika
4 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
8.8. Hiperlipidémiák ............................................................................................................. 111 9. Hematológia ............................................................................................................................... 113
9.1. A vér sejtjei és a vérképzés élettana ............................................................................... 113 9.2. A vér, illetve a vérképzés sejtes elemeinek vizsgálatára szolgáló eljárások .................. 114 9.3. A vörösvérsejteket érintő legfontosabb kórképek .......................................................... 121 9.4. A fehérvérsejtek rendellenességei .................................................................................. 124
10. A véralvadás laboratóriumi vizsgálata ...................................................................................... 126 10.1. A vérlemezkék (trombociták) szerepe a hemosztázisban ............................................. 126 10.2. A véralvadás szerin-proteáz-rendszere és annak szabályozása .................................... 127 10.3. A trombinaktivitás kontrollja ....................................................................................... 130
10.3.10.3.1. Plazma proteáz-inhibitorok ...................................................................... 130 10.3.10.3.2. A protein C/protein S-rendszer ................................................................ 131
10.4. A véralvadék feloldása ................................................................................................. 132 10.5. A véralvadás legfontosabb zavarai és azok laboratóriumi vizsgálata .......................... 133
10.5.10.5.1. A vérlemezkék rendellenességei és vizsgálatuk ...................................... 133 10.6. A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai (koagulopátiák) és kimutatásuk ........ 134
10.6.10.6.1. A vérzékenység differenciáldiagnosztikája ............................................. 134 10.6.10.6.1.10.6.1.1. Protrombin-idő (PI; Quick-teszt) ...................................... 134 10.6.10.6.1.10.6.1.2. Aktivált parciális tromboplasztin-idő (aPTI) .................... 136 10.6.10.6.1.10.6.1.3. A fibrinolízis sebességének meghatározása ..................... 136 10.6.10.6.1.10.6.1.4. A trombinidő mérése ........................................................ 137 10.6.10.6.1.10.6.1.5. A XIII-as faktor vizsgálata ............................................... 137
10.7. A trombózisok laboratóriumi diagnosztikája ............................................................... 137 10.7.10.7.1. Az alvadási faktorok aktiválódásának kimutatása ................................... 138 10.7.10.7.2. A hiperfibrinolízis kimutatása ................................................................. 138
10.8. Az aktivált protein C (APC) rezisztencia kimutatása ................................................... 139
v Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Előszó
A klinikai kémia tankönyv elkészítése során, célunk az örömszerzés volt. Annak az örömnek az átélését
szeretnénk minden egyes olvasónknak megadni, amit akkor érez az ember, ha betekintést nyerhet sejtjeink,
szöveteink, szerveink és egész szervezetünk működésébe, a fiziológiástól eltérő működés hátterébe, a patológiás
működésből fakadó eltérések meghatározásába. Természetesen az egyes eltérések nemcsak egy szövet, vagy
szerv működését befolyásolják, további eltéréseket is generálhatnak, így nagyon fontos, hogy (bár a tankönyv
különálló fejezetekre tagolódik) mindig az összefüggésekre helyezzük a hangsúlyt. A klinikai kémia
sajátosságából adódik, hogy tárgyalásakor közel egyenlő súlyt kell kapnia a patobiokémiai és a kórélettani
szemléletnek. Ezt az egyensúlyt igyekeztünk fenntartani, míg a tankönyv mindkét szerzője patobiokémiai
gyökerekkel rendelkezik, addig a lektora egy gyakorló laboratóriumi szakorvos.
Egy gyakorlati ismereteket nyújtó könyv esetében a jó ábraanyag nélkülözhetetlen. Nincs ez másként jelen
könyv esetében sem. A szerkesztő ezúton is szeretne köszönetet mondani Balogh Tibornak és Lőrincz
Tamásnak az ábraanyag elkészítésében nyújtott segítségért. A tankönyvben szereplő fényképeket a szerkesztő
készítette a Szent Imre Oktatókórház központi laboratóriumában.
Budapest, 2013. november 13.
Szarka András
6 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1. fejezet - Mintavétel, preanalitikai folyamatok és variabilitásuk
A megfelelő mintavétel, feldolgozás és tárolás létfontosságú a megfelelő mérési eredményhez. Számtalan hiba
forrása lehet, amennyiben nem megfelelően végezzük ezeket a folyamatokat. A felsorolt folyamatok elégtelen
elvégzése okozhatja az úgynevezett preanalitikai variabilitást.
A preanalitikai variabilitásokat két nagy csoportra oszthatjuk a kontrollálható és a nemkontrollálható
variabilitásra. A kontrollálható variabilitások közé tartoznak a mintagyűjtés, –szállítás, illetve az adott páciens
fiziológiás állapotával kapcsolatos tényezők, mint például a neme, kora, szóban forgó betegsége stb.
Egy jó „laborosnak” tudnia és értenie kell mind a kontrollálható, mind a nemkontrollálható változékonyság
testfolyadékokra gyakorolt hatását ahhoz, hogy értel-mezni tudja az eredményeket.
1.1. Mintagyűjtés
Lássuk csak, milyen mintákat vizsgál egy klinikai laboratórium: teljes vér, szérum, plaz-ma, vizelet, széklet,
nyál, spinális (gerincvelői), szinoviális (ízületi) folyadékot, magzatvizet (amniotikus folyadék), különböző
szilárd szövettípusokat, illetve specifikus sejteket. Az egyes mintavételi eljárások jól sztenderdizáltak. Tekintsük
át, a legfontosabb mintákat, mintavételi eljárásokat.
1.1.1.1.1. Vér (minta)
A vizsgálathoz szükséges vért vénából, artériából és kapillárisból nyerhetjük. Leggyakrabban a vénás vért
vizsgáljuk, amelyet vérvétellel nyerünk. Csecsemőktől, illetve „ágy melletti” (point of care) vizsgálatokhoz
kapilláris vért vehetünk. Artériás vérvételre leggyakrabban vérgáz analízishez kerül sor. A vérvételi eljárás latin
elnevezése phlebotomia és kizárólag gyakorlott szakember végezheti. (Az angolszász területen és
szakirodalomban külön phlebotomist végzi.) A mintavételt követően lehetőségünk adódik, hogy megvizsgáljuk
a teljes vért, a plazmát, amelyet az alvadás gátlóval kezelt vér lecentrifugálása révén kapunk. Itt a kiülepedett
csapadék a sejtes elemeket, a felülúszó pedig a plazmát tartalmazza. Ezen kívül vizsgálhatjuk a szérumot,
amelyet úgy kapunk, hogy hagyjuk megalvadni a vért és ezt követően centrifugálással eltávolítjuk a sejtes
elemeket. Ez utóbbi esetben tehát a vérvételi cső nem tartalmaz semmiféle alvadás gátló anyagot.
1.1.1.1.1.1.1.1.1. Vénás vérvétel
Minden olyan mozzanatot magában foglal, amely során megfelelő és beazonosított vér-mintát nyerünk a beteg
vénájából.
1.1. ábra - Vákumos vérvétrli cső
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1. Megelőző lépések
Mielőtt bármit tenne a vérvételt végző személy a legfontosabb és legelső dolga a beteg azonosítása. A folyamat
során legalább két-három paraméterre ki kell térnie (ilyenek lehetnek például a név, a TAJ szám, születési idő
stb.), amelyeket a mintavételi eszközö-kön a mintavétel előtt fel kell tüntetni (1.1. ábra).
Ennél a pontnál kell kérdést intézni az esetleges allergiáról. A legfontosabb a jódérzékenység tisztázása, mert
allergia esetén nem alkalmazható jódos fertőtlenítőszer, ezen kívül fontos a latex allergia tisztázása is (az
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
7 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
egészségügyben általában latex kesztyűt használnak, illetve a véna elszorítására használt strangulátor is
tartalmazhat latex elemeket). A mintavétel előtt a vérvételt végző személy megfelelő védő öltözéket és védő
eszközöket kell, hogy felvegyen. Nagyon fontos, hogy magát, illetve a többi beteget is megóvja az esetleges
fertőzésektől. A védőöltözetnek mindig része a köpeny (egyes esetekben ez teljesen áthatolhatatlan folyadékok
számára) és a gumikesztyű. Különleges esetekben természetesen, különleges védőruházatra is szükség lehet (pl.:
maszk, szemüveg). A betegnek a mintavétel előtt, során kényelmesen kell elhelyezkednie. Kényelmesen le kell
ültetni, esetleg fektetni, amennyiben nem lehetséges az ülő pozíció (1.2. ábra). Fontos, hogy annyi ideig legyen
ebben a kényelmes helyzetben (a vérvételt megelőzően) ameddig csak lehetséges és a helyzet megkívánja. Járó
beteg esetében tanácsos már a személyazonosítást leültetve a későbbi helyzetben végezni, így a relaxáció ideje
meghosszabbítható. Álló helyzetben sohasem szabad vért venni! A beteg karját a válltól a csuklóig egyenesen
kell, hogy tartsa. El kell kerülni a vérvételt olyan karból, amelyben intravénás kanül, vagy kiterjedt hematóma,
seb, vágás található. A vérvételt végző személynek le kell ellenőriznie a kiírt vizsgálatokat, meg kell becsülnie a
levenni kívánt vér mennyiségét, illetve ki kell választania a megfelelő számú és típusú mintavételi csövet a vér,
a plazma és a szérum számára.
A megfelelő csöveken kívül a megfelelő tűt is ki kell választania. A leggyakrabban 19-22-gauge-s (G-s) tűket
használnak (minél nagyobb a G érték annál kisebb átmérőjű a tű). Minél nagyobb a tű, annál kisebb a folyadék,
áramlási sebessége, a nyíróerő (ami például a vörösvértesteket károsíthatja). Egy normális vénákkal rendelkező
felnőtt esetében általában 20 G-s tűt használnak. Amennyiben a véna összeesésre, kollapszusra hajlamos inkább
21 G-st. Nagyobb mennyiségű (30-50 ml) vér vételére a megfelelő véráramlást biztosítandó G 18-ast (igaz ez a
méret a vákuumos csöveknél már nem használatos). A tű általában 3,7 cm (1,5 hüvelyk), vagy 2,5 cm (1
hüvelyk) hosszú. Az utóbbi méretűekhez általában szárnyas, vagy más néven pillangós tű csatlakoznak.
Természetesen mindegyik tűnek, sterilnek, hegyesnek, sorjamentesnek kell lennie.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.2. A vérvétel helye
Legyakrabban a vena cubitalis-ból vesznek vért (1.3. ábra), mivel ez a véna nagy és közel fut a bőrfelszínhez. A
kézfej és a boka vénái is alkalmasak lehetnek speciális esetekben, ámbátor ezek kevésbé preferáltak és
kifejezetten kerülni kell rossz keringéssel rendel-kező személyek (pl. cukorbetegek) esetén.
1.2. ábra - Vérvételi hely, előkészített vérvételi eszközökkel.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
8 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.3. A vérvétel helyének előkészítése
A vérvételi hely környékét meg kell tisztítani. Erre a célra leggyakrabban négy különféle anyagot használnak:
előrecsomagolt alkoholos vattát, 70%-os izopropanollal átitatott gézlapkát, benzalkonium-klorid oldatot, illetve
hemokultúra vétele esetén jódos lemo-sásra is szükség van. Benzalkonium-klorid oldatot használnak abban az
esetben, ha a mintából alkohol meghatározás történik. A vérvételi hely megtisztítása bentről kifelé irányuló
körkörös mozdulatokkal kell, hogy történjen. A bőrnek meg kell száradnia, el kell kerülni, hogy alkohol, vagy
más fertőtlenítőszer maradjon a bőrön, mert az hemolízist okozhat és meghamisíthatja a vizsgálatok eredményét.
Amennyiben már egy-szer a bőrfelületet megtisztítottuk, akkor azt nem szabad megérinteni, tapogatni,
nyomkodni.
1.3. ábra - Vénás vérvétel helye.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
9 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.4. Időzítés
A laboratóriumi vizsgálatokhoz ideálisan a vérvétel reggel, éhgyomorra történik. A mintavétel időpontja kritikus
azokban az esetekben, amikor olyan alkotót vizsgálunk, amelyek hangsúlyos diurnális ingadozással bírnak (mint
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
10 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
például a kortikoszteroidok és a vas). Szintén fontos azokban az esetekben, amikor a mérendő paraméter alapján
állítanak be egy adott gyógyszerterápiát. Ezen kívül fontos lehet alkohol és drog meghatározásnál.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.5. Vénás vérvétel
Az alapos nekikészülődést követően tekintsük át magát a vérvétel folyamatát. Miután a bőrfelületet
fertőtlenítettük, egy vérnyomásmérő mandzsettát, vagy strangulátort he-lyezzünk 10-15 cm-rel a tervezett
vérvételi pont fölé (felnőttek esetén érvényes távol-ság) (1.3. ábra). Ez a vénás elszorítás megakadályozza, hogy
a vénás vér visszaáramoljon a szívbe és kitágítja a vénákat. Amikor vérnyomásmérő mandzsettát használunk a
célra nagyjából 60 Hgmm körüli nyomásra szokás felfújni. A strangulátorok puha, gumis anyagból készült
textilcsíkok. Általában egy percnél rövidebb ideig szokás fent tartani a strangulátort. Ez alatt az időperiódus alatt
a vér összetételbeli változása elhanyagolható, azonban három percet követően már egész jelentős mértékű lehet.
Az elsőként levett vér (a vér, amely a strangulátorhoz legközelebb található) összetétele áll a legközelebb a
keringő vérhez. Ebből az okból kifolyólag az elsőként levett mintát, olyan meghatározásokra kell felhasználni,
mint például a Ca2+ szint meghatározása, amelyek így megfelelőek a kritikus orvosi döntésekhez. A későbbiek
során levett vér egyre inkább magában hordozza a keringés hiányából, a vénás pangásból eredő hatásokat. Ezen
változásokat figyelembe véve kell meghatározni a mintavétel sorrendjét. A vénás pangással a víz és a
kismolekulák visszaszivárognak (abszorbeálódnak) a sejtbe, ezáltal megnövelve az oldhatatlan anyagok, mint a
fehérjék és fehérjékhez kötődő anyagok koncentrációját. Így az első csőben még mindössze 5%-os, addig a
sorban harmadjára levett csőben már 10% körüli fehérjekoncentráció növekedéssel kell számolnunk. Hosszabb
tartamú vénás pangás során akár 15%-os növekedést is tapasztalhatunk a fehérjékhez kötött anyagok
koncentrációjában. A vérvételt megelőzően az ököl pumpálása elkerülendő, mivel a plazma kálium, foszfát és
laktát szintjének megemelkedését okozhatja.
1.4. ábra - Vérvételi eszközök
A vérvételt leggyakrabban vákuumos vérvételi csőbe végezzük, mert így a vérvétel zárt rendszerben történhet,
amivel a fertőzésveszély csökkenthető. Ez a módszer általá-ban olcsóbb, kényelmesebb és egyszerűbb, mint a
fecskendővel történő vérvétel. Számos fajtájuk létezik, amelyek térfogatukban, illetve az alkalmazott
adalékanyagban térnek el egymástól. A kupak színe utal az adalékanyag minőségére. A különböző csövek tartal-
mát, az esetleges keresztreakció miatt sohasem szabad keverni, összeönteni.
Egy tipikus vákuumos vérvételi cső a hozzá való tűvel az 1.4. ábrán látható. A tűt, vagy szárnyas (pillangó) tűt a
vérvételi cső tartójába csavarják. Használat előtt érdemes óvatosan megkocogtatni a csövet, hogy az esetlegesen
a kupakjába került adalékanyagokat eltávolítsuk, mielőtt a tűt a vénába szúrnánk. Ezáltal elkerülhető, hogy
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
11 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
esetlegesen a beteg vénájába kerüljön az adalékanyag. A bőrfertőtlenítést követően tehát óvatosan a beteg
vénájába kell tolni a tűt, amikor a tű a helyére került, a csövet a tartóba nyomjuk, hogy átszúrja a kupakot a tű
(belső fele) és a vákuum kifejthesse hatását. Amikor a vér elkezd a csőbe áramlani a strangulátort ki kell oldani
anélkül, hogy megmozdítanánk a tűt. A cső addig telik, amíg a vákuum tart. Az kritikus, hogy a vákuumcső
teljesen megteljék. Az adalékanyagok mennyiségét aszerint számították ki, hogy teljesen megtelt csővel
kalkuláltak. Amikor a cső teljesen megtelt lehúzzuk a tartóról és óvatosan összekeverjük úgy, hogy nem hirtelen
mozdulattal a feje tetejére fordítjuk, majd vissza (a keverő mozdulatot a cső fajtájától függően néhányszor
megismételjük). Ezt követően, amennyiben szükséges kicseréljük egy üres csőre. A soron következő csövet
ugyanezzel a technikával megtöltjük, oly módon, hogy a csőtartó végig a helyén marad. A vérvételi eszközben
egy gumis visszacsapó szelep biztosítja, hogy a csövek cseréjekor ne folyjon ki a vér. Tekintve, hogy különböző
metabolikus változások játszódnak le, amennyiben az alvadék, vagy a sejtes elemek közvetlenül érintkeznek a
szérummal, illetve a plazmával. Szeparációs gyűjtő csövek alkalmazásával elkerülhető ez a probléma.
Mindegyik cső tartalmaz egy tixotróp polimer gélt, amely sűrűsége 1,04 g/cm3 körül van. Ez a sűrűség pont a
plazma, vagy szérum és a sejtes elemek sűrűsége között van. Centrifugáláskor ez a gélszerű anyag felemelkedik
a cső aljáról és egy réteget képez a folyékony fázis és a sejtes elemek között. A centrifugálást követően tehát a
gél képezte mechanikai határoló réteg révén elkerülhető a fent említett metabolikus változás lejátszódása. A
centrifugálásnál alkalmazott relatív nehézségi gyorsulásnak 1100 g körül kell lennie a gél felemelkedéséhez. Az
így létrejött mechanikai határréteg több órán, akár néhány napon keresztül is műkö-dőképes.
Fecskendővel meglehetősen ritkán vesznek vért, manapság szinte kizárólag olyan betegektől, akik vénájából
igen nehézkes a vérvétel, illetve vérgáz analízis céljából. Fecskendővel történő vérvétel esetén a tűt 15º-os
szögben szúrjuk a vénába és a fecskendővel finoman szívjuk le a vért. A fecskendőt cserélgetjük, amelyből
rögtön vérgáz analízisre kell vinni a mintát, illetve áttölteni egy előre elkészített csőbe. Áttöltéskor különösen
figyelni kell, hogy a vér kifecskendezése finoman történjen meg, nehogy hemolizáljon a minta (a vörösvértest
membrán sérülésekor tartalma a plazmába kerül és további vizsgálatra alkalmatlanná teszi, meghamisítja az
eredményeket).
1.5. ábra - A sejtes elemek és a plazma/szérum centrifugálással történő elválasztást
követően. A két fázis között látható a mechanikai határvonalat képező gélréteg
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
12 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
13 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Amikor a vérvétel befejeződik a vérszivárgás valószínűségét csökkentendő, megkérjük a beteget, hogy legalább
5 percig szorítson a szúrás helyére egy száraz gézlapkát és tartsa a karját nyújtott állapotban. Ezt követően egy
újabb gézdarabkát fel lehet ragasztani, amit nagyjából 15 perc elteltével távolíthat el. Amennyiben a vérvétel
hagyományos tűvel történt a csőtartóval együtt kidobjuk a használt tűket gyűjtő edénybe. Amennyiben szárnyas
(pillangó) vérvételi eszközzel vettük a vért a szárnyakat előre nyomva befedjük a tűt, az újabb eszközökön
található egy gomb, amelyet megnyomva egy rugót old, amely visszahúzza a tűt. Minden csövet az intézeti
rendnek megfelelően feliratozni kell (lehetőleg még a vérvétel előtt). A kesztyűket, potenciálisan
szennyezettnek kell tekinteni minden esetben, a veszélyes hulladéktárolóba dobjuk. Ezt követően kezet kell
mosni mielőtt új kesztyűt húzunk az újabb vérvétel előtt.
1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.6. Vénás vérvétel gyerek esetében
A vénás vérvétel technikája gyerek és felnőtt páciensek esetén teljesen hasonló. A gyerekek azonban
hajlamosabbak váratlan mozdulatokra, így plusz odafigyelés és a mozdulatlanul tartásuk kívánatos lehet.
1.1.1.1.1.1.1.1.2. Kapilláris vérvétel
A kapilláris vérvétel során a bőrt (nyitott rendszerben) egy kis lándzsával megszúrjuk és e kicseppenő kis
mennyiségű vért egy kis gyűjtőedénykébe fogjuk fel. A gyakorlatban ezt a módszer alkalmazzuk, amennyiben 1.
a mintatérfogat limitált (pl. csecsemők, kisgyerekek esetében), 2. az ismételt vénás vérvételsúlyos
vénakárosodással járna, 3. a beteg megégett, vagy be van kötözve és így a vénás vérvétel nem lehetséges.
Szintén ezt a technikát alkalmazzák ágy melletti, point of care tesztek esetén. A leggyakrabban ujjbegyből
vesznek vért. Ebben az esetben a gyakori használat miatt a hüvelyk és a mutatóujjat, a mérete miatt pedig a
kisujjat kizárjuk és a középső és gyűrűs ujj két oldalát (nem középen) szoktuk megszúrni. Amennyiben ez a
vérvételi hely akadályba ütközik kapilláris vér vehető a fülcimpából, illetve csecsemők esetén a sarok két
oldalából, vagy a nagylábujjból (1.6. ábra).
1.6. ábra - Kapilláris vérvételi helyek csecsemők esetében
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
14 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
15 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Természetesen a vénás vérvételhez hasonlóan, ez esetben is a bőr fertőtlenítésével kezdődik a konkrét vérvételi
procedúra. Amikor a bőrfelület már megszáradt, egy hegyes lándzsával megszúrjuk. A szúrás mélysége
maximum 2,5 mm lehet, hogy elkerüljük az esetleges csontsérüléseket. Amennyiben ujjbegyből történik a
vérvétel, úgy kell azt tartani, hogy a gravitáció révén az ujjak végébe áramoljon a vér és a szúrást valamelyik
oldalon a körömhöz közel (de nem veszélyesen közel) kell megejteni. Az ujjak véráramlást fokozó
masszírozását el kell kerülni, mivel ebben az esetben sérülhetnek a sejtek, szövetek és a szöveti folyadék
kiáramolhat. Tekintve, hogy ennek összetétele eltér a plazmáétól meghamisíthatja a mérési eredményt. A
véráramlás fokozásának szabályos módja, ha az ujjbegyet, vagy a csecsemők sarkát egy meleg vizes ruhával,
vagy speciális eszközzel megmelegítjük. Az első kicseppenő vércseppet letöröljük és az ezt követő(ke)t töltjük
éppen csak a vérvételi cső falához érintve. A csőbe töltésnek gyorsnak kell lennie az alvadást elkerülendő,
illetve figyelni kell, nehogy levegőbuborék kerüljön a mintába. A kapilláris vérvételi csőbe a kapilláris hatás
eredményeképpen kerül a vér. Számos vérvételi kapilláris van kereskedelmi forgalomban, különböző véralvadás
gátló anyagokkal, mint a nátrium- és az ammónium-heparin, illetve fényérzékeny anyagok vizsgálatához, mint a
bilirubin rendelkezésre áll barna üvegből készült kapilláris is. Az utóbbi időben kezdenek elterjedni a kevésbé
törékeny műanyag, vagy műanyag bevonatú vérvételi kapillárisok.
Az újszülöttek szűrővizsgálatánál, illetve az egyre gyakoribb genetikai vizsgálatoknál alkalmazott szűrőpapírra
történő mintavétel során a szűrőpapírt óvatosan egy nagyobb vércsepphez érintjük és hagyjuk, hogy az felszívja
és kitöltse az előre kijelölt kört (1.7. ábra). A procedúrát körönként külön-külön kell elvégezni, ugyanazzal a
cseppel több kört nem szabad kitölteni. a szűrőpapírt a levegőn kell megszárítani, figyelve a gombás és
bakteriális befertőződés elkerülésére. Ez nagyjából 2-3 óra alatt bekövetkezik és egy előre feliratozott papír
borítékban tároljuk. Vérvételi kapillárisba gyűjtött vért sohasem szabad a szűrőpapírra áttranszferálni, mivel a
kapillárisban már az részben, vagy teljesen megalvadhatott, így a minta minősége bizonytalan lehet.
1.7. ábra - Újszülöttek szűrővizsgálata
1.1.1.1.1.1.1.1.3. Artériás vérvétel
Az artériás vérvétel speciális hozzáértést és képességeket igényel és gyakran kizárólag orvos, vagy az erre
kiképzett technikus, vagy nővér végezheti. Az artériás vérmintákat elsősorban vérgáz analízisre használják. Az
artériás vérminta vétele leggyakrabban a 1. csuklói radiális artériából, 2. a felkari brachialis artériából, vagy 3. a
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
16 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
lágyéki femoralis artériából történik. Tekintve, hogy a femoralis artériából (elsősorban idős embereknél) a vér
kiáramlása jóval nagyobb mértékű a karból történő mintavétel jóval gyakoribb.
1.1.1.1.1.1.1.1.4. A vérvételt befolyásoló tényezők
A vérvételt befolyásoló tényezők közé tartoznak az alvadásgátlók, tartósítószerek használata, a vérvétel helye és
a hemolízis.
1.1.1.1.1.1.1.1.4.1.1.1.4.1. Alvadásgátlók és vértartósítószerek
Plazmát és bármilyen alvadásmentes vérkészítményt kizárólag különböző alvadás gátlók teljes vérhez történő
adagolásával nyerhetünk. Számos alvadásgátló készítmény van forgalomban, mint például a heparin, EDTA,
savas citrát dextróz (ACD), citrát, nátrium-fluorid, oxalát és a jodoacetát.
Heparin: A heparin a legáltalánosabban használt alvadásgátló kémiai és hematológiai vizsgálatok esetén, de
nem alkalmazható polimerázláncreakció (PCR) esetén, mivel ez a nagy fehérje molekula gátolja a polimeráz
enzimet. A heparin egyik legnagyobb hátránya, magas ára, illetve, hogy kék hátteret ad Wright festéssel
készített vérminták esetében. A heparin gátolja a savas foszfatáz aktivitását és interferál a kalcium EDTA
kötésével. Szintén befolyásolja a trijódtironin (T3) és a tiroxin (T4) hordozó fehérjéjükhöz kötését, ily módon
megnöveli ezen hormonok szabad formájának koncentrációját.
EDTA (etilén-diamin-tetraacetát): Az EDTA, mint jó kelátor kétértékű kationokat köt, mint például a Ca2+ és
a Mg+. Elsősorban hematológiai vizsgálatok és teljes genomi DNS izolálása esetén használják. Az EDTA-t
dinátrium, dikálium, illetve trikálium só formájában alkalmazzák, az utóbbi kettő jobb vízoldhatósággal
rendelkezik. Az ICSH (International Council for Standardization in Haematology) ajánlása alapján a
hematológiai mérésekhez K2-EDTA-t kell használni.) Általában 1-2 g/l-es koncentrációban használatos, az ettől
magasabb koncentráció hatására zsugorodnak a vörösvértestek. Az alvadást a Ca2+ megkötése révén éri el.
ACD (savas citrát dextróz): Elsősorban molekuláris diagnosztikai célokra szánt minták esetében alkalmazzák,
mivel mind a sejtes elemek formáját (citogenetikai tesztek), mind funkcióját megőrzi.
Nátrium-fluorid: gyenge alvadásgátló. Tekintve, hogy gátolja a glikolízist a glukózt igen jól konzerválja a
vérmintában. Az urea meghatározást zavarja, mivel gátolja az ureáz enzimet is.
Citrát (nátrium-citrát): 34-38 g/l-es koncentrációban alkalmazzák 1 rész citrát, 9 rész vér arányban (3,2%-os
citrátot kell használni a véralvadási vizsgálatokhoz). Igen széles körben alkalmazzák koagulációs (véralvadási)
tesztekben, mivel hatása könnyen visszafordítható Ca2+ hozzáadásával. Tekintve, hogy a citrát megköti a Ca2+-t,
nem alkalmazható antikoagulánsként, olyan esetekben, amikor ezen elem meghatározása a cél.
Oxalát (nátrium-, kálium-, ammónium-,litium-oxalát): oly módon gátolja meg az alvadást, hogy viszonylag
oldhatatlan komplexet alkot a Ca2+-kal. Leggyakrabban a kálium oxalátot alkalmazzák 1-2 g/l-es
koncentrációban.
Nátrium-jodoacetát: Igen gyakran helyettesítik a nátrim-fluoridot vele, olyan minták esetében, amelyekből
mind glukóz, mind urea tesztet akarnak végezni, mivel ez nem gátolja az ureázt. A legtöbb klinikai teszttel nem
interferál.
1.1.1.1.1.1.1.1.4.1.1.1.4.2. A mintavétel helye
A különböző helyekről vett vérminták összetétele eltérő. A kapilláris vér összetétele sokkal inkább az artériás
vér összetételéhez hasonlít, mint a vénás véréhez. A szabadon folyó kapilláris vér és az artériás vér pH, PCO2,
PO2 és oxigén szaturációja között gyakorlatilag nincs eltérés, míg a vénás vér PCO2 értéke 6, 7 Hgmm-rel (8, 9
kPa) magasabb. A vénás vér glukóz koncentrációja legalább 0,4 mM-rel alacsonyabb a szöveti metabolizmus
következtében. A kapilláris vérvétel során a vér intersticiális, illetve intracelluláris folyadékkal szennyeződik,
aminek következtében a vénás vérhez képest megnő a glukóz és kálium koncentrációja, illetve lecsökken a
bilirubin, a Ca2+, a Cl-, a Na+ és a teljes fehérje koncentrációja.
Amennyiben centrális vénás katéteren, vagy artériás vonalon veszünk vért, meg kell bizonyosodnunk afelől,
hogy a páciens szervezetébe juttatott folyadék nem befolyásolja a minta összetételét.
1.1.1.1.1.1.1.1.4.1.1.1.4.3. Hemolízis
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
17 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A hemolízis a vörösvértestmembrán kiszakadását és a hemoglobin, illetve más sejtalkotók kijutását jelenti. A
szérum már szemmel látható változásokat szenved, a hemolízis nyilvánvaló, amennyiben a hemoglobin
koncentrációja meghaladja a 200 mg/l-es értéket (1.8. ábra). Az enyhe hemolízis a legtöbb mért paraméter
értékét nem befolyásolja jelentős mértékben. A komolyabb mértékű hemolízis, a leggyakoribb kémiai tesztekre
enyhe hígítási hatást gyakorol azon összetevők esetében, amelyek szintje az eritrociták belsejében alacsonyabb,
mint a plazmában. Sokkal nagyobb a jelentősége azoknak az összetevőknek, amelyek szintje az eritrociták
belsejében magasabb, mint a plazmában, ilyenek a laktát-dehidrogenáz (LDH), a kálium, a magnézium és a
foszfát.
1.8. ábra - Hemolizált (jobb oldalt) és nem hemolizált (bal oldalt) plazma.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
18 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
19 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.1.1.1.2. Vizelet
A gyűjtött vizeletfajta milyensége attól függ, hogy milyen vizsgálatokat szeretnénk elvégezni.
Általában adott időtartamon keresztül (1, 4, 24 óra) gyűjtött vizeletet szoktunk vizsgálni, mivel a random vett
vizeletminta csak erősen korlátozott mértékű kémiai vizsgálatra alkalmas. A tiszta, korán reggel, éhgyomorra,
felkelés után vett minta általában a legkoncentráltabb minta ezért ez a legalkalmasabb a mikroszkópos,
abnormális anyagok, mint például a fehérjék jelenlétének, illetve szokatlan anyagok, mint a hCG (humán Chorio
Gonadotropin) vizsgálatára.
Az ürített vizelet első 10 ml-ének bakteriális vizsgálata a legmegfelelőbb az urethritis (húgycsőgyulladás), a
középsugaras vizelet pedig a legmegfelelőbb a húgyhólyag rendellenességek megállapítására. A különböző
metabolikus rendellenességek vizsgálatára leginkább a rendellenesség tüneteinek jelentkezésével egyidejűleg,
vagy közvetlen utána gyűjtött vizelet a legmegfelelőbb. A betegnek tanácsos a genitáliáit megmosni
vizeletürítés előtt, hogy a minimálisra csökkentse a felületéről a vizeletbe jutó baktériumok számát.
1.1.1.1.2.1.1.2.1. Gyűjtött vizeletminták
A gyűjtési időnek elegendően hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy a rövid idejű biológiai változékonyságot
minimálisra csökkentsük. A gyűjtött vizeletminták esetében nagyon fontos, hogy a beteg a mintagyűjtési
szabályokat maximálisan betartsa (igen komoly hiba forrása lehet a szabálytalan mintavétel). A gyűjtési
periódus kezdetekor a hólyagját teljesen ki kell ürítenie, az így nyert vizeletet ki kell önteni, majd az összes
vizeletet fel kell fogni egészen a kijelölt gyűjtési időpont végéig. Amennyiben a betegnek széklete van az ürítési
időszak alatt vigyázni kell, nehogy keresztszennyezze a mintát vele. Amennyiben hosszabb időn keresztül tart a
gyűjtés a mintát ideálisan 4 °C-on kell tárolni. Amennyiben több edénybe történik az ürítés, azok tartalmát
egyesíteni kell, hogy homogén minta kerüljön a laboratóriumba.
Egyes esetekben kívánatos lehet különböző tartósítószereket (pl. savat) adni a gyűjtött vizelethez.
Amint a vizeletgyűjtési idő lejárt a vizeletet rögtön a klinikai laboratóriumba kell vinni analízisre.
1.1.1.1.3. Széklet
A széklet vizsgálata szinte kizárólag különböző mikroorganizmusokra, a hasmenés kiváltó okának tisztázására
és a vér jelenlétére terjed ki, amelyből a gasztointesztinális fekélyes és rosszindulatú elváltozásaira
következtethetünk. Gyerekek székletének triptikus aktivitását cisztás fibrózis diagnózisához szokták vizsgálni.
Felnőttek esetében a széklettel ürített nitrogén és zsír meghatározása a felszívódási zavarok (malabszorpció)
súlyosságát mutathatja, illetve egyes esetekben a fekális porfirin meghatározása hozzájárulhat a porfiria
típusának meghatározásához.
Tartósítószert nem szoktunk a székletmintához adni, de a hűtésről egyes esetekben gondoskodni kell, illetve el
kell kerülni a vizelettel történő keresztszennyezést.
1.1.1.1.4. Gerincfolyadék (liquor cerebrospinalis)
A gerincfolyadékot leggyakrabban a lumbális régióból szoktak venni, de esetenként előfordul, hogy műtétek
esetében más területről is. A következő betegségek gyanúja indikálhatja a gerincfolyadék vizsgálatát: 1.
cerebrovaszkuláris sérülés 2. meningitisz 3. demielinizációval járó betegségek, 4. malignus betegség agyi
áttéttel. A lumbális punkciót kizárólag orvos végezheti. A mintavevő edényeknek sterilnek kell lenniük,
különösen, ha mikrobiológiai tesztre kerül sor. Tekintve, hogy az elsőként levett minta szöveti törmelékkel
szennyezett lehet ezt kizárólag kémiai és szerológiai vizsgálatokra használhatjuk fel, a másodikat
mikrobiológiai, a harmadikat pedig mikroszkópikus és citológiai vizsgálatokra.
1.1.1.1.5. Ízületi folyadék
A vizsgálati céllal végzett ízületi folyadékvételi technikát arthrocentesisnek nevezik. Az ízületi folyadékvétel
segítségével megállapíthatjuk az arthritis (ízületi gyulladás) típusát, mibenlétét. Normálisan csak igen csekély
mennyiségű folyadék található az ízületekben, azonban gyulladás esetén ennek mennyisége igen jelentős
mértékben is megnőhet. A mintavételi eljárást orvos végzi steril körülmények között és ő állítja fel limitált
mintamennyiség esetén a vizsgálatok prioritási sorrendjét is. A mintavételi eljárás esetenként és ízületenként
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
20 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
jelentős variabilitást mutat. Sima steril csövet használunk molekuláris diagnosztikához, tenyésztéshez, glukóz és
fehérje meghatározásokhoz, EDTA-s csövet teljes leukocita, differenciál és eritrocita számláláshoz.
1.1.1.1.6. Magzatvíz (amniotikus folyadék)
Analóg módon a magzatvízgyűjtési eljárást amniocentézisnek nevezik. Ezt is kizárólag orvos végezheti, a
következő esetekben: 1. veleszületett betegség prenatális diagnózisa, 2. a magzat érettségének megállapítása, 3.
Rh-izoimmunizáció, vagy intrauterin fertőzés gyanúja esetén. A mintavétel általában altatásban történik, a
lefertőtlenített bőrfelületet egy hosszú tűvel szúrják át és 10 ml folyadékot szívnak le egy fecskendővel. A
mintát steril tárolóedénybe töltik és küldik a laboratóriumba analízisre. Amennyiben a magzati tüdő fejlettségét
kívánják megállapítani a surfactant, albumin, vagy a lecitin-szfingomielin arány alapján, akkor a mintavételt
követően rögtön jégre helyezik. A fényérzékeny anyagokat barna csőbe veszik és így továbbítják a laborba.
1.1.1.1.7. Mellhártya, szívburok és hasűri folyadékok (pleurális, perikardiális folyadékok és ascites)
Normálisan ezen szerózus folyadékok a velük szemben található membránfelületeken történő könnyebb csúszás
végett nedvesítési funkciókat töltenek be. Gyulladás esetén térfogatuk jelentős mértékben megnőhet.
1.1.1.1.8. Specifikus sejtek
A szájüregből vehető bucca sejtekből kiválóan lehet genomi DNS-t izolálni. Két módon szokás mintát venni: 1.
speciális összetételű szájvízzel alaposan átöblíti a száját a beteg, majd egy gyűjtőedénybe köpi azt, 2. egy kis
darab steril vattával (mint a fülpiszkáló) megdörzsöli a szájüreg belsejét és a vattára tapadt sejtekből izolálunk
DNS-t.
A másik egyedi sejtgyűjtés a CVS (Chorionic Villus Sampling), azaz a korionboholy mintavétel. A mintavétel
során egy katétert, vagy egy tűt tolnak a placentába és (a magzatburokból a placentába nyúló
érképződményekből a) korionbolyhokból lecsípnek egy kicsit. A korionbolyhok a magzattal megegyező
genetikai háttérrel rendelkeznek, így kiválóan alkalmas genetikai rendellenességek vizsgálatára. Előnye, hogy a
10-12 héten már elvégezhetőek ezen vizsgálatok, míg a magzatvízből történő hasonló vizsgálatok csak a
terhesség 15-20 hetét követően.
1.2. A minták kezelése
A megfelelő vizsgálati eredmény csak reprezentatív, megfelelő módon gyűjtött és megfelelő módon kezelt
minta révén érhető el. A megfelelő kezelésnek szerves része az egyértelmű mintajelölés, mintaazonosítás.
1.2.1.2.1. A minták minőségének megőrzése a szállítás, tárolás során
Minden hőérzékeny minta esetében a szérum és plazma preparálásához szükséges centrifugálást hűtött
centrifugában kell elvégezni. Néhány fényérzékeny alkotót, mint például a bilirubint és a karotint óvni kell a
napfénytől és a mesterséges fénytől egyaránt. A vérmintákat a szállítás során óvni kell a hemolízist okozó
rázkódástól. Amennyiben pneumatikus csőrendszerben történik a szállítás, ezt úgy kell kialakítani, hogy az ne
tartalmazzon hirtelen kanyarokat és megállásokat. Amennyiben ez nem biztosítható, vagy a beteg olyan kezelést
kap, aminek következtében sejtjei sérülékenyebbek lesznek, a centrifugálást a szállítást megelőzően el kell
végezni.
Eleve a szérum és plazma sejtes elemektől történő szeparálását, olyan gyorsan el kell végezni, amilyen gyorsan
csak lehet, de mindenképpen két órán belül. Amennyiben ez nem lehetséges inkább szobahőmérsékleten tároljuk
a mintát, mint 4 °C-on, mivel így csökkenthető a hemolízis mértéke. Számos bomlékony analit esetében, mint
például sok hormon a szérumot, plazmát rögtön a centrifugálást követően le kell fagyasztani. A mintatartó
csöveket kupakkal együtt kell centrifugálni, hogy megelőzzük a minta összetételének megváltozását, illetve
csökkentsük a fertőzésveszélyt.
1.3. Preanalitikai variabilitások
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
21 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.3.1.3.1. Kontrollálható variabilitások
A fent részletezett mintavétellel kapcsolatos tényezők mind a kontrollálható preanalitikai variabilitások közé
tartoznak. Szintén ebbe a csoportba sorolhatjuk az élettani variabilitásokat, továbbá a diétával, életvitellel,
stimulánsokkal, gyógyszerekkel, gyógynövényekkel és a roboráló szerekkel kapcsolatos tényezőket.
1.3.1.3.1.1.3.1.1. Élettani variabilitások
Testhelyzet: Egy átlagos felnőtt szervezetében nagyjából 10%-kal (600-700 ml) csökken a vértérfogat, ha fekvő
testhelyzetből álló helyzetbe kerül. Tekintve, hogy kizárólag fehérjementes folyadék halad át a kapillárisok falán
a szövetekbe ez a plazma mennyiségének csökkenését és a plazma fehérjekoncentráció (8-10%-os) emelkedését
jelenti. Normális esetben ez a térfogatváltozás 10 perc alatt lejátszódik, azonban ha valaki hosszú távon
ágynyugalomra volt kárhoztatva ez az idő hosszabb is lehet.
Fekvőbetegek esetén első körben a plazma és az extracelluláris folyadéktérfogat csökken, ami természetesen
növekedett fehérje és fehérje-kötött anyag koncentrációval jár együtt. Hosszabb távú fekvés esetén viszont a
folyadék visszatartás megnövekszik és a hígítási hatás miatt a plazma albumin és a fehérjekötött anyagok
koncentrációja csökken. A hosszan tartó fekvés kihatással van a kis molsúlyú anyagok és számos ion
koncentrációjára is. Ezt, valamint azt a tényezőt, hogy csak jóval később (néhány héttel) a hosszú távú
fekvőállapot megszűntét követően normalizálódik a helyzet fontos figyelembe venni az eredmények
értékelésekor.
Fizikai aktivitás: Természetesen figyelembe kell venni, hogy milyen mértékű és időtartamú az aktivitás.
Általánosságban csak annyit érdemes megjegyezni, hogy 1. az aktivitással erőteljes folyadékáramlás indul be az
intravaszkuláris és interstíciális kompartimentumok között, 2. az aktivitásbeli különbség, jelentős hormonszint
változást okoz, 3. a verejtékezéssel jelentős folyadékvesztés jár együtt.
A konkrét metabolikus, enzimszintbeli változásokra az aktuális paraméterek tárgya-lásánál fogunk kitérni.
Cirkadián változások: A cirkadián változások az analitek 24 óra alatt leírt termelési, szekréciós és
koncentráció mintázatát, görbéjét jelenti. A testfolyadékok megannyi alko-tója mutat ilyen ciklikus napi
változást. Ehhez a ciklikussághoz számos tényező járulhat hozzá, mint a testhelyzet, aktivitás, táplálkozás,
stressz, napfény és sötétség, az ébredés és alvás. Egyes esetekben igen kifejezett is lehet, figyelmen kívül
hagyásuk komoly értékelési problémákhoz vezethet, ezeket az adott esetekben feltétlenül meg fogjuk említeni.
Menstruációs ciklus: Nők esetében a nemi és más hormonok szintjét is igen jelentős mértékben befolyásolja a
menstruációs ciklus. Erre külön fejezetben (reproduktvív en-dokrinológia) is ki fogunk térni.
A fent részletezett élettani variabilitásokon kívül még számos kontrollálható variabilitással kell az eredmények
kiértékelésekor számolnunk, ilyenek az utazás, a diéta, a különböző táplálkozási szokások (pl. vegetáriánus),
a malnutrició, az éhezés és jóltápláltság, az életstílus, amiben fontos szerepet kap a dohányzás és
alkoholfogyasztás. A különböző gyógyszerek, táplálék kiegészítők fogyasztása.
1.3.1.3.2. Nem-kontrollálható variabilitások
A nem-kontrollálható variabilitások körét a 1. biológiai, 2. környezeti, 3. hosszú távú ciklikus befolyások és az
4. alapvető egészségügyi helyzet adja.
1.3.1.3.2.1.3.2.1. Biológiai hatások
A beteg kora, neme és a rassz, amelybe tartozik, mind befolyásolják laboratóriumi tesztjeinek eredményét. Igen
gyakran oly mértékben, hogy különböző referencia tartományokat kell felállítani ezek figyelembevételével.
Életkor: Az életkor igen jelentős mértékben befolyásolja a referencia intervallumokat, elsősorban a hormonok
esetében. Általában négy korcsoportba szoktuk osztani a betegeket: újszülött és csecsemő (1 éves korig),
gyerekek és kamaszok (pubertás), szexuálisan érett felnőttek és idősek.
Nem: Egészen a pubertásig csak igen kevés különbség tapasztalható a fiúk és a lányok laboratóriumi
paraméterei között. Ezt követően a nemi hormonok és a következményes fiziológiai változások, mint például a
férfiak esetében általában előforduló nagyobb izomtömeg már igen jelentős eltéréseket is okozhat.
Mintavétel, preanalitikai folyamatok
és variabilitásuk
22 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.3.1.3.2.1.3.2.2. Környezeti hatások
A laboratóriumi paramétereket befolyásoló környezeti tényezők közé tartozik a 1. tengerszint feletti magasság, a
2. környezeti hőmérséklet, a 3. földrajzi hely, lakhely, illetve az 4. évszaki befolyások.
1.3.1.3.2.1.3.2.3. Alapvető egészségügyi állapot
A következő általános egészségügyi állapotot befolyásoló tényezők bizonyosan befolyással vannak a
testfolyadékok összetételére: 1. elhízás, 2. vakság, 3. láz, 4. sokkos állapot, trauma, 5. transzfúzió és infúzió.
23 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2. fejezet - Molekuláris biológiai módszerek az örökletes, veleszületett betegségek diagnosztikájában
2.1. A DNS, a humán DNS főbb jellemzői
A sejtjeink DNS állománya által kódolt fehérjék határozzák meg sejtjeink szerkezetét és funkcióját.
Amennyiben a DNS állományunk megváltozik, sérül, megváltozhat az általuk kódolt fehérje szerkezete, ezáltal
funkciója is, amely igen gyakran betegségekhez vezethet. Vegyük szemügyre kicsit alaposabban genetikai
háttértárunkat, sejtjeink DNS állományát.
A humán sejtek két kompartimentumban tartalmaznak örökítő anyagot, DNS-t a sejtmagban (nukleáris DNS) és
a mitokondriumban.
Nukleáris DNS: A sejt DNS állományának legnagyobb része kettős magmembránnal védve, a sejtmagban
található. A sejtmagban található DNS mintegy hárommilliárd (3,2*109) bázispárból áll. Ez a hárommilliárd
bázispárnyi DNS 46 db (23 pár) kromoszómán oszlik meg, nagyjából 25000 önálló transzkripciós egységet, gént
tartalmazva. Az ivarsejtek és még néhány sejt kivételével minden egyes humán sejt minden kromoszómából két
kópiát, egy apai és egy anyai eredetű kópiát tartalmaz. 2001-re ismertté vált a humán genom első, még kissé
kiforratlan szekvenciája, 2004-re pedig a finom szekvencia is. A humán genom megismerésével az örökletes,
genetikai betegségek diag-nosztikája is nagy lendületet kapott. A hihetetlen adathalmaz több jelentős direkt
felfedezést is hozott. Az első közülük az volt, hogy a genom mindössze igen csekély része (1-1,5%-a) a fehérjét
kódoló szakasz. Egy átlagos gén mintegy 27000 bázispárból (bp) áll. Ha ezt összevetjük azzal, hogy egy átlagos
méretű fehérjelánc kódolásához mindössze 1300 bp-ra van szükség, akkor láthatjuk, hogy valóban jelentős
méretű a nem kódoló részek aránya. Mi lehet ezen szekvenciák szerepe? Az exon és intron szekvenciákon kívül
jelentős méretű regulációs szekvencia is társul minden egyes génhez, amelyek feladata, hogy a megfelelő időben
be (vagy ki) kapcsolt állapotban legyen az adott gén, illetve biztosítják, hogy a megfelelő mértékben fejeződjék
ki és csak is kizárólag a megfelelő sejttípusban.
A teljes genom szekvenciájának ismeretében megválaszolhatjuk a sokakat érdeklő kérdést, hogy mekkora
különbség van két különböző fajhoz tartozó élőlény és mekkora két ember DNS szekvenciája között.
Egy csimpánz és egy ember DNS szekvenciája mindössze nagyjából 1%-os különbséget mutat. Ha két ember
ugyanazon DNS szekvenciáját vizsgáljuk meg, akkor pedig kevesebb, mint 0,1% különbséget találunk. Nyílván
az egyes fajok közötti különbség, mint egy adott egyed különbsége (mutációja) jelenik meg először. Az, hogy az
adott mutáció megragad-e a populációban és így a fajra jellemzővé válik-e az azon múlik, hogy milyen
funkcionális következményekkel jár. Amennyiben a mutáció egyértelműen súlyos, káros következményekkel
jár, akkor kiszelektálódik és nem ragad meg a populációban (hordozója méhen belül, vagy születést követően, a
legtöbbször utódok nélkül meghal). Következésképp, ha egy egyértelműen előnyös reprodukciót érintő
tulajdonságról van szó, az nagyon gyorsan elterjedhet a populációban. A mutációk legnagyobb része se nem
káros, se nem előnyös. Ezen szelekciósan neutrális mutációk szintén megragadhatnak és elterjedhetnek, így
hozzájárulhatnak a különböző genomok evolúciós változásához.
Az emberek között egyik leggyakrabban jelentkező különbség, nagyobb DNS blokkok (melyek mérete
nagyjából 1 kilobázispártól néhány megabázispárig terjed) duplikációja, illetve deléciója. Ha egy találomra
kiválasztott ember DNS állományát összehasonlítjuk a genom adatbázisban található szekvenciával, nagyjából
100 különbséget (CNV – copy number variation) találhatunk, az ilyen hosszú szekvencia blokkok között.
Néhány ilyen „kópia számbeli különbség” gyakrabban, míg mások csak az emberek kis hányadában fog
előfordulni. Az egyes fajok, egyedek között fennálló különbségek közül az egy bázis cseréjével járó SNP-k
(single nucleotid polimorphism) a legjobban karakterizáltak. Ahogy a nevük is mutatja, mindössze egyetlen
nukleotidot érintenek a genomban, amelyben az emberek egy nagyobb populációja egyféle, míg másik jelentős
részük egy másik féle nukleotidot tartalmaz. Ha két ember genomját összehasonlítjuk, akkor azok 2,5 millió
ilyen helyen (1 az 1300 nukleotid párból) fognak különbözni. Néhány szekvencia részlet kiemelkedik magas
mutációs rátájával. Erre jó példát szolgáltatnak a néhány nukleotidból álló ismétlődések, például a CA
ismétlődés(ek), amelyek igen gyakoriak a humán genomban (ahogy az összes eukarióta genomban). A (CA)n
motívumot tartalmazó DNS részletek viszonylag alacsony fokú hűséggel replikálódnak, mivel a templát és az
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
24 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
újonnan szintetizálódott lánc között csúszás van, így az n pontos értéke az egyes genomok között meglehetősen
széles skálán változhat. Ezek az ismétlődések, így ideális genetikai markerek, tekintve, hogy minden ember
heterozigóta – két különböző n értéket hordoznak minden egyes CA ismétlődésre, egyféle hosszt örökölve az
anyától (n) és jó eséllyel egy másfajta ismétlődést, hosszúságot örökölve az apától. Így az adott szakasz két
kópiájában az ismétlődések hossza egyedre jellemző, és kiválóan felhasználható molekuláris markerként például
kriminalisztikai vagy apasági ügyekben. Habár a legtöbb hosszúság polimorfizmus és SNP a fenotípust nem
befolyásolja, egy kis hányaduk egyértelműen felelőssé tehető az emberi sajátságok örökletes aspektusaiért. A
klinikai kémikus szemével nézve pedig igen nagy a jelentősége, hogy akár egyetlen SNP, vagy akár a DNS
hosszának (egy adott szekvencia ismétlődési számának megváltozása: hosszúság polimorfizmusa) olyan
fehérjeszerkezetbeli különbséget idézhet elő, amely igen súlyos kórképek kialakulásához vezethet.
Mitokondriális DNS: A mitokondriális DNS (mtDNS) jóval kisebb méretű, mint a nukle-áris mindössze 16569
bp-ból áll. A lineáris nukleáris DNS-sel ellentétben cirkuláris (a bakteriális DNS-hez hasonlóan), ezzel is
bizonyítékot szolgáltatva a mitokondrium bakteriális eredetére. A mtDNS kizárólag anyai ágon öröklődik,
kizárólag a petesejtekben található mtDNS-ek határozzák meg a születendő gyerek mtDNS-ét. A kisméretű
mtDNS összesen 37 gént tartalmaz. A 37 gén közül 13 gén fehérjét kódol, 2 gén rRNS-t, 22 gén tRNS-t. Az
mtDNS által kódolt fehérjék a mitokondriális elektron transzfer lánc fontos alkotói. A II-es komplex kivételével
mindegyik komplex rendelkezik egy, vagy több mtDNS által kódolt alegységgel (I: 7 db, III: 1 db, IV: 3 db,
ATP-szintáz: 2 db). A mtDNS által kódolt RNS-ek pedig a mitokondriális transzlációs apparátus alkotói. A
mtDNS-ben bekövetkezett mutációk, éppen ezért a sejtek energiatermelő folyamataira lesznek ha-tással. Ezért
különösen a nagy energiaigényű szövetek (ideg, szívizom, vázizom, máj) esetében kell súlyos
következményekkel számolnunk.
A mtDNS pedig különösen magas mutációs rátával rendelkezik, aminek oka lehet rossz hibajavító apparátusa, a
mitokondriumban termelődő nagy mennyiségű reaktív oxigénvegyület, a mtDNS nem rendelkezik klasszikus
hiszton fehérjékkel, ez tovább fokozza védtelenségét. Mindezek hozzájárulhatnak ahhoz, hogy jelenleg több
mint 5000 különféle mtDNS mutációt ismerünk. Az mtDNS mutációk száma a kor előrehaladtával nő, így az
idősebb korosztályt hangsúlyosabban érinti.
2.2. DNS izolálás
A klinikai kémiában egyre növekvő szerepet kapnak a molekuláris biológiai módszerek. Felhasználjuk őket: 1.
örökletes, genetikai hátterű betegségek diagnosztizálására. Ebben az esetben az előző fejezetben leírtak szerint
ismert SNP-ket, vagy a DNS hosszúságának megváltozását keressük. 2. Kórokozók kimutatására. Ebben az
esetben ismert idegen eredetű, az adott kórokozóra jellemző szekvenciájú DNS jelenlétét mutatjuk ki.
Amennyiben ezt a DNS részletet ki tudjuk mutatni azzal meghatároztuk az adott élőlényt (vírust, baktériumot,
gombát, személyazonosítás esetén embert). 3. Egyre nagyobb súlyt kapnak (a személyre szabott gyógyszeres
terápia térnyerésével) a farmakogenetikai vizsgálatok (pl. CYP2C9 polimorfizmusok), 4. Végül, de nem utolsó
sorban kiemelt szerep jut számukra a vérképzőszervi daganatok diagnosztikájában, genetikai hátterének
felderítésében (pl. Philadelphia kromoszóma: t(9,22)).
Mindegyik esetben az első feladat megfelelő minőségű DNS izolálása. Tekintsük át röviden, hogy milyen
fontosabb lépései vannak a DNS izolálási eljárás(ok)nak.
A mintavétel, ahogy az 1. fejezetben írtuk a vizsgálat céljától függő szövetből történhet invazív módon,
leggyakrabban vérvétellel, korionboholyból (CVS), illetve nem invazív módon bucca sejtekből, hajból,
körömből. Természetesen bármilyen DNS tartalmú minta alkalmas lehet DNS izolálásra, legfeljebb a módszert
kell adaptálni, a leggyakrabban gyakorlati megfontolásból az előbb felsorolt mintákból történik a DNS
kinyerése.
2.2.2.2.1. A sejt feltárása
A DNS-hez hozzá kell férnünk, így első lépésünk a sejt feltárása lesz. Humán sejtek esetében, amelyek nem
rendelkeznek sejtfallal legtöbbször elegendő a hipotóniás sokk (valamilyen alacsony koncentrációjú semleges
kémhatású pufferbe tesszük a feltárandó sejteket). A komoly sejtfallal rendelkező baktériumok esetében
szükséges a sejtfal emésztése lizozimmel. Ezen kívül szövetdarabok, baktériumok esetén szükség lehet
mechanikai szövet-, sejtfeltárásra. Ilyen mechanikai feltárók a French press, Waring késes feltáró, a BeadBeater,
a Potter-Elvehjem feltáró. Szintén mechanikus feltárási eljárás, a térfogatváltozáson alapuló, ismételt
fagyasztás-olvasztás. Kötőszövetekből történő izolálás esetén (kollagenáz) enzimes kezelésre is szükség lehet. A
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
25 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
különböző membránszerkezetek megbontása detergensekkel, illetve enzimekkel (leggyakrabban proteináz K)
történik.
2.2.2.2.2. A sejt saját nukleázainak inaktiválása
Célunk a lehető legkisebb mértékben sérült genomi DNS (egyes esetekben organelláris DNS) kinyerése. Ehhez
a sejt saját nukleázait, amelyek felszabdalnák a DNS szálakat inaktiválnunk kell. Ez leggyakrabban EDTA
tartalmú pufferek használatával történik meg, mivel ezek a nukleázok működéséhez szükséges ionokat (Ca2+,
Mg2+) megkötik.
2.2.2.2.3. Szennyező alkotók eltávolítása
A legnagyobb gondot a szennyező fehérjék jelenthetik (különösen a leggyakoribb izolálást követő folyamat, a
PCR alkalmazása során). A szennyező fehérjéktől leggyakrabban oldószeres extrakcióval
(fenol/kloroform/izoamil-alkohol) szabadulhatunk meg. A fenol vízzel rosszul elegyedő folyadék, ha a
mintánkhoz, a vizes DNS, fehérje oldathoz adjuk két külön fázis jön létre (hasonlóan mint a víz, olaj
rendszereknél). A fehérjék a fenolos, a DNS pedig a vizes fázisba oldódik. A két fázis, centrifugálással
elkülöníthető és a vizes-DNS fázis lepipettázható. Ezen kívül a fehérjék elkülöníthetők még szelektív
kicsapással. A fehérjék eltávolítása ez esetben NH4OAc-tal, vagy NaCl-dal történő kicsapással történik. A
kicsapódott fehérjéket ezt követően centrifugálással leülepíthetjük.
2.2.2.2.4. A DNS szelektív kinyerése
A vizes DNS oldathoz, vele megegyező térfogatú, alkohol oldatot adva a hosszú DNS láncok kicsapódnak és
centrifugálással könnyen szeparálhatóak. A DNS alkoholos kicsapása történhet 2-propanollal, illetve etanollal.
Újabban néhány kromatográfiás módszer is megjelent a piacon. Alkalmazásuk egyelőre meglehetősen drága,
ezért széles körben nem terjedtek még el.
2.3. A DNS méret szerinti elválasztása gélelektroforézissel
A DNS méret szerinti elválasztása leggyakrabban agaróz gélben szokott történni. A gél alapanyaga az agaróz
egy hínárból kivont poliszacharid, amely csak forró vízben oldódik és lehűlve megdermed. A feloldást követően
egy téglatest alakú formába töltjük és egy fésűt helyezünk a még olvadt agaróz oldatba. A dermedést követően a
„fésűfogak” lenyomata fogja képezni a gélzsebeket, amelyekbe az elválasztani kívánt DNS oldatot töltjük. Az
agaróz tömböt egy pufferrel töltött kádba helyezzük, amelyre egyenáramot kapcsolunk (2.1. ábra). A
gélelektroforézis során az áram hatására a foszfát csoport miatt negatív töltésű DNS a pozitív elektróda irányába
mozdul el. Az elmozdulást a gélmátrix annál jobban akadályozza minél nagyobb méretű a DNS szál. A
gélelektroforézist mindaddig végezzük, amíg a DNS oldathoz kevert kék színű indikátorfesték, például a bróm-
fenol kék el nem éri a gélhasáb szélét. A bróm-fenol kék és társai kis molekulaméretű, negatív töltésű festékek,
így a DNS-szálak garantáltan lassabban haladnak és nem futnak ki a gélből a pufferbe. Ekkor, hogy láthatóvá
tegyük a DNS-szálakat a gélt etídium-bromid oldatba tesszük. Az etídium-bromid egy fluoreszcens festék,
amely a DNS és RNS molekulák bázisai közé interkalálódik. A gélt UV fénnyel átvilágítva a nukleinsav
láncokba interkalálódott etidium-bromid élénk színnel fluoreszkál. A DNS-szálak méretét ismert hosszúságú
DNS-t tartalmazó, DNS molekula tömeg markerrel, úgy nevezett létrával tudjuk megállapítani. Az azonos utat
megtevő DNS csíkok, azonos mérettel rendelkeznek (2.1. ábra).
2.1. ábra - DNS minták (agaróz) gélelektroforézise.
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
26 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A DNS mérete és a megkívánt felbontás alapján választjuk ki a gél anyagát, töménységét. Az agaróz
gélelektroforézis egyszerű, de nem túl jó felbontást tesz lehetővé (viszonylag tömény 2% körüli gél esetében is
maximum 10 bp-os felbontás). Az agaróz mellett, kisebb méretű (50-1000 bp) DNS-szálak elválasztására
alkalmazzák a poliakrilamid gélelektroforézist. Ebben az esetben már 3 bp-os felbontás is elérhető. Ettől
komolyabb felbontás, akár 1 bp különbség is elérhető kapilláris gélelektroforézis-sel. Kapilláris
gélelektroforézis során egy keskeny kapilláris egyik oldalán történik a mintafelvitel és a hagyományos
gélelektroforézissel megegyező módon, a kapilláris két oldalára kapcsolt egyenáram hatására történik meg a
különböző gélmátrixot tartalmazó kapillárisban a méret szerinti elválasztás. A kapilláris túloldalán található
detektor segítségével történik a nukleinsavak detektálása (2.2. ábra).
2.2. ábra - DNS minták kapilláris elektroforézise.
Eredményként, egy kromatogramhoz hasonló elektroforetogramot kapunk, ahol az eltelt idő, vagy a
molekulaméret függvényében ábrázolják a detektor jelének intenzitását (2.9. ábra).
Az izolálás során nyert genomi DNS hosszú, különböző mértékben fragmentálódott darabokból áll. Nehezen
kezelhető ebben a formában. A DNS minták kezelését megoldja, illetve a további vizsgálatok is megkívánják,
hogy kisebb darabokra vágjuk őket. Ebben bakteriális enzimek, a restrikciós endonukleázok vannak a
segítségünkre. A DNS-hez kötődnek a specifikus (általában 4-6 bp-ból álló) felismerési helyen és elhasítják a
DNS láncot. Eredetileg a baktériumokba behatoló vírusok ellen fejlődtek ki. A saját DNS állományukat nem
hasítják, mivel mindegyik restrikciós endonukleáznak létezik egy metiláz párja, amely a saját DNS-t metilálja,
ezáltal egy védő jelet téve rá.
Az enzimek révén akár SNP-k kimutatása is lehetségessé válik. Ha a kérdéses SNP átfed valamely restrikciós
endonukleáz specifikus hasítási helyével, akkor annak megléte, vagy hiánya befolyásolja az adott DNS darab
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
27 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
adott enzimmel történő hasítását. Például a vad típusú DNS esetén létrejön a hasítás, az SNP-t (pontmutációt)
tartalmazó esetén pedig, mivel megváltozott az enzim hasítási helye nem. Így, amennyiben vad típusú a DNS,
két rövidebb darabkát kapunk az enzimmel történt hasítást követő gélelektroforézis során. Amennyiben a
vizsgált DNS minta hordozta a szóban forgó SNP-t, akkor pedig egy hosszabbat.
2.4. Hibridizáció, Southern blot
A gélelektroforézis és az etídium-bromidos festés segítségével az egyes DNS szálak hossza megállapítható, de a
különböző bázissorrenddel rendelkező DNS szálak nem különböztethetők meg egymástól. Az egyes DNS szálak
beazonosítása során azt használjuk ki, hogy a kettős szálú DNS vizes oldatban 100 °C-on, vagy lúgos pH-n
szétbomlik szimpla szálakra (a kettős láncot összetartó hidrogén hidak felbomlása miatt, melynek egyik esetben
a magas hőmérséklet okozta hőmozgás, a másikban az enol-oxo tautoméria áll a hátterében). Ha huzamosabb
ideig 65 °C-on tartjuk újra kettősszálú szerkezetet vesz fel, kialakulnak a komplementer bázispárok között a
hidrogén hidak: hibridizál (renaturálódik). Amennyiben a hibridizáció során a keresett DNS szakasszal
komplementer, jelölt próbát is adunk a DNS oldatunkhoz, azok a megfelelő (komplementer) régiókkal
hibridizálni fognak. A próbák tehát 15 – néhány ezer bázispár hosszú radioaktívan, vagy fluoreszcensen jelölt
nukleotid szakaszok.
Az eljárás tehát két fő részből áll:
1. Elsődleges durva elválasztás gélelektroforézissel (méret szerint)
2. Másodlagos specifikus analízis jelölt hibridizációs próbával
A módszert, kifejlesztőjéről, Sir Edwin Southernről, Southern Blot technikának nevezték el. Később hasonló
módon, a Southern Blot technikára alapozva megvalósították az RNS szálak: Northern Blot és a fehérjeláncok:
Western Blot azonosítását is. S mivel southern angolul annyit tesz, hogy déli az utóbbi esetekben már az eltérő
égtájakról történt elnevezés, az eltérő molekulák azonosítására utal.
A módszer igen érzékeny és szelektív. A polimeráz láncreakció (PCR), amely szintén a hibridizáción alapul
azonban valamelyest háttérbe szorította.
2.5. Polimeráz láncreakció (PCR)
A polimeráz láncreakció során – melynek ötlete kifejlesztőjének Kary Mullis fejében egy ezüstmetál Honda
Civicben töltött hajnali autóút során fogant meg, miután hazavitte barátnőjét és lakása felé hajtott –
tulajdonképpen a sejtben zajló replikáció folyamatát másoljuk le. A legfontosabb különbség az, hogy míg a
replikáció során a teljes genomot lemásolja a sejt, addig a PCR során a minta DNS mindössze egy általunk
kiválasztott hosszabb, vagy rövidebb részletéről készül igen jelentős számú kópia (2.3. ábra).
2.3. ábra - Polimeráz láncreakció
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
28 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Adódik a kérdés, hogy tudjuk mi kiválasztani a megsokszorozni kívánt DNS szakaszt? Bizonyára mindenki
emlékszik még rá, hogy a DNS polimeráz, csak egy már megkezdett oligonukleotid láncot tud folytatni. Így a
PCR reakcióelegynek tartalmaznia kell egy 15-25 bp hosszú kezdő DNS oligonukleotid szekvenciát, a primert.
A primer szekvenciáját mi adjuk meg és gyártatjuk le egy céggel. A primer a bázis komplementaritás alapján
hozzáköt a templát DNS vele komplementer régiójához és a DNS polimeráz ettől a ponttól kezdve folytatja a
lánc meghosszabbítását. Mindebből következik, hogy a módszer alkalmazásának előfeltétele, hogy a
vizsgálandó DNS-szakasz nukleotid sorrendjét – legalább részben, a primerek tapadási helyeinél – ismerjük.
Tekintsük át, milyen reagensekre van szükségünk a „kémcső replikációhoz” és pontosan milyen folyamatok is
zajlanak a PCR csőben!
Hozzávalók:
• Templát DNS: Ezt az előzőek szerint izoláljuk a betegből származó mintából.
• PCR puffer
• Primerek: tervezzük, majd leszintetizáltatjuk
• dNTP Mg2+: az újonnan szintetizálandó DNS lánc(ok) építőelemei
• Hő stabil DNS polimeráz (pl. Taq, Pfu)
Történések:
Minden alkotót a megfelelő arányban összemérünk egy PCR csőbe és a PCR készülékbe helyezzük. Ez
tulajdonképpen egy programozható termosztát. Egy általános PCR hőprogram három lépésből áll.
1. Denaturáció: A lépés során a készülék 95 °C-ra melegíti a reakcióelegyet. Ennek hatására a kettős szálú DNS
részletek között a hidrogénhidak felhasadnak és egyszálúvá válnak.
2. Primerek betapadása: Az angolszász irodalomban annealing-nek nevezett lépés során a készülék 40-60 °C
közé hűti le a reakcióelegyet. Ennek hatására a rövid primerdarabok betapadnak a komplementer DNS
részletekhez, létrejönnek köztük a H-hidak és megindul a polimerizáció, a lánchosszabbítás folyamata.
3. Polimerizáció: A lépés során a készülék 72 °C-ra melegíti a reakcióelegyet. Ez a hő stabil polimeráz
optimális működési hőmérséklete, a polimerizáció folyamata felgyorsul.
A PCR reakció során ezt a három lépést ismétli ciklikusan a műszer (2.4. ábra)
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
29 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2.4. ábra - A polimeráz láncreakció lépései, hőprogramja
Egy lépés nagyjából fél percig tart és hozzávetőlegesen 35-50-szer szoktuk megismételni. A primer, ahogy az
ábrán is látjuk az újonnan szintetizált DNS az egyik végét határozza csak meg. Így a kívánt jól definiált
hosszúságú termék csak a leányszálakról, illetve azok utódszálairól készülhet. Ez problémát nem okoz, mivel
néhány ciklus alatt ezek száma bőven meghaladja (exponenciális mértékű növekedés) a kizárólag a templát
DNS-ről készülő nem pontosan definiált hosszúságú DNS szakaszok hosszát (lineáris mértékű növekedés).
A PCR tehát lehetőséget ad arra, hogy egy adott DNS szekvencia jelenlétét kimutassuk, hiszen kizárólag abban
az esetben keletkezik az adott (a primerpár, tehát általunk meghatározott) hosszúságú PCR termék, ha a
primerpárral komplementer szekvencia jelen van. A PCR-t követő gélelektroforézis során ez ellenőrizhető. Így
viszonylag gyorsan juthatunk a DNS minőségét mutató eredményhez, tehát információt kaphatunk egy adott
mutáció, vagy patogén jelenlétéről, vagy távollétéről.
Idővel felmerül az igény, hogy ne csak a DNS minőségéről, hanem mennyiségéről is információhoz jussunk. Ez
a hagyományos PCR-rel nem volt lehetséges, hisz a PCR végén mérhető DNS mennyiség nem áll
összefüggésben (a PCR során folyamatosan változó hatásfok miatt) a kiindulási DNS mennyiségével. Tehát
olyan módszert kellett kidolgozni, amely folyamatosan a reakció során információt szolgáltat a DNS
mennyiségéről, azaz valós időben, real-time nyomon tudjuk követni a folyamatot.
2.6. Real-time PCR, a DNS mennyiségi meghatározása
Lássuk csak, miben különbözik a real-time (valós idejű) PCR a hagyományos PCR-től! A reagens összetételnél
két fontos különbséget kell megemlítenünk: 1. a primerpár mellett, egy fluoreszcensen jelölt harmadik
oligonukleotidot is tartalmaz a reakcióelegy. 2. A hőstabil polimeráznak 5’–3’ exonukleáz aktivitással kell
rendelkeznie. A készülék ebben az esetben már nem egy egyszerű programozható termosztát, hanem egy arra
ültetett fluorimétert is magában kell foglalnia, amely minden egyes ciklus végén megméri az egyes PCR
csövekben található reakcióelegy fluoreszcenciáját.
2.5. ábra - Real time PCR TaqMan próbával
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
30 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Most pedig nézzük meg, miben különbözik a reakció, mi ad lehetőséget a mennyiségi DNS meghatározásra! A
real-time PCR működési elvét a TaqMan próbával történő detektáláson mutatjuk be, de fontos megjegyezni,
hogy számtalan más detektálási eljárás létezik, jelen könyvnek nem célja ezek részletes bemutatása
A primer betapadási lépés során nemcsak a primerek, hanem a harmadik, a fluoreszcensen jelölt oligonukleotid,
a TaqMan próba is betapad. A TaqMan próba szekvenciáját úgy tervezzük meg, hogy a megsokszorosított DNS
darabka egy belső, rövid szakaszának komplementere legyen. A próba két, fluoreszcensen gerjeszthető
festékmolekulát is hordoz. A két festékmolekula eltérő fluoreszcens spektrummal rendelkezik: az R riporter
festékmolekula által kibocsátott fényt a próba másik felére kötött (2.5. ábra) Q kioltó festék képes elnyelni,
amennyiben a két festék közötti távolság nem haladja meg a 100 nm-t. Tehát kellő közelségben a riporter festék
által emittált fény nem detektálható, ha azonban a két festék távolabb kerül egymástól, detektálhatóvá válik a
riporter által kibocsátott fény is.
A real-time PCR során a polimerizációs lépésben a polimeráz útjába kerül a TaqMan próba, az 5’–3’ exonukleáz
aktivitása révén az hasítani fogja, aminek eredményeképp az 5’ végen található riporter festék már kellő
távolságba kerül, hogy detektálhatóvá váljon fluoreszcenciája (2.5. ábra). Minden egyes ciklussal a szaporodó
DNS-sel arányosan nő a fluoreszcens jel nagysága is. Így a PCR készülékre szerelt fluoriméter segítségével real-
time azaz valós időben detektálni tudjuk a DNS mennyiségét.
A ciklusszám függvényében egy exponenciálisan növekvő, majd (valamelyik DNS építőelem limitálóvá
válásával) telítésbe hajló görbéket kapunk. Az a ciklus, ahol a görbénk az exponenciális növekedési szakaszba
lép, ahol a görbe metszi az alapvonalat, (2.6. ábra) a küszöbciklus.
2.6. ábra - Real time PCR eredménygörbék és kiértékelésü
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
31 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tekintve, hogy a DNS felszaporodása kezdetben exponenciális a mennyiségi meghatározásnak az, az alapja,
hogy az amplifikációs görbe exponenciális fázisán belüli küszöbértékhez tartozó PCR ciklusok száma és a DNS
kiindulási kópiaszámának logaritmusa között lineáris összefüggés van a 2.7. ábrának megfelelően.
2.7. ábra - A kiindulási DNS kópiaszámának logaritmusa és a PCR küszöbciklusszámok
között meglévő lineáris összefüggés
A real-time PCR-nél szoros összefüggés van a kiindulási DNS koncentráció (kópiaszám) és a felszaporodás
időbeni lefutása között, így ismert koncentrációjú standardok párhuzamos vizsgálata lehetőséget ad a
mintánkban jelen levő DNS-szakaszok koncentrációjának meghatározására (2.7. ábra).
A módszer alkalmazása révén meghatározható például a Hepatitis C vírustiter. Így kontrollálható az egyes
vírusellenes készítmények hatásossága és kiválasztható az, amelyik a legnagyobb mértékben szorítja vissza a
vírusszámot.
2.7. A PCR technika klinikai diagnosztikai alkalmazásai
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
32 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A módszerek ismertetését követően itt az ideje, hogy néhány gyakorlati példán bemutassuk alkalmazásukat.
Az örökletes betegségeket többféleképpen csoportosíthatjuk: Az olyan betegségeket, amelyek egy gén adott
mutációjának következményei, monogénes betegségeknek nevezzük. Ilyen például az V. véralvadási faktor
mutációja, a Leiden mutáció, amely fokozott trombózishajlammal jár együtt. Ezen betegségek esetében,
különösen, ha súlyos életet veszélyeztető állapotot idéznek elő igen nagy jelentősége van a prenatális
diagnosztikának. Ezen elváltozások száma erősen limitált. Az olyan betegségeket, amelyek akkor alakulnak ki,
ha több génben történik mutáció poligénes betegségeknek nevezzük. Ebben az esetben egyik, vagy másik gén
mutációjának kimutatásakor nem mondhatjuk, hogy biztosan kialakul a betegség, csak azt, hogy az illető
rizikófaktorokkal rendelkezik. A poligénes betegségre jó példa a nem inzulindependens cukorbetegség
(NIDDM).
A DNS-ben történt elváltozás szerint megkülönböztethetjük az egyetlen bázis cseréjével járó SNP-k és a DNS
hosszúságának (ismétlődések számának megváltozásával, delécióval, duplikációval) megváltozásával járó
hosszúságpolimorfizmusok kiváltotta kórképeket. A két különböző elváltozás eltérő molekuláris biológiai
diagnosztikai eljárásokat igényel.
A következőkben néhány példát ismertetünk a hosszúságpolimorfizmusok és az SNP-k okozta örökletes
betegségekre és kimutatási módszereikre.
2.7.2.7.1. Hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek és vizsgálatuk PCR-rel
2.7.2.7.1.2.7.1.1. Huntington-kór
A Huntington kórt elsőként George Huntington írta le mindössze 22 éves korában. A kór autoszomális
domináns módon öröklődő neurodegeneratív megbetegedés (100.000 emberre 5-10 megbetegedés jut a nyugati
lakosság körében), amely olyan progresszív neurológiai tünetekkel jár együtt, mint az akaratlan mozgások
(chorea: az ujjak zongorázásszerű mozgása, dystonia: a folyamatos izom összehúzódás következtében kialakuló
csavaró, hajlító mozdulatok, a testtartással és a járással kapcsolatos abnormalitások), a kognitív funkciók
leromlása és pszichés elváltozások. A betegség kifejlődésével nehezítetté válik a rágás, nyelés és a beszéd. A
neuropatológiai vizsgálatok a striatumra (az előagy belső része) és kisebb mértékben a cortexre (agykéreg)
kiterjedő neurodegenerációt és gyulladást mutatnak. A Huntington kórban szenvedő betegek viselkedésbeli és
neuropatológiás tüneteinek kifejlődése évtizedekig tart. A tünetek leggyakrabban 35-45 éves életkor között
jelentkeznek (de gyerekkortól egészen az idős korig előfordulhat megjelenésük) és a betegség, a beteg állapota
10-20 éven keresztül megállíthatatlanul romlik a motoros szimptómáktól a beteg haláláig.
2.8. ábra - PCR primerek a Huntingtinben található CAG ismétlődések
meghatározására
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
33 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Huntington kór hátterében a CAG tripletek igen nagyszámú ismétlődése áll. Az ismétlődések kódoló régióba
esnek, amely így poliglutamin ismétlődést eredményez, az ismeretlen funkciójú, huntingtin fehérje N-
terminálisának közelében. A poliglutamin ismétlődések normálisan is előfordulnak, de számuk 6 és 34
ismétlődés között változik, azonban azokban az emberekben, ahol az ismétlődési szám meghaladja a 40-et,
mindig kialakul a betegség. A CAG ismétlődések száma fordítottan arányos azzal az életkorral, amikor a
motoros tünetek megjelennek és a betegség általuk diagnosztizálásra kerül.
2.9. ábra - PCR termékek analízise kapilláris elektroforézissel
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
34 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A betegség molekuláris biológiai diagnosztikája PCR segítségével történik. Kezdetben a primerpár egyik felét
az ismétlődési régión kívülre, míg a másik primert magára a CAG ismétlődésekre tervezték. Ezt követően
elegendő volt a PCR termék hosszát kapilláris elektroforézissel megállapítani és eldönthető volt a hosszúság
alapján, hogy az ismétlődések száma meghaladja-e a kritikus értéket, az adott személy hordozza-e a genetikai
elváltozást.
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
35 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A CAG ismétlődések analízise azonban meglehetősen nehézkes lehet a CAG ismétlődési régiót környező DNS
összetétele miatt. A környező terület meglehetősen sok CCG és CCT ismétlődést tartalmaz, amelyek ráadásul
igen polimorfok is.
A problémát úgy hidalták át, hogy egy primer szettet terveztek kizárólag a CAG régióra (HDF1 és HDR1
primerek), kizárólag a CCG régióra (HDF2 és HDR2 primerek), illetve a CAG+CCG régiókra együtt (HDF1 és
HDR2 primerek) (2.8. ábra).
A reverz primereket a detektálás végett 5’ végükön fluoreszcens jelöléssel látták el. A HDR1 és a HDF2
primerekbe pedig szándékosan hibás, nem komplementer nukleotidot vittek be a 3’ végtől visszafelé 2
nukleotidnyira, így fokozva specificitásukat. Tekintve, hogy a CAG ismétlődések szomszédságában található
CCG és CCT régiók polimorfok, három PCR reakciót is végeztek, annak érdekében, hogy a CAG ismétlődések
számát kellő pontossággal meghatározzák.
A PCR termékek hossza a CAG régióra normális allél esetében 116 bp volt, ami 26 ismétlődésnek felel meg,
119-143 bp, 27-35 ismétlődés mutációra hajlamos allél, 146-155 bp, 36-39 ismétlődés igen erős hajlam, illetve a
mutáns allél esetében 158 bp-nál hosszabb, ami több mint 40 ismétlődésnek felel meg (2.9. ábra).
2.7.2.7.2. SNP-k okozta betegségek vizsgálata PCR-re
2.7.2.7.2.2.7.2.1. Leiden mutáció
A Leiden mutáció, amely nevét Leiden városáról kapta, ahol a mutációt felfedező kutatócsoport működött, az V-
ös véralvadási faktor mutációja. Az 1994-ben felfedezett mutáció az aktivált protein C rezisztenciáját okozza és
a vénás trombózis leggyakoribb genetikai rizikófaktora.
A vénás tromboembólia (mélyvénás trombózis és pulmonáris embólia) a nyugati civilizációk egyik igen komoly
egészségügyi problémája, minden ezredik embert érint, és előfordulása növekvő tendenciát mutat. A genetikai
rizikófaktor mellett (ennek hatását jelentősen felerősítendő) számos környezeti rizikófaktor is létezik, mint
például a dohányzás, a férfi nem, idősebb életkor, mozgáskorlátozottság, sebészi beavatkozás, malignus
neoplázia, terhesség, orális fogamzásgátlók szedése, hormonpótló terápia és különböző gyulladások.
Lássuk mi áll a fokozott trombózisveszély hátterében! Az V-ös véralvadási faktor az alvadási kaszkád fontos
tagja a Xa faktorral egyetemben a protrombin trombin átalakulásért felelős. Az 1994-ben közölt mutáció az V-
ös faktor 10-es exonában történik, az 1691-es pozícióban levő nukleotid esetében egy Guanin Adenin csere. A
misszensz mutáció eredménye egy glutamát arginin csere lesz az V-ös faktor nehéz láncának 506-os
pozíciójában. Ez az aminosav csere az Va faktor három aktivált protein C hasítási helyének egyikét érinti (a
másik a kettő: Arg306 és Arg679). A mutáns fehérje teljesen normális módon aktiválódik és megtartja
prokoaguláns funkcióját, csak éppen jóval kevésbé érzékeny az aktivált protein C általi hasításra, inaktivációra,
ezáltal hiperkoagulációs állapotra (aktivált protein C rezisztenciára) hajlamosítva tulajdonosát.
2.10. ábra - Allél specifikus PCR primerek
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
36 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A mutáció szűrése az utóbbi időben egyre nagyobb teret kapott. Jelenleg számos módszer áll rendelkezésre,
például a restrikciós fragmens polimorfizmus, amely esetében a korábbiakban említetteknek megfelelően azt
használjuk ki, hogy a mutáció (SNP) egy restrikciós endonukleáz hasító helyet szüntet meg, vagy hoz létre.
Hasonlóan egyszerű eljárás az allél specifikus PCR. Ezen módszer esetében tervezünk egy primerpárt a
normális, vad típusú DNS-re és egyet a mutációt tartalmazó DNS-re, úgy, hogy a mutációval szembe kerülő
(komplementer, vagy nem komplementer) bázis a primer 3’ végére kerüljön. Ez a hely kiemelt jelentőséggel bír,
ugyanis, ha itt nem komplementer bázis található jó eséllyel nem jön létre a primer betapadása, nem tudja
folytatni a DNS polimeráz a lánchosszabbítást és így nem kapunk PCR terméket (2.10. ábra).
2.11. ábra - Allél specifikus PCR gélelektroforézis eredmények
A reakció specifikussága tovább növelhető a már korábban említett módszerrel, hogy a 3’ végtől visszafelé
néhány nukleotidnyi távolságban egy másik nukleotidot is kicserélünk. Amennyiben a normális primerrel
kapunk PCR terméket egészséges, amennyiben a mutáns primerrel kapunk terméket beteg a vizsgált személy
(2.10. ábra és 2.11. ábra). Amennyiben mindkét primer esetén PCR termékképződést tapasztalunk a vizsgált
személy heterozigóta (2.11. ábra).
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
37 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A real-time PCR klinikai laboratóriumokban történő elterjedésével, az előző allél specifikus PCR-hez igen
hasonló, de fluoreszcens detektálást alkalmazó módszerek egyre nagyobb teret kapnak. Ezek alkalmazásával
elkerülhetők a keresztszennyezésre is alkalmat adó poszt-PCR műveletek és felgyorsítható az eredmény nyerése
is. A korábban ismertetett TaqMan próbán alapuló módszer esetében két allél specifikus próbát tervezünk és egy
primerpárt. Az egyik próba normális, a másik próba mutáns DNS-sel komplementer. Az egyes próbák eltérő
fluoreszcens jelölést kapnak. A PCR-t valós időben nyomon követve látható, hogy melyik jelölést tartalmazó
TaqMan próba esetén nőtt meg a fluoreszcens jel, így a vizsgált személy genotípusa meghatározható.
Amennyiben mindkét próba esetében ezt tapasztaljuk, megint heterozigóta a vizsgált személy.
A mutáció megléte hagyományos alvadási teszttel is kimutatható. Amennyiben a beteg plazmájához aktivált
protein C-t adva nem nyúlik meg az alvadási idő a vizsgált személy aktivált protein C rezisztenciában szenved.
A Leiden mutáció előfordulási valószínűsége igen változó, a leggyakrabban a kaukázusi rasszhoz tartozó
embereket érinti 15%-os előfordulást mutatva, ugyanakkor az ázsiai, afrikai, ausztrál és amerikai őslakosok
körében igen ritka vagy szinte ismeretlen.
A Leiden mutáció a vénás trombózis kockázatát, más környezeti rizikótényezők hiányában nagyjából 4-7-
szeresére növeli heterozigóta esetben és 80-szorosára homozigóta esetben.
2.7.2.7.2.2.7.2.2. Sarlósejtes anémia
Az autoszomális domináns öröklésmenetet mutató sarlósejtes anémiát egy pontmutáció okozza.
A humán hemoglobint 4 polipeptid lánc alkotja, melyek mindegyikéhez egy-egy hem tartozik. Ezen hem
csoportokhoz kötődhet egy-egy oxigénmolekula. A felnőtt hemoglobin A-t (adult, HbA) két alfa és két béta lánc
alkotja. Az alfa lánc génje a 16-os kromoszómán a béta lánc génje a 11-es kromoszómán található. Az
egészséges felnőttek vörös vértestjeiben javarészt (96%-ban) ilyen α2β2 szerkezetű HbA, kis mennyiségben
HbA2 (α2δ2) és magzati (fötális) HbF (α2γ2) található.
A β-génben bekövetkező báziscsere, melynek során a GAG kodon GTG-re cserélődik, a fehérjeláncban egy
glutamát valin cserét eredményez. Az így létrejövő hemoglobinforma, a Hb S, belefekszik a szomszédos Hb β-
lánc hidrofób részébe és így hosszú füzéreket képez, oldhatósága csökken, a vörös vértesteket sarló alakúra
deformálja. A tünetek hátterében is minden esetben az áll, hogy a Hb S-t tartalmazó rugalmatlan, deformált
vörös vértestek elzárják a kapillárisokat. A homozigóta forma akár csecsemőkori halált, növekedési, fejlődési
rendellenességet okozhat. A heterozigóta forma általában csak hipoxiás körülmények között manifesztálódó
tünetekkel jár együtt, ilyenek 1. gyerekekben a lépkárosodás, fokozott szepszishajlam, 2. végtagfájdalmak a
csontok hipoxiája miatt, 3. tüdőgyulladás (pneumonia), 4. nehezen gyógyuló fekélyek, 5. elhalások vesében,
agyban, hasnyálmirigyben, májban.
A kezelés ez esetben is a tünetek enyhítését célozza, például antibiotikum terápia tüdőgyulladás esetén, súlyos
esetben vérátömlesztés (transzfúzió).
2.7.2.7.3. SNP-k és hosszúságpolimorfizmus okozta betegségek
2.7.2.7.3.2.7.3.1. Cisztikus fibrózis
A cisztikus fibrózis egy meglehetősen gyakori autoszomális recesszív módon öröklődő megbetegedés, amelyet
minden 25-30. ember hordoz a kaukázusi populációban. A betegséget hordozók száma a dél-európai, a latin, az
afrikai és az ázsiai populációban jóval alacsonyabb. A betegség hátterében egy több mint 250.000 bp hosszú
génnel rendelkező transzportfehérje defektusa áll. A meglehetősen hosszú gén egy meglehetősen nagyméretű
(1480 aminosav) ioncsatorna fehérjét, a CFTR-t (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) kódolja.
A gén 1989-es azonosítása és klónozása, illetve az a megfigyelés, mely szerint a cisztás fibrózis hordozók 70%-
ában ugyanaz a nukleotid triplett deléció (ΔF508) fordul elő azt a reményt keltette, hogy a veszélyeztetett párok
kiszűrhetők, majd genetikai tanácsadásba vonhatóak, illetve szükség esetén prenatális tesztek végezhetők. A
közelmúltig azonban több mint 1300 más egyéb mutációról számoltak be, s bár a legtöbbjük meglehetősen ritka,
a kizárólag a ΔF508-ra szűrő vizsgálatok mindössze a veszélyeztetett kaukázusi házaspárok 50%-át képes
azonosítani. Ez az arány további 5-10 gyakrabban előforduló mutációt bevonva is csak 81%-ig növelhető.
Természetesen nem tudunk mind az 1300 jelenleg ismert mutációval foglalkozni, így röviden a leggyakrabban
előforduló ΔF508 delécióval szeretnénk foglalkozni, illetve egy rövid áttekintést adni a betegségről.
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
38 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A deléció a CTT triplett kiesését okozza, melynek eredményeképen az 508 pozícióban levő fenilalanin kiesik a
fehérjéből. A mutációk számának, illetve gyakoriságának magas számát feltehetően az okozza, hogy ezek
szelekciós előnyt jelentettek a kolerával szemben. A homozigóta ΔF508 bélhámsejtek érzéketlenek voltak a
koleratoxin szekréciót fokozó hatására. Érdekes módon a fenilalanin kiesése nem okoz direkt funkcióvesztést a
fehérjemolekulán belül. Az érett fehérjemolekula az endoplazmás retikulumban, majd a Golgi apparátusban
glikozilálódik, majd a membránba transzportálódik. A legtöbb mutáció esetében az endoplazmás retikulum
minőségellenőrző rendszere érzékeli a vad típustól eltérő fehérjeszerkezetet és lebontja azt (Ez történik a ΔF508
esetében is.).
A változatos mutációs és környezeti háttér miatt a tünetek igen változatosak, de minden esetben a CFTR
csatorna elégtelen, hibás működése áll a hátterükben, aminek következtében a mirigyek váladéka alacsony víz
és magas iontartalmú lesz. A külső elválasztású mirigyek esetében tapasztalható váladékpangás a kivezető cső
elzáródását (obstrukció) okozza, amelynek következménye cisztaképződés, majd fibrózis lesz. A tüdők az esetek
jelentős részében érintettek, a hörgőket a sűrű nyák ingerli, a beteg köhög, fullad, igen gyakran lép fel
tüdőgyulladás is. A csecsemők egy kisebb részében a béltartalom (meconium) elzárja vékonybelet. A
hasnyálmirigy, mint külső elválasztású mirigy szinte minden esetben érintett, az emésztőenzimek hiánya
emésztési zavarokhoz vezet. A verejtékmirigyek érintettsége igen szembeötlő, az érintett gyerekek bőre
kimondottan sós ízű az iontranszport zavar miatt kialakuló magas só koncentráció miatt, a 60 mM-nál magasabb
Cl- koncentráció a betegségre utal, diagnosztikai értékkel bír.
A betegek várható élettartama pár évtizede mindössze 2-3 év volt. Manapság, a járulékos betegségek, tünetek,
mint például a tüdőgyulladás kezelése antibiotikumokkal, az emésztési problémák kezelése enzimadagolással
révén a várható élettartam 40 év környékére emelkedett. Az enyhébb mutációkkal rendelkező emberek várható
élettartama nem kevesebb, mint bármelyik mutációt nem hordozó embertársunké (70-80 év).
Ahogy, azt már megállapítottuk a nagyszámú mutáció miatt a heterozigóta párok szűrése nem igazán
megoldható. Prenatális vizsgálatokat abban az esetben szoktak végezni, ha a párnak már született beteg gyereke.
A molekuláris biológiai vizsgálatokat legtöbbször restrikciós fragmens polimorfizmus, vagy allél specifikus
PCR segítségével szokták elvégezni.
2.7.2.7.4. STR lókuszok, DNS ujjlenyomat
A következő példa nem örökletes betegséghez, de jellegzetes, örökletes DNS tulajdonsághoz kötődik, ezért
ebben a fejezetben tárgyaljuk.
A humán genom nem kódoló régióiban számos rövid, 2-6 bázispár hosszú ismétlődő DNS szakasz található.
Ezen mikroszatelit, vagy más néven short tandem repeat (STR) szekvenciák érdekességét az adja, hogy
ismétlődési mintázatuk egyedi. Ezen szakaszok ismétlődésének száma alapján egy adott ember pontosan
beazonosítható. Egy példa segítségével próbáljuk meg szemléltetni a gyakorlati jelentőségét, kivitelezését.
Vegyük a következő CATTCG szekvenciájú ismétlődő szakaszt. Ez a szakasz Taszilóban kétszer ismétlődhet,
míg Katinkában szintúgy kétszer, Arisztidben pedig háromszor. Önmagában tehát egy ilyen ismétlődő
szekvencia nem elég ahhoz, hogy megkülönböztessünk két embert, ha azonban vizsgálat tárgyává teszünk még
egy másik ilyen szekvenciát (legyen ez mondjuk a TAAGC), ez mondjuk Katinkában négyszer ismétlődik, míg
a Taszilóban ez is csak kétszer. Amennyiben kellő számú STR szekvencia ismétlődési számát határozzuk meg,
akkor ez alapján beazonosíthatunk egy konkrét személyt is. A vizsgálat alól egyetlen kivétel létezik, az
egypetéjű ikrek esete, akik genetikai állománya teljesen megegyezik. Az ő kivételükkel tehát meg tudjuk
különböztetni az embereket egymástól.
Korábban restrikciós endonukleázokkal készültek az ilyen DNS ujjlenyomatok. Manapság paralel, több STR
lókuszra, fluoreszcensen jelölt primert tervezünk és multiplex PCR-t végzünk el a DNS mintákon. A szimultán
munkavégzés, detektálás végett különböző fluoreszcens jelölést fogunk alkalmazni a különböző primerek
esetében. A primereket úgy tervezzük meg, hogy az egyes primerpárok, az egyes STR lókuszokat közrefogják
(2.12. ábra). A PCR termékek kiértékelése ez esetben is kapilláris elektroforézis segítségével történik
fluoreszcens detektálást alkalmazva. A (primerek révén) különböző hullámhosszokon fluoreszkáló termékeket
meg tudjuk egymástól különböztetni.
2.12. ábra - STR lókuszok PCR analízise
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
39 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tételezzük fel, hogy egy apasági perben kell az apa kilétét megállapítani. Vegyük az alábbi egyszerű esetet,
amikor csak két apajelölt közül kell kiválasztanunk a tényleges, biológiai apa személyét. Ekkor DNS-t kell
izolálni az anyából, a gyerekből, és a két apajelöltből. Az anya és a gyerek lókuszai között nyilvánvalóan
egyezésnek kell lennie (2.13. ábra), ezt követően összehasonlítjuk a két férfi mintáját a gyerekével (2.13. ábra).
2.13. ábra - STR lókuszok gélelektroforetogramja (DNS ujjlenyomat).
Az egyes STR lókuszok ismétlődési számában (PCR termékek hosszában) egyezést mutató lesz a biológiai apa.
Tulajdonképpen a DNS ujjlenyomat nem más, mint ezen, az adott személyre jellemző ismétlődések száma. Az
igazságügyi orvostanban, például egy bűntény helyszínén hagyott nyomokból, hajból, körömből tudnak DNS-t
izolálni és ezekből megállapítani a tettes, tanúk, áldozat, más helyszínen járt emberek DNS ujjlenyomatát,
amelyet később össze tudnak vetni az eljárásba bevont emberek DNS ujjlenyomatával.
2.8. DNS chip
A DNS chip, komoly költségvonzata miatt Magyarországon még egy ideig biztosan nem lesz része a rutin
laboratóriumi diagnosztika eszköztárának. A tankönyv azonban a jövő számára készül, ezért feltétlenül
ismertetni szeretnénk ezt a rendkívül izgalmas, nagy áteresztőképességű analitikai eljárást. Működésének
alapelve, tulajdonképpen semmiben sem különbözik a négy évtizede leírt southern blot működésétől: a
komplementer bázispárok között kialakuló H-hidak révén történik a megfelelő nukleotidszekvenciák
felismerése, tehát ez a módszer is a hibridizációs technikán alapul. A feldolgozott minták számában azonban
óriási különbség van a két módszer között. Az újdonságot a DNS-chip esetében az jelenti, hogy egyszerre több,
egymástól különböző, akár több tíz-, százezer próbaként használt oligonukleotidot hibridizáltathatunk a
mintával mindössze néhány perc leforgása alatt. Ez azt jelenti, hogy több tízezer mutációra tudjuk leszűrni a
mintát pár perc alatt, ami különösen nagy áteresztőképességgel ruházza fel ezt az eljárást. A DNS-chip esetében
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
40 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a tervezés, a próbák bázissorrendjének kiválasztása és a chipen történő elhelyezés, ami idő- és szellemi
munkaigényes feladat. Maga a chip, egy megközelítőleg 1 cm (0,8-1,5 cm) élhosszúságú szilícium lapka,
amelyet sok kisebb szektorra, 30-50μm élhosszúságú kis négyzetekre osztunk fel (2.14. ábra). Minden egyes kis
négyzet felületére különböző bázissorrendű oligonukleotid próbát viszünk fel. A chipek síkjára merőlegesen
találhatjuk az oligonukleotidokat, a különböző kis szektorokban különböző bázis sorenddel.
2.14. ábra - DNS chip.
A DNS-chipek előállítása a nanotechnikában igen népszerű fotolitográfiás technikával történik. A technika és a
DNS chip előállításának a lelke a fényérzékeny védőcsoportok. A szilíciumlapka hordozó felületén
nukleotidokkal reagáló funkciós csoportok vannak. Ezeket a csoportokat, hogy idő előtt ne reagáljanak el,
fényérzékeny védőcsoporttal látják el. Megvilágítás hatására ezek a védőcsoportok elbomlanak, a reakció
végbemehet, tehát a nukleotidok 3’ vége kapcsolódni fog a reagáló csoporttal. Azok 5’ végét szintén ilyen
fényérzékeny védőcsoporttal látják el, a reakció tehát a továbbiakban is csak megvilágítás hatására, ellenőrzött
körülmények között mehet végbe.
Minden egyes oligonukleotid emelet felépítése 4 lépésből áll. Az első emelet első lépésének kezdőmozzanata a
maszk elkészítése. A maszk lefedi a teljes DNS chipet, kivéve azokat a szektorokat (kis négyzetecskéket),
amelyikre az adott nukleotidot szeretnénk felvinni. Az első nukleotid legyen az adenin. Azon négyzetecskék
maszkon megfelelő részét ahova az első emeletre adenint szeretnénk felvinni, azt kivágjuk, tökéletes fedésbe
hozzuk a szilícium lapkával, majd megvilágítjuk. Ahol a maszk ki volt vágva, ott a fényérzékeny védőcsoportok
elbomlottak, a reaktív csoport előkerült. Majd a maszkot eltávolítjuk, és hozzáadjuk az adenint a lapkához. Az
adenin kizárólag oda fog kapcsolódni, ahonnan ezeket a fényérzékeny védőcsoportokat eltávolítottuk. Az első
emeletre tehát felkerültek az adeninek. Az első emelet második lépése, hogy ahova mondjuk timint szeretnénk
helyezni, ott a maszkot kivágjuk, megvilágítjuk, onnan megint eltűnnek a védőcsoportok, majd hozzáadjuk a
timint. Újfent, kizárólag oda kerülnek timinek, ahol a védőcsoport elbomlott. Ugyanezt guaninnal, citozinnal
megcsináljuk, és ne feledjük, hogy a szintézishez olyan nukleotidokat használunk, amelyek 5’ végén is
fényérzékeny védőcsoport van. Amikor az első emelet megépül, akkor jön a második emelet megépítése, szintén
4 lépésben, különböző helyeken kivágott maszkokkal. Ez azt jelenti, ha 20 bázis hosszú oligonukleotid próbákat
építünk, akkor azok 20×4, azaz 80 lépésben kerülnek megszintetizálásra. Maga a szintézis meglehetősen
gyorsan zajlik, mindössze néhány órás művelet.
Röviden tekintsük át egy vizsgálat menetét. A DNS izolálását követően egy PCR reakció során felszaporítjuk az
érdeklődésünkre számot tartó DNS szakaszt. (RT-PCR segítségével RNS minták is vizsgálhatóak.) A PCR
Molekuláris biológiai módszerek az
örökletes, veleszületett betegségek
diagnosztikájában
41 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
reakció során fluoreszkáló festékkel jelöljük meg (pl. fluoreszcein, fikoeritrin) a DNS szálakat. A DNS szálakat
denaturáljuk, egyszálúvá tesszük, majd a denaturált DNS szálakat a DNS chipre visszük fel, hibridizáltatjuk a
DNS chipen található oligonukleotidokkal. Ha ezek komplementerek, megtörténik a hibridizáció. A felesleget
lemossuk. Ekkor kizárólag a chipen komplementer szekvenciájú próbával rendelkező PCR termékek maradnak
rajta. Legvégül megvizsgáljuk, hogy mely szektorok rendelkeznek fluoreszcenciával. Az adott cella
oligonukleotidsorrendje ismert, (mert a chipet mi terveztük), ahol fluoreszkál, ott tökéletes a komplementaritás,
ahol nem fluoreszkál, ott nincs komplementaritás. Számítógép segítségével, így a mutáció megléte, vagy hiánya
megállapítható.
A mutáció vizsgálatát megkönnyíti, ha a PCR-t két különböző fluoreszcens marker jelenlétében végzik el a vad
típusnál és a vizsgálni kívánt mintánál. Mondjuk a vad típust fluoreszceinnel (piros), a vizsgált mintát
phycoerythrinnel (zöld) jelölik. Ezt követően mindkét mintát megvizsgálják egy-egy DNS chippel. A
számítógép a kapott, és memóriában tárolt képeket egymásra vetíti. Ha a két pont színes, tehát a nukleotid
sorrendjük azonos, akkor egy harmadik színnel jelöli a pontot, pl. sárgával. Ha csak az egyik pont színes, annak
megtartja az eredeti színét. Jelen esetünkben tehát a piros és zöld pontok a két DNS minta eltéréseit mutatják. A
chip térképe alapján ezek az eltérések könnyen azonosíthatók.
A DNS chip által nyújtott szolgáltatásokra komoly az igény elég csak a rendkívül gyors patogén analízist
megemlíteni, de egyre nagyobb igény mutatkozik különböző poligénes betegségek genetikai hátterének
felderítésére is. Ez utóbbi esetben a hajlam ismeretében a környezeti faktorok szerepét jelentős mértékben
csökkentheti, ezáltal a betegség kialakulását késleltetheti, vagy akár meg is akadályozhatja az érintett személy.
Az igény tehát igen komoly a gyors és széles spektrumú tesztekre. Sajnos jelenleg meglehetősen drága az eljárás
a magas szintű technikai követelmények és a chiptervezés hosszú, magas szellemi kapacitást igénylő folyamata
miatt.
42 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3. fejezet - Klinikai enzimológia
Az enzimek kettős szerepet töltenek be a klinikai laboratóriumi diagnosztikában. Egyfelől számos analit
meghatározása zajlik enzimek segítségével. Másfelől a különböző testfolyadékokból (leggyakrabban a
plazmából, szérumból) történő enzimaktivitás meghatározások rendelkeznek fontos diagnosztikai szereppel. Az
első esetben tehát eszközként használjuk fel őket, a mintához adott reagens tartalmazza őket, nem maguk
képezik a vizsgálat konkrét tárgyát, célját. Míg a második esetben magának az enzim aktivitásának a
meghatározása a cél, az bír diagnosztikai értékkel. A két eltérő cél, eltérő reakcióparaméter beállítást tesz
szükségessé. Mielőtt a két eltérő célnak megfelelő paraméter beállításokkal foglalkoznánk, tekintsük át, milyen
diagnosztikai jelentősége van a különböző enzimaktivitás meghatározásoknak.
Hogy mekkora diagnosztikai jelentőséggel bírnak az enzim meghatározások, mi sem mutatja jobban, minthogy a
rutin klinikai kémiai vizsgálatok bő egyharmadát különböző testfolyadékokból történő enzimaktivitás
meghatározások adják. Sejtjeink nagyjából 12.000-13.000 különféle enzimet tartalmaznak, ebből a klinikai
laboratóriumban diagnosztikai célból legfeljebb 15-20 enzim maghatározása történik. Sőt a diagnosztikai
spektrum szélességét még tovább szűkíti, hogy a meghatározott (15-20 különféle) enzimaktivitás sok esetben
redundáns információval bír. Erre jó példát szolgáltatnak a transzaminázok az ASAT (aszpartát-
aminotranszferáz) és ALAT (alanin-aminotranszferáz) aktivitások általában paralel szoktak változni, ha az egyik
változik, akkor jó eséllyel a másik is változni fog. Szeparált transzamináz emelkedésre nem nagyon ismerünk
példát.
Maguk a testfolyadékok (plazma, szérum, vizelet stb.) normális élettani körülmények között nem, vagy csak
kevés enzimet tartalmaznak. Pontosan ez adja az enzim meghatározások fontos diagnosztikai jelentőségét! A
testfolyadékokba jutó enzimek jellemzőek arra a sejt-, szövettípusra, szervre ahonnan az adott
testfolyadékba jutottak. Így az enzimaktivitás meghatározása lehetővé teszi, hogy viszonylag olcsón, gyorsan
(saját enzimaktivitása révén) információt nyerjünk az adott szövet elváltozásáról (gyulladásáról, pusztulásáról).
Az ideális az lenne, ha minden szövettípusra tudnánk ilyen jellegű tesztet végezni. Ennek korlátot szab, hogy
kevés olyan nagy tömegű szerv van, amelyből sejtpusztulást követően jelentős mennyiségű intracelluláris, vagy
membránhoz kötött, asszociált fehérje kerülhet a testnedvekbe. Ezt a kritériumot a máj, a vázizom és bizonyos
mértékig a szívizom teljesíti. A prosztatára jellemző savas foszfatáz már csak immunológiai módszerekkel lehet
biztonsággal meghatározni, klasszikus enzim meghatározások erre már nem alkalmasak. Tovább szűkítheti az
alkalmas enzimek körét, hogy a sejtekből, sejtorganellumokból kijutva, a miliő megváltozásával, elveszthetik
enzimaktivitásukat. Összefoglalva, azok az enzimek lehetnek alkalmasak klinikai labordiagnosztikai
szempontból, 1. amelyekből viszonylag nagy mennyiség áll rendelkezésre, 2. nem denaturálódnak az
extracelluláris térbe jutva, 3. onnan lassan tűnnek el, 4. aktivitásuk pontosan, reprodukálhatóan meghatározható.
A diagnosztikai jelentőség tisztázását követően térjünk vissza az enzimek klinikai laboratóriumban betöltött két
különböző, de mindkét esetben nélkülözhetetlen szerepének megtárgyalásához, illetve tisztázzuk a kétféle
szerepkör, eltérő paraméter követelményét.
Lássuk mi a különbség a két különböző szerepkör között:
1. Analit mennyiségének meghatározása: Az enzimet ebben az esetben eszközként használjuk. A mérés
célja valamilyen analit (pl. vércukor) mennyiségének meghatározása. Ebben az esetben az enzimet arra
használjuk, hogy az analitet, amely az enzim szubsztrátja, átalakítsuk valamilyen könnyen mérhető anyaggá,
vagy az enzimreakcióban az analit mennyiségével arányos koenzim képződést/fogyást határozzuk meg. Tehát
ez esetben a reakciósebességnek (és a mérendő paraméternek) az analit mennyiségével arányosnak kell
lennie. Ebben az esetben az alkalmazott enzim reakciósebességének a szubsztrát mennyiségével
(koncentrációjával) arányosnak kell lennie. Ez a feltétel a Michaelis-Menten egyenlet (lineáris) elsőrendű
szakaszában érvényesül (3.1. ábra). Tehát a szubsztrát koncentráció – enzimmennyiség arányának
beállítására ennek elérésére kell törekednünk.
2. Enzimmennyiség meghatározása: Ebben az esetben az enzimmennyiséggel arányos enzimaktivitás
meghatározása a cél. Kizárólag az enzim mennyiségével arányos reakciósebességet a Michaelis-Menten
egyenlet nulladrendű szakaszában tudunk mérni (3.1. ábra). Így az enzimmennyiség meghatározásakor úgy
kell a szubsztrát koncentrációt beállítanunk, hogy az mindig a Km érték ötszöröse legyen legalább, ekkor már
jó közelítéssel a nulladrendű tartományban tudunk mérni. Tekintve, hogy egyes enzimek mennyisége (pl. a
májban található transzaminázok intenzív májsejt széteséssel járó állapotokban, hepatitiszben) igen jelentős
mértékben, akár több mint százszorosára is megemelkedhet, ezt nem mindig lehet biztosítani. Ilyen esetekben
a vizsgált plazma, szérum hígítása jelenthet megoldást.
Klinikai enzimológia
43 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az enzim meghatározás esetén tehát kétszeresen is indirekt módon gondolkozunk: 1. enzimaktivitást mérünk,
amely abban az esetben arányos lesz a mintában lévő aktív enzimfehérje mennyiségével, ha az nulladrendű
(vagyis a mért enzimaktivitás kizárólag az enzim mennyiségétől függ), 2. A második feltételezésünk, hogy az
így meghatározott enzimfehérje mennyiség arányos a sejt-, szövetkárosodás mértékével, amelynek hatására az
enzimfehérje a testfolyadékba került.
Miután tisztáztuk ezt a fontos különbséget a továbbiakban kizárólag az enzimmennyiség meghatározásokkal
foglalkozunk, az analitek meghatározására és az azokkal kapcsolatos reakciókra az adott analit mérésénél
fogunk kitérni.
3.1. ábra -
3.1. Izoenzime
Az eltérő aminosavsorrenddel (azaz fehérjeszerkezettel) rendelkező, de azonos reakciót katalizáló enzimeket
izoenzimeknek nevezzük. Az izoenzimek regulációja, illetve lokalizációja jelentős különbségeket mutat. Így
diagnosztikai jelentőségük is nagy, hisz a különböző izoenzimeket (fehérjéket) meghatározva, megállapítható a
szövetkárosodás pontos(abb) helye. Az izoenzim meghatározások leggyakrabban gélelektroforézissel történnek,
így nem automatizálhatóak.
3.2. Az enzimaktivitás meghatározásának körülményei
Számos mérési körülmény befolyásolja az enzimek aktivitását. Természetesen az elképzelhetetlen, hogy az
egyes laboratóriumok között eltérés legyen, ezért 1972-ben a Német Klinikai Kémiai Egyesület
kezdeményezésére már megtörtént az enzim meghatározások első szabványosítása. A leggyakrabban
meghatározásra kerülő enzimek mérési körülményeinek kidolgozásakor a következő paramétereket vették
figyelembe:
1. Szubsztrát koncentráció: Egyrészről teljesülni kell a nulladrendűség fenti gondolatmenet szerinti
követelményének, másrészről a szubsztrát koncentráció bizonyos határon túli emelésének határt szab az
esetlegesen fellépő szubsztrát gátlás. Így a korábbi gondolatmenetnek megfelelően extrém magas
enzimaktivitás esetén a minta esetleges hígítása jelenthet megoldást. A laboratóriumi automaták
(legtöbbször) erre figyelmeztetnek, akár maguk el is végzik.
Klinikai enzimológia
44 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2. Optimális pH: Ebben az esetben az in vitro a reakcióközegre vonatkozó optimális pH-t kell beállítani, ami
eltérhet az in vivo tapasztalható pH-tól. Ez utóbbira jó példa az alkalikus foszfatáz, amely in vitro 10-es pH-n
mutatja maximális aktivitását, pedig a szervezetünkben ilyen pH nem fordul elő.
3. Ionösszetétel: A pH állandó értéken tartását különböző pufferekkel oldjuk meg, amelyek egy része ugyan
előfordul a szervezetünkben (pl.: foszfát) azonban korántsem olyan magas koncentrációban, mint a
reakcióközegben. Más puffer oldatok (Mops, TRIS, HEPES, TEA stb.) pedig mesterségesek, meg kell találni
azt a koncentrációt, amely kellő puffer kapacitást biztosít, de nem gátolja a reakciót. Gondoskodni kell az
enzimek által kofaktorként igényelt ionok jelenlétéről (pl. Mg2+ foszfát csoport transzferét katalizáló enzimek
esetében).
4. Koenzimek: Azon kívül, hogy szükségesek az enzimaktivitáshoz (pl. NADH a laktát dehidrogenáz esetében)
gyakran a kofaktorok átalakulása szolgáltatja az indikátorreakció alapját is. Ideális koncentrációjának
beállítása eset függő.
5. Hőmérséklet: Az enzimes reakciók hőmérsékletét két tényező szabja meg: 1. mint minden reakció az
enzimes reakciók is az Arrhenius egyenlet értelmében exponenciális mértékben függenek a hőmérséklettől, 2.
az enzimek, mint minden fehérje esetében számolnunk kell hődenaturációjukkal is. Kezdetben 25 °C-on
zajlottak a mérések ez a hosszabb reakcióidő miatt kényelmesen nyomon követhető volt és a
hődenaturációval sem kellett számolni. Manapság a laboratóriumi automaták korában a gyorsaság inkább
előny. Ilyen megfontolásból, a mérések kétharmadát kitevő analit (szubsztrátum) meghatározások egységesen
37 °C-on zajlanak, célszerű volt az enzim meghatározásokat is ezen a hőmérsékleten végezni. Így elkerülhető
a két különböző hőmérséklet alkalmazása, illetve meggyorsíthatóak az enzim meghatározások is. Ezen a
hőmérsékleten gyorsabban zajlanak a reakciók, ugyanakkor a hődenaturáció még nem számottevő.
6. Reakcióidő: Az a legrövidebb idő, amely alatt a normális felső határnak megfelelő enzimaktivitás még jól
mérhető, azaz teljesül a linearitási kritérium (nulladrendű marad a reakció) és az abszorbancia változás
sebessége hibahatáron belül meghatározható.
Az általános megfontolásokat követően vegyük sorra a legfontosabb enzim meghatározásokat.
3.3. Kreatin-kináz
A kreatin-kináz egy 82 kDa moltömegű dimer fehérje, amely a kreatin ATP terhére történő reverzibilis
foszforilációját katalizálja (3.2. ábra). Az izmok összehúzódásakor az ATP ADP-vé alakul és a kreatin kináz az
ADP-t visszaalakítja ATP-vé a kreatin-foszfát, mint nagyenergiájú foszfátraktár terhére. A kreatin-foszfát
képződés optimális pH értéke 9, míg az ellentétes irányú reakcióé 6.7. A folyamathoz Mg2+-ra van szükség,
azonban a Mg2+ túlsúly gátlólag hat. Az enzim a szérumban viszonylag instabil, mivel az enzim aktív helyének
tiol csoportjai oxidálódnak. Az enzim oxidációja elkerülhető és viszonylag jól stabilizálható N-acetil-cisztein
adagolásával.
Legnagyobb mennyiségben a harántcsíkolt- és a szívizomban fordul elő, az agyban, a gasztrointesztinális
traktusban és a húgyhólyagban jóval kisebb mennyisében.
Az enzim kizárólag dimer formájában aktív a 41000 Da-os monomerek egyike sem rendelkezik önállóan
enzimaktivitással. A három monomer közül kettő az M (muscle, izom) és a B (brain) szabadon
kombinálódhatnak. A harmadik monomer a Mt (mitokondriális) a mitokondriális intermembrán térben található
és mind immunológiai, mind elektroforetikus mobilitás szempontjából eltér a másik kettőtől. A szívizom kreatin
kináz aktivitásának mintegy 15%-át ez adja. A másik két szabadon kombinálódó monomer három formát hoz
létre: MM, MB, BB. Ezen formák eloszlása a szövetek között jelentős különbséget mutat:
Vázizom: 97-99% MM, 1-3% MB
Szívizom: 78% MM, 22% MB
Agy: 100% BB
Gasztrointesztinális traktus: 96% BB, 1% MB, 3% MM
Húgyhólyag: 92% BB, 6% MB, 2% MM
Klinikai enzimológia
45 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Diagnosztikai jelentősége: A szérum kreatin kináz aktivitás, jelentős mértékben emelkedett az izomdisztrófia
minden fajtája esetében. Ez az emelkedés kimondottan hangsúlyos fiatal gyerekkorban, amikor az izomsejtek
pusztulása jelentős mértékű és csökken az izomtömeg hanyatlásával. Szintén megemelkedik fokozott
izommunka és traumás izomsérülés esetén. Az izomsérülés egy specifikus formája a szívizom elhalással járó
szívinfarktus, amely diagnosztikájában elsősorban az izoenzimvizsgálatoknak rendkívül nagy jelentősége van.
Meghatározás: Leggyakrabban a fotometriás enzimaktivitás meghatározást végzik. Ebben az esetben a hatszor
gyorsabb inverz reakció alapján történik az enzimaktivitás meghatározása. A kreatin kináz (CK) a kreatin-
foszfátot kreatinné alakítja, miközben ATP képződik (3.2. ábra). Az első reakcióban képződött ATP-vel
foszforiláljuk a glukózt, glukóz-6-foszfáttá (hexokináz, HK segítségével) (3.2. ábra), majd a harmadik reakció
során a glukóz-6-foszfát dehidrogenáz által katalizált reakcióban (G6P DH) a koenzim NADP+ redukcióját
követjük nyomon, annak 340 nm-en mért abszorbancia növekedése által (3.2. ábra). Itt érdemes megjegyezni,
hogy a NADP/NADPH és a NAD/NADH koenzimek redukálásának/oxidálásának nyomon követése a klinikai
kémia igen kedvelt indikátorreakciója. A jövőben is számtalan esetben fogunk vele találkozni.
3.2. ábra - A kreatin-kináz aktivitásának meghatározása.
A szérum CK aktivitás természetesen függ a fizikai aktivitástól, izomtömegtől, így a különböző nemek,
korosztályok között különbség mutatkozik: férfiak esetében a referencia tartomány magasabb: 46-171 U/l, mint
nők esetében: 34-145 U/l.
Izoenzim vizsgálatok: A CK izoenzimeket aktivitásfestéssel követett elektroforézissel szokták végezni. Az
izoenzim vizsgálatok jelentőségét az adja, hogy a CK-MB izoenzim nagy tömegben kizárólag a szívizomban
fordul elő. Így ennek az izoenzimnek a szérumban történő megjelenése egyértelműen szívizomsérülésre,
szívinfarktusra utal. Ennek jelentősége rendkívül nagy volt a szívinfarktus diagnózisa során. Ezen a helyen
azonban meg kell jegyeznünk, hogy ez a szerep csökkenőben van, ugyanis az Európai Kardiológiai Szövetség
irányelve szerint jelenleg a troponin a szívizom elhalás általános markere. A szívinfarktusnak léteznek alattomos
néma, fájdalommal nem járó formái (pl. diabéteszes neuropátia esetén). A vizsgálat során az M formára
specifikus antitesttel azt lefogták, aktivitását megszüntették, így kizárólag a B forma aktivitása érvényesült. A
szérumba zavaró BB forma például agykárosodás esetén (pl. stroke) kerülhet, azonban ennek diagnosztikai és
egyben zavaró hatása is csekély, mivel ilyen mértékű agykárosodásnak már szemmel látható jelei is vannak.
3.4. Laktát dehidrogenáz (LDH)
A LDH minden sejtben megtalálható, ahol az anaerob glikolízis során képződő piruvátot redukálja laktáttá,
NAD+ keletkezés közben, vagy az ellentétes irányú folyamatban NADH képződés mellett a laktátot oxidálja
piruváttá.
A LDH egy 134 kDa molekulatömegű tetramer, amelyet két különböző monomer alkot. A két különböző
alegységet előfordulási helyüknek megfelelően H: heart és M: muscle betűkel jelöljük. Ezek kombinálódásával
5 különböző izoenzim jöhet létre: LDH-1: HHHH, LDH-2: HHHM, LDH-3: HHMM, LDH-4: HMMM, LDH-5:
MMMM. Egy hatodik ritka, pubertást követően kimutatható izoenzim (LDH-X, LDHC) 4 X alegységet
tartalmaz, illetve nagyon súlyos betegségben szenvedők szérumából lehet kimutatni a hetedik (elmésen) LDH-6-
nak nevezett izoenzimet.
Gyakorlatilag minden sejtünk tartalmazza kivétel nélkül a sejtek citoplazmájában. Az LDH izoenzimek
eloszlása a különböző szövetek között eltérő:
Klinikai enzimológia
46 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
LDH-1, LDH-2: szívizom, vese, eritrociták (vörösvértestek)
LDH-3: lép, tüdő, nyirokcsomó, fehérvérsejtek
LDH-4, LDH-5: máj, vázizom
Diagnosztikai jelentősége: Tekintve, hogy meglehetősen széles az előfordulása, a klinikai esetek meglehetősen
széles körében nő meg szérumszintje is. Így emelkedett miokardiális infarktus, hemolízis, illetve máj, vese, tüdő
és izom rendellenességek esetén.
A súlyos hemolízis a szívinfarktushoz hasonló LDH mintázatot mutat. Megaloblasztos anémiák az LDH-1 és
LDH-2 izoenzimek jelentős emelkedésével járnak.
Májbetegségekben is jelentősen megemelkedik a szérum LDH aktivitás, azonban ez elmarad az
aminotranszferázok emelkedésétől.
Szintén jelentős LDH szint emelkedés tapasztalható mononucleosis infectiosában.
Meghatározás: A meghatározás a képződött (laktátból történő piruvát képződés esetén), vagy felhasznált
(piruvátból történő laktát képződés esetén) NADH alapján történik (3.3. ábra). Elvileg, bármely irányú reakció
alkalmazható a meghatározásra. Az egyes izoenzimek fagyasztásra eltérő módon érzékenyek ezért szobahőn
tárolt mintából (3 napon belül) kell elvégezni a meghatározást. Hemolizált minta a vörösvértestek magas LDH
tartalma miatt nem alkalmas LDH meghatározásra.
Izoenzim vizsgálatok: Az LDH izoenzim vizsgálatok leggyakrabban agaróz, illetve cellulóz-acetát
gélelektroforézissel történnek. Tekintve, hogy az izoenzimek hőstabilitása is igen eltérő figyelni kell, nehogy
felmelegedjen a gél a folyamat közben (hűteni kell a cellát). A gélelektroforézist követően az izoenzim csíkokat
aktivitásfestéssel tesszük láthatóvá. Az LDH csíkok (zónák) által generált NADH-t jellegzetes fluoreszcenciája,
vagy a nitroblue-tetrazólium színes formazánná történő redukciója alapján mutatjuk ki.
3.3. ábra - LDH enzim aktivitásának meghatározása.
3.5. Aminotranszferázok
Az aminotranszferázok aminosavak és 2-oxo savak egymásba történő átalakulását katalizálják egy amino-
csoport átvitelével. Klinikai kémiai szempontból az aszpartát aminotranszferáznak (ASAT, AST, GOT),
illetve az alanin aminotranszferáznak (ALAT, ALT, GPT) van jelentősége.
Az aminotranszferáz reakciók koenzime a pirodoxál-foszfát (és az amino analóg piridoxamin-foszfát).
A transzaminázok szintén igen széles körben előfordulnak szervezetünkben. Az ASAT elsősorban a májban, a
szívben, a vázizmokban és a vesében, az ALAT elsősorban a májban és a vesében. Míg az ALAT kizárólag
citoplazmatikus lokalizációval bír, addig az ASAT a citoplazmában és a mitokondriumban is megtalálható. A
Klinikai enzimológia
47 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
két eltérő lokalizációjú homodimer izoenzim eltérő genetikai háttérrel rendelkezik. A szérum ASAT
aktivitásának 5-10%-a származik a mitokondriális formából.
Diagnosztikai jelentőségük: A szérum emelkedett transzamináz aktivitásának oka leggyakrabb valamilyen
májat érintő elváltozás. A legtöbb májbetegség esetében az ALAT aktivitás magasabb, mint az ASAT. Az akut
hepatikus nekrózissal járó megbetegedések esetében a szérum ASAT és ALAT aktivitás emelkedése megelőzi a
betegség klinikai tüneteinek (mint például a sárgaság) jelentkezését. Mindkét enzimaktivitás értéke akár a felső
határ 100-szorosára is megnőhet, de legtöbb esetben 10-40-szeres emelkedés tapasztalható. Ilyen esetekben az
aktivitások tetőzése a 7-12 napon várható, majd a 3-5 hétre visszatér a normál értékre eseménytelen felépülés
esetén. A csúcsértékek nem rendelkeznek semmilyen prognosztikai értékkel. Amennyiben az ALAT érték 6
hónapnál hosszabb időn keresztül fennáll, krónikus hepatitiszről beszélhetünk. Ebben az esetben általában a
referencia tartomány felső határának hétszeresénél kisebb érték várható.
Acetaminofen (gyógyszer) kiváltotta transzamináz emelkedésre a rendkívül gyors lefolyás jellemző. Gyorsan
magas értéket ér el és onnan viszonylag gyorsan (4-5 nap alatt) normalizálódik.
Az alkoholos és virális hepatitiszen kívül a nem alkoholos zsírmáj (steatohepatitisz) állhat még gyakran az
emelkedett aminotranszferáz aktivitások hátterében. Epeút elzáródások esetében annál magasabb értékeket
tapasztalhatunk minél hosszabb ideje fennáll az obstrukció. A transzaminázok megemelkedését okozhatják
különböző gyógyszerek (antibiotikumok, epilepszia ellenes szerek, nemszteroid gyulladásgátlók, HMG-CoA
reduktáz gátló – koleszterincsökkentő szerek). Ritkábban előforduló májat károsító kórképek: hemokromatózis,
Wilson kór, autoimmun hepatitisz, α1-antitripszin hiány, primer biliáris cirrhosis, epeút gyulladás.
3.4. ábra - Aminotranszferáz aktivitások meghatározása.
A két transzamináz közül az ALAT-ot tartják májspecifikusabbnak. Szívinfarktus, progresszív izomdisztrófia,
dermatomyositis esetén is megemelkedett ASAT aktivitás tapasztalható.
Meghatározás: Az aminotranszferáz reakcióhoz kapcsolt specifikus dehidrogenázok segítségével történik
meghatározásuk. A transzamináz aktivitás során keletkezett 2-oxo savak redukciója során hidroxil savak és
NADH csökkenés következik be. Ezt a NADH csökkenést követjük nyomon az abszorbancia 340 nm-en mért
csökkenésével (3.4. ábra). Az ALAT által katalizált reakcióban keletkező piruvát laktát dehidrogenáz (LDH)
segítségével laktáttá alakul, miközben a NADH mennyisége arányosan csökken (3.4. ábra). Az ASAT által
katalizált reakcióban keletkező α-ketoglutarát malát dehidrogenáz (MDH) segítségével maláttá alakul, miközben
a NADH mennyisége arányosan csökken (3.4. ábra). Amennyiben a szubsztrát, a NADH és a segédenzimek
(malát-, laktát dehidrogenáz) kellő mennyiségben jelen vannak a szűk keresztmetszetet a meghatározni kívánt
ASAT és ALAT mennyisége jelenti.
Az ASAT szérumban mérhető aktivitása 24 órán keresztül stabil szobahőmérsékleten tárolt minta esetében. A
minták hűtve, vagy fagyasztva tárolása szükséges ennél hosszabb tárolás esetén. A transzamináz aktivitások
stabilitása szérumban a következőképp alakulnak a tárolási hőmérséklet függvényében:
ASAT: szobahőmérsékleten 24 óra, hűtve (2-8 ºC) 1 hét, fagyasztva (-20 ºC) 1 hónap
ALAT: szobahőmérsékleten 3 nap, hűtve 1 hét, fagyasztva 1 hét
ASAT referencia tartomány: 0-35 U/l.
ALAT referencia tartomány férfiak számára: 0-60 U/l, nők számára: 0-40 U/l.
Klinikai enzimológia
48 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3.6. Gamma-glutamiltranszferáz
A gamma glutamiltranszferáz (GGT) a γ-glutamil csoport átvitelét katalizálja peptidekről az akceptor
molekulára. A GGT aktivitás vizsgálatához szükséges szubsztrát oldatnak tartalmaznia kell a 1. γ-glutamil
akceptort, 2. valamilyen aminosavat, vagy peptidet, 3. vagy vizet, ez utóbbi esetben egy egyszerű hidrolízis
zajlik le. Az enzim kizárólag olyan peptideken, peptidszerű anyagokon hat, amelyek terminális (-γ-) karboxil
csoporton keresztül kapcsolódó glutamátot tartalmaznak. A glicilglicin az egyik leghatékonyabb ismert akceptor
molekula (3.5. ábra).
A GGT a következő szövetekben fordul elő (csökkenő mennyiségi sorrendben): vese proximális tubulus, máj,
pankreasz, bélrendszer. Habár az enzim intracellulárisan is előfordul, döntő részben az aminosav és peptid
transzportban vesz rész a sejtmembránhoz asszociáltan.
Diagnosztikai jelentősége: Habár a vesében fordul elő a legnagyobb mennyiségben, a szérumba jutó enzim
elsősorban a hepatobiliáris rendszerből származik. Kimondottan érzékeny indikátora bármely máj eredetű
elváltozásnak. Klinikai jelentőségét alacsony specificitása csökkenti. Az alkalikus foszfatázhoz hasonlóan,
legnagyobb mértékben a májon belüli, vagy az azt követő epeút elzáródások esetében emelkedik meg szérum
aktivitása (a referencia tartomány felső értékének 5-30-szorosára). A májat érintő elváltozásokon kívül
megemelkedik a pankreászt érintő betegségek esetében is. Emelkedett szintje minden alkoholproblémával küzdő
és más, a biotranszformációs enzimrendszert indukáló gyógyszert szedő beteg esetében.
3.5. ábra - A GGT meghatározása.
Meghatározás: A korai GGT meghatározási módszerek L-γ-glutamil-p-nitroanilid szubsztrátot tartalmaztak,
glicilglicin akceptorral. A reakció során keletkező, sárga színű p-nitroanilin 405 nm-en történő fotometrálásával
követték nyomon a reakció alakulását. Az L-γ-glutamil-p-nitroanilid azonban limitált oldhatósággal bír, ezért
most már ennek különböző származékait használják (3.5. ábra).
A GGT meglehetősen stabil enzim, 4 °C-on tárolva egy hónapig, −20 °C-on tárolva pedig egy évig biztosan
eltartható.
GGT referencia tartomány férfiak számára: 0-55 U/l, nők számára: 0-38 U/l. Újszülöttekben a felnőtt aktivitás
6-7-szerese mérhető, amely úgy féléves korukra fokozatosan lecsökken.
3.7. Alkalikus foszfatáz
Az alkalikus foszfatáz (ALP) a természetes és mesterséges szubsztrátok tömkelegének alkalikus hidrolízisét
katalizálja. Az enzim aktivitását kétértékű ionok, mint a Mg2+, Co2+ és Mn2+ fokozzák, továbbá a Zn2+ alkotója a
holoenzimnek. A foszfát, borát, oxalát és cianid ionok pedig gátlólag hatnak rá. A reakcióközeget biztosító
pufferek is jelentős mértékben befolyásolhatják az enzimaktivitást.
Az ALP aktivitás testünk majd minden szervében jelen van. Leginkább a sejtmembránokhoz, a sejtek
felszínéhez asszociáltan található meg a vékonybél nyálkahártyán, a vese kanyarulatos csatornában, a
csontokban (osteoblast), a májban és a placentában (méhlepény). Pontos élettani szerepe nem ismert feltehetően
részt vesz a vékonybélben lipid felszívódásában és a csontok kalcifikációjában.
Több különböző formában létezik, ezek közt vannak valós izoenzimek, amelyek eltérő gének termékei, de a
csont, máj és vese izoformák ugyanazon gén terméke, de szénhidrát alkotójukban (glikozilációjukban) eltérnek.
Diagnosztikai jelentősége: A szérum ALP aktivitás emelkedése igen gyakran máj és csont eredetű, így
különböző máj és csontbetegségek diagnosztikájában van szerepe.
Klinikai enzimológia
49 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Máj: Bármilyen epeút elzáródással járó állapotban a máj fokozza az ALP expresszióját és az újonnan szintetizált
enzimek egy része a keringésbe kerül, megnövelve az enzim aktivitását. ez a növekedés kifejezettebb
extrahepatikus obstrukció esetén. Az enzimaktivitás akár a referencia tartomány felső értékének 10-12-szeresét
is elérheti, az obstrukció megszűntét követően normalizálódik. Máj tumorok és gyógyszerterápia szintén
markáns emelkedést váltanak ki, míg fertőző májgyulladások csekélyebb mértékűt.
Csont: A csontban található ALP-t az osteoblastok szintetizálják és a csontmátrix vezikulumaiban található,
amelyek mintegy a sejtmembrán „rügyei”, lefűződései. Az enzim így gyakorlatilag a teljes csontformáció
aktivitásáról ad jó, átfogó képet. A legmagasabb enzimaktivitást Paget kórban lehet mérni. Ebben az esetben az
osteoblastok (fokozott aktivitásuk révén) próbálják újraépíteni a csontot, ami az osteoclastok kontrollálatlan
aktivitása miatt felszívódott. Ilyenkor a referencia tartomány felső értékének 10-25-szörösére is felugorhat az
enzimaktivitás. Szintén magas értékek mérhetők osteogenikus csontrák esetén. A többi csontot érintő kórkép,
mint a primer és szekunder hiperparatireoizmus, a D-vitamin hiány vagy a csonttörést követő, illetve a fejlődés
során bekövetkező csontnövekedés jóval kisebb mértékű emelkedést idéz elő.
Más esetek: A terhesség harmadik trimeszterében a placenta eredetű ALP 2-3-szoros emelkedést idézhet elő.
Ismertek familiáris benignus (jóindulatú) ALP szintemelkedések is. A placenta izoenzimet számos tumor is
szintetizálja.
Meghatározás: A meghatározás mind az enzimaktivitás mértékére, mind az izoenzim kilétére kiterjed.
A leggyakrabban a hasítatlan formában színtelen, de hasított formában sárga színű 4-nitrofenil-foszfát
szubsztrátot alkalmazzák az enzimaktivitás nyomon követésére. A foszfát csoport pedig a vízre kerül (3.6. ábra).
A meghatározás szérumból és heparinos plazmából végzendő, mivel a többi alvadásgátló megköti az enzim
aktivitásához nélkülözhetetlen kétértékű fémionokat. Amennyiben lehetséges 4 órán belül el kell végezni a
meghatározást, ha ez nem kivitelezhető a felolvasztott mintát 18-24 órán keresztül szobahőmérsékleten kell
hagyni a teljes aktivitás eléréséhez.
3.6. ábra - Az alkalifus-foszfatáz meghatározása
Az ALP aktivitás életkorfüggő a legmagasabb aktivitást a növésben levő gyerekek mutatják.
5’-nukleotidáz: Az 5’-nukleotidáz (NTP) olyan foszfatáz, amely kizárólag nukleozid-5’-foszfátokat hasít. Az
NTP egy glikoprotein, amely az egész szervezetünkben megtalálható. Annak ellenére, hogy rendkívül széles
körben előfordul, viszonylag specifikus az epe szekrécióját befolyásoló elváltozásokra. A kevésbé specifikus
ALP mellett kiegészítő vizsgálatként ezt is meg szokták határozni. Emelkedett szintje megerősíti, hogy az ALP
aktivitás emelkedése máj eredetű.
3.8. Kolinészteráz
Tulajdonképpen két különböző enzim is fut ezen a néven.
Klinikai enzimológia
50 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az első az acetilkolinészteráz, vagy valódi kolinészteráz az eritrocitákban, a tüdőben, a lépben az
idegvégződésekben és az agy szürkeállományában található. Feladata az idegvégződésekből kikerülő acetilkolin
(neurotranszmitter) azonnali hidrolízise. Ez elengedhetetlen, ahhoz, hogy az idegsejt depolarizálódjon és a
következő vezetési körben képes legyen újra repolarizálódni.
A másik enzim az acilkolin acilhidroláz, vagy más néven pszeudo kolinészteráz (CHE) (ezen kívül még számos
néven ismert) a májban, a pankreászban, a szívben az agy fehér állományában, és a szérumban fordul elő.
Biológiai szerepe teljes mértékben ismeretlen.
A két kolinészteráz néhány szubsztrát irányába mutatott specificitásában különbözik, azonban egymás
szubsztrátjai irányában hasonlóan viselkednek.
Diagnosztikai jelentősége: A CHE (pszeudokolinészteráz) szérum aktivitásának szerepe van 1. a májfunkció
megítélésében, 2. az esetleges rovarírtószer mérgezés megállapításában, 3. az olyan személyek azonosításában,
akik az enzim atipikus formáját hordozzák, így a műtéteknél adott izomrelaxánsok hatása elhúzódhat, ami
légzési problémákhoz, halálhoz vezethet. Szintén jó információt szolgáltat a máj szintetikus kapacitásáról (30-
50% csökkenés akut hepatitiszben, 50-70% máj metasztázis, vagy cirrózis esetén). Sorozatos meghatározása
alkalmat ad a májbetegség nyomonkövetésére. A szerves foszforvegyületek (köztük sok rovarirtószer), mint a
parathion, sarin, tetraetil pirofoszfát gátolják a CHE működését. Ezek bizonyos szint felett az idegrendszeri
kolinészterázt is gátolják és halált okoznak.
A szukcinil-dikolin, amelyet műtéteknél izomrelaxánsként alkalmaznak, szintén a CHE szubsztrátja.
Normálisan, így pont annyi ideig tart a hatása, ameddig a műtéti beavatkozás megkívánja. Olyan betegek
esetében, akik alacsony enzimaktivitással, vagy kevésbé aktív enzimformával rendelkeznek a hatása elhúzódhat
és a légző izmok bénulása miatt megfulladhat a beteg. Ezért a CHE vizsgálata része a preoperatív
vizsgálatoknak.
Meghatározás: A legtöbb meghatározási módszer aciltiokolin-észtereket alkalmaz, mint például a
butiriltiokolin (3.7. ábra). A reakció során képződött tiokolin a második lépésben ditio-nitrobenzoáttal (DTNB)
reagál, amely a színes merkapto nitrobenzoát képződésével jár, így fotometriásan meghatározható (3.7. ábra).
3.7. ábra - A kolin-észteráz meghatározása.
Az aktivitást szérumból szokták meghatározni, amely mély hűtve évekig felhasználható. CHE referencia
tartomány: 3500-8500 U/L. Újszülöttekben a felnőtt aktivitás 50%-a mérhető, amely úgy 3-6 éves korukra
fokozatosan nő 30%-kal meghaladja a felnőtt értéket, amelyen a pubertás idejére normalizálódik.
Glutamát dehidrogenáz: Mitokondriális eredetű enzim. A májban, szívizomban, vesében, agyban,
vázizmokban, leukocitákban fordul elő. Elsősorban kiegészítő meghatározása terjedt el, mivel aktivitása jól
korrelál a máj sejtpusztulás mértékével.
3.9. Amiláz
Az α-amiláz a poliszacharidok 1-4 glikozidos kötéseit hidrolizálja, az elágazásoknál található 1-6 kötéseket
nem. Az amiláz működéséhez Ca2+-t igényel. Teljes aktivitásához anionok is szükségesek, a leghatásosabbak a
Cl− és a Br−.
Klinikai enzimológia
51 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az amiláz normális körülmények között is megtalálható a szérumban. Tekintve, hogy kis molsúlyú molekula
(54-62 kDa) filtrálódik és az enzimek közül egyedüliként megjelenik a vizeletben is. Legnagyobb
mennyiségben, a nyálmirigyekben és a hasnyálmirigyben található, de kis mennyiségben előfordul az ondóban,
a herékben, petefészkekben, petevezetékben, harántcsíkolt izomban, tüdőben, zsírszövetben. A szekrétumok
közül az anyatej és a könny tartalmazza. A nyálmirigy és a pakreász eredetű enzimek izoenzimek.
Diagnosztikai jelentősége: A szérum amiláz szint viszonylag alacsony és állandó szintet mutat. A nyálmirigyek
és hasnyálmirigy gyulladása esetén jelentős mértékben (4-6-szorosára) megemelkedik. Epekő esetén mintegy 4-
szeres emelkedés tapasztalható. Szintén emelkedik veseelégtelenségben a csökkent kiválasztás
következményeképp.
Meghatározás: A meghatározás mind az enzimaktivitás mértékére, mind az izoenzim kilétére kiterjed.
Rövidebb glukóz egységekből álló szubsztrát, segéd és indikátorenzimek találhatók a reakcióelegyben. A
tesztek gyakorlatilag minden esetben a glukóz megjelenését mutatják ki.
A heparin kivételével mindegyik alvadásgátló gátolja az enzimet is, tekintve, hogy megkötik az aktivitáshoz
szükséges Ca2+-t. Az amiláz viszonylag hosszú ideig stabil marad a minta tárolása alatt.
3.10. Lipáz
A humán lipáz egy 48 kDa moltömegű egyláncú glikoprotein. Bár kis molsúlya miatt filtrálódik, mégsem
jelenik meg a vizeletben, mivel teljes mértékben reabszorbeálódik. Teljes aktivitásához az epesavas sók, illetve
a kolipáz jelenléte szükséges. A lipázok a trigliceridek 1-es és 3-as pozíciójában levő zsírsavait hasítják. A 2-es
pozíció rezisztens, csak 3-as pozícióba izomerizálódva bontható. A szérum lipáz meghatározásának
diagnosztikai jelentőségét az akut hasnyálmirigy gyulladás kimutatása adja.
Tripszin: Ezen szerin proteáz előalakja (tripszinogén) található meg normálisan a szérumban. Amennyiben az
aktív, tripszin forma is megjelenik az akut hasnyálmirigy-gyulladásra utal.
Kimotripszin, elasztáz: Mindkét szerin proteáz székletből történő meghatározása része a krónikus
hasnyálmirigy gyulladás következtében kialakuló hasnyálmirigy elégtelenség (alacsony enzimaktivitások)
diagnosztikájának.
52 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4. fejezet - A vese laboratóriumi diagnosztikája
A veseműködés laboratóriumi diagnosztikájával foglalkozó fejezettel megkezdjük a tankönyv azon fejezeteinek
sorát, amelyben nagyobb hangsúlyt kap a kórélettani szemléletmód. Természetesen, ezen fejezetekben továbbra
is érvényesül a patobiokémiai, kémiai tárgyalásmód is.
A vese páros szervünk, 150 g-os tömegének mintegy 40%-át a benne található erek és vér adja. A vesék
vérellátása és keringése igen intenzív, a teljes nyugalmi perctérfogat 20-25%-a átáramlik rajtuk. A vese három
fő feladatkört is ellát:
1. A hulladékanyagok kiválasztása: habár a májban történik a nem vízoldható toxikus anyagok vízoldhatóvá
tétele, azok vízoldható formái a fázis III. transzport folyamatok során (lásd a 6. fejezet) a májsejtből a
véráramba kerülnek és a vesébe jutnak. A vesében filtrálódnak, specifikus transzporter hiányában nem
szívódnak vissza, majd a húgyutakon keresztül kiürülnek.
2. Az extracelluláris folyadék térfogatának, összetételének fenntartása, szabályozása: Szervezetünk teljes
víztartalma hozzávetőlegesen a testsúly 54%-a. Ez az érték gyerekekben magasabb, idősekben alacsonyabb.
Továbbá függ a test zsírtartalmától: nőkben (~10%-kal), elhízott emberekben (~10%-kal, súlyos elhízás
esetén ~20%-kal) alacsonyabb (sovány testalkatú emberekben akár ~10-kal magasabb is lehet). Az
extracelluláris folyadéktér a teljes víztér 27-53%-a (mérési módszertől függően). A napi gyakorlatban 40%-
kal szokás számolni. Ez az érték nőkben és idős emberekben magasabb. Az extracelluláris folyadék három fő
alkotó között oszlik meg: 1. interstíciális (sejtek közötti) tér: a teljes testvíztér 28%-a, 2. a plazma (8%), és a
transzcelluláris (pl. gasztrointesztinális luminális folyadék, központi idegrendszer, szem és különböző
nedvesítő folyadékok) víztér (4%). Ezen a ponton érdemes áttekintenünk a különböző testfolyadékok
összetételét.
elektrolit Plazma (mM) Interstícium (mM) Sejt (mM)
Na+ 140 145,3 13
K+ 4,5 4,7 140
Cl− 104 114,7 3
Ca2+ 2,5 2,8 0,5*10−7
HCO3− 24 26,5 10
P 1,2 1,3 57
Fehérje 1 0,5 2,5
A vese az extracelluláris folyadéktér térfogatát és összetételét viszonylag állandó szinten tartja. Teszi ezt a
vizelet térfogatának és összetételének igen széles tartományon belüli változtatása mellett. Erre igen jó példa,
hogy a vizelet proton koncentrációja hozzávetőlegesen 4 nagyságrenden belül (pH= 4-8) változhat.
1. Hormonok szintézise (endokrin funkció): A vesék a vér pontosabban a vörösvértestek képződéséhez
elengedhetetlen hormont az eritropoetint (EPO), tromboxánokat, prosztaglandinokat, renint és kalcitriolt
termelik.
A vesék funkcionális egysége a nephron, melyből hozzávetőlegesen vesénként 1 milliót tartalmaznak. A
vesekapillárisok tulajdonképpen magas nyomású szűrőként funkcionálnak. A kapillárisban áramló vér átjut a
fenesztrált endothelsejteken, majd a folyadék a vese bazális membránján átszűrődve átjut a nefron
epithelsejtjein. Tehát sem az endothel-, sem az epithel sejtek nem alkotnak összefüggő réteget (4.1. ábra). Így a
bazális membrán az egyik oldalon a vérrel, a másik oldalon a nefron lumenével érintkezik. A glomerularis
filtrátum tulajdonképpen a plazma ultraszűrlete.
4.1. ábra - A vese mint magas nyomású szűrő.
A vese laboratóriumi diagnosztikája
53 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kapilláris endthelium meggátolja a sejtes elemek érpályából történő kilépését a bazális membrán pedig
átjárhatatlan a nagymolekulák számára. A méret szerinti szelekció úgy működik, hogy a hemoglobin éppen átjut
(64,5 kDa) még az albumin pedig éppen nem jut át (68 kDa) a bazális membránon. A méreten kívül a molekula
töltése is szerepet játszik a szűrés folyamatában, a negatív töltésű molekulák nehezebben, a pozitív töltésű
molekulák könnyebben jutnak át. A glomerulus filtrátumból gyakorlatilag az összes fehérje visszaszívódik és
lebomlik a proximális kanyarulatos csatorna sejtjeiben, így a vizelettel ürített fehérje mennyisége nem haladja
meg normális esetben a 150 mg/24 óra értéket.
A filtráció tulajdonképpen egy passzív folyamat, amely függ: 1. a kapilláris vérnyomás – és nephron lumen
hidrosztatikai nyomásának különbségétől, 2. a glomerulus alapmembrán szerkezetétől, illetve 3. a glomerulusok
számától. A normális glomerulus filtrációs ráta (GFR) 120 ml/perc, amely megközelítőleg 170 l/nap
(24*60*120=172800 ml/nap) filtrátumnak felel meg. Tekintve, hogy az ürített vizelet mennyisége 1-2 l/nap a
bevitt és az izzadsággal (illetve más úton) eltávozott folyadék függvényében, igen jelentős mértékű visszaszívás
történik a nefron további részeiben. Röviden tekintsük át a visszaszívás folyamatát. A szűrlet jelentős része már
a proximális tubulusban visszaszívódik, a glükóz (Na+-glükóz kotranszporter), az aminosavak, a kálium, a
bikarbonát teljes mértékben, a nátrium, mintegy 75%-ban visszaszívódik, az itt található aktív transzporterek
révén (4.2. ábra). Az ellenáramlásos elv alapján kialakult hiperozmotikus viszonyok (1200 mOsm) további
vízvisszaszívást eredményeznek a medullában (vesevelő) (4.2. ábra).
4.2. ábra - Transzportfolyamatok a vesében, a vesetubulusok működése.
A vese laboratóriumi diagnosztikája
54 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A velő hipertóniájához a gyűjtőcsatornából származó urea is hozzájárul, amely hatása malnutrició (különösen
alacsony fehérje, így nitrogén bevitel esetén) következtében hiányozhat. A disztális tubulusba érkező folyadék a
felszálló ágban történő nagymértékű Na+ és Cl− vesztés következtében hipotóniás (150 mOsm) lesz. A disztális
tubulusban további aldoszteron regulált Na+ és vízvisszaszívás történik. Tulajdonképpen itt történik a tubuláris
folyadék szervezet igényeinek megfelelő összetétel beállítása, hisz a visszaszívás jelentősebb mértékű része már
a proximális tubulusban, illetve a Henle kacsban megtörtént (4.2. ábra). A Na+ visszaszívás révén előálló
elektrokémiai gradienst a K+, illetve a H+ ürítésének elősegítésére használja fel a vese. A folyadék ezt követően
bejut a gyűjtőcsatornába, amely áthalad a hipertóniás velőn. A gyűjtőcsatorna sejtjeinek membránjába
vazopresszin (ADH: antidiuretikus hormon) hatására aquaporin I vízcsatornák kerülnek, amelyeken keresztül
megtörténhet az ozmotikus viszonyoknak megfelelően a víz passzív visszaszívása. Ilyen aquaporin I csatornák
találhatók a proximális tubulus, illetve a Henle-kacs leszálló ágának sejtmembránjában is. Vazopresszin
hiányában, vagy elégtelen aquaporin működés esetén, így híg nagyobb mennyiségű (diabetes insipidus) vizelet
képződik.
Most már beláthatjuk, hogy a vesét érintő bármely kóros folyamat igen jelentős hatással lehet a víz-, só-, illetve
hidrogénion homeosztázisra, valamint a hulladék anyagok eltávolítására.
4.1. A vesefunkció klinikai kémiai tesztjei
A veseműködés vázlatos ismertetését követően tekintsük át, hogy milyen paramétereket, milyen kémiai
módszerek segítségével határozunk meg.
Tekintve, hogy a glomerulusok fő fukciója, a víz és kis molsúlyú anyagok vérből történő filtrálása, míg a nagy
molsúlyú anyagok retenciója a leggyakrabban végzett tesztek a GFR-ről, illetve a glomerulus filtrációs
barrierek, leggyakrabban a bazális membrán integritásáról adnak információt.
A vese laboratóriumi diagnosztikája
55 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4.1.4.1.1. A Glomerulus Filtrációs Ráta (GRF) meghatározása
A vesék funkcionális kapacitásának legmegbízhatóbb, mérhető indikátorának a GFR-t tartják. Szintén ezt az
értéket tekintik a legmegfelelőbb információnak a funkcionáló nefronok számáról. Bizonyítottan bármilyen
vesefunkcióban történt elváltozás érzékeny és specifikus markere. A GFR meghatározása egy markervegyület
clearance-én alapul. A clearance pedig a „plazma azon térfogatát jelenti, amelyet az adott anyagtól időegység
alatt a vese megtisztít”. Az adott anyaggal szemben támasztott kritériumok a következők: 1. stabil
plazmakoncentrációval rendelkezik, 2. élettanilag inert, 3. szabadon filtrálódik a glomeruluson keresztül, 4. nem
szekretálódik, reabszorbeálódik, szintetizálódik, vagy metabolizálódik a vesében. Ha mindezen feltételek
teljesülnek, akkor a glomeruluson keresztül filtrálódott anyag mennyisége megegyezik a vizeletbe kiválasztott
anyag mennyiségével. Ekkor a clearance, azaz a GFR megkapható a következő képlet segítségével:
(4.1)
ahol
U = az adott anyag vizeletben mért koncentrációja (μmol/l)
V = időegység alatt kiválasztott vizeletmennyiség (ml/ perc, vagy l/nap)
P = az adott anyag plazmában mért koncentrációja (μmol/l)
A vese mérete és a GFR durva közelítéssel arányos a testmérettel. Éppen ezért szokásos egy átlagos testfelületre
(1.73 m2) vonatkoztatni azt.
Lássuk, mely anyagok alkalmasak a GFR meghatározására. Exogén anyagok közül az inulint kell
megemlítenünk, amely egy 5 kDa körüli molekulatömeggel rendelkező fruktóz polimer. Az inulin minden egyes
korábban felsorolt kritériumnak megfelel, éppen ezért az inulin clearance ideális a GFR meghatározásához,
tulajdonképpen a legjobb GFR standard. A gyakorlati alkalmazása mégsem terjedt el, mivel az inulin nem
szívódik fel az emésztő traktusból, folyamatos infúziós adagolása szükséges, amely igencsak megnehezíti rutin
laboratóriumi alkalmazását.
A gyakorlatban ezért egy másik anyag az endogén kreatinin clearance-t használják a GFR meghatározására. A
kreatinin kreatinből keletkezik vízvesztéssel (4.3. ábra), moltömege mindössze 113 Da, szabadon filtrálódik a
glomerulusokban, plazmakoncentrációja fordítva arányos a GFR értékével.
4.3. ábra - A Kreatin kreatinin átalakulás.
Bár olcsón meghatározható, endogén anyag lévén nem kell a szervezetünkbe juttatni néhány korlátozó
tényezővel tisztában kell lennünk: koncentrációját befolyásolja az 1. életkor, 2. a nem, 3. a fizikai aktivitás, 4.
néhány gyógyszer (pl. cimetidin), 5. az izomtömeg, 6. a tápláltsági státusz, 7. a húsbevitel. Továbbá a vizelet
kreatinin kicsi, de szignifikáns és változó hányada (~7-10%-a) tubuláris szekréciójából származik. Ez különösen
veseelégtelenség, igen lecsökkent GFR esetén válik jelentőssé, zavaróvá.
A vese laboratóriumi diagnosztikája
56 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kreatinin clearance meghatározásának pontatlanságát tovább fokozza, különösen járóbetegek esetén a
vizeletgyűjtés bizonytalansága. A gyűjtött vizelet mennyiségének és minőségének problémájával már
foglalkoztunk az 1. fejezetben, így itt csak vissza szeretnénk utalni arra. Még megbízható beteg esetében is 10%
körül mozog a variációs koefficiens, egy átlag beteg esetében ez ennek 2-3-szorosa is lehet. Fontos
megemlítenünk, hogy a GFR változik a korral. 40 éves életkor felett hozzávetőlegesen 1ml/min/1.73m2 értékkel
csökken évente, amely csökkenés 65 éves életkor felett gyorsul.
Mindezen pontatlanságok és kényelmetlenségek miatt, gyakran a vesefunkció kevésbé érzékeny indikátorát, a
plazma kreatinint szokták „csak” meghatározni. Sajnos a plazma kreatinin szint egész jelentős vesefunkció
romlás következtében emelkedik csak a referenciatartomány felső értéke fölé (4.4. ábra). Nagyon kevéssé
érzékeny vesefunkciós teszt. Így önmagában nem alkalmas a vesefunkció megítélésére. Tekintve, hogy a
kreatinin, az izomban található kreatin és kreatin-foszfát bomlásterméke az izomtömeg jelentős mértékben
befolyásolja vérszintjét. A húsfogyasztás jelentős mértékben emeli. Ezért érdemes az éhgyomri vérvételre
odafigyelni. Természetesen a kreatininszint is életkorfüggő, amelyet figyelembe veszünk a referencia tartomány
megállapításánál is.
A kreatin meghatározása: Két módszert érdemes megemlítenünk. Az első egy igen régen, 1886-ban publikált,
de a közelmúltig alkalmazott eljárás a Jaffé módszer. Ennek lényege, hogy a kreatinin lúgos közegben pikrát
ionokkal egy jól mérhető vöröses terméket képez. A módszer hátránya, hogy nem túl specifikus. A kreatinin
mellett egy sor más anyag (pl. glükóz, karbamid) is adja a reakciót, szerencsére kisebb mértékben és jóval
lassabban. Ezért, ahol még alkalmazzák, a kinetikus mérést részesítik előnyben, mivel ez nagyobb specificitást
mutat és jól adaptálható a klinikai kémiai automatákra.
4.4. ábra - a kreatinin clearance és a plazma kreatinin szint között fennálló kapcsolat.
A vese laboratóriumi diagnosztikája
57 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A közelmúltban egyre jobban elterjedt az úgy nevezett szarkozin oxidázos kreatinin meghatározás, melynek
lényege, hogy a kreatinint egy bakteriális kreatináz enzimmel szarkozinná és karbamiddá bontják, majd a
szarkozint szarkozin oxidázzal oxidálják glicinné és formaldehiddé (4.5. ábra). A reakció sztöchiometrikus
arányban keletkezett mellékterméke a hidrogén-peroxid, amelyet vízzé és atomos oxigénné bontunk peroxi-dáz
enzimmel. Az atomos oxigént az egyik legáltalánosabb indikátorreakcióban a Trinder reakcióban 4-
aminofenazon és egy fenolszármazék jelenlétében elreagáltatjuk és az így keletkező színes kininoimin
vegyületet fotometriásan meghatározzuk (4.6. ábra).
4.1.4.1.2. Plazma urea
Az urea (karbamid) elsősorban a májban keletkezik az aminosavak lebontásakor, az ornitin ciklus során.
Vizeletbe történő kiválasztása a nitrogénürítés elsődleges módja. A glomerulusokban filtrálódik, de passzív
tubuláris reabszorpciója egész jelentős mértékű lehet. Mind a mai napig használják a vese glumeruláris
funkciójának megállapítására, de meg kell jegyeznünk, hogy a plazma kreatinin szint jobban korrelál azzal. A
plazma karbamid szintjét a táplálék fehérjetartalma igen jelentős mértékben befolyásolja. A plazma karbamid
szintjének emelkedését azotémiának nevezzük, amely csak akkor alakul ki, ha a kreatinin clearance értéke már
30-40 ml/min alá csökken.
4.5. ábra - A kreatinin meghatározása szarkozin-oxidáz segítségével.
4.6. ábra - A Trinder-reakció.
A karbamid meghatározása: A karbamid ureázos bontása során keletkező ammónium ionokat α-
ketoglutaráttal reagáltatjuk glutamát dehidrogenáz és NADPH jelenlétében. A reakció során glutamát és NADP+
keletkezik. A reakciót a NADPH fogyás 340 nm-en történő meghatározásával követjük nyomon (4.7. ábra).
A vese laboratóriumi diagnosztikája
58 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4.1.4.1.3. Cisztatin C
A cisztatin C egy kis molsúlyú (12.8 kDa) fehérje, amelyet minden sejtmaggal rendelkező sejt termel.
Fiziológiai szerepe a cisztein proteázok gátlása. Kis molsúlya és magas izoelektromos pontja (pI=9.2) révén
szabadon filtrálódik, plazma szintjét nem befolyásolja az izomtömeg, a nemi hovatartozás, vagy a táplálkozás.
Eliminációjának kizárólag egyetlen ismert útja a glomerulusokon keresztüli filtrációja. Mindezen előnyös
tulajdonságai révén kitűnően alkalmas a GFR pontos meghatározására. Különösen előnyös kis, vagy közepes
mértékű vesekárosodások detektálására. A módszer egyedüli hátulütője magasabb költsége.
4.7. ábra - Az urea enzimes meghatározása.
4.1.4.1.4. Glomeruláris permeabilitás, fehérje ürítés
A glomerulusok mint szelektív szűrők működnek. A 1. fenesztrált endotél réteg, 2. a negatívan töltött
proteoglikánokban gazdag bazális membrán és 3. a nagymértékben specializálódott epitel sejtek egy olyan
szűrőt alkotnak, amelyen a makromolekulák 1. méret, 2. töltés és 3. alakfüggő módon juthatnak át. Mindezek
eredményeként az albuminnál nagyobb méretű (66 kDa, átmérő 3.5 nm) fehérjéket a glomerulus visszatartja,
azonban számos kisméretű fehérje visszatartása is bekövetkezik.
A fehérjeürítés megnövekedhet és proteinuriát (fehérjevizelés) okozhat, ennek három féle eredete lehet:
glomeruláris, túlterheléses és tubuláris. Ahogy azt már korábban megjegyeztük a normális fehérjeürítés 150
mg/24 h. Ennek durván felét az albumin adja, a másik felét kisebb, illetve a tubulusok által kiválasztott
(többnyire Tamm-Horsfall fehérje) fehérjék. A laboratóriumok által fehérje meghatározásra használt tesztcsíkok
általában 300 mg/24 h fehérjeürítésnél szólalnak meg. Az e feletti fehérjeürítés általában patológiás, azonban
kivételek akadnak, ilyen például a láz, a testmozgás, vagy a testhelyzet (ortosztatikus) miatt megnövekedett
fehérjeürítés. Ez utóbbit úgy lehet kiszűrni, hogy a reggeli (fekvést követő) vizeletből hiányzik.
Egyre inkább elfogadottá válik az a szemlélet, hogy a proteinuria nemcsak a következménye, hanem
kimondottan hozzájárul a vesebetegség progressziójához. A tubulusokban normálisnál nagyobb mennyiségben
felgyülemlő fehérje gyulladásos reakciókat indíthat el, ami hozzájárulhat az interstíciális szerkezeti
elváltozásokhoz és tovább rontja a már fennálló vesebetegséget.
4.2. A vese megbetegedései
A fejezet elején szeretnénk tisztázni, hogy jelen tankönyv nem egy belgyógyászat tankönyv így inkább csak
felvillantani szeretnénk a lehetséges megbetegedéseket, amely révén könnyebben megérthető a mért klinikai
paraméterek megváltozása, nem célunk a betegségek részletes tárgyalása.
Manapság egyre inkább kiszorul a veseműködés zavarainak akut és krónikus klasszifikációja, de mivel még
számos esetben alkalmazzák, röviden kitérünk rá.
4.2.4.2.1. Akut veseelégtelenség
A vese laboratóriumi diagnosztikája
59 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vese kiválasztó funkciója óráról órára romlik, azonban visszafordítható, ha a beteg túléli az akut fázist.
Tekintve, hogy rendkívül gyorsan fejlődik ki, gyors elektrolit, sav-bázis, és folyadék homeosztázis
összeomlással jár együtt, amely gyakran nehezen kontrollálható. Gyakorlatilag a kiváltó októl függetlenül
anuriával, vagy oliguriával (<400 ml/nap vizelet), illetve tubuláris diszfunkcióra utaló más abnormalitásokkal
jár. Amennyiben a beteg túléli, a felépülése napokon, heteken a kiváltó ok megszűntét követően bekövetkezik.
A biokémiai tesztek közül a vesefunkció gyors kiesésére utal a gyorsan megugró urea, kreatinin koncentráció,
illetve a súlyos, életet veszélyeztető metabolikus zavarok, mint a hiperkalémia (K+) és a metabolikus acidózis
(H+). A kezelés során, amelynek mindenképpen része a dialízis ezek rendkívül gyors megszüntetésére kell
koncentrálni. A felépülési szakasz alatt az elektrolit és folyadék státusz monitorozása miatt a labor szerepe
kritikus. A felépülési időszak általában egy poliuriás (sok vizelet) szakasza kezdődik, mivel a glomerulus
funkció korábban visszatér, mint a tubuláris. Ennek további következménye a jelentős elektrolit vesztés (K+,
PO43−) és az acidozis.
A kiváltó okok alapján az akut veseelégtelenség 3 alcsoportját különböztethetjük meg: 1. prerenális (vese
vérátáramlásának csökkenése), 2. intrinsic (a vese belső károsodása), illetve 3. posztrenális (húgyutak
obstrukciója).
A prerenális akut veseelégtelenséget valamilyen a vesét is érintő keringési rendellenesség okozza. Ilyen lehet
1. a súlyos vérveszteség, 2. az égés, 3. a folyadékveszteség, 4. a szívelégtelenség, 5. a hipotenzió. A lecsökkent
vese vérátáramlás vazokonstrikciót és a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer aktiválását idézi elő, amely
révén a GFR lecsökken. Amennyiben nem áll helyre rövid időn belül a vese vérátáramlása az akut prerenális
veseelégtelenség intrinszik veseelégtelenség kialakulását vonja maga után. Adódhat a kérdés, hogy miért
csökken le a kiválasztott vizelet mennyisége (anuria, oliguria)? A hipovolémia, hipotenzió miatt a vese
igyekszik folyadékot (vért) menteni, ezért aktiválódik a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer, illetve
vazopresszin szekréció indul be. Ezen hatások eredőjeként fokozódik a Na+ és víz visszaszívás, aminek
eredménye koncentrált, kis mennyiségű és alacsony Na+ koncentrációjú vizelet lesz. A csökkenő GFR
eredményeképpen pedig megnő a plazmakreatinin és urea szint. A csökkent H+ és K+ kiválasztás pedig
acidózisban, illetve hiperkalémiában nyilvánul meg.
Az intrinsic akut veseelégtelenségnek számos kiváltó oka lehet, de leggyakrabban különböző nefrotoxinok (pl.
gyógyszerek, mint az aminoglikozidok és a nem szteroid gyulladás gátlók) és veseisémia áll a hátterében.
Mindkettő tubuláris nekrózist idéz elő. Gyakran a GFR a keringés helyreállása után sem normalizálódik. Ennek
oka lehet vazoaktív anyagok intrarenális felszabadulása, illetve a tubuluslumen elzáródása törmelék, cilinder,
interstíciális ödéma következtében.
A postrenalis veseelégtelenség hátterében a vizeletelfolyás elzáródása következtében kialakuló hidrosztatikus
nyomás emelkedése áll, amely másodlagos vesetubulus károsodásokat okoz. A vesekárosodás reverzibilitása
attól függ, hogy milyen hosszan áll fenn az obstrukció.
4.2.4.2.2. Krónikus vesebetegség
A krónikus vesebetegségek körébe sorolnak minden olyan vesebetegséget, amelyek esetében a GFR értéke 60
ml/min/1.73m2 alácsökken 3 hónapnál hosszabb időre. A krónikus veseelégtelenség hátterében a leggyakrabban
1. a diabetes mellitus, 2. a hipertónia, 3. a glomerulonephritis, 4. policisztás vese, 5. a pyelonephritis áll. A
betegség észlelésétől a végstádiumig eltelt idő hetektől, évekig változhat. Sajnálatos tény, hogy a vesefunkció
romlása megállíthatatlan, legfeljebb a romlás mértéke befolyásolható. A romlás mértéke általunk nem
befolyásolható faktoroktól, mint 1. az életkor, 2. nem, 3. faji hovatartozás, 4. a vesefunkció a diagnóziskor és
általunk befolyásolható faktoroktól, mint 1. a proteinuria, 2. vérnyomás, 3. dohányzás függ. A vérnyomás és a
proteinuria csökkentése kimondottan kedvezően hat a vesebetegség romlására. A krónikus veseelégtelenség
miatt számos komplikáció alakulhat ki, mint például kardiovaszkuláris betegségek, csont betegségek és a
vérszegénység.
A krónikus veseelégtelenség klinikai kémiai tünetei a kiváltó októl függetlenül igen hasonlóak: 1. (4 l/nap alatti)
poliuria, 2. koncentráló, hígító funkció romlása (nikturia), 3. a Na+ egyensúly GFR = 20 ml/min értékig
megmarad általában, 4. hiperkalémia, 5. acidozis hajlam, 6. csökkent foszfát és ammónia kiválasztás.
4.2.4.2.3. Urémia szindróma
Az urémia szindróma egy olyan tünet együttes, amelynek hátterében a vesefunkció olyan mértékű leromlása áll,
hogy az képtelen már kielégítő módon fenntartani a kiválasztó, (folyadék, elektrolit háztartás) szabályozó és
A vese laboratóriumi diagnosztikája
60 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
endokrin funkcióit. Ezt tartják a veseelégtelenség terminális stációjának. Urémia szindróma esetén legalább 90
olyan anyagról számoltak be, amelyek, kiválasztásuk hiányában, feldúsulnak a plazmában. Példaképp néhányat
felsorolunk: karbamid, kreatinin, húgysav, cianát, poliolok, fenolszármazékok, cisztatin C, IL-6, TNF-α stb.
Ezek jelentős része toxikus.
Mindezek előidézik az urémia klasszikus tüneteit: fáradékonyság, gyengeség, étvágytalanság, hányinger,
hányás, izomtömeg vesztés, remegés, abnormális mentális funkciók, gyakori, felszínes lélegzés, metabolikus
acidózis. A szindróma kezeletlen esetben eszméletvesztéshez, kómához, majd halálhoz vezet. A kezelés dialízis
és vesetranszplantáció lehet. A plazma összetétele igen érzékenyen reagál az 1. étrendre, 2. a hidratáltsági fokra,
3. a gasztrointesztinális vérzésre, 4. hányásra, 5. hasmenésre, 6. gyógyszeres kezelésre.
A szindróma diagnosztikai kritériuma 15 ml/min alatti GFR érték. Gyakorlatilag ezen érték alatt vesepótló
kezelésre szorul a beteg. A korábban, a krónikus veseelégtelenségnél, felsorolt klinikai kémia paraméterek
további romlása is bekövetkezik. Ezeken kívül a romló endokrin funkciók miatt lecsökken az eritropoetin és a
kalcitriol szintézise, amely következményes anémiában és osteomaláciában nyilvánul meg. A vérnyomás
elégtelen szabályozása pedig általában hipertenzióhoz vezet.
4.2.4.2.4. Vesekövek
A nyugati lakosság mintegy 5-10%-nak 70 éves életkora előtt legalább egy veseköve képződik és a
vesekőképződés valószínűsége növekvő tendenciát mutat. Mind férfiak, mind nők esetében az első vesekő
képződése egyre fiatalabb életkorban bekövetkezik. A vesekőképződést táplálkozási és környezeti faktorokra
szokták visszavezetni, azonban genetikai és anatómiai abnormalitások is állhatnak a hátterében. Kövek
kialakulhatnak a vese gyűjtőcsatornájában, az uréterben, illetve a húgyhólyagban. A kő vándorlása rendkívüli
fájdalommal jár, amit vese kólikának neveznek és 15 perctől néhány órán keresztül is eltarthat, gyakran
hányingerrel és hányással jár együtt.
A kövek leggyakrabban kalcium-oxalátból (foszfáttal, vagy anélkül) (67%-os előfordulási valószínűség),
magnézium-ammónium-foszfátból (12%), kalcium-foszfátból (8%), urátból (8%), cisztinből (1-2%) illetve ezek
keverékéből (2-3%) állnak. Ezek a rendkívül alacsony oldhatósággal rendelkező vegyületek egy szerves
mátrixba kristályosodnak.
61 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
5. fejezet - Vizeletvizsgálat
A vizeletvizsgálatokkal kapcsolatos fejezet egyrészről a vesefunkciók vizsgálatával kapcsolatos fejezet
folytatása, másrészről több attól, mivel látni fogjuk, hogy a vizeletbe kerülő anyagok a rendellenességek igen
széles körére (más szervek diszfunkciójára is) utalhatnak. Ezért úgy döntöttünk, hogy megkülönböztetjük a
többi testfolyadéktól és külön fejezetben foglalkozunk vele.
5.1. ábra - Vizelet tesztcsík több reagenspárnával.
Vizeletvizsgálat
62 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vizeletvizsgálat tipikusan jó szűrővizsgálati módszer, mivel 1. a mintavétel nem invazív, 2. a betegek (vagy
talán jobb kifejezés a vizsgálandó emberek) igen széles köre bevonható, 3 elvégzése nem igényel mélyebb
laboratóriumi szaktudást. A leggyakrabban mégis a központi laboratórium feladatkörébe tartozik, mivel így
összevonhatók a már komoly szaktudást és gyakorlatot igénylő, rendkívül informatív vizeletüledék vizsgálattal.
Vizeletvizsgálat
63 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Természetesen a vizeletvizsgálat során számos hátránnyal és korláttal is szembesülnünk kell. Ahogy azt a
vesefunkció vizsgálatával foglalkozó fejezetben már említettük a vese úgy biztosítja az extracelluláris
folyadéktérfogat és összetétel állandóságát, hogy a vizelet térfogatát és összetételét meglehetősen tág határok
között változtatja. Így meglehetősen nagy különbség lehet a vizelet mennyiségében, illetve a vizeletben oldott
anyagok koncentrációjában. Ezt a problémát áthidalhatjuk, úgy hogy csak minőségi analízist végzünk, csak
azzal foglalkozunk, hogy az adott analit jelen van-e a vizeletben, vagy sem. Illetve megoldás lehet, hogy a
vizelet térfogatától független viszonyítási alapot keresünk. Mindenesetre a néhány szemikvantitatív
vizeletvizsgálat, amely a vizeletben megjelenő kóros analitek kimutatására irányul az általános betegvizsgálat
részét képezi. További hátrányt jelent a nagyszámú minta gyűjtése, kezelése. Ez ahhoz vezethet, hogy a
laboratóriumba érkező minta nem friss, emiatt vizsgálhatósága korlátokba ütközhet.
Az úgy nevezett kémcsőpróbákat gyakorlatilag már nem alkalmazzák a laboratóriumok, leggyakrabban analitek
(pl. glükóz, bilirubin, urobilinogén, ketontestek, nitrit, vér/hemoglobin, fehérje, aszkorbinsav) kimutatására
kizárólag tesztcsíkokat alkalmaznak. A tesztcsíkok vékony műanyagcsíkra felragasztott szűrőpapír, üvegrost
párnácskákból állnak, amelyekben a megfelelő reagensek megtalálhatóak (5.1. ábra). A csíkot a vizeletbe
mártjuk, majd a vizelet feleslegét az edény peremén lehúzzák. Itt gondosan figyelni kell arra, hogy a csíkot ne
tartsuk huzamosabb ideig a vizeletben, mert ez esetben a reagensek kioldódhatnak és az egyébként intenzív szín
gyengülhet, a reakció csak korlátozott mértékben, vagy egyáltalán nem játszódik le. A kiértékelés szemmel
történik a tesztcsík dobozára ragasztott színskálához viszonyítva. A reakció következtében kialakult szín igen
gyakran nem tartós, így a kiértékelést néhány percen belül el kell végezni.
5.2. ábra - Vizelet tesztcsík leolvasása remissziós fotométerrel.
A tesztcsíkok egy részét remissziós fotométerrel (5.2. ábra) is kiértékelhetjük, sőt ezeket a fotométereket
gyakran automatává építik ki. Ez esetben ezen szemikvantitatív vizsgálatok pontossága megközelítheti a
mennyiségi analitikai meghatározások pontosságát. Ehhez szükséges a leíratok pontos betartása, a pontos
inkubációs idő (a vizelettel nedvesítés és a leolvasás között eltelt idő) betartása.
Vizeletvizsgálat
64 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Szintén fontos elem, hogy a vizelet minél gyorsabban, a minta megromlása, további változása nélkül analízisre
kerüljön. A tesztcsíkok reagens párnái igen érzékenyek a nedvességre, így a tároló kupakban nedvességmegkötő
szilikagél található, ügyelni kell a gyors és tökéletes zárásra használatukat követően. A többféle analit
meghatározására szolgáló több reagens mezős tesztcsíkok különböző reagens mezői nem egy időben
inaktiválódnak a helytelen, vagy hosszú (lejárati időn túli) tárolás esetén.
Természetesen ezen szemikvantitatív vizeletvizsgálatok minőségét is ellenőrizzük megfelelő kereskedelmi
forgalomban kapható, liofilizált kontroll vizeletkészítmények segítségével.
Az általános megfontolásokat követően lássuk a legfontosabb vizeletből meghatározott analitek sorát.
5.1. Vizeletcukor
Ez a gyakorlatban a vizelet glükóz tartalmának meghatározását jelenti. A glükóz a vese glomerulusokban
filtrálódik, majd a proximális tubulusban teljes mértékben visszaszívódik, így normális esetben a vizeletben
nincs jelen. Vizeletben történő megjelenésének legvalószínűbb oka a magas vércukorszint. Az emelkedő
vércukorszinttel a proximális tubulus glükóz transzporterei is telítődnek és a telítési koncentráció felett már nem
képesek visszaszívni (transzportálni a glükózt). Ekkor az megjelenik a vizeletben. Ez a telítés 9-10 mM-es
vércukor koncentráció esetén következik be. Nagyon nagy mennyiségű gyorsan felszívódó szénhidrát
(elsősorban monoszacharid, glükóz) fogyasztását követően ez fiziológiásan is bekövetkezhet, de leggyakrabban
cukorbetegségre (diabetes mellitusra) utal. Amennyiben tehát a vizeletben glükózt találunk, a következő lépés
mindenképpen a plazma glükóz koncentrációjának meghatározása kell, hogy legyen. A glükóz vizeletben
történő megjelenése (glükózuria) előfordulhat normális plazma glükózkoncentráció esetén is. Ennek oka lehet a
proximális tubulus glükóz transzportereinek örökletes, vagy szerzett defektusa (renális glükózuria).
5.3. ábra - Vizeletcukor meghatározása glükóz-oxidáz, peroxidáz kálium-jodid
próbával.
Vizeletvizsgálat
65 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Meghatározás: A tesztcsíkok glükóz párnácskái glükóz-oxidáz, peroxidáz enzimeket és kálium-jodidot
tartalmaznak. Amennyiben a vizelet glükózt tartalmaz a glükóz oxidáz azt glükonsavvá oxidálja. A reakció
sztöchiometrikus arányban keletkező mellékterméke a hidrogén-peroxid, amelyet a reagens párna peroxidáz
tartalma atomos oxigénre és vízre bontja. Az így képződött atomos oxigén a jodidot (KI) jóddá oxidálja. A
káliumjodid jelenlétében a képződött jód oldódik a vizes közegben és a reagens párna elszíneződését okozza
(5.3. ábra). A tesztcsík viszonylag széles határok között alkalmas a vizelet glükóz tartalmának szemikvantitatív
meghatározására. Igen gyakran a glükóz meghatározásra készült tesztcsíkok tartalmaznak aszkorbát reagens
mezőt is, mivel a nagymennyiségben fogyasztott C-vitamin, a vese aszkorbát visszaszívási küszöbét
meghaladva (a glükózhoz hasonlatosan) a vizeletbe kerülhet és mint antioxidáns a hidrogén-peroxidot, atomos
oxigént megköti, ezáltal gátolja a fenti reakció lezajlását.
5.2. Ketontestek a vizeletben
A ketontestek közé soroljuk az acetoacetátot, a β-hidroxi-butirátot. Az acetoacetát egy része spontán módon
acetonná dekarboxilálódik. Az aceton jellegzetes szaga miatt, a beteg aceton szagú lehelete révén igen könnyen,
akár laboratóriumi háttér nélkül is, diagnosztizálható a ketoacidózis. Normális esetben a plazma mindössze 20-
30 μM-os acetoacetát és β-hidroxi butirát koncentrációval jellemezhető. Éhezés során ez 3-4 mM-ra emelkedik,
diabetes mellitus esetén pedig elérheti akár a 15-20 mM-es plazmakoncentrációt is (a részletes
reakciómechanizmust a cukorbetegséggel foglalkozó fejezetben ismertetjük). Jó vízoldhatóságuk miatt, magas
plazma ketontest koncentráció esetén a ketontestek megjelennek a vizeletben is. A vizeletbe mind az
acetoacetát, mind a β-hidroxi butirát bekerül, arányuk viszonylag állandó 75-80% acetoacetát, 20-25% β-hidroxi
butirát. A laboratóriumban leggyakrabban alkalmazott módszerrel csak az acetoacetát és a belőle
dekarboxilációval keletkező aceton mutatható ki, -hidroxi butirát
arány miatt ez nem jelent gondot. (Ez alól kivételt képez a diabeteses betegek ketoacidózisa, ahol az arányok
épp fordítottak: 78% hidroxi-butirát, 20% acetoacetát, 2% aceton, ami miatt kialakul az a paradoxon, hogy a
beteg kezelésével a ketózis látszólag romlik, mert a hidroxi-butirát acetoacetáttá konvertálódik.)
5.4. ábra - Vizelet ketontest meghatározás
Meghatározás: A reagens párna nátrium-nitropruszidot (dinátrium-pentaciano-nitrozil-ferrát(III)) és dinátrium-
hidrogénfoszfátot tartalmaz. Utóbbi biztosítja az enyhén lúgos pH-t, amelyen a nátrium-nitropruszid színes
(ibolyásbarna) terméket képez az acetoacetáttal és az acetonnal (5.4. ábra).
5.3. Vizelet bilirubin
A bilirubin, a hem lebontási terméke, amelynek biotranszformációjával, szervezetből történő kiürülésével
részletesen a máj funkciós fejezetben foglalkozunk. Most röviden csak annyit jegyeznénk meg, hogy a bilirubin
hidrofób sajátságú vegyület, a keringésben albuminhoz kötődve szállítódik, mivel az albumin sem filtrálódik,
így a hidrofób sajátságú (nem konjugált) bilirubin sem kerül a vizeletbe. A hidrofób sajátságú vegyületet a máj
felveszi, majd itt UDP-glukuronsavval konjugálódik, így vízoldható lesz. A vízoldhatóvá tett bilirubin az epébe
ürül, normális esetben nem jelenik meg, legfeljebb csak igen kis mennyiségben a keringésben, majd a
vizeletben. A vizeletben megjelenő (konjugált) bilirubin annak a jele, hogy annak szintje a keringésben 20-25
μM fölé emelkedett. Ennek igen gyakori oka az epeút elzáródása. A vizelettesztek 7-8 μM-es (konjugált) vizelet
bilirubin koncentráció fölött válnak pozitívvá.
Meghatározása: A bilirubin jelenléte szemmel is jól látható, a vizeletet sárga-vöröses sárga színűre színezi.
Ezen kívül feltűnő lehet intenzív habosodása, amelyen nem a bilirubin, hanem az epeút elzáródással szintén a
keringésbe, majd a vizeletbe kerülő detergens hatású epesavak okoznak. A vizelet bilirubin meghatározása
tesztcsíkokkal történik. A tesztcsík bilirubin párnácskája valamilyen diazóniumsót (pl. 2,6-diklór-benzol-
diazónium-tetra-fuoroborát) tartalmaz, amely elszíneződés kíséretében diazotál-ja a bilirubint (5.5. ábra).
5.5. ábra - Vizelet bilirubin meghatározás.
Vizeletvizsgálat
66 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
5.4. Urobilinogén
Az urobilinogén az epével a bélcsatornába kerülő konjugált bilirubinből keletkezik. A vizelet urobilinogén
mennyisége a bilirubin enterohepatikus körforgásának mértékét tükrözi. A vizelet urobilinogén tartalmának
kimutatásakor, a hozzá hasonlóan, a kimutatásra szolgáló reagenssel reagáló, szintén epefesték mezobilinogén
és szterkobilinogén is kimutatásra kerül. Kis mennyiségű urobilinogént a vizelet fiziológiásan is tartalmaz, tehát
az abszolút negatívvá váló urobilinogén a bilirubin enterohepatikus körforgásának hiányára (leggyakrabban
epeút elzáródásra) utal. Fokozott enterohepatikus bilirubin körforgás esetén az urobilinogén (és társainak)
mennyisége is megnő a vizeletben a reakció színintenzitása is fokozódik. Ilyen emelkedett UBG kiválasztás
tapasztalható például hemolítikus ikterusz, hepatitisz esetén.
Meghatározása: A tesztcsíkok UBG párnácskája az UBG-re specifikus diazóniumsót (pl. 4-metoxibenzol-
diazónium-tetrafluoroborátot) tartalmaz. A bilirubinhoz hasonlóan a keletkező színes vegyület indikálja a
reakció lezajlását, az UBG jelenlétével arányos szín kifejlődését. Fontos megjegyeznünk, hogy a vizelet UBG
szintje cirkadián ingadozást mutat, melynek maximuma délután 2-4 óra között van. Állás közben a légköri
oxigén hatására urobilinné, illetve szterkobilinné oxidálódnak a bilinogének, amelyek már kisebb intenzitással
adják a színreakciót, így a vizsgálatot célszerű friss vizeletből végezni.
5.5. Vizelet fehérje
Ahogy azt korábban a vesefunkcióval foglalkozó fejezetben említettük a vizelet mindig tartalmaz kis
mennyiségű fehérjét. A vizelettel ürített fehérje mennyisége normálisan nem haladja meg a 150mg/24h értéket.
Az e feletti fehérjeürítés kórosnak tekintendő. A tesztcsíkok kimutatási határa 0.1 g/l-es koncentráció körül van.
A gyakorlatban különösen nagy figyelmet kell fordítani a diabetes mellitushoz, a hipertóniához és az autoimmun
folyamathoz társuló mikroalbuminuriára.
Meghatározás: A tesztcsíkok fehérje reagens párnája valamilyen savas kémhatású puffert és tetrabrómfenol-
kék indikátort tartalmaznak. A vizelettel történő érintkezéskor az indikátor gyakorlatilag teljes mértékben nem-
disszociált formában fordul elő és az erre jellemző sárga színt mutatja. Amennyiben a vizelet fehérjét tartalmaz,
akkor azok savas pH-n (ez a savas puffer oka) kvaterner (−NH3+) formában található amino csoportjaival reagál,
disszociál és megjelenik a disszociált formára jellemző kék szín (ez a sárga háttér előtt zöldnek látszik) (5.6.
ábra). A tesztcsík elsősorban albuminra érzékeny és számos vegyület, például a kvaterner ammónium ionokat
tartalmazó fertőtlenítőszerek zavarják. Tekintve, hogy ezen meghatározás is szemikvantitatív, a diabéteszes
nefropátia nyomon követésére az albumin kvantitatív meghatározása vizeletből (albuminuria) megfelelőbb.
5.6. ábra - Vizelet fehérje meghatározás.
5.6. Vizelet pH
Vizeletvizsgálat
67 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vese az extracelluláris folyadéktér térfogatát és összetételét viszonylag állandó szinten tartja. Ez alól az
állandó pH biztosítása sem kivétel. Ennek, következménye, hogy a vizelet összetétele, így a vizelet pH értéke is
igen széles tartományon belül változhat (pH 4.8-9.0). A vizelet pH-jára komoly hatást gyakorol a táplálkozás,
nagyobb mértékű húsfogyasztás a savas, a vegetáriánus életmód pedig a lúgos irányba tolja el.
Meghatározás: a teszt csíkok pH reagens mezője univerzál indikátorpapír tulajdonképpen, általában metil-
vöröst és bróm-timolkék indikátorokat tartalmaz. Figyelembe kell venni, hogy a vizelet pH meghatározását
különböző gyógyszerek, illetve a vizeletbe kerülő nagyobb mennyiségű fehérje zavarja, valamint az állás során
jelentős mértékben változhat.
5.7. Vizelet vér/hemoglobin
A vizeletüledék vizsgálat helyettesítheti, mivel az pontosabb képet ad a vizeletbe került vérsejtekről (és
baktériumokról) mint a tesztcsíkok tájékoztató jellegű eredményei.
Kimutatásuk: A tesztcsíkok vér/hemoglobin párnácskái valamilyen szerves peroxidot, leggyakrabban kumol-
hidroperoxidot, illetve nagy kapacitású puffert (pl. citromsav-citrát) és egy redox indikátorfestéket tartalmaznak.
A hemoglobin pszeudo peroxidáz aktivitása révén a tesztcsík vizeletbe mártásakor az ott levő szabad
hemoglobin, vagy a vörösvértestek felbomlása révén oda kerülő hemoglobin a szerves peroxidot atomos
oxigénre és vízre bontja. A felszabaduló atomos oxigén a csíkban található színtelen aromás redoxindikátort
oxidálja, az oxidált forma színes lévén a párna elszíneződését okozza (5.7. ábra). Az egyenletes elszíneződés
hemoglobin, a pöttyök kialakulása vörösvértest jelenlétére utal.
5.7. ábra - Vizelet vér (hemoglobin) kimutatása
A vizeletbe került fehérvérsejtek kimutatása a leukociták észteráz aktivitásán alapul. A reagens párna a
szubsztátot, naftol AS-D klóracetátot és egy stabilis diazóniumsót (2-klór-4-benzamido-5-metil-benzil)-benzol-
diazónium-kloridot tartalmaznak. A tesztcsíkot a vizeletbe mártva, amennyiben a vizelet leukocitákat tartalmaz,
annak észteráz aktivitása a szubsztrátban található észterkötést hidrolizálja, a szabaddá váló naftolvegyület pedig
a diazóniumsóval egy vöröses színű terméket képez.
A vizeletben lévő leukociták jelenléte valamilyen bakteriális húgyúti fertőzésre utal. Ez megerősíthető a vizelet
nitrittartalmának vizsgálatával. A vizelet ugyanis nitritet nem, csak nitrátot tartalmaz. A vizeletben lévő
baktériumok a nitrátot nitritté alakítják. Így tehát a nitrit vizeletben történő megjelenése bakteriális fertőzésre
utal. A nitrit párnácska Griess-Ilosvay reagenst tartalmaz. A reakció két lépésből áll, az első a szulfanilsav
diazotálása a savanyítás hatására keletkező salétromossavval, a második az így keletkezett diazóniumsó
kapcsolása az α-naftilaminnal vörös diazofestékké:
NH2-Benzol-SO3H + NH2-Naftalin + NO2−+ H+→ HSO3-Benzol-N=N-Naftalin-NH2 + 2H2O
Vizeletvizsgálat
68 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Itt fontos megjegyeznünk, hogy a Gram pozitív baktériumok nem alakítják át a nitrátot nitritté, viszont, ezek is
okoznak húgyúti fertőzést (pl. S. saprophyticus), tehát negatív eredmény esetén sem zárható ki a bakteriális
fertőzés. Akár pozitív, akár negatív a nitrit, leukocitáknak lenniük kell a vizeletben infekció kapcsán.
5.8. Vizelet sűrűség
Az egyetlen vizsgált fizikai paraméter a vizeletvizsgálatok közül. Elsősorban a vesék által kiválasztott víz
mennyisége határozza meg. Amennyiben a vizeletben normálisan jelenlevő sókon és nitrogéntartalmú
anyagokon (főleg karbamid) kívül más anyag is megjelenik, megnő a fajsúlya. Ilyen anyagok lehetnek a glükóz
és a fehérje. A vizelet fajsúlyának meghatározására a vesék koncentráló funkciójának vizsgálatakor kerül
elsődlegesen sor.
5.9. Vizeletüledék
A vizeletüledék vizsgálata a vese és húgyutak vizsgálatának kulcsmódszere. A vizsgálat történhet mikroszkóp
segítségével manuálisan, vagy laboratóriumi vizeletüledék automata alkalmazásával. A manuális módszerrel
történő vizsgálat, tapasztalt személyzet esetén nem tart hosszú ideig. A minták jelentős része negatív, a pozitív
minták jó része pedig nem igényel hosszasabb mérlegelést (gennyes és/vagy véres). A manuális vizsgálathoz
általában nagy nagyítást (HPF) 40x-es nagyítású objektívet használunk leggyakrabban, de a cilinderek
vizsgálatához kis nagyítást (LPF) 10x objektívvel. A minták általában 6-8 látótér alapján már megítélhetőek. A
vizsgálatot lehetőleg friss, 1-2 óránál nem régebbi vizeletből végezzük. A mintát 10 ml-es centrifugacsőbe
töltjük, majd 5 percig 1000 g-n centrifugáljuk. A tiszta felülúszó 9 tizedét leszívjuk, majd a maradék egy tized
térfogatban felszuszpendáljuk a pelletet. A szuszpenziót tárgylemezre cseppentjük.
A vizeletüledék automata esetében a minta előkészítése hasonló módon történik. Ez esetben a különbség annyi,
hogy a kicseppentett minta egy automatába kerül, amely hasonló nagyítás mellett egy CCD kamera segítségével
fényképet készít a mintáról. Ezt követően egy program az üledékben található sejtes és nem sejtes elemeket
alakjuk (morfológiájuk) alapján beazonosítja. Ezen kívül léteznek a hematológiai automatákhoz hasonló elven
(Coulter-elv) működő vizelet üledék automaták is (Sysmex UF sorozat).
A vizelet mintavételezése az első fejezetben leírtak szerint kell, hogy történjen. Fontos a betegek figyelmét
felhívni a megfelelő tisztálkodásra és a középsugaras vizeleti mintavételre, másképp a minta a sok laphámsejt
miatt nem, vagy csak igen nehezen értékelhető.
Sejtes elemek
Vörösvértestek: Könnyen felismerhetők méretük és szemcsézetlen szerkezetük (nem rendelkeznek
sejtorganellumokkal) alapján. Az alsó húgyutakból származó friss vörösvértestekkel szemben, a húgyhólyagból
és a felső húgyutakból származó vörösvértestek vadgesztenye formájúak, zsugorodottak.
Fehérvérsejtek: Lehetnek élő fehérvérsejtek, elhalt leukociták és gennysejtek. Az élő leukociták eltérő
nagyságúak, a sejtmagjuk kicsi, ezzel szemben az elhalt leukociták egyforma méretűek, sejtmagjuk kerek alakú
az élő sejtekhez képest puffadtak. Akut vesegyulladás esetén a leukociták összecsapzódnak, sejtes szerkezetük
elmosódik, illetve a sejtek között szemcsés törmelék látható.
Laphámsejtek: A húgycsőnyílás környékéről mosódnak a mintába. Veszélyük az, hogy elfedik a diagnosztikai
szempontból érdekes sejtes elemeket. A hólyagból is származhatnak, ezek általában kisebb számban vannak és
végeik kihúzottak, kis farok-szerű képződményük van. A hámsejtek mennyisége megnő bakteriális fertőzés,
fűszeres ételek és bizonyos gyógyszerek hatására.
Spermiumok: Idősebb férfiakban állandó jelenlétük az ondóvezeték gyulladására utalhat.
Gombasejtek: elsősorban cukrot ürítő cukorbetegek vizeletében találni élesztősejteket, illetve hüvely
candidiasisban szenvedő nők vizeletében Candida albicans fonalakat.
Cilinderek: A cilinderek a vesecsatornákban képződő legömbölyített végű, pálcika, vagy csavar alakú
képződmények. A fehérjetartalmú glomerulusfiltrátumból képződnek a vizelet pH változása révén. Alakjukat a
vesetubulusoktól, mint öntőformától nyerik. A tiszta cilinderek a proteinuriával azonos jelentést hordoznak.
Amennyiben a fehérjetartalmú tubuláris vizelet sejtes elemeket is magával visz, akkor ezek belekerülnek a
képződő cilinderbe és a sejt típusától függően vörösvértest, fehérvérsejt, hámsejt, vagy ezek kombinációjából
Vizeletvizsgálat
69 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
álló cilinderek jönnek létre. A sejtes-cilinderek fontos diagnosztikai jelentősége az alsó húgyúti és
vesegyulladások elkülönítésében rejlik.
Kristályok
Bár a vizeletüledékben található kristályok és a vesekövek között csak laza összefüggés van, érdemes
megvizsgálni őket. Beazonosításuk viszonylag könnyen megtehető morfologiájuk alapján, majd az étrend
változtatásával tehetünk kialakulásuk (mértéke) ellen.
Oxalát: A savas pH mellett megjelenő oxalát kristályok oktaéderesek, míg semleges és lúgos pH mellett ovális
alakúak. Általában Ca-oxalát formában vannak jelen. Tanácsos friss (meleg) vizeletből végezni a vizsgálatot,
mivel hideg vizeletből az állás során akkor is kiválik, ha fiziológiásan nem volt jelen.
Húgysav, urátsók: Az oxalát sókhoz hasonlóan könnyen kiválik az állni hagyott vizeletből savas pH-n vaskos
tompa végű, lúgos pH-n mandragóragyökér alakú kristályokat képez.
A különböző foszfát kristályok közül magnézium-ammóniumfoszfát jelenléte bakteriális fertőzésre utalhat.
70 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
6. fejezet - Májfunkciók laboratóriumi vizsgálata
A máj központi szerepet tölt be az anyagcserében, az emésztésben, a méregtelenítésben és a különböző anyagok
szervezetből történő eltávolításában. Az emésztőtraktusból érkező teljes vérmennyiség elsőként a májon
keresztüláramlik, ahol megtörténik az emésztésből származó anyagok feldolgozása, átalakítása, raktározása.
Igen fontos szerepet tölt be a szénhidrátok, fehérjék és lipidekanyagcseréjében, szintén itt történik az epesavak
koleszterinből történő szintézise, amely elősegíti a koleszterin, keringésből történő eltávolítását, valamint a
lipidek és zsíroldható vitaminok felszívódását. A máj biotranszformációjuk során elvégzi mind az endogén,
mind az exogén anyagok (mint például különböző gyógyszerek, toxinok) feldolgozását, amely lehetővé teszi
szervezetből történő eltávolításukat. A máj ezen kívül endokrin szerepkörrel is bír, mivel itt zajlik a pajzsmirigy
hormon, a kortizol, a D vitamin katabolizmusa, illetve az inzulin-szerű növekedési faktor I (IGF-I), az
angiotenzin és az eritropoetin szintézise. Ezen májfunkciók bármelyike vizsgálható a klinikai laboratóriumban,
hogy betekintést nyerjünk a máj integritásába.
A máj, mint nagyméretű szerv meglehetősen nagy tartalék kapacitással rendelkezik. Éppen emiatt számos, akár
súlyos májkárosodással járó betegség esetében képes a normális májfunkciók viszonylag hosszú időn keresztül
történő fenntartására. Ezekben az esetekben a májat ért károsodásra csak az abnormális teszteredmények
utalhatnak. Leggyakrabban erre, a májban található enzimek szérumszintjének és azok eltérő mintázatának
meghatározását használjuk. A krónikus májbetegségek igen gyakran járnak együtt a máj kötőszövetesedésével, a
kötőszövetesedési folyamat markerei gyakran a májkárosodás jó indikátorai.
A fejezet elején egy nagyon rövid anatómiai ismertetést követően rátérünk a máj biokémiai funkcióinak
ismertetésére és azok laboratóriumi vizsgálatának módszereire.
6.1. A máj anatómiája
Egy felnőtt ember mája megközelítőleg 1.2-1.5 kg súlyú. A diafragma (rekeszizom) alatt, az abdomen (hasüreg)
jobb felső kvadránsában (negyedében) a bordák által védve helyezkedik el. Rögzítéséről szalagszerű
képződmények gondoskodnak.
Vérellátás: A máj kettős vérellátással rendelkezik. Az első a portális véna, amely a lépből és a tápanyagokban
gazdag vért szállítja az emésztőtraktusból. Nagyjából a máj teljes vérellátásnak 70%-át ez biztosítja. A másik a
hepatikus artéria. Ez utóbbi a központi keringésből származó oxigén dús vérrel látja el a májat. Legvégül ez a
két vérellátási forrás egyesül és a máj szinuszoidokba ömlik. A májszinuszoidok a különálló, egysejt réteget
alkotó hetatociták között levő tér (6.1. ábra). A májból történő vénás elfolyás a hepatikus vénákon keresztül
történik, amely aztán a vena cava inferiorba torkollik közel annak jobb pitvarba torkollásához.
Epeutak: Az epeelfolyás az epe kanalikulusoknál ered. Az epe kanalikulusok a szomszédos májsejtek között
található kis árkok, amelyek csatornácskákat formálnak, majd ezek egyesülnek és az intrahepatikus
epevezetékeket alkotják (6.1. ábra).
6.1. ábra - A máj mikroszkópikus felépítése.
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
71 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Ezek végül egyesülnek és a jobb és bal hepatikus epecsatornát alkotják, amelyek a porta hepatikán lépnek ki és a
közös hepatikus csatornát alkotva egyesülnek. A hepa-tikus csatorna egyesül az epehólyagból érkező cisztikus
csatornával, hogy együtt alkossák a közös epevezetéket (6.2. ábra), amely a duodenumba ömlik. Az epehólyag,
amely a jobb májlebeny alatt helyezkedik el az epasavas sókból és hulladék anyagokból álló epét tárolja és
koncentrálja. A táplálék elfogyasztása által kiváltott hormonális stimulus hatására az epehólyag izmos fala
összehúzódik és epesavas sókat juttat a vékonybélbe, hogy elősegítse a zsírok emésztését.
Mikroszkópikus felépítés: A máj funkcionális anatómiai egysége az acinus, amely a portális véna, hepatikus
véna és epecsatorna által alkotott portális triáddal határolt. Minden egyes acinus egy máj paranchyma által
alkotott gyémánt alakú szövetdarab. Az acinus ellátásáról a portális véna és a hepatikus artéria végső elágazásai
gondoskodnak és az epeelfolyást az epecsatornácska végső elágazásai biztosítják. A vérerek a periféria irányába
haladva szinuszoidokat alkotnak, amely átöblíti a májat és végül a központi májvénába ömlik. A szinuszoidok
fenesztrált endotél sejtekkel határoltak, ezáltal lehetővé teszik a vér szabad filtrálódását (6.1. ábra). Szintén itt
találhatóak a Kupffer sejtek, amelyek monocitákból származnak és lizoszóma tartalmuk révén képesek a
fagocitált baktériumok lebontására. Ők felelősek a véráramban található antigén-antitest komplexek
kiszűréséért, eliminálásáért is.
6.2. ábra - A máj és az epeutak makroszkópikus anatómiája.
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
72 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A máj legfontosabb funkcionáló sejtjei a hepatociták, ők felelősek a legtöbb metabolikus és szintetikus
funkcióért. A csillagsejtek a hepatociták és a szinuszoidok bélését adó endotél sejtek között helyezkednek el.
Normális körülmények között feladatuk az A vitamin raktározása és a NO szintézise. Külsődleges stimulusra
kollagén termelő sejtekké alakulnak, így ők felelősek a máj kötőszövetesedéséért, a cirrózis kialakulásáért.
A hepatociták ultraszerkezete: Nagy meglepetés nem éri a biokémiát ismerő embert. A mitokondriumok
felelősek az energia előállításáért. A durva felszínű endoplazmás retikulum a fehérjeszintézisért, a sima felszínű
endoplazmás retikulum tartalmazza a biotranszformáció, a koleszterin és az epesavas szintéziséért felelős
enzimrendszereket. A peroxiszómák felelősek a zsírsavak β-oxidációjáért (7-18 C atomszám között), valamint
részt vesznek az alkohol lebontásában. A lizoszómák hidrolitikus enzimeket, vasat, lipofuscint, epe pigmenteket
és rezet tartalmaznak, raktároznak. A Golgi apparátus pedig különböző anyagok, mint az epesavak és az
albumin szekréciójában vesz részt.
6.2. A máj biokémiai funkciói
A máj biokémiai funkcióinak sorát a méregtelenítéssel, a biotranszformációs folyamatok ismertetésével kezdjük.
A biotranszformáció folyamatai elsősorban a máj parenchy-masejtjeiben zajlanak, azonban meg kell
jegyeznünk, hogy más szervekben is lejátszódnak, így a tüdőben, a bőrben, a bélben és a vesében is. A
biotranszformáció során azok az endogén (pl.: hormonok, bilirubin) és azok az idegen (vagy xenogén) anyagok
(pl.: különböző gyógyszermolekulák, toxinok), amelyek felhalmozódnának a szervezetben átalakításra, majd
kiürítésre kerülnek. A biotranszformációs reakciók során általában egy adott vegyület oldhatósága megváltozik,
a zsíroldható vegyületek vízoldhatóvá válnak, kijutnak a sejtből, a vérpályán keresztül a vesébe jut, ahol már,
mint vízoldható molekula filtrálódik és a vizelettel ürül. Másik lehetséges eltávolítási mód, hogy az
epekanalikulusokba választódik ki az epével együtt, a bélbe jut és a széklettel távozik.
A biotranszformáció folyamatait három szakaszra osztjuk.
I. Előkészítő 1. fázis: a kiválasztandó molekulán konjugációra alkalmas funkciós csoportok (pl. hidroxil,
karboxil, amino, tiol) kialakítása, 90 %-ban monooxigenázok katalizálják
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
73 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
II. Konjugációs 2. fázis: a reaktív (konjugációra alkalmassá tett) molekulákhoz általában vízoldható molekula
kötése. Ennek révén maga a molekula is vízoldhatóvá válik.
III. Transzport 3. fázis: a vízoldhatóvá tett molekula transzportja a sejtből
A biotranszformáció enzimei alacsony Km értékkel és széles szubsztrát specificitással jellemezhetőek. Így a
toxikus anyagok igen széles körét, már igen alacsony koncentrációban képesek átalakítani, majd kiüríteni.
Röviden tekintsük végig a biotranszformáció három fázisának történéseit, majd egy endogén és egy xenogén
szubsztrát szervezetből történő eliminálását.
Előkészítő 1. fázis
Az előkészítő fázis során alakulnak ki a konjugációra alkalmas funkciós csoportok. Elméletileg ez
bekövetkezhet 1. oxidáció (oxigenáció), 2. redukció, vagy 3. hidrolízis révén. Gyakorlatilag az 1. fázis
reakciók 90%-a oxigenáció, mely során a légzési oxigén molekula egyik oxigén atomja a konjugációra
előkészítendő molekulába épül a másikból pedig egy vízmolekula képződik (6.3. ábra). Az oxidációs
folyamatokat a sima felszínű endoplazmás retikulum membránhoz kötve egy többkomponensű enzimrendszer
katalizálja. Az enzimrendszer által katalizált folyamat, mivel hasonlít a légzési elektrontranszfer láncra,
mikroszómális légzési láncnak nevezték el. Az oxigenációt végző citokróm P 450 enzimek, nevüket onnan
kapták, hogy CO-dal alkotott komplexük 450 nm-es hullámhosszúságnál mérve jellegzetes abszorpciós
maximumot mutat. A mikroszómális oxigenációs enzimrendszer működéséhez NADPH-t és O2-t igényel. Így
nem meglepő, hogy fokozott aktivitás (pl. betegség esetén gyógyszerszedése következtében) esetén megnő a
máj NADPH, O2 igénye is.
A szervezetünkben található endogén és a környezetünkből felvett xenogén anyagok oxigenációját végző
citokróm P450 enzimcsaládnak jelenleg nagyjából 700 izoenzim tagját írták le. Természetesen adódik a kérdés,
hogy mi váltotta ki a citokróm P450 enzimek ilyen nagyfokú differenciálódását, hiszen a szervezetünkbe jutó
sokféle toxikus anyag jelentős hányada, a vegyipar 19. századi fejlődésével jelent meg.
6.3. ábra - A fázis I. reakciók 90%-át kitevő oxigenáció folyamata.
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
74 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A differenciálódás alapja minden bizonnyal a növényvilág. A növényi táplálékkal számos, nem hasznosítható,
vegyület is a szervezetünkbe jut, amelyeket ki kell üríteni és ki kellett üríteni már több száz, ezer évvel ezelőtt
is. Ezen vegyületek növények által történt szintézisének és az állatok ezen vegyület lebontására kifejlesztett
képességének hátterében feltehetően a növények és az állatok között fennálló versengés lehet. A vegyületeket
tehát felfoghatjuk, mint a növények védekezését az őket pusztító állatokkal szemben. A citokróm P450 enzimek
pedig megvédenek minket ezekkel a növényi „mérgekkel” szemben. Az alábbi táblázat néhány gyakrabban
fogyasztott növényt és az általuk termelt, citokróm P450 enzimek által lebontott vegyületeket tartalmazza.
Növények Vegyületek
Fokhagyma, zeller, kelbimbó indol-3-karbinol, diallil-szulfid
káposzta, répa, petrezselyem psoralen
A változó környezeti feltételekhez alkalmazkodva, az igényeknek megfelelő mértékű a citokróm P450 enzimek
kifejeződése. Amennyiben nagyobb mennyiségű endogén, vagy xenogén szubsztrát kerül a szervezetünkbe a
citokróm P450 enzimek szintje megnő, indukálódik (Indukálódás: a fehérjeszintézis fokozása valamilyen
behatásra) a megfelelő enzim. A különböző növények (vegyületek) különböző citokróm P450 enzimek
szintézisét fokozzák.
Az alábbi táblázatban felsoroltunk néhány citokróm P450 családot és legfontosabb induktoraikat.
CYP1 benzpirén, teofillin, dioxinszármazékok
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
75 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
CYP2 szteroid gyógyszerek, paracetamol, etanol, aceton
CYP3 több antibiotikum, fogamzásgátló
CYP4 klofibrát (hiperlipidémiás gyógyszer)
Az indukció mértéke akár több 100-szoros is lehet a citokróm P450 enzimek esetében.
Konjugációs 2. fázis
A 2. konjugációs fázis során célunk az első fázis során előkészített molekula vízoldhatóvá tétele. Ennek elérése
érdekében az első fázis során kialakított funkciós csoport(ok)ra különböző vegyületeket, konjugációs faktorokat
kapcsolunk. Ilyen konjugációs kofaktorok: a glukuronsav, metil-, acetil-, szulfát csoportok, a glutation, az
aminosavak. A konjugációs reakciók közül kiemelkedik a glukuronsavval történő konjugálás, a glukuronidáció,
amely a konjugációs reakciók mintegy 80%-át teszi ki. Ezen kívül gyakran előfordul még a szulfatálás, illetve a
glutationnal történő konjugálás.
Az alábbi táblázatban összefoglaltuk a három leggyakoribb konjugációs folyamot katalizáló enzimeket.
Folyamat Enzimek
Glukuronidáció UDP-glukuronoziltranszferázok
Szulfatálás szulfotranszferázok
Konjugáció glutationnal glutationil-S-transzferáz
A konjugációs reakciók viszonylag aspecifikus folyamatok egyazon vegyület ugyanazon csoportja akár többféle
anyaggal is konjugálódhat. Erre jó példa az Aspirin hatóanyagának vázát adó szalicilsav, amely karboxil
csoportja egyaránt konjugálódhat glukuronsavval és glicinnel.
A glukuronidációt végző UDP-glukuronoziltranszferázok (UDPGT) a citokróm P450 enzimekhez hasonlóan
indukálhatóak, igaz jóval kisebb mértékben. További rokon vonás, hogy ez is egy izoenzim család, amelyek az
endoplazmás retikulum membránjához kötöttek. A reakció kofaktora, a glukuronsav glukózból képződik, így a
konjugáció egy molekula glukóz veszteséget jelent a máj számára.
Transzport 3. fázis:
A második konjugációs fázis során konjugálódott molekulák a 3. fázis transzportereinek ligandjaivá váltak.
Ezen transzporterek egy jelentős része ATP-kötő, úgy nevezett ABC transzporter (ATP Binding Casette).
Különösen jól ismertek a multidrog rezisztencia transzporterek (MDR, MRP). Ezen transzporterek a májsejtek
epekanalikulus és laterális plazmamembránjában találhatóak.
Bár a citokróm P450 és az UDPGT enzimek indukciójáról szóltunk már, röviden meg kell emlékeznünk a
koordinált enzimindukcióról. Ez azt jelenti, hogy nemcsak a már említett enzimek, hanem a kofaktorellátásért
és más kapcsolódó folyamatokért felelős enzimek is a méregtelenítő enzimekkel együtt indukálódnak. Ilyen
folyamatok és enzimek például a 1. NADPH ellátás és az érte felelős glükóz-6-P dehidrogenáz, 2. a glukuronsav
ellátás, 3. a citokróm P450 enzimek prosztetikus csoportjának a hem szintéziséért felelős enzimek.
6.3. Bilirubin lebontás, a bilirubin enterohepatikus körforgása
A máj biotranszformációs funkcióját, a funkció sérülését, annak következményeit és laboratóriumi
diagnosztikáját kiváló módon lehet bemutatni a bilirubin lebontása révén. A bilirubin a hem bomlásterméke.
Kövessük hát nyomon a hem lebontásának folyamatát. Ha a vér kilép az érpályából, megszűnik az
oxigenizációja a hemoglobin, dezoxi hemoglobinná alakul, ezt könnyen nyomon tudjuk követni színének
változása révén, amíg az oxi hemoglobin élénkpiros színű, addig a dezoxi forma kék. Ez a jelenség és a további
történések is könnyen megfigyelhetők a mindennapok során is, egy tompa sérülés közvetlen következményeként
a zúzódás helye, ahová a vér kiáramlott először megkékül (a dezoxi hemoglobin színét mutatja), majd a folt egy
idő elteltével megzöldül, később sárgás színű lesz. A háttérben a hemből történő biliverdin (zöld), majd bilirubin
(sárga) képződése áll. A hem gyűrű felnyitásáért a hemoxigenáz felelős (6.4. ábra), a gyűrű felnyitásával a hem
vasatomja is felszabadul a keletkező biliverdin pedig leválik a globin fehérjeláncról.
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
76 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
6.4. ábra - A hem gyűrű felnyílása
Az ily módon keletkezett biliverdin, a biliverdin reduktáz hatására bilirubinná redukálódik (6.5. ábra).
6.5. ábra - a biliverdin redukálódása bilirubinná
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
77 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A bilirubin erősen hidrofób karaktere miatt gyakorlatilag vízben nem oldódik, a vérben albuminhoz kötődve
szállítódik. Az albuminhoz kötött bilirubin (ahogy az albumin sem) nem filtrálódik a vesében, eliminációja attól
függ, hogy milyen ütemben veszi fel a máj, konjugálja és üríti ki az epével. Az albuminhoz kötött bilirubint a
hepatociták specifikus receptorokon keresztül felveszik, majd itt egyből egy fehérjéhez kapcsolódik
megakadályozván véráramba történő visszajutását. A hepatocitában UDPGT enzimek segítségével bilirubin
molekulánként 2 molekula UDP-glukuronsav kapcsolódik (6.6. ábra).
6.6. ábra - A bilirubin UDP-glukuronsavas konjugálása
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
78 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A konjugáció révén vízoldhatóvá tett bilirubin-diglukuronid az epével a bélcsatornába jut. Az epeutak
elzáródása esetén a már vízoldható bilirubin diglukuronid a vérkeringésbe kerül, vízoldható molekula lévén
filtrálódik és a vizeletbe kerül ahogy azt már a vizeletvizsgálat fejezetben leírtuk. A vizeletben található
bilirubin tehát minden esetben konjugált bilirubin. A bélbe jutott bilirubin egy részét a bélbaktériumok
dekonjugálják, másik részét pedig a vízoldható urobilinogénné alakítják. Az urobilinogén egy része felszívódik
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
79 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a bélből és a portális keringésbe kerül, a máj nem veszi fel az urobilinogén teljes mennyiségét és egy csekély
része a szisztémás keringésbe kerülve a vesén keresztül filtrálódik. Normális esetben, ahogy azt már a
vizeletvizsgálatok esetén megjegyeztük a vizelet minimális mennyiségű urobilinogént tartalmaz. A bélben
maradó urobilinogén egy része szterkobilinogéné, majd ezek oxidációs termékeivé urobilinné és szterkobilinné
alakul. A széklet színét elsősorban a barna szterkobilin adja. Epeút elzáródás esetén éppen ezért nemcsak a
konjugált bilirubin szint nő meg a szérumban és jelenik meg a vizeletben, hanem a vizelet urobilinogén
negatívvá válik, valamint a hiányzó bél urobilinogén miatt a székletből eltűnik a szterkobilin és abnormálisan
világos színű lesz.
Hozzávetőlegesen 300 mg bilirubin képződik naponta. Ahogy említettük a máj meglehetősen nagy tartalék
kapacitással bír, így akár ezen érték tízszeresét is képes konjugálni, kiválasztani. Éppen ezért a plazma bilirubin
koncentráció meghatározása nem tekinthető a májfunkció érzékeny tesztjének.
Az albuminhoz kötött bilirubin fény hatására mind in vivo, mind in vitro bomlik. A keletkező bomlástermékek
polárosabbak, mint a bilirubin ezért in vivo lassan képesek a vesén keresztül kiválasztódni. Ezt terápiás céllal fel
is használják a születést követően besárgult újszülöttet ezért szokták kék fénnyel megvilágítani.
6.7. ábra - A szérum bilirubin meghatározása diazotálással
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
80 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Meghatározása: Színes vegyület lévén egész érzékenyen meghatározható a beteg szemrevételezésével. Igen jól
lehet látni már az enyhe ikteruszt (sárgaságot) a beteg szemfehérjéjének (sclera) szemrevételezésével.
A bilirubin laboratóriumi meghatározása leggyakrabban fotometriásan történik, ez a bilirubin diazotálásával
keletkező színes bilirubinszármazék meghatározását jelenti (6.7. ábra). A módszer előnye a direkt fotometriás
módszerrel szemben (színes vegyület lévén, akár így is meghatározható a bilirubin), hogy a diazotálással
megszűnik a bilirubin fényérzékenysége és a diazo-bilirubin moláris abszorpciós együtthatója is jóval
magasabb.
Egy kis időt érdemes még eltölteni a plazma bilirubin meghatározásával. Ahogy azt korábban említettük
normálisan a vér bilirubin tartalmának döntő része (96-97%-a) albiminhoz kötve található. Ez a konjugálatlan
bilirubin vizes közegben csak igen lassan diazotálódik, az így végbemenő lassú reakcióval mérhető az úgy
nevezett „direkt” bilirubin. Gyakran ezt a kifejezést szokták (még szakmai körökben is) egyszerűen a konjugált
bilirubin szinonimájaként alkalmazni. Normális körülmények között annyira alacsony a konjugált bilirubin
vérszintje, annak magas clearance értéke miatt, hogy nem is éri el a kimutatási határt. Ebben az esetben mérhető
3-5 μM-nyi direkt bilirubin a vizes közegben gyéren, de reagáló konjugálatlan bilirubinból származik, tehát
ekkor a két fogalom nem fed át, nem igazán helyes szinonimaként történő használatuk. Ha azonban emelkedik a
vér konjugált bilirubin tartalma az alacsony tubuláris maximum miatt megnő a vér konjugált bilirubin tartalma,
tehát ekkor a vér direkt bilirubin tartalma már jól korrelál a konjugált bilirubin szinttel. A direkt bilirubin
meghatározásának tehát csak a teljes bilirubin meghatározás mellett van diagnosztikai értéke.
Technikailag a két különböző típusú bilirubin meghatározása abban különbözik, hogy a direkt bilirubin
meghatározás során nem, az indirekt bilirubin meghatározás során pedig egy gyorsító adalékot alkalmaznak,
amely a nem vízoldható bilirubint a fe-hérjék kicsapása nélkül oldatba viszi és ily módon már a konjugált
bilirubinnal azonos sebességgel reagálhat a diazotáló reagenssel. Erre a célra három különböző reagens,
módszer is született: 1. a klasszikus Jendrassik-Gróf eljárás gyorsító vegyülete az enyhén savas koffein oldat, 2.
DMSO (dimetil-szulfoxiddal) történő gyorsítás. Ez automaták esetében inkább ajánlott. 3. savas közegben
detergens jelenlétében végzett bilirubin meghatározás.
6.4. Máj funkciózavar és hiperbilirubinémiák
Bár még a máj számos biokémiai funkciójának ismertetésével adósak vagyunk, most mégis rátérünk a
patológiás elváltozások és azok laboratóriumi diagnosztizálási lehetőségeinek ismertetésére. Tesszük ezt azért,
mert számos esetben a bilirubin lebontás ad az elváltozások meghatározására lehetőséget. A fejezet elején
szeretnénk leszögezni, hogy a májat érintő elváltozások nem mindig járnak együtt magas bilirubin szinttel
(hiperbilirubinémiával) és a hiperbilirubinémia hátterében sem mindig húzódik meg májbetegség.
6.4.6.4.1. Nem konjugált hiperbilirubinémia
A nem konjugált hiperbilirubinémia elnevezés találó, hiszen utal a probléma gyökerére, valamilyen oknál fogva
az albuminhoz kapcsolódott hidrofób karakterű bilirubin mennyisége felszaporodik a vérben. A (nem konjugált)
bilirubin koncentrációja ritkán haladja meg a 100 μM-os értéket. A probléma hátterében állhat a megnövekedett
hemolízis (hemolitikus anémia), amely következtében megnő a hem lebontása, így a lebontási termék bilirubin
mennyisége is. Hemolitikus anémiát okoz például a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz deficiencia, amely mintegy
400 millió embert érint a Földön. A fokozott bilirubin termelődés miatt ilyen esetekben megnő az epébe
kiválasztott konjugált bilirubin és a bélben abból képződő urobilinogén mennyisége is, melynek következménye
lesz a vizelet urobilinogén szint emelkedése. A máj ebben az esetben semmilyen funkciózavarral nem
rendelkezik, egész egyszerűen, csak a – nagy tartalék kapacitása ellenére – sem képes a nagymértékben
megnövekedett bilirubinmennyiség konjugálására, kiválasztására, ezért ez esetben a sárgaságot prehepatikus
ikterusznak nevezzük. Az elnevezés utal arra, hogy a májat megelőző okok miatt alakul ki a hiperbilirubinémia.
Nem konjugált hiperbilirubinémia alakulhat ki a konjugáló enzim defektusa miatt is. A gyerek születését
követően még alacsony a konjugáló enzimek aktivitása, majd hormonális hatásra megnő. Ez okozhatja az
újszülötteknél kialakuló sárgaságot, amihez hozzájárulhat a fokozott hemolízis. A bilirubin konjugációjában
legnagyobb jelentőséggel az UGT1A1 (UDP-Glukuronozil-Transzferáz1A1) rendelkezik. Ennek kismértékű
örökletes (autoszomális recesszív) expressziós zavara áll a jóindulatú Gilbert kór hátterében, amelyben a
bilirubin vér szintje nem emelkedik 60 μM fölé. Előfordulása meglehetősen gyakori a teljes populáció mintegy
5-6%-a érintett. Ettől jóval súlyosabb a helyzet a szintén örökletes Crigler-Najjar szindrómában. A
szindrómának két eltérő klinikai formája ismeretes:
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
81 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
I. bilirubin 340 μM felett: azonnali májtranszplantáció szükséges a születést követően
II. bilirubin 60-340 μM kezelhető UGT induktorokkal: pl. fenobarbitállal.
A szállításért felelős albumin 300 μM körüli bilirubin koncentrációnál telítődik, a hidrofób bilirubin molekula
átjut a vér-agy gáton a glia, illetve agysejtek károsodását okozza, kialakul a kernikterusz.
Természetesen ezeken az örökletes májenzim defektusokon kívül más, szerzett májbetegség következtében is
kieshet a máj konjugáló funkciója, ami szintén a bilirubin felszaporodásához vezethet, mivel ez esetben a máj
defektusa okozza a sárgaságot hepatikus ikteruszról beszélünk. A szerzett májbetegségekről egy kicsit később
fogunk értekezni.
6.4.6.4.2. Konjugált hiperbilirubinémia
Konjugált hiperbilirubinémia, akkor alakul ki, ha az elfolyás gátlása, akadályoztatása révén a hepatocitákból,
vagy az epeutakból a véráramba kerül a konjugált bilirubin. A konjugált bilirubin vízoldékony lévén,
kiválasztódik a vizeletbe sötét narancs, barna színűre festve azt. Egyúttal az elfolyás akadályoztatása miatt a
bilirubin enterohepatikus körforgása megszakad, nem jut el a bélbe, ennek eredményeként a széklet
abnormálisan világos színű lesz. Amennyiben az epeutak elzáródása okozza a magas bilirubin szinttel együtt
járó sárgaságot poszthepatikus ikteruszról beszélünk. Konjugált hiperbilirubinémiát okoz az MRP2
transzportfehérje hiánya, amely így transzport harmadik fázis betegségnek tekinthető. A Dubin-Johnson
szindróma néven ismert autoszomális recesszív módon öröklődő betegségben az exréciós zavar
pigmentlerakódást, májmegnagyobbodást (hepatomegáliát) okoz.
6.5. A máj megbetegedései
A máj jól definiált módon reagál az őt ért károsodásokra. Az akut májkárosodás akár tünetmentes is lehet, de
igen gyakran jár sárgasággal. A két legfontosabb akut májbetegség az akut májgyulladás (hepatitisz) és a
kolesztázis (az epeút elzáródása). A krónikus májbetegségek leginkább a krónikus hepatitisz formájában
jelentkeznek, amelyek hosszú távon cirrózishoz és hepatocelluláris karcinomához vezetnek.
6.5.6.5.1. A károsodás mechanizmusa és mintázata
A károsodás célsejtje tulajdonképpen meghatározza a károsodás mintázatát. A májsejtek (hepatociták)
károsodása hepatocelluláris betegséghez az epesejtek károsodása kolesztázishoz vezet. Minden sejtkárosodás,
mint adaptációs, vagy gyógyulási válasz fibrózist válthat ki, a károsodás időtartamától és a genetikai faktoroktól
függően cirrózis és végül karcinóma alakulhat ki.
A sejtek elhalása apototikus és nekrotikus, vagy mindkettő lehet. A laboratóriumi tesztek segítenek
megkülönböztetni 1. a károsodás mintázatát (hepatocelluláris, vagy kolesztatikus), 2. krónikus, vagy akut
mivoltát, 3. a károsodás súlyosságát. Nagy általánosságban, a klinikai enzimológia fejezetben már részletezett
aminotranszferáz (ASAT, ALAT) és az alkalikus foszfatáz aktivitások révén eldönthető, hogy a károsodás
hepatocelluláris, vagy az epeutakat érinti-e. A plazma albuminszintje alapján eldönthető, hogy krónikus, vagy
akut problémával állunk szemben, a súlyosság foka pedig alvadási paraméterek és faktorszintek (elsősorban V-
ös faktor) alapján megítélhető.
6.5.6.5.2. Vírusos májgyulladások
Öt különböző vírust azonosítottak (Hepatitisz A, B, C, D, E, G), amelyek elsődleges célpontja a máj. Ezeken
kívül számos más vírus fertőzheti meg a májat egy generális több szervet érintő fertőzés keretében, ilyen például
a citomegalovírus (CMV), Epstein-Barr vírus (EBV) és a herpes szimplex vírus (HSV). A hepatitisz vírusokkal
részletesebben az egészségügyi mikrobiológia foglalkozik, de röviden a legfontosabb, leggyakrabban előforduló
Hepatitisz A, B, C vírusokról ejtünk néhány szót.
Hepatitisz A vírus (HAV): Észak-Amerikában és Európában az akut hepatitisz leggyakoribb kiváltó oka.
Terjedése feko-orális úton történik legtöbbször szennyezett ivóvízzel, illetve élelmiszerrel. Nem válik
krónikussá, felnőttek esetében sárgaság kísérheti, a gyerekek igen gyakran tünetmentesek, illetve hasmenéses
betegség formájában zajlik le. Incidenciája az egyre terjedő vakcináció miatt csökkenő tendenciát mutat.
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
82 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Diagnosztikája: A HAV ellenes totál antitestek a fertőzést, vagy vakcinációt követően jelennek meg és a
keringésben maradnak egész életünk során, de a vakcinációt követően legalább 20 évig. Az IgM anti-HAV igen
gyorsan megjelenik a fertőzést követően és 3-6 hónapig detektálhatóak.
Hepatitisz B vírus (HBV): A krónikus virális májinfekciók közül ez a leggyakoribb. A föld lakosságából
hozzávetőlegesen 350 millió ember krónikusan HBV-vel fertőzött és mintegy harmada van kitéve a fertőzésnek.
A HBV testnedvekkel terjed, leggyakrabban parenterálisan és szexuális úton. Vakcinációja mind aktív, mind
passzív immunizációval történhet.
Diagnosztikája: A vírus által termelt HBsAg használatos a vírus laboratóriumi kimutatására. Mind a krónikus,
mind az akut fertőzésben jelen van. Antitestek közül a hepatitisz B magi antigént (anti-HBc), mutatjuk ki a
leggyakrabban. Két vizsgálati mód terjedt el: a totál anti HBc és az IgM. A totál antitest vizsgálat mind az IgM,
mind az IgG antitesteket méri és a kitettséget követően az egész élet során pozitív. Az IgM az akut fertőzést
követően 3-6 hónapig pozitív. A Hepatitisz B felületi antigénje elleni antitest (anti-HBs) az immunitásra utal és
azokban fordul elő, akik hepatitisz B elleni vakcinációban részesültek, a fertőzést követően e mellé mindig
társul az anti-HBc is.
A HBeAg és az anti-HBe a krónikus HBV fertőzés kimutatására szolgál. A HBeAg a replikálódó vírus
partikulákkal együtt termelődik, de nem része magának a vírus partikulának. Így, mint marker szerepel, jelzi,
hogy replikálódó stádiumba került a vírus és meg kell kezdeni az anti-virális kezelést.
Ahogy a molekuláris biológiai módszereket taglaló fejezetben már említettük a vírus DNS direkt kimutatása is
lehetséges. Klinikailag jelentős virémiának minősül a 100 000 kópia/ml feletti érték.
Hepatitisz C vírus (HCV): A föld lakosságából hozzávetőlegesen 170 millió ember fertőzött HCV-vel. A
fertőzés többnyire vérrel terjed. A legfontosabb rizikófaktorok az I.V. adagolt drog és a vérvizsgálat előtti
(1990-t megelőző) transzfúzió. Sajnos meglehetősen mutagén, 6 különböző fő genotípus és számos alvariánsa
ismeretes. Jelenleg nem rendelkezünk védőoltással ellene. Visszaszoruló incidenciájának hátterében a véradók
tesztelése, illetve a biztonságosabb injekciós gyakorlat áll.
Diagnosztikája: A legfontosabb diagnosztikai teszt az anti-HCV antitest kimutatására irányul. A 2. generációs
tesztek 12 héttel, a harmadik generációs tesztek 9 héttel a vírussal történő találkozást követően lesznek
pozitívak. Az aktív fertőzés kimutatása a HCV RNS detektálásán alapul.
6.5.6.5.3. Akut hepatitisz
Az akut hepatitisz a májsejtek (hepatociták) ellen irányuló direkt, vagy indirekt akut ká-rosodás. Direkt
májsejtkárosodást okoz néhány gyógyszer, mint például az acetaminofen és az isémia. Az indirekt károsodást az
immunrendszerünk mediálja és hepatitisz vírusok, a gyógyszerek jelentős része és az alkohol váltja ki. Direkt
károsodás következtében gyakorlatilag azonnal megemelkedik számos citoszólikus enzim plazmában mérhető
aktivitása. A legfontosabb ilyen enzimek az ASAT, ALAT és az LDH (referencia tartomány érték felső
értékének legalább 5-6-szorosa). Az emelkedést követően hasonlóan gyorsan lecsökken az aktivitásuk (fél-
életidejükhöz közelítő gyorsasággal). Habár a sárgaság a legszembeötlőbb akut hepatitisz tünet, mégis sokszor
hiányzik. Az alkalikus-foszfatáz szint emelkedése általában igen mérsékelt legfeljebb a referencia tartomány
felső értékének háromszorosa szokott lenni. A bilirubin szint emelkedése, amennyiben jelen van hasonló
mintázatú, mint az epeút elzáródás esetében. A máj szintetikus funkciói általában megtartottak akut hepatitisz
esetén. A prognózis általában kedvező, a felépülés megtörténik, a máj regenerálódása pedig normális szerkezetű
és funkciójú szervhez vezet. Néhány virális infekció esetén azonban a hepatitisz krónikussá válik. Az akut
esetek kisebb hányadában, a súlyos májkárosodás pedig akut (fulmináns) májelégtelenséghez vezet, amely
mortalitása igen magas (hacsak nem történik meg a máj transzplantációja).
A virális hepatitiszek akut fázisa hasonló lefolyást mutat: A transzaminázok jelentős mértékben, a referencia
tartomány felső értékének 8-50-szeresére emelkednek. Az ALAT általában magasabb kisebb clearance értéke
miatt. Az enzim értékek tetőzése megelőzi a bilirubin szint tetőzését és 4-5 hétig a plató értéken maradnak. Az
egyes vírusok közötti differenciálás a vírus antigének, ezekre termelődő antitestek (esetleg nukleinsavak)
specifikus meghatározásán alapul. Az antigének szintje néhány héttel (4-8 hét), az antitestek szintje néhány
hónappal (3-6 hónap) a fertőzést követően emelkedik meg.
6.5.6.5.4. Toxikus hepatitisz
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
83 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A toxikus hepatitisz során valamilyen toxin, vagy toxikus metabolit direkt módon káro-sítja a hepatocitákat. A
toxikus hepatitiszek döntő részében az acetaminofen főszerepet játszik. Az Egyesült Államokban és Európában
az akut májkárosodások feléért-harmadáért az acetaminofen túladagolás felelős. Az acetaminofen mérgezés
kezdeti, nem specifikus tünetei a hastáji fájdalom, gyengeség, étvágytalanság. Valamivel később lesznek
kimutathatók az emelkedett szérum enzimszintek, a megnövekedett protrombinidő, valamint az artériás pH
csökkenése. Súlyos acetaminofen túladagolás vagy későn elkezdett, esetleg elmulasztott kezelés esetén
fulmináns májelégtelenség, hepatikus kóma is kialakulhat, szükségessé válhat a májátültetés.
6.5.6.5.5. Isémiás hepatitisz (Májsokk)
A hospitalizált betegek esetében mérhető emelkedett szérum enzimszintek hátterében leggyakrabban a máj
hipoperfúziója áll. Legtöbbször minimális bilirubin szintemelkedéssel jár együtt, amely tetőzése néhány nappal
a szérum enzim szintek tetőzését követi. Igen gyakran akut veseelégtelenség súlyosbítja a helyzetet. A
laboratóriumi paraméterek megváltozása egyébiránt a toxikus hepatitiszhez hasonló.
6.5.6.5.6. Reye szindróma
Aszpirin adagolását követő akut hepatitisz. Akut májmegnagyobbodással, az ammónia vérbeli
felszaporodásával, az aminotranszferázok szintemelkedésével, illetve a protrombin idő megnyúlásával jár.
6.5.6.5.7. Krónikus hepatitisz
A krónikus hepatitisz a hepatociták 6 hónapnál hosszabb ideig tartó folyamatos gyulladásos károsodásával
jellemezhető, amely gyakran jár együtt hepatocita regenerációval és hegesedéssel. A krónikus hepatitisz
hátterében állhat hepatitisz B és C fertőzés, auto-immun hepatitisz, Wilson-kór, különböző gyógyszerek (ide
értendő az alkohol is),α1-antitripszin hiány.
A legtöbb beteg tünetmentes, de számos nem specifikus velejárója lehet, mint a gyengeség, koncentrálóképesség
leromlása, hiánya és a kimerültség. Mindezen enyhe klinikai tünetek ellenére a háttérben folyamatosan zajlik a
májsejtek pusztulása, hegesedése, amelyek szép lassan a funkcionáló májsejtek számának drasztikus
lecsökkenéséhez, cirrózishoz vezetnek. A krónikus hepatitisz kis mértékben megemelkedett aminotranszferáz
aktivitásokkal (1-5-szörös referencia felsőhatár érték) jár együtt. Azonban az aminotranszferáz aktivitások,
különösen HCV fertőzésben és nem alkoholos zsírmáj esetében (NASH: non-alcoholic steatohepatitis),
hosszabb időn keresztül is a referenciatartományon belül maradhatnak. A többi laboratóriumi teszt általában
normális értéket mutat.
A krónikus hepatitisz két legfontosabb komponense a fibrózis és a nekroinflamatorikus aktivitás. A fibrózis
kiterjedtsége szorosan korrelál a cirrózis kialakulásának rizikójával. Az ALAT aktivitás a nekroinflammatorikus
folyamatok jó indikátora.
6.5.6.5.8. Cirrózis
A cirrózis anatómiai definíciója szerint diffúz módon előforduló kötőszövetesedés, csomópontokban előforduló
regenerációval. Ez az állapot jelenti krónikus májkárosodásokban a hegesedés és regeneráció végstádiumát.
Gyakorlatilag minden krónikus májbetegség cirrózishoz vezet.
A krónikus hepatitisz cirrózis átmenet korai szakaszában, amelyet sokszor kompen-zált cirrózisnak is neveznek,
sok esetben semmilyen tünet, vagy jel sem utal a májbetegségre. Laboratóriumi abnormalitások azonban
gyakran megjelennek a klinikai tünetek jelentkezését megelőzően. Később a csökkent albuminszintézis miatt
lecsökken a keringésben az albumin mennyisége, amely maga után vonja az ozmotikus egyensúly felbomlását,
folyadék lép ki az érpályáról és kialakul az ascites. A férfiakban a biotranszformációs funkció romlása
következtében felszaporodnak a női nemi hormonok, ami impotenciával és ginekomasztiával
(mellmegnagyobbodás) jár együtt, nőies küllemet adva a betegnek. A máj véralvadási faktorokat szintetizáló
funkciójának következményeként alvadási problémák lépnek fel, bevérzések keletkeznek. Mindezen tünetekkel
együtt jelentős mértékben megnő a portális vérnyomás.
A máj transzaminázok szintjéről nagyon nehéz általános megállapítást tenni. A kis mennyiségű még funkcionáló
májsejtek szétesése már nem szokta jelentős mértékben megemelni a plazma transzamináz aktivitását.
Májfunkciók laboratóriumi
vizsgálata
84 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Ahogy a cirrózis előrehalad, bekövetkezik a beteg dekompenzációja a portális hipertenzió fokozódik, majd
végül bekövetkezik a halál.
85 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
7. fejezet - A diabetes mellitus laboratóriumi vizsgálata
A cukorbetegséget (diabetes mellitus) szokás a modern kor egyik népbetegségének titulálni. A betegség
korántsem új keletű, első említésének sokak véleménye szerint a Théba környéki ásatásokon előkerült i.e. 1550-
re datált, a kutatásokat vezető régészről Ebers-papirusznak nevezett tekercset tartják. Annyi bizonyos, hogy
ebben említés történik egy poliuriás betegségről. A kórkép tényleges leírása és a „diabetes” szó használata
sokkal régebbi keletű. Az elnevezést első alkalommal, i.e. 230-ban, Memfiszi Apolloniusz használta, jelentése
túláradás, amely a betegségben jelentős mértékben megnövekedett vizelet mennyiségére utal. A ma típusosnak
tekintett tünetek összefoglalása az i.sz. I. században élt Kappadóciai Aretaeus nevéhez fűződik. A betegségre
oly jellemző édes vizelet ürítését az angol Thomas Willis írta le a XVII. században. Az édes íznek cukorral való
azonosítása (1776) egy honfitársa Matthew Dobson érdeme. Ő észlelte, hogy a betegek plazmája édes és
gyakran tejszerű. Ez tekinthető a diabeteses hiperglikémia és hiperlipidémia első leírásának. Az édes ízre,
cukorra utaló „mellitus” jelző William Cullentől (1710-1790) származik. Így a betegséget megkülönböztették a
szintén poliuriával járó diabetes insipidustól (lásd vesefunkciók vizsgálata). A XIX. századtól kezdve mind
gyakrabban végezték a vizelet cukortartalmának meghatározását. A vér cukortartalmának meghatározását
lehetővé tevő eljárások a XX. század első évtizedeiben váltak általánosan hozzáférhetővé. A diabétesz növekvő
gyakoriságának, a minél korábbi diagnózis szükségességének felismerése, a veszélyeztettek felkeresése iránti
igény a szűrővizsgálatok elterjedéséhez vezetett.
A betegségre helyezett fokozott figyelmet indokolja, hogy az utóbbi pár évtizedben a cukorbetegek száma
világszerte jelentősen emelkedik. A betegség előfordulását a teljes földi populációban 2000-ben 2.8%-ra, míg
2030-ra 4.4%-ra jósolják. Ez konkrét számadatokban 171 millió főről (2000) 366 millió főre (2030) történő
emelkedést jelent.
7.1. A diabetes mellitus klasszifikációja
A cukorbetegséget sokáig egységes megbetegedésnek tartották, noha számos klinikai megfigyelés egyértelmű
különbséget tett a – rendszerint – sovány testalkatú gyerekekben, fiatal felnőttekben, viharos tünetekkel kezdődő
kórforma és az inkább idősebb korban, gyakran tünetszegényen induló diabetes mellitus között. Az egységes
elméletet az endogén inzulin meghatározás kifejlesztése döntötte végleg meg. Kiderült, hogy a zömmel gyerek-,
illetve fiatal felnőttkorban kezdődő cukorbetegségre a diagnózis után gyorsan tapasztalható endogén
inzulinhiány, az idősebb korban kialakuló diabéteszre pedig a kórisme után még hosszú ideig kimutatható,
gyakran a normális értéket meghaladó, endogén inzulinszint jellemző.
Endokrin Pankreász
A hasnyálmirigy endokrin funkcióiért felelős szigetsejtekről első ízben Paul Langerhans német orvos számolt be
1869-ben diplomamunkájában. Az exokrin állománytól elkülönülő szigetsejtek a pankreasz tömegének csupán
1-2%-át teszik ki. Az endokrin állomány legalább 5 különböző hormon elválasztásáért felelős:
1. Inzulin: β-sejtek termelik
2. Glukagon: α- sejtek termelik
3. Szomatosztatin: δ-sejtek termelik, gátolja az inzulin és a glukagon szekrécióját
4. Pankreász polipeptid: a PP-sejtek termelik elválasztásának fő stimulusa a táplálékbevitel, részt vesz az étvágy
és a táplálékbevitel csökkentésében
5. Islet Amiloid PoliPeptid (IAPP): 37 aminosav hosszú polipeptid, a β-sejtek az inzulinnal együtt szekretálják
(100:1 arányban), gátolja az inzulin szekréciót, lassítja a bélürülést, gátolja a posztprandiális (étkezést
követő) glukagon szekréciót
A vércukorszint szabályozásában a fő szerepet az inzulin és a glukagon kapja. Az inzulin képződése két
prekurzoron keresztül történik. Első körben a 11500 Da molekulatömegű preproinzulin keletkezik, amelyről in
situ lehasításra kerül a szignál szekvencia, így alakul ki a 9000 Da-os proinzulin. A proinzulinban az inzulin A-
(21 aminosav) és B láncát (30 aminosav) egy összekötő, vagy C (connectiv) peptid (31 aminosav) köti össze. Az
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
86 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A- és B- láncok között kialakul 2 intermolekuláris és az A-láncon belül egy intramolekuláris diszulfid híd. Ezt
követően a proinzulin a β-sejteken belül a Golgi apparátusba kerül, ahol megindul a C-peptid polipeptid láncból
történő kihasítása, amely a szekréciós granulumokban folytatódik, fejeződik be. A proteolítikus folyamat végén
a C peptid és az inzulinláncok csatlakozásánál 2-2 bázikus dipeptid kihasad és így a C peptid kiválik az inzulin
molekulából, de továbbra is együtt tárolódnak a szekréciós granulumokban. Itt az inzulin cink ionokkal hexamer
kristályokat alkot, amely megakadályozza a további proteolízist. Stimulus hatására a két peptid ekvimoláris
arányban jut a keringésbe. Normális körülmények között az elválasztott hormon 90-95%-a inzulin (és C-peptid)
és mindössze 5-10%-a nem konvertált proinzulin. Az erőltetett inzulin bioszintézis és kibocsátás során, amikor
nincs elegendő idő arra, hogy a proteolítikus folyamatok tökéletesen végbemenjenek, a keringésbe jutó hormon
akár 20-80%-a is proinzulin lehet.
A glukagon a Langerhans szigetek α-sejtjei által termelt 29 aminosavból álló poli-peptid. A két hormon
egymással ellentétes, az inzulin a vércukorszint csökkentésében, a glukagon pedig annak emelésében játszik
fontos szerepet.
7.1. ábra - A GLUT4 transzporterek inzulin hatásra történő plazmamembránba
helyeződése
Az inzulin legfontosabb vércukorszint csökkentő hatása abban nyilvánul meg, hogy elősegíti a sejtek glükóz
felvételét. A glükóz másodlagos aktív transzporttal kerül a bélhámsejtekbe és szintén ezzel a mechanizmussal
történik a vesetubulusokban a visszaszívódása. A többi sejtünkbe passzív transzporttal kerül be a GLUT család
közvetítésével. A család 14 tagját írták le, ezek közül ötöt karakterizáltak részletesen. GLUT 1 található a
vörösvértestben, agyban, izomban, zsírszövetben működése nem inzulinfüggő. GLUT 2 található a
májsejtekben, pancreas β-sejtekben, vesében, a vékonybél hámsejtek bazális oldalán, nagy kapacitású, kis
affinitású (magas Km és Vm érték jellemzi) transzporter. GLUT 3 található az idegsejtekben, kis kapacitású, nagy
affinitású (alacsony Km és Vm érték jellemzi). GLUT 4 található az izom, zsírszövetben, inzulindependens. Így a
vércukorszint szabályozása szempontjából ez utóbbi érdemli a legnagyobb figyelmet. Nyugalmi állapotban
(alacsony inzulinszint mellett) a GLUT 4 transzporterek csak mintegy 10%-a található a sejtek
plazmamembránjában, azonban inzulin hatására 2-3 perc alatt az intracelluláris membránvezikulák a
plazmamembránhoz vándorolnak, összeolvadnak azzal, így a GLUT 4 transzporterek a plazmamembránba
helyeződnek (7.1. ábra).
7.2. ábra - Az inzulin jelpálya. http://1.bp.blogspot.com/-
ntbIEMesVZE/ThccKz70EAI/AAAAAAAAAUU/xYiWPRC0QuM/s1600/Insulin_Rece
ptor.jpg
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
87 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A rendkívül összetett inzulin jelátviteli útvonal (7.2. ábra) csak egyik eleme a GLUT 4 transzporterek
plazmamembránba helyeződése, az inzulin csökkenti a sejtben a cAMP szintet, aktiválja a glikogén-szintáz
foszfatázt, ezáltal előtérbe kerül a glikogén felépítés folyamata. A glukokináz, a foszfofruktokináz I és a piruvát
kináz aktiválása révén fokozza a glukóz glikolízis során történő lebontását. Ezen kívül fokozza a glikolízis
végtermék piruvát Ac-KoA-vá történő átalakítását a piruvát-dehidrogenáz defoszforilációja révén. A
glukagonnak, ezzel szemben pont ellentétes a hatása, növeli a celluláris cAMP szintet, aktiválja a glikogén
glükózzá történő lebontását, illetve a glükóz glukoneogenezis során történő felépítését.
Az inzulin szénhidrát anyagcserére kifejtett hatásán kívül a zsír és fehérje anyagcserére is jelentős hatást
gyakorol. Fokozza a zsírsav, a triglicerid és a koleszterin szintézisét, illetve ugyanezen anyagok lebontását
gátolja. A zsírsavszintézis egyrészt a fokozódó Ac-KoA-karboxiláz aktivitás (malonil-KoA keletkezése),
másrészt a korábban említett piruvát-dehidrogenáz aktivitás fokozódásának következménye. A zsírsavoxidáció
gátlása főleg a mitokondriumok belső membránjában található karnitin-palmitoil-transzferáz-I aktivitás
csökkenése miatt jön létre. A triglicerid szintézis növekedése a glicerin-foszfát észteresítésének fokozása révén
alakul ki, elsősorban a zsírsejtekben. A lipolítikus enzimek foszforilációjának csökkentése révén (cAMP
dependens protein kináz aktivitásának csökkenése miatt) az inzulin gátolja a zsírbontást. A koleszterinszintézis
növekedése a HMG-KoA-reduktáz aktiválásának következtében alakul ki. Ennek révén érvényesül az inzulin
ketontest képződést csökkentő hatása is.
Az inzulin a fehérje anyagcsere esetében is egyértelműen anabolikus hatással rendelkezik.
7.1.7.1.1. I. típusú diabetes mellitus
A diabétesz ezen altípusát korábban inzulin dependens (IDDM), vagy fiatalkori (juvenilis) diabetes mellitusnak
is hívták. A diabéteszben szenvedők körülbelül 5-10%-a tartozik ebbe a csoportba. A betegek nagy többsége
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
88 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
(~75%-a) fiatalabb, mint 30 éves a betegség kialakulásakor. A betegség klasszikus tünetekkel indul, mint a 1.
poliuria (nagy mennyiségű vizelet ürítése), 2. polidipsia (szomjúság, nagy mennyiségű folyadék fogyasztása), 3.
polifágia (nagy mennyiségű táplálék fogyasztása), 4. fogyás. Gyakran előforduló tünetek még az altesti
viszketés, piogén bőrinfekciók, nőknél kezelés hatására sem múló fluor, acetonos lehelet. A tünetek
mindegyikének hátterében az inzulintermelő β-sejtek elpusztulása következtében kialakuló inzulinhiány, illetve
a következményes hiperglikémia (magas vércukorszint) áll. A következőkben röviden szeretnénk ismertetni a
pankreász endokrin funkcióit, az inzulintermelő β-sejtek pusztulásának folyamatát, illetve az inzulin
anyagcserében betöltött szerepét, amelynek kiesése a fent ismertetett tünetek kialakulásához vezet.
7.1.7.1.1.7.1.1.1. Az I-es típusú diabétesz tüneteinek háttere
Az inzulin szintézisét, szerkezetét, biokémiai funkcióját ismertető fejezet után térjünk vissza az I. típusú
diabétesz ismertetéséhez. Most már kitűnően megérthetjük miért alakulnak ki a klasszikus és gyakori tünetek: 1.
poliuria: A nagy mennyiségű vizelet ürítése az inzulin hiányában nagy mennyiségben a vérben maradó glükóz
következménye, hisz ~10mM-es vércukorkoncentráció felett elérjük a vesetubulus glükóz transzporterek
telíthetőségét. A vizeletbe nagy mennyiségű glükóz kerül, a glükóz, mint vízben kitűnően oldódó anyag (jó
ozmotikum), nagy mennyiségű vizet visz magával. 2. polidipsia (szomjúság, nagy mennyiségű folyadék
fogyasztása): A nagy mennyiségű folyadékveszteséget pótolni kell ezért lesz szomjas és fogyaszt nagy
mennyiségű folyadékot a hiperglikémiás beteg. 3. polifágia (nagy mennyiségű táplálék fogyasztása): Az a furcsa
paradox helyzet áll elő, hogy bár a vér cukorkoncentrációja igen magas, a cukor inzulin hiányában nem tud a
(zsír és izom) sejtekbe jutni, mivel az inzulindependens GLUT 4 transzporterek a sejtek belsejében maradnak. A
sejtek tehát a magas vércukorszint ellenére éheznek és éhezési programot indítanak el, aminek fokozott
zsírsavlebontás és ketontest termelés lesz a következménye (7.3. ábra, 7.4. ábra).
7.3. ábra -
A betegek így nagyon lefogynak. A rendkívül nagy mennyiségben keletkezett vízoldható ketontestek (vérszint:
5-20 mM) pedig filtrálódásuk során még több vizet visznek magukkal, tovább fokozva a szervezet
kiszáradásának veszélyét.
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
89 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A betegek súlyos esetben kómába eshetnek lévén az agy igen érzékeny az ozmotikus egyensúly felborulására. A
savas pH értékű ketontestek ketoacidózis kialakulásához vezetnek. A gyakran előforduló altesti viszketés,
piogén bőrinfekciók, nőknél kezelés hatására sem múló fluor a bőr és a nyálkahártya felszínén megjelenő nagy
mennyiségű cukor hatására kialakuló bakteriális és gombás fertőzések következménye.
7.1.7.1.1.7.1.1.2. Az I-es típusú diabétesz patogenezise
A legtöbb esetben egy T sejt közvetítette autoimmun β-sejt károsodás áll az I-es típusú diabétesz hátterében. Az
α, δ és más szigetsejtek megtartottak, nem érintettek. A szigetsejtek mononukleáris sejtekkel infiltráltak. Az
autoimmun folyamat hónapokkal, évekkel a klinkai kórkép megjelenése előtt elkezdődik, azonban, amíg a β-
sejtek 80-90%-a el nem pusztul, addig a tipikus tünetek nem fejlődnek ki. A keringésben jelenlévő
autoantitestek jó markerei a β-sejtes autoimmunitásnak. A vérben a következő antitestek szoktak hónapokkal,
évekkel a betegség manifesztálódása előtt, az autoimmun folyamat elindulásakor megjelenni: 1. szigetsejt
ellenes antitestek (ICA: islet cell cytoplasmic antibodies), 2. inzulin autoantitestek, 3. glutamát dekarboxiláz
antitestek (GAD), 4. két inzulinoma-asszociált antigén (IA-2A és IA-2β), ezek két tirozin-foszfatáz ellen
termelődött antitestek.
7.4. ábra -
A betegségre való hajlam valamilyen mértékben örökölhető, azonban az öröklődés módja rendkívül összetett és
mind a mai napig nem teljesen felderített. A HLA rendszer bizonyos génjei szerepelnek a diabéteszre
hajlamosító gének között, azonban ezen gén konstellációk igen sok nem diabéteszes egyénben is előfordulnak.
Az örökletes komponens „erősségére” jellemző, hogy az I-es típusú diabéteszes emberek mindössze 10%-ának
van diabétesszel érintett első fokú rokona.
A betegség kiváltásában szerepet játszó környezeti faktorok közül említést érdemel az anyatejes táplálás
időtartama (minél hosszabb, annál kisebb az esélye), a nitrozamin tartalmú táplálékok fogyasztása, számos
vírusinfekció (pl.: rubeola, mumpsz, coxsackie B), tehéntej fogyasztása (csecsemőkorban).
A késői expozíciós tényezők közül említést érdemel a pubertás korban felgyorsult növekedés következtében
megnövekedő perifériális inzulinigény.
7.1.7.1.2. II-es típusú diabétesz
A korábban nem inzulindependens diabetes mellitus (NIDDM) néven ismert kórforma teszi ki a diabéteszes
megbetegedések döntő részét, mintegy 90%-át. A betegek tünetszegények, gyakran tünetmentesek, nem
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
90 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
érzékenyek ketózisra és inzulin megvonásra ketoacidózis nem fejlődik ki náluk. Ahogy korábban megjegyeztük
már a betegek inzulinszintje a referencia tartományon belül szokott lenni, amennyiben eltér attól, igen gyakran
magasabb. A betegséget nem az inzulin abszolút hiánya váltja ki, hanem a csökkent mértékű inzulinhatás. A
betegek úgy nevezett inzulinrezisztenciában, relatív inzulinhiányban szenvednek. Igen gyakran elhízottak (az
elhízás inzulinrezisztenciához vezet) és már maga a testsúlycsökkentés rendezheti a szénhidrát anyagcseréjüket,
normalizálhatja a vércukor szintjüket. Míg az I-es típusú diabétesz, az abszolút inzulinhiányból fakadóan
kizárólag külsődleges forrásból származó inzulin bejuttatásával kezelhető, addig a II-es típusú diabétesz
esetében több lehetőség is fennállhat: 1. a már említett testsúlycsökkenés normalizálhatja az inzulinrezisztenciát,
2. szükség lehet diéta bevezetésére, 3. orális antidiabetikum szedésére, 4. inzulin adagolására (az I-es típusú
diabéteszhez hasonlóan). A legtöbb beteg 40 évesnél idősebb a betegség jelentkezésekor, azonban az egyre
fiatalabb korban bekövetkező és egyre jelentősebb mértékű elhízással (és mozgásszegény életvitellel) már
megjelent a fiatalabbak, sőt a gyerekek között is.
A kifejlődő és hosszú időn keresztül fennálló inzulinrezisztencia előbb-utóbb β-sejt diszfunkcióhoz vezethet,
amikor a β-sejtek már nem képesek az inzulinrezisztencia következtében megnövekedett inzulinigénnyel lépést
tartani. Így a kezdeti relatív inzulinhiány a későbbiek során abszolút inzulinhiánnyá alakulhat át. A II-es típusú
diabétesz egy rendkívül heterogén betegség, amely semmiképpen sem vezethető vissza egyetlen kiváltó okra. A
betegség kialakulásában mind örökletes, mind környezeti faktorok szerepet játszanak.
Ahogy láttuk az inzulinrezisztencia, a keringésben jelenlevő normál mennyiségű inzulinra adott csökkent
válaszreakció a betegség központi problémája. Fontos kiemelnünk az elhízás hatását. Minden túlsúlyos ember
inzulinrezisztens! A heterogén, több komponensű háttér és a II-es típusú diabéteszre jellemző szénhidrát
anyagcserezavarhoz társult, lipid anyagcserezavar miatt újabban komplex metabolikus szindrómáról, vagy X-
szindrómáról szoktunk beszélni. A metabolikus X-szindrómában megfigyelhető 1. az inzulinrezisztencia, 2.
hiperinzulinémia, 3. elhízás, 4. diszlipidémia (magas triglicerid, alacsony HDL koleszterinszint) 5. magas
vérnyomás.
Az inzulinrezisztencia következtében megnövekedett inzulinigény hatalmas nyomást helyez a β-sejtekre, amely
előbb-utóbb progresszív β-sejt funkcióvesztéshez vezet, ez pedig éhomi hiperglikémiát von maga után. A
legfontosabb defektus a glükóz kiváltotta inzulin felszabadulás eltűnése lesz. A hiperglikémia gyakorlatilag
érzéketlenné teszi a β-sejteket a glükóz stimulusra. Az inzulinszekréció elveszti pulzáló karakterét. A hiper-
glikémia következtében kialakult állandó fokozott mértékű inzulinszekréció következtében a szekretált
prohormon, proinzulin mennyisége fog dominálni, az inzulinhoz képest.
7.1.7.1.2.7.1.2.1. A II-es típusú diabetes mellitus patogenezise
A II-es típusi diabétesz kialakulásában igen nagy hangsúlyt kap a genetikai háttér. Az egypetéjű
ikervizsgálatokban a konkordancia aránya közel 100%-os volt, míg az I-es típus esetében ez mindössze 30%
körül mozgott. Egy túlsúlyos egyénben 10-szer nagyobb a II-es típusú diabétesz kialakulásának valószínűsége,
ha volt a szülei között II-es típusú diabéteszes mint egy olyan ugyanolyan mértékben elhízott egyénben, akinek
nem volt a szülei között II-es típusú diabéteszes. A betegség poligénes, így öröklésmenete szinte
kiszámíthatatlan.
A környezeti faktorok közül ki kell emelnünk a táplálkozás és a mozgás szerepét. Egyértelmű összefüggés van
az elhízás és a II-es típusú diabetes mellitus kialakulása között. Habár azt érdemes megjegyeznünk, hogy a
diabéteszesek 60-80%-a elhízott, mégis „csak” az elhízott emberek 15%-a diabéteszes. Viszont az is tény, hogy
minden elhízott ember inzulin rezisztens és hiperinzulinémiás. Fontos megjegyezni, hogy az elhízás időtartama
és módja is fontos tényező (az alma típusú veszélyes). Ugyanakkor inverz összefüggés van a mozgás és a II-es
típusú diabétesz előfordulása között. Ennek hátterében a mozgás inzulinérzékenyítő hatása áll.
7.1.7.1.3. Gesztációs diabetes mellitus
A cukorbetegség azon típusa, amely a terhesség során kezdődik, vagy annak kapcsán fedezik fel. Oka részben a
gesztáció során egyre fokozódó kontrainzuláris hormonelválasztás következtében kialakuló inzulinrezisztencia.
Azokban a terhes nőkben, akikben az inzulintermelés nem fedezi a megnövekedett inzulinszükségletet,
szénhidrát anyagcserezavar jelenhet meg. A betegek egy része a szülést követően egészséges anyagcseréjű lesz,
a kisebb része cukorbeteg marad. A normalizálódott anyagcseréjű gesztációs diabéteszes nők között viszont
nagyobb arányban fejlődik ki a későbbiek során II-es típusú diabétesz.
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
91 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
7.2. A diabetes mellitus diagnosztikája, differenciáldiagnosztikájuk
Láttuk, hogy az egyes diabétesz típusok meglehetősen különböző patogenezissel és klinikai tünetekkel
rendelkeznek, azonban mindegyik esetben biztosan van egy közös vonás: a magas vércukorszint, a
hiperglikémia. Így a diagnosztika kapcsán elsőként a különböző vércukor meghatározási eljárásokat kell számba
vennünk.
7.2.7.2.1. Glukóz meghatározások
Az 1960-as években használt Hagedorn-Jensen és az 1970-es években alkalmazott O-toluidines eljárásnak
maximum történelmi jelentősége van, így nem is foglalkozunk velük. Az 1980-1990-es évektől kizárólag a
specifikus és érzékeny enzimes módszereket alkalmazzák a vércukorszint meghatározására.
Glukóz-oxidáz-peroxidáz (GOD-POD)
A reagensben található flavinenzim, glükóz-oxidáz glükonsavvá oxidálja a plazma glükóz tartalmát a légköri
oxigén felhasználásával. Az enzim működése során a szubsztráttal megegyező mennyiségű H2O2 képződik (7.5.
ábra). A glükóz meghatározás során, tulajdonképpen az ily módon „melléktermékként” keletkező hidrogén-
peroxid mennyiségét határozzuk meg.
7.5. ábra - A vércukorszint meghatározása glükóz-oxidáz enzimmel.
A keletkezett hidrogén-peroxidot egy másik, szintén a reagens oldatban található, enzim a peroxidáz vízre és
atomos oxigénre bontja (7.6. ábra).
7.6. ábra - A glükóz-oxidáz enzim által generált peroxidáz bontása peroxidázzal,
valamint a keletkezett nascens oxigén detektálása Trinder-reakció segítségével.
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
92 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A hidrogén-peroxid bontásakor keletkező atomos oxigén meghatározására kétféle indikátorreakció terjedt el. Az
egyik a vizzel glükóz meghatározás során már ismertetett jodid jóddá oxidálása, a másik a Trinder reakció. A
Trinder reakcióban atomos oxigén jelenlétében a fenol és 4-aminofenazon vöröses kininoimin vegyületté
egyesül (7.6. ábra). A cukorszint így egyszerű kolorimetriás módszerrel meghatározható. Jelenleg mind a
klinikai laboratóriumokban, mind a tesztcsíkokkal működő point of care készülékek a GOD-POD módszer
szerint határozzák meg a vércukorértéket.
Hexokináz
Az etalon, referenciamódszer azonban a hexokináz enzimmel történő glükóz meghatározás. A módszer lényege,
hogy első lépésben a glükózt hexokináz katalizálta folyamatban ATP felhasználásával glükóz-6-foszfáttá
alakítjuk (Ez a lépés a glikolízis első lépése.) Majd a második reakció során glükóz-6-foszfát dehidrogenáz
segítségével 6-foszfoglükono-d-laktonná oxidáljuk, miközben ekvimoláris mennyiségű NADPH képződik (a
NADP redukciójával). Mind a két lépés ekvimoláris a keletkező NADPH mennyisége (a redukció mértéke)
pedig igen pontosan nyomon követhető 340 nm-en történő fotometrálással (7.7. ábra).
7.7. ábra - Vércukor meghatározása hexokináz segítségével
Orális glukóz tolerancia teszt (OGTT)
Magas szénhidráttartalmú táplálék elfogyasztását követően a vércukorszint fiziológiásan is emelkedik, az
emelkedő vércukorszint fokozott inzulinszekréciót vált ki, ezt követően az inzulinhatásnak köszönhetően a
gyomorürüléssel párhuzamosan hozzávetőlegesen 2-3 óra elteltével a vércukorszint visszaáll az éhomi szintre. A
relatív inzulin hiány első megnyilvánulása szokott lenni, hogy ez a folyamat lelassul, csökkent szénhidrát, vagy
csökkent glükóz tolerancia (IGT: impaired glucose tolerance) alakul ki. Az orális glükóz tolerancia teszt során a
táplálkozást jól definiált körülmények között modellezzük. A szénhidrátot glükóz oldat formájában juttatjuk a
szervezetbe, így nincs szükség emésztésre. Fontos megjegyeznünk, hogy nem a már diagnosztizált, manifeszt
diabétesz kimutatására szolgál. Manifeszt diabéteszes emberen tilos az OGTT elvégzése. A vizsgálat sikere igen
erősen attól függ, hogy mennyire sikerül a vizsgálat körülményeit sztenderdizálni:
1. Nem áll fenn acidózis, ketoacidózis, lázzal járó betegség, hipokalémia, hipomagnézia, gyomor-béltraktus,
májbetegség (hasmenés, ismert felszívódási zavar, ikterusz, gyógyuló hepatitisz), menstruáció (női beteg
esetében)
2. Előkészítés: minden glükózanyagcserét befolyásoló gyógyszert el kell hagyni a kezelés előtt egy héttel:
szteroidok, három nappal: nem-szteroid gyulladás gátlók, diuretikumok.
3. Előző este már ne étkezzen, de legalább 12 órával a vizsgálat megkezdése előtt. Hívjuk fel pl. a cukros kávé,
tea és más szénhidráttartalmú ételek, italok fogyasztásának elkerülésére is a figyelmet.
A vizsgálat menete:
1. Éhgyomri vérvétel, ebből vércukor meghatározása
2. A betegnek 75 g glükózt tartalmazó oldatot adunk, amelyet egyszerre fogyaszt el (gyerekeknél 1.75 g
glükóz/ttkg).
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
93 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3. Vérvétel és vércukorszint meghatározás 120 perccel a glükóz oldat elfogyasztását követően. A beteg ez alatt
az idő alatt nem vehet magához ételt, ital (víz kivételével). Érdemes megkérni a beteget, hogy lehetőleg
maradjon nyugalomban, pl. olvasson, de semmiképpen se intézze a dolgait. Az eredmények értékelése az
ábrának megfelelően történik.
7.8. ábra - Orális glükóz tolerancia teszt lehetséges eredményei
Amennyiben 2 óra (120 perc) elteltével a vércukor értéke meghaladja a 11.1 mM-os értéket, az illetőt
cukorbetegnek tekinthetjük. Amennyiben ez az érték 7.8-11.0 mM közé esik, akkor csökkent
glükóztoleranciáról beszélhetünk (7.8. ábra).
7.2.7.2.2. Inzulinszint meghatározás
Az inzulin több szempontból úttörő molekula. Elsőként ezen polipeptid szekvenciáját határozta meg Frederick
Sanger 1953-ban (Nobel-díj 1958-ban), elsőként az inzulin térszerkezetét határozták meg (Dorothy Hodgkin,
Nobel díj 1964-ben) és elsőként ezt a hormont határozta meg Yallow és Berson kompetitív radioimmunassay
segítségével 1959-ben (Nobel díj Roslyn Yallow számára 1977-ben). Ez lehetővé tette a két fő diabétesz forma
az I-es és a II-es típus elkülönítését. Napjainkra a β-sejtek inzulintermelését a C-peptid mennyiségével
határozzuk meg, így az inzulinszint meghatározása az inzulin túltermeléses állapotok (inzulinómák)
megfigyelésére szűkült be.
7.2.7.2.3. C-peptid meghatározás
Klinikai jelentőségét az adja, hogy vérszintjének mérésével a β-sejt működés olyan állapotokban is jól
megítélhető, amikor az inzulin-assay (legtöbbször inzulinkezelés miatt) nem használható. A C-peptid
meghatározását a vérben lévő inzulin és inzulinantitestek nem zavarják. Elvégezhető akár vizeletből is (a C-
peptid kis molekula lévén szabadon filtrálódik) a 24 órás vizelettel kiválasztott C-peptid mennyisége jól korrelál
az integrált napközi szérumértékkel.
7.2.7.2.4. Glikált szérumfehérjék, hemoglobim A1c
A glikáció a cukrok és a fehérjék primer amino csoportjai között létrejövő reakció. A folyamathoz enzimre nincs
szükség, a kapcsolódás a fehérje teljes szintézisét követően, poszttranszlációsan jön létre. A glikáció minden
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
94 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
emberben (a nem cukorbetegekben is) végbemegy, hisz minden ember vére tartalmaz glükózt. A
cukorbetegekben azonban sokkal dominánsabban jelentkezik, mivel az átlagos vércukorszintjük magasabb a
normálisnál. A glikáció megfigyelhető az inzulindependens sejtekben, a sejtfelszíni fehérjestruktúrákban, a
keringő fehérjékben és a különböző szövetek szerkezeti fehérjéiben. A glikációnak két formája különíthető el,
az érintett fehérje élettartamától, metabolizmusától függően. A korai glikáció azokban a fehérjékben figyelhető
meg, amelyek életideje rövidebb, annak tartama hetekre tehető. A nem enzimes glikáció során először a glükóz
és a fehérjék szabad amino csoprotjai között az aldimin kötést tartalmazó, labilis Schiff bázis alakul ki (7.9.
ábra). Hosszabb idő (néhány hét) alatt egy lassabb izomerizáció következik be, amelynek eredményeképpen
stabil, de mégsem teljesen irreverzibilis szerkezetű vegyület, a ketoamin kötést tartalmazó, Amadori termék jön
létre (7.9. ábra).
7.9. ábra - Korai glikáció, Amadori termékek képződése
Hemoglobim A1c: A hemoglobin korai glikációs termékének, a hemoglobim A1c-nek fontos gyakorlati
jelentősége van az ábrán látható Amadori átrendeződés ütemére utal az, hogy a k2 értéke a k1 1.6%-nak felel
meg. A hetek alatt zajló folyamat végül egyensúlyi állapotba jut. Az ekkor mért glikációs termék értéke a
megelőző hetek biokémiai folyamatait összesítve tükrözi, az a magyarázata annak, hogy a hemoglobim A1c
értéke a korábbi kb 1-2 hónapos anyagcsere helyzetéről (vércukor értékéről) ad felvilágosítást. A rövidebb
féléletidejű albumin glikációs terméke a szérum fruktózamin, pontosan a rövidebb féléletidő következtében a
vércukor megelőző 1-3 heti átlagos értékéről ad információt. Ezért a Diabetes Társaság ajánlására ez utóbbit
már nem határozzák meg széles körben, azonban hemoglobinopátiák pl. thalassemia esetében viszont csak a
fruktózamin használható, mert a HbA1c fals alacsony eredményt ad. A hemoglobim A1c meghatározását az
automaták HPLC-vel, vagy affinitás kromatográfiával végzik.
7.10. ábra - Késői glikációs termékek képződése
A diabetes mellitus laboratóriumi
vizsgálata
95 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Késői glikációs végtermékek: A hosszú életidejű szerkezeti fehérjékben (pl. kollagén, krisztallin, mielin) a
glikáció eredményeként létrejött Amadori termékek további áta-lakulásokon mennek keresztül. Az igen lassan
zajló folyamatok (átrendeződés, dehidratáció, keresztkötések kialakulása) eredményeképpen egy nagyon
heterogén vegyületcsoport a késői glikációs végtermékek (advanced glycation endproducts: AGE) jönnek létre
(7.10. ábra). A poszt-Amadori folyamatok lassúak és irreverzibilisek, ennek következtében az AGE mennyisége
hosszú diabétesz tartam és magas vércukor értékek esetén felszaporodhat. Habár az AGE vegyületek csoportja
rendkívül heterogén és kémiai szerkezetük nehéz vizsgálhatóságuk miatt kevésbé ismert, az általánosan
elfogadott, hogy az AGE-k egyik hatása a fehérjék keresztkötése, amely akkor jön létre, amikor egy már glikált
fehérje reakcióba lép egy másik fehérjével. Diabéteszben, azért van nagy jelentősége, mert a késői glikáció
azokat a fehérjéket érinti, amelyeknek szerepük lehet a cukorbetegség késői szövődményeinek kialakulásában.
96 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
8. fejezet - Lipid anyagcsere, szérum lipidek laboratóriumi vizsgálata
A fejezet elején célszerű definiálni milyen anyagok tartoznak a lipidek közé. A vegyületcsoport rendkívül
heterogén, de a definíció meglehetősen egyszerűen hangzik, lényegében azok az anyagok, amelyek vízben nem,
csak apoláros oldószerben oldódnak. Testünkön belül történő szállításuk során pont az apoláros karakterük
jelenthet problémát, hiszem a vérplazma egy (hidrofil) vizes oldatnak tekinthető.
A lipid szállítás problémaköre, vizsgálata, annak fontossága talán úgy érthető meg a legjobban, ha nyomon
követjük a lipidek útját.
8.1. Lipidek emésztése, felszívódása
A lipidek (is) a táplálkozás során jutnak szervezetünkbe. A kiegyensúlyozott étrend gyenge felét (45-50%-át) a
szénhidrátok, a jó harmadát (35-40%-át) a zsírok, a bő tizedét (10-15%) a fehérjék teszik ki. Tehát az étrend bő
harmadát alkotják a lipidek. Ezen belül a legjelentősebb részt (~90%) a trigliceridek (8.1. ábra) teszik ki, a
maradékon osztozik a koleszterin (8.2. ábra), koleszterin-észterek, foszfolipidek (8.3. ábra), zsírsavak (8.1.
ábra).
8.1. ábra - A triglicerid és alkotói: glicerin és zsírsav.
8.2. ábra - A koleszterin.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
97 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
8.3. ábra - A foszfolipidek.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
98 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A lipid tartalmú táplálékot elfogyasztva a lipid komponenseket a lipázok valamilyen szinten elkezdik a
szájüregben emészteni, amely folyamat a gyomorban is folytatódik. Meglehetősen jelentéktelen mértékű a
gyomorban, vagy a szájüregben zajló lipid emésztés. A tényleges emésztés a vékonybélben történik, ahol az
epesavak emulgeálják a lipideket, így az emésztés felülete jelentős mértékben megnövekszik. A gyomortartalom
bélbe történő jutása kolecisztokinin és szekretin elválasztását váltja ki. Hatásukra lipáz és kis mértékben
specifikus észterázok jutnak a hasnyálmirigyből a vékonybélbe, amelyek elkezdik a lipidek emésztését. A
hasnyálmirigy lipázt a kolipáz, horgonyozza le a hidrofób-hidrofil határfelületen, a vizes közeg és a
zsírcseppecskék határfelületén. A lipáz a glicerin 1-es és 3-as C atomján található OH csoportjairól hidrolizálja
le a zsírsavakat, így 2-monoglicerid és zsírsavak keletkeznek (8.4. ábra).
8.4. ábra - A trigliceridek emésztése.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
99 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A foszfolipideket bontásáért a foszfolipiáz A2 felelős. Az enzim nem aktív, előfor-mában szintetizálódik, hiszen
a sejtmembránjaink is meglehetősen nagy mennyiségű foszfolipidet tartalmaznak. Hasonlóan a fehérjék
emésztéséért felelős enzimekhez, ez is a bélben aktiválódik. A foszfolipáz A2 tripszin hatására alakul aktív
foszfolipázzá. A foszfolipáz katalizálta hidrolízis eredménye lizofoszfatidilkolin és zsírsav (8.5. ábra). Ezt
követően az előbbi továbbalakul, egy újabb zsírsavvá és glicerolfoszfokolinná, amely vagy további bontás után
felszívódik, vagy a széklettel ürül. Meglehetősen túltervezett a lipid bontó kapacitásunk, normálisan a széklettel
nem ürül zsír. Amennyiben mégis zsírt tartalmaz a széklet, az valamilyen hasnyálmirigy, vagy máj
rendellenességre utal.
8.5. ábra - A foszfatidil-kolin emésztése.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
100 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A koleszterin kisebb mennyiségben szabadon, nagyobb részt a hidroxil csoportján hosszú szénláncú
karbonsavakkal észteresítve, koleszterin-észterek formájában fordul elő, amelyeket különböző észterázok
bontanak koleszterinné és zsírsavakká. A béllumenben a lebontott lipidek az epesavakkal micellákat képeznek,
majd felszívódnak a bélhámsejtekbe. A sejt belsejében a hosszú szénláncú zsírsavak észteresítik a 2-
monoglicerideket újra triglicerideket alkotva, a koleszterinből is újfent koleszterin-észter képződik.
8.2. Lipidek szállítása
A feladat ettől kezdve tehát adott, a plazma vizes közegében nem oldódó lipideket egyrészt a vékonybélből el
kell juttatni azokhoz a szervekhez, amelyek zsírok oxidálásával tudnak energiát termelni, illetve a májhoz, ami a
központi anyagcsere (így a lipid anyagcsere) központi szerve. A májban szintetizálódó lipideket el kell juttatni a
felhasználás helyére. Harmadrészt pedig a zsírszövetből, mint raktárból éhezés során felszabaduló lipideket
szintén el kell szállítani lebontásuk helyszínére.
A hidrofób lipidek szállítására két stratégia alakult ki:
1. A keringésben a zsírsavak több mint 95%-a trigliceridekben, foszfolipidekben és koleszterin-észterekben
található, amelyeket a következőkben részletesen ismertetésre kerülő 2. szállítási stratégia szerint
lipoproteinek szállítanak. A keringő zsírsavak néhány százaléka azonban nem észteresített formában és nem
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
101 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
lipoproteinekben található. Ezek a szabad zsírsavak, amelyek albuminhoz kötve szállítódnak. (Erre más
hidrofób anyag pl. a bilirubin esetén már láttunk példát.). A metabolizmusban a szabad zsírsavak nagyon
fontos szerepet játszanak. A zsírszövetekben raktározott trigliceridekből éhezéskor felszabaduló zsírsavak a
keringésben szabad zsírsavként jelennek meg. A keringésben a zsírsavak egy kis hányada ténylegesen
szabadon, albuminhoz nem kötve van jelen, ami egyensúlyban van az albuminhoz kötött zsírsavval. A
szervek a nem kötött zsírsavat veszik fel, ami azonnal pótlódik az albuminhoz kötött zsírsav terhére. Ez újra a
szervek rendelkezésére áll. A keringő szabad zsírsavak így nagyon gyorsan a szervek rendelkezésére állnak.
A szabad zsírsavak mennyisége a metabolizmus állapotától függ: éhezéskor és erőteljes izommunka során
megnő, étkezés után, amikor elegendő glükóz áll rendelkezésre az energiaigény fedezésére, csökken a szabad
zsírsav mennyisége. A szabad zsírsavak a szöveti lipidek szintézisére is felhasználhatók. A májba felvett
szabad zsírsavak a ketontestek szintézisével pedig az agy számára is fontos energiaforrást jelentenek.
Táplálkozást követően tehát a szénhidrátokra bízzuk az energiaellátás szerepét, szénhidrátokból pedig
tartalékot képzünk zsírsav formájában, hiszen, ha a szénhidrátokat lebontjuk, abból acetil-koenzimA lesz,
ebből két C atomos egységenként fel tudnak épülni a zsírsavak. Fordítva ez nem játszódik le jelentős
mértékben, lipidekből jelentős mértékben képtelenek vagyunk szénhidrátot, glükózt előállítani.
2. A második szállítási stratégia révén történik a koleszterin, koleszterin-észterek, trigliceridek szállítása. Ezek a
hidrofób vegyületek hidrofil felszínű csomagokba lipoproteinekbe pakolódnak. A lipoproteinek általános
jellemzője, hogy bennük a hidrofób lipidek egy hidrofil burokba csomagolva és ezáltal a plazma vizes
közegétől elválasztva találhatók. A burok részben fehérjéből áll, amelyeket apoproteineknek nevezünk,
továbbá foszfolipidekből, amelyek poláros csoportjaikkal a vizes közeg, apoláris csoportjaikkal pedig a
lipoprotein belseje felé irányulnak. Ebben a burokban orientáltan foglal helyet a koleszterin, OH csoportjával
a foszfolipidek poláros feje felé fordulva. A lipoproteinek belsejében helyezkednek el az apoláris lipidek, a
trigliceridek és a koleszterin-észterek (8.6. ábra). Ez a szerkezeti felépítés minden lipoproteinre jellemző. A
különböző lipoproteinekben eltérő a lipid és fehérjetartalom. Ennek következtében a sűrűségük (denzitásuk)
is különböző, minél magasabb a fehérjetartalom, annál magasabb a sűrűségük. A sűrűségük alapján
csoportosítjuk a lipoproteineket: kilomikron, VLDL (very low density lipoprotein), IDL (intermediate density
lipoprotein), LDL (low density lipoprotein) és HDL (high density lipoprotein). Az apoproteinek szerepe a
lipoproteinek funkcióiban sokrétű: részt vesznek a lipoproteinek szerkezetének kialakításában, felszíni
markerként viselkednek, a lipid anyagcserében fontos enzimeket, fehérjéket regulálnak.
8.6. ábra - A lipoproteinek felépítése.
Mennyiségileg ugyan nem jelentős, minőségileg viszont annál inkább, hogy a zsíroldható vitaminok is így
szállítódnak (pl.: A-, E-vitamin).
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
102 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Most pedig térjünk vissza a bélhámsejtekbe felszívódott és ott újraszintetizált lipidekhez (8.7. ábra),
kövessük nyomon szervezetünkben további sorsukat. A lipidek a bélhámsejtekbe jutva kilomikronba
csomagolódnak (8.7. ábra). A kilomikron a legkisebb sűrűségű lipoprotein. Feladata a lipidek
bélhámsejtektől a periféria, a szövetek irányába, illetve (a maradék) májba történő szállítása. Lipid tartalma
igen magas, ennek megfelelően a legkisebb sűrűségű lipoprotein. A bélhámsejtekbe felszívódott lipidekből
létrejött micella a sima felszínű endoplazmás retikulumban kiegészül a rá jellemző apoproteinekkel (apo B-
48, A-I, A-IV) és létrejön a nascens kilomikron.
8.7. ábra - Lipidek emésztése és felszívódása
Ez a nascens kilomikron a bélhámsejteket a nyirok kapillárisok felé hagyja el és a nyirokereken, majd a
mellvezetéken keresztül a vénás keringésbe kerül (8.8. ábra). A nascens kilomikron a véráramban érik, újabb
apoprotein (apo C-II-t és apo E-t a HDL-től) és lipid komponenseket vesz fel. A zsírszövetben, a szívben, a
harántcsíkolt izomban és a laktáló emlőben a kapillárisok egy extracelluláris enzimet tartalmaznak. Ez a
lipoprotein-lipáz, amely a kilomikron által szállított triglicerideket glicerinre és zsírsavra bontja (8.8. ábra).
Az enzimet a kilomikron apo C-II apoproteinje aktiválja (amely egyben az enzim kofaktora is). A glicerin a
keringéssel a májba kerül, ahol részt vehet a glükoneogenezisben, vagy trigliceridek szintézisében. A
zsírsavakat a szövetek veszik fel. A triglicerid tartalmának jelentős részét elvesztő kilomikron, nagyobb
sűrűségű, kisebb méretű kilomikron maradvánnyá alakul. Apo-E felszíni markere révén a májsejtek
felismerik, endocitózissal felveszik (8.8. ábra).
Lipid tartalmú táplálék elfogyasztását követően vett vérmintában kilomikron partikulák apró zsírcseppecskék
láthatóak. A kilomikron viszonylag rövid időt (5-10 perc) tölt a keringésben. Amennyiben az éhomi vérvétel
esetén is opálos (lipémiás) a plazma az valamilyen lipidszállítási, lipidanyagcsere problémára utal.
A májból a lipideket a perifériális szövetek irányába a VLDL szállítja (8.9. ábra). A VLDL 10% fehérje, 90%
lipid tartalmú lipoprotein. Az általa szállított lipidek döntő része triglicerid. Ezen trigliceridek zsírsav
tartalma eredhet 1. a kilomikron maradvánnyal felvett táplálékból származó zsírsavakból, 2. a máj által
felvett keringő szabad zsírsavakból, 3. a májban, elsősorban szénhidrátokból, de novo szintetizált
zsírsavakból. A VLDL szállítja el a májból a koleszterint is, amely egyrészt a táplálékból származik, másrészt
a májsejtek de novo koleszterinszintéziséből ered. A VLDL-ben a koleszterin:triglicerid arány általában 1:4,
de koleszterin dús táplálkozás esetén ez 1:1-re is módosulhat. Jellegzetes apoproteinje az apo B100. A VLDL
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
103 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a keringéssel szállítódik a szövetekhez. Itt, a kilomikron transzport során ismertetett, lipoprotein-lipáz
lebontja triglicerid tartalmának jelentős részét.
8.8. ábra - A kilomikron életútja.
Az ily módon VLDL-ből kialakult IDL koleszterint és kevés maradék trigliceridet tartalmaz (8.9. ábra).
További trigiceridet távolít el az IDL-ből a máj, triglicerid-lipáz aktivitása révén és ezáltal az IDL átalakul
LDL-lé. Az LDL fő lipid komponense a koleszterin-észter, jellegzetes apoproteinje az apo B-100. Az IDL
durván felét felveszik a májsejtek, endocitózissal visszakerülnek az apo E és B receptorokon keresztül (apo E
és B100 kötésére képesek). Normál körülmények között nagyon kevés IDL van a keringésben gyors
eliminációja, illetve LDL-lé történő átalakulása miatt.
8.9. ábra - Triglicerid és koleszterinszállítása a májból a perifériára.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
104 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az LDL a koleszterin fő szállítója, elsősorban koleszterin formájában. Az LDL 2/3-a B-100 receptorokon
keresztül hagyja el a keringést. A receptorhoz való dokkolást követi az endocitózis, majd az endocitotikus
vezikula fúziója lizoszómákkal, a szabad koleszterin felszabadítása (8.10. ábra). A koleszterin, keringésből
történő eltávolításában kiemelt szerepet kap a máj, a bélrendszer, a mellékvese és a gonádok. A koleszterint
minden sejt felhasználja sejtmembránjának alkotójaként. Ezen kívül fontos kiinduló vegyület a szteroid
hormonok és az epesavak szintézise során. A sejtbe jutott koleszterin gátolja a HMG-KoA reduktázt, a
koleszterinszintézis sebesség meghatározó lépését katalizáló enzimet, illetve az LDL (apo B-100) receptor
szintézist (8.10. ábra). Ezen túl stimulálja a koleszterin-észterek képződését az acil-KoA:koleszterin-
aciltranszferáz (ACAT) enzim aktivitásának fokozása révén.
8.10. ábra - A koleszterin felvétele apo B 100 receptorokon keresztül.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
105 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az LDL receptorok telíthetők, az intracelluláris koleszterinszint emelkedése számukat csökkenti. A keringő
monocitákból származó makrofágok koleszterint eltakarító (scavenger) receptoraik révén fel tudják venni az
LDL-t. Ez a folyamat felel az LDL kisebb részének (1/3) eltávolításáért normális körülmények között. Ez a
folyamat azonban fokozódhat az LDL koncentrációjának növekedésekor, illetve, ha az LDL oxidálódik.
Amikor a makrofágok koleszterin-észterrel túlterheltté válnak, átalakulnak habsejtekké, amelyek az
érelmeszesedést okozó plakkok tipikus összetevői.
Születést követően a plazma LDL koncentráció jóval alacsonyabb, mint felnőttekben. Az LDL koncentráció
folyamatosan növekszik, a felnőttekre jellemző szintet pubertás után éri el. Az LDL receptorok számának,
vagy működésének elégtelensége súlyos koleszterin anyagcserezavarokhoz vezet. A familiáris
hiperkoleszterinémiák mutációk következtében jönnek létre. Leggyakrabban a receptorok szintézisének
hiányát okozzák, de megváltozhat a receptorok térszerkezete is (így már nem képesek ellátni feladatukat).
Heterozigóta familiáris hiperkoleszterinémia esetében a receptorok száma a normális fele, ennek megfelelően
csökken az LDL keringésből történő kivonása. A homozigóta esetben gyakorlatilag hiányoznak a
működőképes receptorok. Ebben az esetben egyedüli terápiás lehetőség a mielőbbi máj transzplantáció. A
heterozigóta kórforma esetében hatékony terápiás lehetőség a HMG-KoA reduktáz gátlók (8.11. ábra)
(statinok), illetve epesav kötő gyanták alkalmazása. A statinok gátolják a sejtek de novo
koleszterinszintézisét, amely fokozott keringésből történő felvételt von maga után. Az epesav kötő gyanták
megakadályozzák a bélből történő epesav felszívódást, megszakítják enterohepatikus körforgásukat, így azok
pótlása kizárólag újabb koleszterinmolekulákból kiinduló bioszintézissel lehetséges (8.12. ábra).
8.11. ábra - A koleszterin bioszintézise és annak gátlása statinokkal.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
106 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
107 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
8.12. ábra - A koleszterinszintézis szabályozása, esetleges beavatkozési lehetőségek.
A legnagyobb sűrűségű lipoprotein partikula a HDL. Az eddigiekben ismertetettel ellentétes irányú
koleszterin transzportot valósít meg (reverz koleszterin transzport). Felveszi a koleszterint az öregedő
sejtekből és más lipoproteinekből, elszállítja azt a kilomikron remnanthoz (maradvány), amit felvesz a máj. A
HDL tehát, mint egy jó „takarító” az extrahepatikus sejtekből, a perifériáról, artériafalból, perifériális
sejtekből szedi össze a koleszterint, és szállítja a máj irányába (8.13. ábra). Ezért is szokták „védő”, vagy „jó
koleszterinnek” nevezni, hiszen a reverz irányú koleszterintranszporttal az érelmeszesedés ellen hat
(ellentétben az LDL-ben található „rossz koleszterinnel”). A HDL membránszerkezete máj, illetve bél
eredetű, a naszcens, frissen szintetizált HDL korongszerű, lapos képződmény. Miután összegyűjti a
koleszterint az érfalból, szövetekből, ez bekerül ebbe a korongszerű képződménybe, a partikulában az LCAT
(lecitin:koleszterin-aciltranszferáz) felelős a koleszterin koleszterin-észterré történő átalakításáért (8.13.
ábra). Ahogy azt már korábban megjegyeztük, a koleszterin a lipoprotein partikulában irányítottan
helyezkedik el, az OH csoportját kifelé a hidrofil rész felé fordítja, első körben felvételekor tehát a burokban
foglal helyet. Miután az LCAT észteresíti a hidroxil csoportját teljesen hidrofóbbá válik és bediffundál a
partikula belsejébe. Ennek eredményeként a korongot szétfeszíti, és egy gömbszerű képződmény lesz belőle.
A HDL triglicerid tartalmának egy részét, az IDL kialakulásában is szerepet játszó, hepatikus lipáz bontja.
Így kialakul egy nagyobb és egy kisebb triglicerid tartalmú HDL alfrakció (HDL2 és HDL3).
8.13. ábra - Reverz koleszterintranszport, a HDL életútja.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
108 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Egy kevés HDL2-t a máj (apo A-1 receptora révén) felvesz, azonban a reverz irányú koleszterintranszport
állomása a kilomikron maradvány lesz, amelynek a HDL átadja koleszterintartalmának jelentős részét, majd
az apo E apoproteinjei révén a májba szállítja azt (8.13. ábra).
Röviden tekintsük át a lipidszállítást!
A lipidek a bélhámsejtekbe jutva a legkisebb sűrűségű lipoproteinbe a kilomikronba csomagolódnak. A
feladata alapvetően a lipidek bélhámsejtektől a periféria (szövetekhez) és a máj irányába (maradék) történő
szállítása. A májban szintetizálódott, vagy újraszintetizálódott lipideket a VLDL szállítja a periféria irányába.
Ebből triglicerid tartalmának jelentős részét leadva alakul ki az IDL. Az IDL nagyjából fele visszakerül a
májba, másik fele pedig LDL-lé alakul. Az LDL által szállított fő lipid komponens a koleszterin, koleszterin-
észter lesz. A HDL felelős a reverz, a szövetektől a máj irányába mutató koleszterintranszportért (8.14. ábra).
8.14. ábra - A lipdszállítás összefoglalása.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
109 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A lipidanyagcsere laboratóriumi diagnosztikája során a következő fő célokat tűzzük ki:
a. A partikulák által szállított fő lipidkomponensek (trigliceridek, koleszterin) mennyiségi meghatározása
b. Érthető módon kíváncsiak vagyunk, hogy a koleszterin hogyan oszlik meg az LDL és HDL lipoproteinek
között. Fontos diagnosztikai értéket hordoz, hogy az érelmeszesedésért felelős, plakképző LDL, vagy a
védő funkcióval rendelkező HDL koleszterinből van több.
8.3. Triglicerid szint meghatározása
A triglicerid meghatározást a glicerin meghatározására vezetjük vissza. A triglicerideket lipáz segítségével
glicerinre és zsírsavakra bontjuk. A glicerint glicerin-kináz segítségével glicerin-3-foszfáttá alakítjuk. Majd a
glicenin-foszfátot dihidroxi-aceton-foszfáttá oxidáljuk. Az oxidáció során (a korábban leírt kreatinin, vagy
glukóz meghatározáshoz hasonlóan) ekvimoláris mennyiségű hidrogén-peroxid keletkezik, melyet peroxidáz
enzimmel vízre és atomos oxigénre bontunk. Az atomos oxigént a korábban ismertetett Trinder-reakcióval
határozzuk meg.
8.4. Koleszterin meghatározás
A koleszterin meghatározása egyike a legrégebben végzett klinikai laboratóriumi teszteknek. Liebermann,
koleszterin meghatározási módszerét 1855-ben publikálta. A ma már csak történelmi érdekességű meghatározás
során a mintát, ecetsavanhidridet és tömény kénsavat tartalmazó, erősen nedvszívó reagenssel kezelve intenzív
kék színű telítetlen szénhidrogén polimerek keletkeznek. A veszélyes reagensek és a vízmentes közeg igénye
miatt ma már nem használatos.
A korábban ismertetett triglicerid meghatározáshoz hasonlatosan a minta koleszterintartalmát koleszterin-
oxidázzal reagáltatva a koleszterin hidroxil csoportja oxo csoporttá oxidálódik miközben ekvimoláris
mennyiségben hidrogén-peroxid képződik. Ezt peroxidázzal bontva a koleszterin meghatározása is Trinder-
reakcióval végezhető (8.15. ábra).
8.15. ábra - A koleszterin enzimes meghatározása.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
110 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az össz koleszterin mennyiségét tehát már megismerhetjük, azonban szükségünk van az egyes lipoprotein
frakciók koleszterinszintjének ismeretére is. A lipoproteinek elkülöníthetők eltérő sűrűségük alapján
ultracentrifugálással, illetve gélelektroforézissel. Azonban egyik módszer sem alkalmas a klinikai
laboratóriumban előforduló nagy mennyiségű minta analízisére. A klinikai laboratóriumban megbízható,
könnyen kivitelezhető, jól automatizálható eljárásra van szükség.
8.5. Nagy sűrűségű (HDL) koleszterin meghatározása
Az automatizálható direkt HDL koleszterin meghatározása két elven történhet.
Az első szerint a plazmához szintetikus polianiont adunk, ami befedi az LDL, VLDL, kilomikron (kis sűrűségű)
lipoproteinek felületét és így azokat detergenssel nem lehet disszociálni. Amikor a reakcióelegyhez detergenst
adunk, az a koleszterint csak a polianionnal nem fedett HDL-ből szabadítja fel. A mért koleszterin érték a HDL
koleszterin.
A másik direkt koleszterin meghatározási módszer első lépésében a kis sűrűségű lipoproteineket (kilomikron,
VLDL, LDL) megfelelő detergenssel elimináljuk. A szabad és a koleszterin-észteráz hatására szabaddá váló
koleszterin, koleszterin-oxidáz hatására (hasonlóan a Trinder reakció első lépéséhez) D4-koleszteronná
oxidálódik és H2O2 keletkezik. A H2O2-t viszont nem peroxidázzal, hanem katalázzal bontjuk el. Ekkor nem
keletkezik atomos oxigén, így ez nem hajtja meg a Trinder színreakciót. A módszer második lépésében további
detergens hozzáadása révén felszabadítjuk a HDL-ben található koleszterint és azt egy Trinder színreakcióval
határozzuk meg. Az első lépésben a flavin enzim (koleszterin-oxidáz) által termelt H2O2-t hatástalanító kataláz a
második reakciót azért nem zavarja, mert az elegy Na-azidot tartalmaz. Bár mind a kataláz, mind a peroxidáz
hemoprotein, így aziddal gátolható a kataláz Na-azid érzékenysége fokozott, viszont a peroxidáz csak 3-4
nagyságrenddel magasabb azid koncentrációval gátolható.
Mind a két módszer az ultracentrifugálással és az elektroforézissel szeparált lipoprotein koleszterin
meghatározásokhoz igen közeli eredményt szolgáltat.
8.6. Könnyű lipoprotein frakciókban található koleszterin meghatározása
Az LDL és VLDL koleszterin meghatározások jelentősége csökken, mivel az esetleges hiperlipoproteinémia
osztályba sorolása az érelmeszesedés kockázatának megállapítására a plazma lipidek a HDL koleszterin és az
egyes apoproteinek elegendő támpontot adnak. A könnyű lipoproteinekben szállított koleszterin
meghatározásának a legegyszerűbb módja, hogy a plazma összkoleszterinből kivonjuk a HDL koleszterin
mennyiségét.
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
111 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
8.7. A koleszterin referenciatartományával kapcsolatos polémia
A koleszterin esetében a referenciatartomány a korral változik, ahogy azt már említettük, születést követően
meglehetősen alacsony, majd a pubertás után éri el a felnőtt korra jellemző értéket. Az összkoleszterinszint
gyerekkorban 4,1 mM alatt tekinthető normálisnak, az LDL koleszterin pedig alacsonyabb szokott lenni mint 1
mM.
Referenciatartomány helyett érdemesebb a plazma összkoleszterinszint függvényében megvizsgálnunk a
kardiovaszkuláris betegségek rizikóját. A görbe lefutását megvizsgálva megállapíthatjuk, hogy a betegség
rizikója az összkoleszterin szint növekedésével egy határérték felett exponenciálisan nő. Ezért is nagyon nehéz
referenciatartományt megadni. A görbe 4-4,5 mM értékig meglehetősen laposan fut, majd ezen érték fölött
megugrik, mindössze 1 mM koleszterin koncentrációnövekedés a rizikót akár a duplájára növelheti. A
dohányzás esetén (elsősorban az LDL molekulák oxidációja miatt) sokkal jelentősebb a kockázat.
Talán ezen a ponton érdemes még egy kicsit a referenciatartományokról elmélkednünk. Abban számos
szakkönyv, szakcikk egyetért, hogy a referencia tartomány nem mindenható és az attól való kisebb eltérés nem
feltétlenül jelez a háttérben zajló patológiás folyamatot, vagy a referencia tartományon belüli paraméter mellett
is elképzelhető egy háttérben már megindult patológiás elváltozás. Sokszor sokkal inkább kórjelző lehet a
korábbi eredményekkel történő összevetés, az adott paraméter tendenciájának vizsgálata. Előfordulhat, hogy
valakinél elindult már egy kóros folyamat, de még a referencia tartományba esik az adott folyamatot jelző
paraméter értéke, azonban, ha visszakeresnénk az előző féléves, vagy 3 hónappal korábbi eredményét, akkor
kiderülne, hogy már a duplájára nőtt az adott paraméter értéke, így ez már mindenképpen kórjelző lehet.
A plazma lipidek szintjében igen markáns emelkedés tapasztalható a menopauzát követően. Általánosságban
elmondható, hogy a fizikai munka a védő szereppel rendelkező HDL koleszterint növeli, az LDL koleszterint,
pedig csökkenti. A komolyabb mennyiségű alkoholfogyasztás jelentősebb mértékű plazma triglicerid
szintemelkedést idézhet elő, mivel Ac-KoA-vá bomlik le, ami a zsírsavszintézis kiinduló vegyülete.
8.8. Hiperlipidémiák
A már tárgyalt familiáris hiperkoleszterinémián kívül számos lipid rendellenesség fordul még elő, amelyekről az
alábbiakban szeretnénk egy rövid összefoglalást adni. Jelen esetben kizárólag primer hiperlipidémiákkal
foglalkozunk, a szekunder esetekkel, amelyeket valamilyen más a lipid szállítással nem direkt összefüggésben
levő betegség vált ki, mint például a diabétesz, vagy a túlzott alkoholfogyasztás jelen fejezetben nem
foglalkozunk, azokról a primer betegség tárgyalásánál teszünk említést.
Poligénes hiperkoleszterinémia: A plazma koleszterinszintet számos gén befolyásolja. Ezért gyakran
előfordul, hogy a hiperkoleszterinémiás ember családját vizsgálva folyamatos koleszterinszint megoszlást
találunk. A plazma koleszterin szintje nem olyan magas, mint familiáris hiperkoleszterinémia esetében és
nagyobb mértékben befolyásolják környezeti tényezők, mint a táplálkozás, elhízás, mozgás. Az állapot
jelentőségét a koronária megbetegedések kockázata adja. Terápiája hasonlatos a familiáris hiperkoleszterinémia
kezeléséhez, azonban ez esetben a diéta egymagában is megfelelő lehet.
Familiáris kombinált hiperlipoproteinémia: A lipoprotein eltérések keverten fordulnak elő. Az érintetteknek
magas a VLDL és/vagy LDL szintje. Az alapeltérés valószínűleg a VLDL túltermelés. A VLDL lebontásának
gyengesége esetén csak hipertrigliceridémia alakul ki. Akikben a VLDL lebontás igen hatékony, azokban a
koleszterin és LDL szintje magasabb. Másokban a triglicerid és a koleszterin együtt emelkedik. A megbízható
diagnózishoz a család szűrővizsgálatára van szükség, de gyakran használják azokra az esetekre, amelyekben
mind a VLDL, mind az LDL emelkedett. A rendellenesség gyakran vezet szívkoszorúér betegséghez és az
érintetteknek gyakran szüksége van mind diétás, mind lipidcsökkentő gyógyszeres kezelésre.
Diszbétalipoproteinémia: Ezt a betegséget a plazmában kilomikron maradékok és IDL felszaporodása jellemzi.
Az ok egy homozigóta mutáns apoE (E2), amely nem tud rendesen kötődni a B,E receptorhoz és feltehetően az
LDL receptorhoz sem. Ez a kilomikron maradék hiányos májfelvételéhez és az IDL LDL-lé történő
átalakításának defektusához vezet.
Familiáris kilomikronémia: Az éhgyomri kilomikronémia két ritka hiperlipidémia tünete, mindkettő
autoszomális recesszív öröklésmenetet mutat. Az egyikben a lipo-protein-lipáz enzim, a másikban az apoCII
Lipid anyagcsere, szérum lipidek
laboratóriumi vizsgálata
112 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
hiányzik, ami az enzim aktiválásához szükséges. Az eredmény mindkét esetben a kilomikron véráramból történő
eltávolításának hiánya. A kórkép rendszerint már gyerekkorban megmutatkozik eruptív xanthomákkal,
hasnyálmirigy-gyulladás következtében visszatérő hasi fájdalommal és néha máj és lépmegnagyobbodással.
Familiáris hipertrigliceridémia: Ez az állapot, melynek előfordulása hozzávetőlegesen 1:600 esetében VLDL
túlsúly alakul ki a plazmában. A betegség molekuláris háttere nem feltárt teljes mértékben, a máj VLDL
szintézise fokozott. Az öröklődés autoszomális domináns.
Familiáris hiperalfalipoproteinémia: Ebben az állapotban a hiperkoleszterinémia oka, csak a HDL frakció
növekedése. A koronária betegség kockázata csökken, kezelése nem szükséges. Bár az összkoleszterin szint nő,
ebből a HDL koleszterin képviseli a nagyobb súlyt, így az állapot csak külön HDL koleszterin meghatározással
diagnosztizálható.
113 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
9. fejezet - Hematológia
A vérplazma és a vér alakos elemeinek vizsgálata a leggyakoribb klinikai laboratóriumi feladatok közé tartozik,
mert a keringés révén gyakorlatilag valamennyi szövet kapcsolatban áll egymással, így a vérvizsgálat nemcsak
az alakos elemeket érintő hematológiai betegségekről, hanem a szervrendszerek általános állapotáról is értékes
információt szolgáltathat.
Ahogy korábban láttuk a vércukorszint, illetve a plazma lipoprotein-frakcióinak eltérései fontos anyagcsere-
betegségekre utalhatnak. A vérplazma ozmolaritásának és a legfontosabb elektrolitek koncentrációjának
meghatározásával az extracelluláris folyadéktér összetételére, illetve a vesefunkciókra is következtethetünk. A
plazmafehérjék szintje és összetétele a máj- és vesefunkciók, illetve az alvadási rendszer érzékeny indikátora. A
hormonszintek meghatározásával az endokrin szervek működéséről kapunk átfogó képet. A különböző
szövetkárosodások révén a keringésbe jutó sejtenzimek és metabolitok szintje a helyes diagnózis (pl.
szívinfarktus) felállítását támogatja.
Jelen fejezet ugyanakkor nem elsősorban a vérplazma klinikai kémiáját tárgyalja, hanem rövid élettani
áttekintést követően bemutatja az alakos elemek vizsgálatára alkalmazott módszereket és röviden jellemzi a vér
sejtjeinek mennyiségi és minőségi eltéréseit különböző hematológiai kórképekben.
9.1. A vér sejtjei és a vérképzés élettana
A vér alakos elemei közé a vörösvérsejtek (eritrociták), a vérlemezkék (trombociták) és a különböző
fehérvérsejtek (leukociták) tartoznak. Utóbbiakat fénymikroszkópos megjelenésük és a mag morfológiája szerint
mononukleáris sejtekre (monociták, limfociták) és granulocitákra lehet felosztani. A granulociták jellegzetes
citoplazmatikus granulumaik alapján neutrofilok, eozinofilok vagy bazofilok lehetnek.
A vörösvérsejtek sejtmagot és nukleinsavakat nem tartalmazó, eozinofil festődésű, bikonkáv, 7-8 μm átmérőjű
képletek. A citoplazmájukban oldott hemoglobin (Hb) oxigénkötése miatt a vér nagyságrendekkel több oxigént
tud szállítani, mintha az oxigén pusztán fizikailag oldott állapotban fordulna elő a vérplazmában. A hemoglobin
négy alegységből álló fehérje; minden alegysége egy globin polipeptidláncból és a hozzá koordinatív kötéssel
rögzülő, központjában vas(II)-iont tartalmazó hem prosztetikus csoportból áll. Emberben a magzati fejlődés
során az alfa-globinláncok mellett először epszilon-láncok expresszálódnak (α2ε2 – Gowers-hemoglobin), később
utóbbiak gammaláncokra cserélődnek (α2γ2 – HbF, fötális Hb), amely a születés utáni napokban lebomlik és
helyét a felnőtt típusú béta-, illetve delta-alegység veszi át (α2β2 – HbA1; α2δ2 – HbA2). Egyetlen hem egyidejűleg
egy oxigénmolekulát tud megkötni, így hemoglobin-molekulánként négy darab oxigénmolekula szállítható. Ha a
központi vas(II)-ion vas(III)-má oxidálódik, oxigén szállítására nincs lehetőség (methemoglobinémia). A Hb
oxigénkötő affinitását a plazma szén-dioxid-koncentrációja, savassága, az emelkedett testhőmérséklet és magas
2,3-biszfoszfoglicerát-koncentráció csökkenti. Az idős vagy károsodott vörösvérsejtek elsősorban a lép
makrofágjai segítségével bomlanak le. A hem gyűrűjéből többlépcsős reakcióban bilirubin keletkezik, amely a
májsejtekben glukuronsavval konjugálódva az epébe kerülve ürül. A nem konjugált és konjugált bilirubin-
frakciók, illetve a vizeletben megtalálható további bomlástermékek (urobilinogén) szintjének meghatározásával
a máj és az epeutak állapotáról is értékes információkat nyerhetünk (lásd 6. fejezet).
A trombociták felépítését és funkcióit a hemosztázisról szóló 10. fejezet tartalmazza.
A fehérvérsejtek szerepe elsősorban a patogénekkel szembeni védekezés, a gyulladásos, allergiás szöveti
reakciókban való részvétel. A monociták a legnagyobb méretű vérsejtek közé tartoznak, nagy, bab alakú maggal
rendelkeznek, a teljes fehérvérsejtszám 3-8 %-át adják. Fagocitózisra képesek, az érpályát elhagyva szöveti
falósejtekké (makrofágokká) differenciálódnak, amelyek a dendritikus sejtekkel egyetemben fontos szerepet
játszanak a különböző antigének processzálásában és a limfociták felé történő prezentálásában.
A granulociták arról kapták a nevüket, hogy különböző festődésű szekréciós granu-lumokat tartalmaznak. A
granulumokban található enzimek és toxikus metabolitok fontos antimikrobiális ágensek. A neutrofil
granulociták (a fehérvérsejtek 60-70 %-a) olyan falósejtek, amelyek a gyulladásos reakció keretében képesek az
érfalon átlépve a szövetekbe jutni (extravazáció). Az eozinofil granulociták egészségesekben a fehérvérsejtek 2-
5 %-át adják, de számuk és arányuk elsősorban allergiás és paraziták okozta megbetegedések esetén
megnövekedhet. A bazofil pettyezettségű granulociták elsősorban szekréciós tevékenységükkel tűnnek ki
(heparin, hisztamin, szerotonin), ám a legkevésbé gyakori fehérvérsejtek közé tartoznak (0,5 – 1 %).
Hematológia
114 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A fehérvérsejtek második legnagyobb frakcióját (20-30%) kitevő limfociták a legkisebb fehérvérsejtek közé
tartoznak; citoplazmájukat szinte teljesen kitölti kerek sejtmagjuk. Két fő osztályuk a celluláris (sejt-mediálta)
immunválaszért felelős T és a humorális immunválaszt biztosító B sejtek. Előbbiek T-sejt-receptort (TCR),
utóbbiak B-sejt-receptort (BCR, membránkötött immunglobulin) expresszálnak. A T-sejteket felszíni
fehérjemarkereik alapján a CD8+ citotoxikus és a CD4+ „helper” osztályokba lehet sorolni. A citotoxikus T-
sejtek apoptózis indukciója révén képesek a célsejtek elpusztítására, amelyeket testidegen felszíni antigénjeik
alapján (MHC I. osztályú antigének) ismernek fel. Ezzel szemben a helper T-sejtek a professzionális antigén-
prezentáló sejtek felszínén található MHC II-es típusú fehérjék által bemutatott antigénekre reagálnak és olyan
citokineket termelnek, amelyek a humorális és celluláris immunválasz szabályzását végzik. A B-sejtek a
felszínükön megtalálható immunglobulin-receptorok révén aktiválódnak, végül ellenanyagot termelő
plazmasejtekké differenciálódnak. Az antitestekkel megjelölt sejtek fagocitózissal elpusztíthatók, illetve a
citotoxikus T-sejtek könnyebben felismerik őket (ADCC, antitest-dependens celluláris citotoxicitás).
A vér sejtes elemei az embrionális fejlődés első hónapjaiban a szikhólyag falában termelődnek, ezt a szerepet
később a máj, majd a születést követően teljes egészében a vörös csontvelő veszi át, amely elsősorban a
csigolyák, a szegycsont, a bordák és a nagy csöves csontok velőűrében található. A csontvelőben többlépcsős és
citokinek által finomhangolt differenciálódási folyamat során alakulnak ki a perifériás vérben megjelenő érett
sejtek. Valamennyi alakos elem a CD34 sejtfelszíni antigént expresszáló multipotens őssejtből alakul ki a
megfelelő kolónia-stimuláló faktorok hatására. Az őssejt osztódása során keletkező utódsejtek egyike megtartja
az őssejtekre jellemző tulajdonságokat, míg a másik a differenciálódás útjára lépve egyre elkötelezettebb
sejteket képez. A multipotens őssejtből két differenciálódási vonal indul, a limfoid és a közös vörösvérsejt-
trombocita-granulocita-monocita vonal. Utóbbi a későbbiekben szétválik a megfelelő elkötelezett sejtvonalakra.
A folyamat szabályzását citokinek (kolónia-stimuláló faktorok, interleukinok, tumor nekrózis faktor), illetve a
vörösvérsejtek esetében többek között a vese peritubuláris endotélsejtjeiben termelődő eritropoetin látja el. A
csontvelő érési előalakjai megfelelő festési eljárásokkal és felszíni markereik alapján immuntipizálással
azonosíthatók. A vörösvérsejtek perifériás vérben is megtalálható közvetlen előalakjai, a retikulociták sejtmagot
már nem, azonban citoplazmatikus RNS-t még tartalmaznak, amely szupravitális krezilkék-festéssel tehető
láthatóvá.
9.2. A vér, illetve a vérképzés sejtes elemeinek vizsgálatára szolgáló eljárások
A vérvétel általában a könyökvéna szúrásával, egyszer használatos vákuumos csőbe történik, amely
alvadásgátló oldatot tartalmaz, hiszen a legtöbb vizsgáló módszer feltétele, hogy a plazma folyékony
halmazállapotban maradjon (a szérum is folyékony halmazállapotú, mégsem alkalmas hematológiai vizsgálatra,
mert a sejtes elemekre vagyunk kíváncsiak, tehát a teljes vérnek kell folyékonynak lennie). A hematológiai
vizsgálatokhoz általában a kalcium-kelátor EDTÁ-t (etilén-diammin-tetraacetát) tartalmazó lila kupakos
csöveket használják. Vérvétel után a csövek tartalmát alaposan össze kell keverni, és a csöveket minél
gyorsabban a hematológiai laboratóriumba kell szállítani. Késlekedés esetén a sejtek anyagcseréje miatt a
plazma összetétele megváltozhat, illetve a sejtmembrán károsodása miatt a sejtek egy része lizálhat.
A mintát fogadó laboratórium első teendői közé tartozik az alakos elemek és a plazma térfogatarányának, a
hematokrit értékének meghatározása. Mivel a vérsejtek össztérfogatának döntő részét (99,9 %-át) a
vörösvérsejtek (továbbiakban: vvs) teszik ki, ezért a hematokrit megfelel a vvs-ek teljes vérhez viszonyított
térfogatszázalékos arányának. Erre utalnak az angol szakirodalomban elterjedt packed cell volume (PCV),
illetve erythrocyte volume fraction (EVF) szinonim elnevezések is. A hematokrit meghatározása úgy történik,
hogy az ún. hematokrit-kapilláriscsőbe levett vérmintát 10 ezres fordulatszámon 5 percig centrifugálják, majd
egy hematokritskála segítségével megállapítják az alul elhelyezkedő, vörös színú vvs-fázis arányát, amelynek
normálértéke férfiakban 45%, nőkben 40% körül van. Újabban a vérsejtszámláló hematológiai automaták a
hagyományos meghatározás mellett lehetőséget adnak a hematokrit számítással történő meghatározására is: a
teljes vvs-térfogatot úgy is megkaphatjuk, hogy az átlagos vvs-térfogatot megszorozzuk a vvs-ek számával.
A hematológiai betegségek vizsgálatában fontos támpontot ad az alakos elemek számának (koncentrációjának)
meghatározása (teljes vérsejtszám, mennyiségi vérkép). Erre a célra kezdetben hemocitométereket (Bürker-
kamra) alkalmaztak. A hemocitométer egy vastag tárgylemezből és a ráerősített üveg fedőlapból áll (9.1. ábra).
9.1. ábra - Bürker-kamra.
Hematológia
115 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A tárgylemezbe mart osztások különböző alapterületű cellákat képeznek. A tárgylemez és a fedőlemez közötti
távolság állandó, így a cellák pontos térfogata is meghatározott. A fedőlemez helyes rögzítése esetén a
fénytörésből fakadóan szivárványszínű Newton-gyűrűk jelennek meg. A megfelelően hígított vérminta a
kapillaritás jelensége miatt gyorsan bediffundál a mérőcellába, és mikroszkóp alatt lehetővé válik az ismert
térfogatú folyadékterekben a sejtek megszámlálása. A nagyobb pontosság kedvéért több cella sejttartalmát
érdemes megszámolni, majd átlagolni, ám a módszer pontossága, idő- és személyzetigénye így is hagy
kívánnivalót maga után.
A vérsejtszámlálás automatizálására és ezzel a hematológiai laboratórium kapacitásának jelentős növelésére az
elektromos ellenállás (impedancia) mérésének elvén alapuló sejtszámláló automaták (Coulter-számlálók)
megjelenésével a múlt század közepétől nyílt lehetőség. Az eljárás lényege, hogy a sejtek két kamra között egy
mikrocsatornában haladnak át (9.2. ábra). Amikor az apertúrán egy sejt áthalad, megváltozik az elektromos
ellenállás, hiszen az apoláris membránnal körülzárt sejtek sokkal rosszabb töltéshordozók, mint a körülöttük
levő elektrolitoldat, tulajdonképpen nagy ellenállású szigetelőnek tekinthetők.
9.2. ábra - Coulter-számláló.
Hematológia
116 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az ellenállás változása az áthaladó sejt méretével arányos, így az automaták az egyedi sejtméret meghatározásán
keresztül a sejttípus azonosítására is alkalmasak. Lényeges, hogy a vizsgálathoz a vérminta erősen ki legyen
hígítva, minimálisra csökkentve annak valószínűségét, hogy két sejt egyszerre haladjon át az apertúrán
(koincidencia). Az apertúra mérete is lényeges tényező. A csatorna átmérőjét egyrészt minél kisebbre kell
tervezni, hogy két sejt egy időben ne léphessen át, másrészt túl alacsony átmérő esetén megnő a nagyobb sejtek,
összecsapódott sejtcsoportok okozta eltömődés esélye. A keresett középutat a korszerű készülékek ún.
hidrodinamikai fókuszálással oldják meg, vagyis a mérendő sejteket tartalmazó mintát egy külső, megfelelő
nyomású, gyors áramlású folyadékköpeny belsejébe injektálják, így kényszerítve a sejtsugarat az optimális
átmérő felvételére.
Az apertúra méretének megválasztásával elérhető, hogy a műszer a vérlemezkéket, a vörösvérsejteket és a
fehérvérsejtek koncentrációját is meghatározza. Az átlagos sejtmérettől való eltérést hisztogrammal lehet
ábrázolni; ennek az adatnak fontos szerepe lehet egyes hematológiai betegségek diagnosztikájában.
A teljes vérsejtszám az optikai elven működő áramlási citométerek segítségével is meghatározható. Az
eljárás a fényszóródás elvén alapszik. A hidrodinámiás fókuszálással előállított sejtnyalábra bocsátott adott
hullámhosszú, monokromatikus, fókuszált lézerfényt a sejtek méretüktől és összetételüktől függően különböző
törőszögekkel szórják. Azokat a fotonokat, amelyek nem léptek kölcsönhatásba a sejtekkel, egy lencse egy
elnyelő ernyőre fókuszálja. A viszonylag kis hajlásszögben szóródó fotonokat (forward scatter, „előre”
szóródás) egy másik lencse gyűjti össze és egy fotodiódára bocsátja. Az így mért fényintenzitás elsősorban a sejt
méretéről ad felvilágosítást. A nagyobb szögben szóródó fényt (side scatter, „oldalra” szóródás) egy tükör egy
másik fotodiódára tereli; az így szóródó fény intenzitása elsősorban a sejt morfológiájával van összefüggésben
(sejtmag mérete és alakja, a citoplazmatikus granulumok és egyéb sejtorganellumok száma, mérete és tartalma,
a sejtmembrán fodrozottsága stb.) (9.3. ábra). A két paraméter együttes mérésével a vizsgált sejtszuszpenzió
méret és sejtösszetétel alapján kategorizálható, az eredmények kéttengelyes koordináta-rendszerben láthatóvá
tehetők. A kétdimenziós foltok (felhők) egy-egy összetartozó sejtpopulációnak felelnek meg. A sejttérfogat és a
sejtstruktúra együttes mérésével a limfociták, a monociták és a granulociták felhői jól elkülöníthetők. Az
áramlási citometria egy továbbfejlesztett változata, amikor a fényszóráson túl specifikus fluoreszcens jelölést is
alkalmazunk. A fluoreszcens festék elméletileg a sejt bármely komponenséhez (sejtszervecske, DNS, fehérje,
membrán stb.) hozzáköthető. Az eljárás fizikai alapja, hogy a fluoreszcens festékkel jelölt sejteken a festék
megfelelő hullámhosszú lézerfény alkalmazásával gerjeszthető, majd a csoport a rá jellemző hullámhosszon
fényt emittál. A kibocsátott fény hullámhosszát úgy választjuk meg, hogy különbözzék a szórt fény
hullámhosszától, így attól megfelelő színszűrő segítségével elkülöníthetővé és mérhetővé válik. Ezzel a
módszerrel egy sejtpopuláción, pl. a limfocitákon belül jellegzetes és fluoreszcens antitestekkel jól jelölhető
felszíni markereket azonosíthatunk, így például a CD4 és CD8 fehérjék jelölésével lehetőség nyílik a helper és a
citotoxikus T-sejtek elkülönítésére. Ennek az eljárásnak elsősorban a különböző leukémia-típusok tipizálásában
van jelentősége. A legkülönfélébb intra-celluláris és sejtfelszíni fehérjemarkerek megjelölésén túl nukleinsav-
festékekkel a sejtek teljes DNS- és RNS-tartalma mérhető, amit a ploiditás-vizsgálatokban használhatunk ki.
Fluoreszcens in situ hibridizációval (FISH) választ kaphatunk arra, hogy milyen kromoszóma-átrendeződések
lehetnek felelősek a malignus klón kialakulásáért, melyik onkogén hova helyeződött át (géntranszlokáció) vagy
van jelen nagyobb kópiaszámban (CNV, copy number polymorphism).
9.3. ábra - Optikai elven működő áramlási citométer
Hematológia
117 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
9.4. ábra - Hematológiai automata
A leukémiában gyakori kromoszóma-átrendeződések, génamplifikációk és DNS-mutációk vizsgálatára a
korszerű genetikai vizsgálatok széles skálája áll rendelkezésre (kromoszóma-sávtechnikák, polimeráz-
láncreakción alapuló genotipizálási eljárások, real-time PCR stb.).
Hematológia
118 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A fluoreszcens jelölés az egyes fehérvérsejt-frakciók elkülönítésénél különösen fontos. Ha csupán fényszóródást
mérünk, csak az erősen granulált bazofil granulociták válnak külön a többi sejttípustól (9.5. ábra).
9.5. ábra - Bazofil granulociták meghatározása fényszórás méréssel
A fluoreszcens technika alkalmazása során a vért először olyan felületaktív anyaggal (detergenssel) kezeljük,
amely feloldja a vörösvérsejteket és a trombocitákat, a fehérvérsejteket viszont csak permeabilizálja. Az így
kezelt sejtekhez egy polimetin-festéket adunk, amely a nukleinsavakat (sejtmag) és a citoplazma granulumait
megfesti és a fehérvérsejt-populációk jobb szétválását eredményezi. A neutrofil és eozinofil granulociták
elkülönítésében egy szerves sav hozzáadása is segít, amely az eozinofil granulumokhoz nagy affinitással
kötődik. Így végeredményben valamennyi fehérvérsejt-frakció egyidejűleg, jó felbontással elkülöníthető (9.6.
ábra).
9.6. ábra - Az egyes fehérvérsejt frakciók meghatározása fluoreszcens technikával
Hematológia
119 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
9.7. ábra - A hematológiai automata által szolgáltatott eredmények
A perifériás vérből történő kenet megfelelő festésével (9.8. ábra), továbbá citokémiai és immuncitokémiai
vizsgálatával is értékes információ nyerhető az alakos elemek, mindenekelőtt a fehérvérsejtek előfordulási
arányáról és morfológiájáról (minőségi vérkép). A kenet készítéséhez egy csepp vért tárgylemezre cseppentünk,
majd egy másik üveglemez segítségével vékonyan szétkenjük annak felületén. A megszárított kenetet az
általános tájékozódás céljából általában a May-Grünwald-Giemsa eljárással festik. A festékkeverék a
Hematológia
120 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
makromolekulák izoelektromos pontja, vagyis töltése alapján differenciál; a negatív töltésű (savas)
makromolekulák, mint a DNS és az RNS metilénkékkel kékre festődnek (mag), míg a bázikus fehérjék eozinnal
vöröses színt adnak. Ez a módszer különösen a neutrofil, eozinofil és bazofil granulociták differenciálásában
jelent óriási segítséget.
A citokémiai eljárások egyes, az adott sejtre vagy fejlődési előalakra jellemző enzim, fehérje vagy egyéb
komponens megfelelő színreakcióval történő kimutatására alkalmasak, megkönnyítve a vizsgált sejttípus
azonosítását. Ilyen pl. a vasat festő Berlini-kék reakció (túl nagy mennyiségű vasat tartalmazó vörösvértestek,
szideroblasztok kimutatására), vagy a peroxidáz-reakció, amely a neutrofil granulociták szabadgyökképző
enzimére, a mieloperoxidázra specifikus.
9.8. ábra - Vérkenet készítése
Az immuncitokémiai vizsgálatok bizonyos sejtfehérjék antigén-antitest reakció segítségével történő
kimutatásával ugyancsak a sejttipizálást szolgálják. A fluoreszcens jel fluoreszcens mikroszkóp segítségével
vizsgálható. A módszer áramlási citometriára is beállítható (lásd a fentiekben), ám a hagyományos
mikroszkópos vizsgálat sejtszinten több információt ad pl. az antigén sejten belüli elhelyezkedésével
kapcsolatban.
Kenetkészítés és (immun)citokémiai vizsgálatok csontvelőből nyert sejteken is végezhetők. A csontvelő
vizsgálatára akkor van szükség, ha a perifériás vérkép nem ad biztos információt a betegségről, ha sejtképződési
zavar, illetve malignus folyamat gyanúja áll fenn. Csontvelői sejteket a szegycsontból történő vákuum-
aspirációval nyerhetünk. Ilyenkor a szöveti struktúra nem vizsgálható, de az egyes sejtek morfológiájáról és
arányáról hozzávetőleges információt kapunk (csontvelő-citológia). Ha pontosabb, a csontvelő szöveti
struktúráját is láthatóvá tevő képet szeretnénk, a csípőlapátból tűbiopszia végezhető (csontvelő-hisztológia).
A vörösvérsejt-rendszer értékelésére az alábbi kvantitatív paraméterek alkalmasak:
1. Teljes vörösvérsejtszám (red blood cell count, RBC): impedancia vagy optikai elven működő áramlási
citométerrel mérhető.
2. A különböző anémiák súlyosságára a vér hemoglobin-koncentrációja utal. Meghatározásának hagyományos
eljárása azon alapszik, hogy a lizált vérmintához adott oxidálószerrel a hemoglobin methemoglobinná alakul,
amely cianidionokkal ciánmethemoglobint képez; ez a vegyület adott hullámhosszon fotometrálható.
(Környezetvédelmi okokból már nátrium-lauril-szulfátot (sodium dodecyl sulfate, SDS) használnak helyette.)
Hematológia
121 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3. Az átlagos vörösvérsejt-térfogat (mean corpuscular volume, MCV) optikai áramlási citometriával, a forward
scatter értékéből számítható. A vörösvérsejtek méretének szórása (RDW, red cell distribution width) a
következőképpen számítható: RDW = (az MCV-értékekből számított standard deviáció)/(átlagos MCV) x
100.
4. A vörösvérsejtek átlagos hemoglobin-tartalma (mean corpuscular hemoglobin, MCH) számítása: MCH =
(Hb-koncentráció)/(vörösvérsejt-koncentráció).
5. A vörösvérsejtek átlagos hemoglobin-koncentrációja (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)
= (Hb-koncentráció)/hematokrit.
6. A retikulociták aránya a már említett festés segítségével, fénymikroszkópos sejtszámolással, illetve
megfelelő fluoreszcens festék alkalmazásával, áramlási citometriával is megállapítható.
9.3. A vörösvérsejteket érintő legfontosabb kórképek
A vörösvérsejtszám (RBC) eltérései alapján policitémia (eritrocitózis, emelkedett RBC) illetve anémia
(csökkent RBC, amely csökkent Hb-koncentrációval jár együtt) diagnosztizálható.
Policitémia kapcsán el kell különítenünk a kiszáradásos állapottal, csökkent plazmatérfogattal (s emiatt
emelkedett plazma ozmolaritással) járó relatív (pszeudo-) policitémiát a valódi policitémiától. Utóbbi esetben az
érrendszerben található teljes vvs-mennyiség növekedett meg. A valódi policitémiákat primer és szekunder
csoportba szokás sorolni aszerint, hogy külső ok nélküli, elsődleges csontvelő-túlműködésről van-e szó
(policitémia vera), avagy a fokozott vvs-termelés egy jól körülírható ok következtében (pl. hipoxiával járó
keringési és légzési rendellenességek) lép-e fel. Primer policitémia esetén, amennyiben egy korai, közös
fejlődési alak osztódási üteme gyorsult, más sejttípusok koncentrációja is emelkedhet (ezek az ún.
mieloproliferatív betegségek, amelyek viszonylag gyakran leukémiába mehetnek át). Policitémia esetén gyakori
a JAK2 protein-tirozin-kináz funkciónyerő mutációból adódó túlműködése, amely genotipizálással bizonyítható.
A vérszegénység viszonylag gyakori állapot, amely nagyon gyakran más betegség kísérőtünete lehet, és sokszor
egyéb okból történő kivizsgálás miatt derül rá fény. Az anémia kezelése fontos, mert szöveti hipoxiát okoz,
amely a perctérfogat növekedésével kompenzálható, viszont a keringést erősen megterheli és szívelégtelenségbe
torkollhat. Anémia esetében is el kell különíteni a plazmavolumen növekedésével társult pszeudo-anémiát a
teljes keringő vvs-mennyiség növekedésével járó valódi anémiától. Valódi anémiához a következő tényezők
vezethetnek: (i) csökkent vvs-képzés a csontvelőben; (ii) a vvs-ek csökkent élettartama, vagyis gyorsabb
pusztulása; (iii) akut vagy krónikus vérvesztés. Az első esetben a perifériás vér retikulocita-koncentrációja
kórosan alacsony, míg a 2-3. kóroki esetben a csontvelői kompenzáció miatt általában emelkedett érték mérhető.
Az anémia súlyosságának megítélésekor a vér hemoglobin-koncentrációját vesszük alapul. A klinikai
gyakorlatban, az anémiák egyes típusainak elkülönítésénél gyakorlati megfontolásból ugyanakkor a vvs-ek
mérete szerinti felosztás terjedt el; ennek megfelelően mikrociter (MCV<80 fL), normociter (MCV 80-100 fL
között) és makrociter (MCV>100 fL) típusokat lehet elkülöníteni. Az alábbiakban a leggyakoribb anémia-
típusok összefoglalása ezen felosztás szerint történik.
A mikrociter anémia általában a hemoglobin szintézisének zavara miatt lép fel és leggyakoribb oka a vashiány.
Ilyenkor a hem szintézise károsodik, a gyűrűrendszerbe nem tud beépülni az oxigén szállításához
elengedhetetlenül szükséges vas(II)-ion. A vashiányos anémiára az alacsony MCV- és MCH-értékek, illetve a
vvs-ek perifériás vérkeneten látható hipokróm festődése (a csökkent Hb-tartalom miatt csökkent eozinofília)
engednek következtetni. A bélből felszívódó vasat a transzferrin transzport-plazmafehérje szállítja a csontvelőbe
és a májba, a szövetekben pedig a ferritin vaskötő fehérjéhez kötve tárolódik. Vashiány esetén csökkent plazma
vasion-koncentrációt, növekedett teljes vaskötő kapacitást (nő a plazma transzferrin-koncentrációja), és
csökkent ferritin- és transzferrin-szaturációt (az említett fehérjemolekulák kevesebb vasat kötnek) mérhetünk. A
diagnózis birtokában fontos a vashiány okának megállapítása. Az elégtelen vasbevitel mellett (fogamzáskorú
nők, illetve terhesek vasigénye fokozott!) sajnos a rejtett vérvesztés is gyakori ok, amely általában vérző
gyomor-bélrendszeri daganatok következtében lép fel, és mindig gondolni kell rá (vér kimutatása székletből,
illetve tükrözéses képalkotó vizsgálatok).
Mikrociter anémiához vezethet, ha a vaskínálat ugyan normális, de a vas nem épülhet be a hemoglobinba a
porfiringyűrű szintézisének gátlása (ólommérgezés) vagy enzimeinek genetikai károsodása (porfíriák) miatt.
Ilyenkor a csontvelői kenetben Berlini-kék festéssel gyűrűs szideroblasztok, vagyis olyan vvs-előalakok
láthatók, amelyek gyűrűsen elrendezett citoplazmai granulumaikban nagy mennyiségű vasat tárolnak. A
Hematológia
122 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
globinláncok genetikai károsodása (hemoglobinopátiák) is csökkent hemoglobin-szintézist eredményez.
Ilyenkor az alfa- vagy a béta-lánc szintézisének mennyiségi csökkenését (talasszémia) vagy hemoglobin-
variánsok (pl. HbS, sarlósejtes vérszegénység) megjelenését láthatjuk, és a diagnózishoz molekuláris biológiai
módszerekre, így a globinláncok elektroforetikus vagy kromatográfiás vizsgálatára, illetve genotipizálással
történő mutáció-keresésre is szükség lehet.
A nem hematológiai, krónikus betegségekhez társuló szekunder anémia mikrociter és normociter is lehet. A
háttérben veseelégtelenség (csökkent eritropoetin-termelés), idült gyulladások, autoimmun betegségek és
daganatok húzódhatnak meg.
Makrociter anémiára az MCV és MCH emelkedett értékei utalnak. Leggyakoribb típusa a B12-vitamin
(kobalamin) vagy folsavhiány következtében fellépő megaloblasztos vagy vészes vérszegénység. Az említett
kofaktorok hiányában az érési előalakok DNS-szintézise károsodik a timin-nukleotidok elégtelen szintézise
miatt. A csontvelői kenetben megaloblasztokat, vagyis megnagyobbodott magvú eritroid prekurzor-sejteket
láthatunk, a perifériás vérkenetben pedig kóros vvs-ek, ovális makrociták, illetve hiperszegmentált magvú
neutrofil granulociták jelennek meg. A megnagyobbodott vvs-ek féléletideje a csökkent membránstabilitás miatt
erősen csökken. A B12-hiány gyakori oka a vitamin felszívódásához elengedhetetlen intrinsic faktor hiánya. Ezt
a fehérjét a gyomor fedősejtjei termelik. A gyomor nyálkahártyájának károsodása esetén (pl. atrófiás
gyomorgyulladás), illetve intrinsic faktor ellenes autoantitestek megjelenése miatt így akkor is kialakulhat B12-
hiány, ha a táplálék kobalamin-tartalma egyébként megfelelő. Ilyenkor a parenterális (nem a tápcsatornán át,
hanem közvetlenül az érrendszerbe történő) vitaminadagolás segíthet.
Makrocitózist eredményezhetnek továbbá különböző krónikus hemolitikus kórképek, de hirtelen vérvesztés is.
Ilyenkor a csontvelő kompenzatóriukus túlműködése miatt a vvs-nél kissé nagyobb méretű retikulociták is
nagyobb számban kijutnak a perifériás vérbe (retikulocitózis).
Krónikus alkoholizmus, a máj betegségei, illetve egyes kemoterápiás szerek is makrocitózist okozhatnak.
Ilyenkor fontos a plazma folát- és B12-szintjének meghatározása a megaloblasztos anémiától való elkülönítés
miatt.
Normociter anémiával együtt járó csökkent vagy normális retikulocitaszám esetén csontvelő-vizsgálatot
érdemes végezni. Amennyiben a csontvelői kép normális, valószínűleg másodlagos anémiáról (gyulladások,
máj- vagy vesebetegség stb.) van szó.
Ha a csontvelőben a hemopoetikus sejtek száma csökkent, aplasztikus anémiáról van szó, amikor nem csak a
vvs, hanem a többi sejtvonal is károsodik, így immunhiány, fertőzésekre való hajlam és alacsony
trombocitaszám miatt vérzékenység is felléphet. Ezt a súlyos állapotot páncitopéniának nevezzük. Aplasztikus
anémia az agresszív tumorellenes kemoterápia egyik legsúlyosabb mellékhatása is lehet, hiszen a nem szelektív
kemoterápiás szerek valamennyi osztódó sejtet többé-kevésbé károsítanak.
Előfordulhat az is, hogy a csontvelő elégtelen működését egy malignus, gyorsan osztódó leukémia-klón
sejtjeinek elszaporodása okozza, amelynek következtében a normál vérképzés sejtjei fokozatosan kiszorulnak a
csontvelőből. Ugyanez figyelhető meg akkor, ha daganatos áttétek jelennek meg a csontvelőben (különösen a
tüdő, az emlő és a prosztata daganatai hajlamosak csontvelői metasztázisokat képezni).
Ha a normociter anémia emelkedett retikulocita-számmal jelentkezik, vérvesztésre vagy hemolízisre kell
gondolnunk. A hemolízist alapvetően a vörösvérsejt saját, öröklött betegségei, vagy külső, szerzett, a
vörösvérsejteket károsító faktorok okozhatják. A hemolízis laboratóriumi kimutatására számos paraméter áll
rendelkezésre. A plazma és a vizelet hemoglobin-tartalma jellemzően emelkedett, ezzel párhuzamosan csökken
a szabad haptoglobin (egy szabad hemoglobint kötő plazmafehérje) és a hemopexin (a plazma hem-kötő
fehérjéje) koncentrációja. A hemoglobin bomlásterméke, a nem konjugált bilirubin felszaporodik a plazmában,
ha a máj konjugáló kapacitását a hemolízis üteme átmenetileg meghaladja, és a vizeletben emelkedett
urobilinogén-koncentráció mérhető. A vvs-ből felszabaduló laktát-dehidrogenáz-izoformák (LDH 1 és 2)
fokozott aktivitást mutatnak a plazmában.
A veleszületett hemolitikus anémiák általában a vörösvérsejtek anyagcseréjének, citoszkeletonjának és/vagy
membránjának károsodására, illetve kóros hemoglobin-izoformák (hemoglobinopátia) expressziójára vezethetők
vissza. Közülük gyakoriságát tekintve kiemelendő a glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz okozta hemolízis, amelynek
oka abban keresendő, hogy a pentóz-foszfát-út károsodása miatt a vvs NADPH-termelése károsodott, így nem
működik a glutation-reduktáz-enzim és redukált glutation hiányában nincsen mód a reaktív oxigéntartalmú
szabadgyökök, így a hidrogén-peroxid vagy a szuperoxid semlegesítésére, amelyek a plazmamembránt
Hematológia
123 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
lipidperoxidáció révén károsítják és hemolízist okoznak (9.9. ábra). A glikolízis enzimeinek defektusai ATP-
hiány és az ozmotikus viszonyok következményes megváltozása miatt okoznak hemolízist; közülük a piruvát-
kináz hiányát észleljük leggyakrabban.
9.9. ábra - A glukóz-6-foszfát-dehidrogenáz szerepe a reaktív oxigénvegyületek
eltávolításában
A citoszkeleton, különösen a sejtváz és a membránfehérjék közötti kapcsolatért felelős fehérjék mutációi vvs-
deformitásokhoz, a jellegzetes bikonkáv alak elvesztéséhez vezetnek. A deformált vörösvérsejtek
membránjának rugalmassága csökken, a kapillárisokon nehezebben jutnak át, és a lép makrofágjai lebontják
őket, így féléletidejük erősen csökken. Az öröklött szferocitózis (gömb alakú vvs-ek) az aktin citoszkeletonhoz
kötődő spektrin génjének mutációja miatt alakul ki, a hasonló funkciót betöltő protein 4.1 mutációja pedig
elliptocitózishoz (ovális alakú vvs-ek) vezet. A paroxizmális nokturnális hemoglobinuria (PNH) hátterében
pedig a glikozil-foszfatidil-inozitol (GPI) membránhorgony szintéziséért felelős fehérjék egyikének a mutációja
áll. A különböző alaki eltéréseket és emiatt csökkent membránstabilitást mutató sejteket – szferociták,
elliptociták stb. – perifériás vérkenetből azonosíthatjuk.
A globinláncok mennyiségi, illetve minőségi eltérései (hemoglobinopátiák) már korábban bemutatásra kerültek.
A szerzett hemolitikus anémiák körébe a legváltozatosabb kórképek tartoznak, hiszen a vörösvérsejteket
fizikai, kémiai, biológiai és immunológiai behatások egyaránt károsíthatják. Így hemolízist vált ki többek között
az erős lokális hőhatás, az extrém magas vérnyomás (malignus hipertónia), a megerőltető testmozgás, az érfal
egyenetlenségei (meszes plakkok, műbillentyűk), a veseműködés beszűkülésével járó elektrolit- és metabolit-
koncentrációváltozások (hemolitikus urémiás szindróma), illetve különböző fertőzések, így a malária is, ugyanis
a malária kórokozójának bizonyos fejlődési stádiumai a vörösvérsejtben mennek végbe, ami a sejt feloldódását
eredményezi. Ezeket az intracelluláris ágenseket megfelelő festéssel láthatóvá is tehetjük. A fizikai traumák
hatására szétesett vörösvérsejt-törmelékek (fragmentociták) perifériás vérkenetben is jól láthatók.
Az autoimmun hemolitikus anémiák hátterében olyan antitestek termelése áll, amelyek a vörösvérsejt felszíni
membránfehérjéihez kötődnek, majd hemolízishez vezetnek. A membránhoz kötött antitestek jelenlétét a direkt
Coombs-teszttel (direkt antiglobulin-teszt) igazolhatjuk: a plazmához adott anti-humán globulin (AHG)
antitestek keresztkötik a vörösvérsejteken található immunglobulinokat, így a sejtek összecsapódnak
(agglutináció; 9.10. ábra).
9.10. ábra - Agglutináció
Hematológia
124 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
9.4. A fehérvérsejtek rendellenességei
A fehérvérsejtek esetében is megkülönböztetjük a sejtek számának csökkenésével vagy emelkedésével járó
kórképeket. A vvs-rendszerrel szemben azonban itt egy új, fontos betegségcsoportot is definiálnunk kell,
mégpedig a fehérvérsejtek malignus transzformációja nyomán kialakuló leukémiákat (fehérvérűség). Utóbbiakat
a betegség dinamikája és eredete szempontjából akut és krónikus, illetve mieloid és limfoid csoportokba
sorolhatjuk.
A fehérvérsejt-szám csökkenése a páncitopénia része lehet, amely anémiával és trombocitopéniával szövődő
súlyos, életveszélyes állapot. Izolált fehérvérsejtszám-csökkenés esetén általában a neutrofil granulociták száma
esik le, ami leggyakrabban vírusfertőzések és autoimmun folyamatok kapcsán látható. A limfociták számának
csökkenése (limfopénia) immunhiányos állapotokat eredményezhet. Ilyenkor érdemes megvizsgálni, hogy
szelektív vagy kombinált T- és/vagy B-sejt-hiányról van-e szó. Az öröklött immunhiányos állapotok hátterében
gyakran génmutációk okozta enzimdefektusok állnak (pl. súlyos kombinált immunhiány az adenozin-
dezamináz-enzim hibája esetén).
A fehérvérsejtek számának növekedése (leukocitózis) általában a fertőző patogénekre adott szisztémás
gyulladásos válasz része. Jellemzően az a sejttípus szaporodik fel a vérben, amely az adott patogénre adekvát
választ tud adni. Így baktériumok okozta gyulladásos állapotokban neutrofília, míg allergiás megbetegedésekben
inkább eozinofília figyelhető meg, illetve vírusos fertőzések limfocitózist eredményezhetnek. Neutrofília esetén
a perifériás kenetben nem szegmentált magvú fiatal neutrofil granulocita-előalakok, az ún. jugend
(metamielocita) és stab (pálcika magvú) formák megjelenését, illetve arányuk relatív növekedését észlelhetjük.
Ez a jelenség a balra tolt vérkép, amely a csontvelő fokozott működésének a jele. Még erősebb balra tolódás és
még korábbi előalakok (promielociták, mieloblasztok) perifériás jelenléte esetén leukemoid reakcióról
beszélünk, amely súlyos gyulladásos állapotokban látható, és a krónikus mieloid leukémiától kell elkülöníteni
(leukemoid reakció esetén nem mutatható ki genetikai eltérés, konkrétabban kromoszóma-transzlokáció).
A leukémia jellemzően klonális megbetegedés: egy fehérvérsejt genetikai állományában sorozatos mutációk
következnek be, amelyek a sejtosztódást gátló tumorszuppresszorokat (antionkogéneket) inaktiválják, a
sejtosztódást támogató proto-onkogéneket pedig még aktívabb onkogénekké transzformálják, így a malignus
klón osztódási üteme gyorsul. A genetikai változások emellett azt is eredményezhetik, hogy a sejtek rezisztenssé
válnak az apoptózissal szemben, élettartamuk megnő, viszont differenciálódási zavar következtében nem
mutatják az érett sejtekre jellemző tulajdonságokat. Rosszul differenciált daganatról beszélünk, ha a malignus
sejtek többsége korai fejlődési alakokra (blasztokra) hasonlít; a differenciálatlanság általában rosszabb
prognózist jelent, és az akut leukémiákra jellemző. Ilyenkor a malignus klón mintegy kiszorítja az ép sejteket a
csontvelőből, így a fertőzésre való hajlam növekszik, anémia és trombocitopénia léphet fel. Ezzel párhuzamosan
Hematológia
125 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
egyre több malignus sejt (blaszt) jelenik meg a perifériás vérben. A leukémia diagnózisát a teljes vérkép, a
minőségi vérkép és csontvelő-vizsgálatok, valamint immunológiai (differenciálódási markerek) és citogenetikai
vizsgálatok támasztják alá.
Akut mieloid leukémia (AML) esetén a minőségi vérkép jellegzetes, rosszul differenciált blasztos sejteket
mutat, amelyek aránya a WHO definíciója szerint legalább 20%, de nem ritkán a 80-90%-ot is elérheti, és
morfológiájuk a korai fejlődési alakokéra hasonlít. A blasztok citoplazmájában jellgzetes Auer-pálcák
figyelhetők meg, amelyek lizoszómák összeolvadásával keletkeznek és azurofil festődést mutatnak. Az érett
sejtek és az éretlen blasztok közötti átmeneti alakok hiánya is megfigyelhető, ez a jelenség az ún. leukémiás
hézag (hiatus leukaemicus). A csontvelői képre is a blasztok dominanciája a jellemző. Az AML további
altípusokba sorolható a blasztok aránya és a differenciálódás jegyei alapján, de az egyes altípusok bemutatása
meghaladja a fejezet kereteit. A WHO által ajánlott beosztás figyelembe veszi a kórkép eredetét (pl. külön
kategória a kemoterápia kapcsán fellépő AML), illetve a citogenetikai eltérések, kromoszóma-transzlokációk és
felszíni antigén-mintázat alapján is csoportosít.
Krónikus mieloid leukémiában (CML) jellemzően nagyon magas a perifériás vér fehérvérsejtszáma, a
kenetben pedig az AML-val ellentétben a granulocita differenciálódási sor csaknem valamennyi eleme
felismerhető. Nagyon jellemző, de nem általános citogenetikai eltérés a 9-es és 22-es kromoszómák
kiegyensúlyozott transzlokációja (Philadelphia-kromoszóma), amely egy konstitutívan aktív citoplazmatikus
tirozin-kináz, az őssejt malignus transzformációjáért részben felelős, folyamatos osztódási szignált továbbító
BCR-Abl fúziós fehérje létrejöttét eredményezi.
Az akut limfocitás leukémiára (ALL) a limfoid blasztos sejtek jelenléte jellemző, amelyek hovatartozását
citokémiai reakciókkal (PAS-pozitivitás), illetve immunológiai tipizálással bizonyíthatjuk. A megfelelő felszíni
CD-markerek kimutatása a T-sejtes és B-sejtes variáns elkülönítésében is nélkülözhetetlen segítséget nyújt. A
blasztokban rendszerint kimutatható a terminális dezoxinukleotid-transzferáz, egy olyan DNS-polimeráz
jelenléte, amely a limfociták receptorainak diverzitásához szükséges génátrendeződéshez nélkülözhetetlen.
A krónikus limfocitás leukémia (CLL) általában időskorban jelentkezik. A ZAP-70 protein-kináz jelenléte
vagy hiánya alapján tovább osztályozható; a ZAP-70 negatív esetekben a leukémia kevéssé agresszív fajtájáról
van szó, amely lassan progrediál és kezelés nélkül is akár több évtizedes túlélés lehetséges. A CLL-sejtek a B-
limfoid vonal leszármazottai és fluoreszcens áramlási citológiával azonosítható, jellemző B-sejtes markereket
mutatnak. Nem a CLL körébe tartozik ugyan, de itt érdemes megemlíteni az immunglobulinok túltermelésével
járó malignus plazmasejt-betegségek közül a multiplex mielómát, amelyet a csontvelő vizsgálatával (atípusos
plazmasejtek magas száma), a szérumfehérjék elektroforézisével (monoklonális gammopátia), illetve a
csontbontó oszteoklasztok aktiválódása miatt röntgenfelvételen is látható csonthiányos (litikus) területek
azonosításával lehet egyértelműen diagnosztizálni.
126 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
10. fejezet - A véralvadás laboratóriumi vizsgálata
A szöveti sérülés nyomán fellépő vérzés csillapításának céljából keletkező alvadék (trombus) megakadályozza a
további vérvesztést, ugyanakkor az is alapvető szempont, hogy ezzel egyidejűleg a sérülésmentes területeken a
folyamatos oxigén- és szubsztrátellátás fennmaradjon. A véralvadási rendszer (hemosztázis) fogalma mindazon
sejtes és szolubilis faktorok összességét jelenti, amelyek dinamikus egyensúlya messzemenőkig fenntartja a
plazma folyékony halmazállapotát, ám az érfal sérülését követően másodperceken belül megindítja a trombus
képződéséhez vezető folyamatokat. Az alvadási folyamat megfelelő keretek között tartásáért az alvadást segítő
(protrombotikus) és gátló (antitrombotikus) fehérjék, illetve sejtes elemek (vérlemezkék és endotélsejtek)
dinamikusan szabályozott összjátéka és egyensúlya szükséges. Az alvadék feloldására (trombolízis, fibrinolízis)
a sebgyógyulás keretében az érpálya újra átjárhatóságának biztosítása miatt kerül sor.
Az érfal folytonosságának megszakadását követően először reflexes érösszehúzódás (vazokonstrikció) lép fel,
amelyet a fájdalominger, illetve a sérült szövetekből és vérlemezkékből felszabaduló szerotonin és
katekolaminok váltanak ki, de hatása rövid ideig tart. Az érösszehúzódás miatt lecsökkent perfúziós nyomás és
áramlási sebesség ad lehetőséget az alvadék keletkezésére, ami a vérlemezkék aktiválódásával és a sérült
érfalhoz történő kitapadásával (celluláris fázis, eredménye a trombocitadugó (fehér trombus)) és a vérplazma
alvadási rendszerének aktiválódásával indul (koaguláció, plazmatikus fázis). Utóbbi során a vérplazmában
oldott állapotban található fibrinogén részleges proteolitikus hasításával kialakul a vér nyomásának ellenálló,
sejtes elemeket is magában foglaló stabil fibrinháló (vörös trombus). A véralvadék későbbi feloldásáért részben
fagociták, részben a plazmin és egyéb proteázok fibrinolitikus aktivitása felelős.
10.1. A vérlemezkék (trombociták) szerepe a hemosztázisban
A vérlemezkék a csontvelő megakariocitáiból lefűződéssel keletkező sejttöredékek, amelyek sejtmagot nem,
csupán kevés, az anyasejtből származó mRNS-t tartalmaznak, így új fehérjék szintézisére csak korlátozott
mértékben képesek. A perifériás vérben megközelítőleg 150-400 ezer vérlemezke található mikroliterenként.
Citoplazmájukban elektronmikroszkóppal fehérjetartalmú alfa-granulumokat és elektrodenz delta-granulumokat
(ADP, szerotonin, adrenalin) lehet megkülönböztetni, amelyek a sejtek aktivációja nyomán kiürülnek
(szekréciós tevékenység).
Az érfali sérülés nyomán a trombociták kitapadnak a sérült endotél alatti kötőszövethez (adhézió), ezzel
párhuzamosan megtörténik a sejtek aktiválódása. Az aktivált sejtek drámai alakváltozáson mennek át
(kontrakció), állábszerű nyúlványok képződése révén sejtfelszínük megnövekszik, így a sejtek képessé válnak
arra, hogy stabilan egymáshoz kötődve hálózatot alkossanak (aggregáció).
A vérlemezkék kitapadását integrin típusú transzmembrán glikoprotein-receptoraik teszik lehetővé, amelyek a
sérült érfali kötőszövet kollagén, laminin és fibronektin rostjaira specifikusak, azonban ezek a kölcsönhatások
meglehetősen gyengék. A stabil kötődés kialakításához egy nagy molekulatömegű plazmafehérjére, a von
Willebrand-faktorra (vWF) is szükség van, amely egyidejűleg az érfali kollagénrostokhoz és a trombociták
vWF-receptorához (glikoprotein Ib) kötődve nagyságrendekkel növeli a kapcsolat erősségét (10.1. ábra). A
vWF-t az endotélsejtek és a megakariociták multimer formában, nagy fehérje-aggregátumként szekretálják a
keringésbe, amely a plazmában a VIII-as alvadási faktort köti és stabilizálja. A fehérjekomplex az érsérülések
környékén fellépő hemodinamikai nyíróerők hatására szétesik és a monomer vWF a leírtaknak megfelelően
adhéziós adapterként működik.
10.1. ábra - A fehér trombus létrejötte
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
127 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kitapadt trombociták ADP-t és tromboxán A2-t szekretálnak, ezzel további vérlemezkéket aktiválnak,
amelyek aggregálódva fehér trombust hoznak létre. A sejt-sejt kapcsolat kialakulásáért bizonyos sejtfelszíni
integrinek (glikoprotein IIb és IIIa) mellett a fibrinogén plazmafehérje felelős (10.1. ábra).
Az aktivált trombociták membránjának foszfolipid-kettősrétegében jellegzetes változás figyelhető meg: a
negatív töltésű foszfatidil-szerin-molekulák a külső rétegbe helyeződnek át. Így keletkezik az ún. aktivált
membránfelszín, amely kalciumionokat és azokon keresztül bizonyos alvadási fehérjéket (gamma-karboxilált
faktorokat, lásd később) magas lokális koncentrációban köt magához, elősegítve a plazmatikus fázis elindulását.
A trombociták aktiválódása és kitapadása természetesen csak az érfali sérülés területén kívánatos. Az ép
endotélsejtekkel borított felszín gátolja a vérlemezkék aktiválódását, mert az endotél elfedi a trombogén
kollagénrostokat, illetve prosztaciklint és nitrogén-monoxidot (NO) termel, amelyek a vérlemezke-aktiváció
hatékony gátlószerei.
Az endotél védő funkciói az érfal megbetegedései – elsősorban az érelmeszesedés –, illetve oxidatív stressz,
magas vérnyomás, a lipoprotein-anyagcsere károsodása miatt kieshetnek, amelynek artériás trombózis,
szívinfarktus és agyi infarktus (stroke) lehet a következménye. A klinikai gyakorlatban a vérlemezkék
aggregációját általában acetil-szalicilsavval (aszpirin) próbálják gátolni; ez a vegyület a trombocita tromboxán-
szintéziséért felelős enzimet irreverzibilisen bénítja. 2008-ban a második legnagyobb forgalmat hozó gyógyszer
a világon egy másik trombocita-aggregáció-gátlószer volt, a klopidogrel, amely az ADP-receptor gátlásán
keresztül fejti ki a hatását.
10.2. A véralvadás szerin-proteáz-rendszere és annak szabályozása
Az alvadási faktorok túlnyomó részét a máj termeli és inaktív proenzim (zimogén) formában a plazmába
szekretálja. Szöveti sérülés hatására beindul a véralvadási proteolitikus kaszkád, az egyes faktorok egymást
hasítva hozzák létre a katalitikusan aktív proteázokat, végül sor kerül a protrombin aktiválására, amely a vízben
jól oldódó fibrinogénből oldhatatlan fibrint képez. A fibrin monomerek spontán polimerizációjával, majd
kovalens keresztkötésével kialakul a stabil fibrinháló, a vörös trombus alapja. Az aktív proteázok általában egy
diszulfidhíddal összekötött két polipeptidláncból állnak, katalitikus centrumuk a C-terminális közelében
található.
10.2. ábra - Gla-kalcium-foszfatidil-szerin kapcsolat
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
128 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az alvadási folyamat jellegzetessége a felületi katalízis, vagyis több alvadási faktor egyidejűleg kötődik az
aktivált trombocita felszínéhez, így egy olyan multienzim komplex alakul ki, ahol a lokálisan magas
faktorkoncentráció miatt a proteolitikus hasítás kiemelkedően nagy hatékonysággal mehet végbe. A
trombocitamembránhoz történő kitapadás a fehérjék gamma-karboxi-glutamátban (Gla) gazdag doménjén
keresztül történik; a negatív töltésű Gla-oldallánc kelátkomplexet képez a véralvadáshoz épp emiatt
elengedhetetlenül szükséges kalciumionokkal, amelyek egyidejűleg a membrán külső rétegébe kihelyezett
negatív töltésű foszfatidil-szerin molekulákkal létesítenek kapcsolatot (10.2. ábra). Az alvadási kaszkád és a
trombocita-aktiváció között tehát szoros és kölcsönös egymásrautaltság van – a vérlemezkék aktív felszínt
nyújtanak, a trombin viszont az egyik legfontosabb aktivátoruk –, ami hozzájárul a vérzéscsillapítás gyors és a
sérülés helyére korlátozódó lezajlásához.
A megfelelő glutamát-oldalláncok gamma-karboxilációja a májsejtek endoplazmás retikulumának lumenében,
K-vitamin-függő poszttranszlációs módosítással történik (K-vitamin-ciklus). Az alvadási proteázok közül a
protrombin, továbbá a VII-es, a IX-es és a X-es faktorok gamma-karboxilálódnak. Érdekes módon az alvadási
folyamat ellen ható protein C és protein S fehérjék is tartalmaznak Gla-aminosavat. A K-vitamin-ciklus egyik
enzime K-vitamin-antagonistákkal (kumarinszármazékok, warfarin) gátolható, amelyek óriási gyógyászati
jelentőséggel bírnak a tromboembóliás kórképek kezelése, illetve megelőzése szempontjából (10.3. ábra).
10.3. ábra - K-vitamin és warfarin
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
129 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A trombociták aktiválódásához hasonlóan az alvadási kaszkádnak is az érfal folytonosságának megszakadása a
közvetlen kiváltó oka. Az érpályából kilépő vérplazma kapcsolatba kerül a szöveti faktorral (tissue factor, TF, a
VII-es faktor receptora és kofaktora), egy olyan sejtfelszíni glikoproteinnel, amely a vérplazmával közvetlenül
nem érintkező valamennyi magvas sejt felszínén megtalálható, és beindítja az ún. szöveti faktor aktiválta
(régebben: extrinsic) alvadási folyamatot. Először is kialakul egy kalcium- és Gla-függő multiprotein komplex
az aktivált membrán, a hozzá kötődő aktív VII-es faktor (VIIa) és az inaktív X-es faktor, valamint a TF
részvételével (régebben extrinsic tenáz komplexnek nevezték). Ebben a mikrokompartimentumban a VIIa
katalitikus aktivitását a TF jelenléte hét nagyságrenddel (!) fokozza, így a X-es faktor aktiválása másodpercek
alatt végbemegy. A VIIa és a TF egyidejűleg, hasonló mechanizmussal a IX-es faktort is aktiválhatja, utóbbi
aktivált VIII-as faktor jelenlétében, szintén egy kelátkomplexen keresztül aktiválhatja a X-es faktort („intrinsic
tenáz”), vagyis a VIIa a X-es faktort közvetlenül és közvetve is aktiválhatja (10.4. ábra).
10.4. ábra - A véralvadási kaszkád
Az aktivált X-es faktor legfontosabb feladata a protrombinnak az ún. protrombináz komplex keretén belül
történő proteolitikus aktiválása. Ebben a membrán-, kalciumion- és Gla-függő reakcióban az aktivált X-es faktor
enzimként, a protrombin inaktív zimogénje szubsztrátként, míg a két fehérjéhez szorosan kötődő aktivált V-ös
faktor egy hatékony katalizátorként vesz részt, amely a hasítási reakció sebességét öt nagyságrenddel fokozza
(10.4. ábra).
Az aktív trombin nemcsak az alvadási fázis végső lépését, a fibrin képződését katalizálja (lásd később), hanem
pozitív visszacsatolások segítségével fokozza saját aktiválódásának sebességét. Többek között hasítással
aktiválja az V-ös és a VIII-as alvadási faktorokat, amelyek ugyan nem proteázok, viszont fehérje-fehérje
kölcsönhatások révén meggyorsítják az alvadási folyamatot, amint az a fentiekből már kiderült. Ezen túlmenően
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
130 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a trombin a XI-es faktort is aktiválja, amely a IX-es faktort hasítja. Az elmondottakat összefoglalva, az alvadási
kaszkád szöveti sérülés hatására kezdetben nagyon alacsony intenzitással, kis mennyiségű trombin
keletkezésével indul (kezdeti fázis), majd a trombin az V-ös, VIII-as, XI-es faktorok hasítása révén saját
képződésének sebességét drámai mértékben fokozza (önerősítő fázis).
A XII-es faktor a régi tankönyvekben még az érfalon belüli (intrinsic) alvadási útvonal iniciátoraként szerepelt,
azonban az újabb kutatások nyomán kiderült, hogy in vivo gyakorlatilag nem játszik szerepet a véralvadásban,
hiszen aktiválódása lassú, hosszú perceket igénylő folyamat, illetve az alvadási rendszer aktiválásán kívül a
fibrinolízist is elindíthatja. A XII-es faktor ún. kontakt aktiválásában a sérült érfal negatív tötésű kollagénrostjai
mellett két plazmafehérje, a nagy molekulatömegű kininogén és a kallikrein proteáz is részt vesz.
Az aktív trombin elsődleges feladata a fibrinogén vízben oldhatatlan fibrinné történő alakítása (10.4. ábra). A
fibrinogén a plazma legmagasabb koncentrációban jelen lévő alvadási faktora, egy hat polipeptidláncból (két-két
alfa-, béta- és gamma-lánc) álló glikoprotein (10.5. ábra).
10.5. ábra - A fibrinogén
Az alfa és béta-láncok N-terminális peptidjeit fibrinopeptid A-nak illetve B-nek nevezzük; ezeket képes a
trombin lehasítani, majd a létrejövő konformációváltozás nyomán kialakul a plazmában oldhatatlan fibrin
monomer. A fibrin monomerek hidrogénkötések révén dimereket hoznak létre, amelyek polimerizálódva hosszú
láncokat alkotnak. Végül egy térhálós szerkezet, az ún. nem-kovalens fibrin polimer jön létre, amelynek
mechanikai stabilitása még kicsi, a vér nyomásának nem áll ellen, ezért tovább szilárdítani szükséges. Ezt a
feladatot a fibrin-stabilizáló vagy XIII-as faktor (Laki-Lóránd-faktor) látja el, amelyet a trombin proteolitikusan
aktivál, és transzglutamináz-aktivitása révén a fibrin monomerek között kovalens keresztkötéseket létesít. Így
alakul ki a nagy mechanikai szilárdságú, mégis rugalmas kovalens fibrin polimer, amely trombocitákat és
vörösvértesteket magába zárva a vérzés csillapításának definitív megoldását adja (vörös trombus).
10.3. A trombinaktivitás kontrollja
A trombin és általában az alvadási kaszkád szerin-proteázainak aktivitását szigorúan szabályozni kell, hiszen az
alvadás folyamatának a sérülés helyére kell korlátozódnia; életveszélyes helyzetet teremtene, ha az ép endotéllel
borított érszakaszokon is vérrögök keletkeznének. Ezt a feladatot a vérplazma szerin-proteáz-inhibitorai
(serpin), illetve a protein C/protein S-rendszer látja el.
10.3.10.3.1. Plazma proteáz-inhibitorok
A plazma proteáz-inhibitorait az alvadási faktorokhoz hasonlóan döntően a májsejtek termelik. Funkcionálisan
két csoportjuk különíthető el; a pszeudoszubsztrát típusú és a sztérikus gátlófehérjék; utóbbiak közül az α2-
makroglobulin a legfontosabb. Ez a több alegységből álló fehérje kosárszerűen körülveszi és természetes
szubsztrátfehérjéitől elszigeteli a szerin-proteázokat. Az α2-makroglobulin egy nem specifikus gátlófehérje,
amely a véralvadás szerin-proteázain kívül a fibrinolízis enzimeit is hatékonyan gátolni képes.
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
131 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A pszeudoszubsztrát típusú gátlófehérjékben található ún. reaktív hurok egy olyan peptidkötést tartalmaz,
amelyet a szerin-proteáz felismer és megköt, de hidrolizálni már nem képes. Az így keletkező inaktív enzim-
inhibitor-komplexet a máj Kupffer-sejtjei veszik fel a keringésből, majd lebontják. A család tagjai közül az
antitrombin (antitrombin III) a legismertebb. Ez az inhibitor az alvadási proteázok széles skáláját gátolhatja
(trombin, Xa, IXa stb.).
Az antitrombin affinitása nagyon alacsony a trombin iránt, azonban heparin katalizátor jelenlétében
nagyságrendekkel megnő. A heparin egy erősen negatív töltésű heteroglikán, amelyet a hízósejtek termelnek és
a szövetközti térbe juttatják, azonban heparán-szulfátként az endotélsejtek felszínén is megtalálható. A heparin
megkönnyíti a trombin-antitrombin komplex kialakulását, amelynek kiemelkedő stabilitása a heparin jelenlétét
már nem igényli, így a heparin ledisszociál és újabb gátló komplexek képződését katalizálhatja (10.6. ábra). A
heparin az alvadásgátló kezelés egyik legfontosabb pillére; a K-vitamin-antagonistákkal szemben hatását
azonnal képes kifejteni, és esetleges túladagolása esetén hatása a hatékony antagonistája (protamin) adása révén
nagyon gyorsan felfüggeszthető. A heparin az antitrombin mellett egy további serpin, a heparin-kofaktor II
működéséhez is nélkülözhetetlen.
10.6. ábra - A heparin hatásmechanizmusa.
A heparinkezelés hatástalansága esetén veleszületett antitrombin-hiányra (familiáris trombofília) kell gondolni
(a heparin csak az antitrombin trombinkötő affinitásának fokozása révén képes hatását kifejteni). Ilyenkor az ún.
direkt trombin-inhibitorok (DTI) nyújthatnak segítséget. Természetes alapvegyületük a hirudin, az orvosi pióca
(Hirudo medicinalis) nyálmirigyében termelődő rövid fehérje, amelynek térszerkezete a fibrinogénre hasonlít,
így egyszerre kötődhet a trombin felszíni fibrinogénkötő helyéhez, illetve aktív centrumához, azonban
pszeudoszubsztrát lévén nem hasítható
10.3.10.3.2. A protein C/protein S-rendszer
Az ép endotél luminális membránja a trombomodulin nevű transzmembrán fehérjét tartalmazza, amelynek
extracelluláris szakasza nagy affinitással köti a véráram révén az ép endotéllel borított területekre sodródott
trombint. A trombomodulinhoz kötött trombin szubsztrátspecificitása drámai változáson megy keresztül. Míg a
szabad trombin a fibrinogént hasítani és az V-ös, VIII-as, XI-es és XIII-as faktorokat aktiválni képes, addig a
kötött trombin ezeket a protrombotikus funkcióit nem tudja betölteni, ellenben hasítani és aktiválni képes az
endotélfelszín endoteliális protein C-receptorához (EPCR) kötődő protein C-t. Az aktivált protein C (aPC) és
segédfehérjéje, a proteolitikus aktiválást nem igénylő protein S gamma-karboxilált faktorok, így kifejezetten
stabil membránkötött komplexet alkothatnak az aktivált V-ös vagy VIII-as faktorral, amelyeket az aPC
peptidkötések hasítása révén inaktivál (Vi és VIIIi). Az Va faktorban három darab aPC hasítási hely található. A
középső és legfontosabb hasítási helyet az 506-os helyzetű arginin karboxilcsoportja által képzett peptidkötés
alkotja. A két szélső hasítási helyen történő proteolízis előfeltétele, hogy az aPC az 506-os arginin melletti
peptidkötést elhasítsa. Ha a Leiden-mutációnak is nevezett G → A misszensz pontmutáció nyomán ezt a kritikus
arginin aminosavat egy glutamin helyettesíti, az Va faktor inaktiválódása nem történik meg, ami a véralvadás
egyensúlyának a trombózis irányába történő eltolódását eredményezi és más rizikófaktorok egyidejű fennállása
esetén (pl. dohányzás, orális fogamzásgátlók szedése) súlyos trombotikus szövődményekhez vezethet (lásd 2.
fejezet). Ez az aktivált protein C-rezisztenciának nevezett állapot a leggyakoribb öröklött trombofília, a hibás
allélt a kaukázusi populáció mintegy 15%-a hordozza. A trombomodulin, az EPCR és a protein S jóval
ritkábban fellépő mutációi hasonló klinikai képet hozhatnak létre.
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
132 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
10.4. A véralvadék feloldása
Amint a trombus betöltötte biológiai szerepét, a sebgyógyulással párhuzamosan szükség van a helyreállított
érszakasz újra átjárhatóságának biztosítására, vagyis az alvadék feloldására, amit trombolízisnek nevezünk, de a
biokémiai szakirodalom a fibrinháló enzimatikus feloldására utalva a fibrinolízis kifejezést részesíti előnyben.
Ebben a folyamatban sejtes elemek (fagociták) és proteázok (elasztáz, metalloproteázok, plazmin) egyaránt részt
vesznek, de a plazmin minden tekintetben kitüntetett szerepet játszik.
A plazmin a fibrin molekulákat a D és E domének között található régióban hasítja (monomerenként tehát
összesen két helyen; 10.5. ábra). Amennyiben a frissen képződött fibrinháló viszonylag korán lebomlik, vagyis
kovalens keresztkötéseket még nem tartalmazott, akkor 2:1 arányban keletkeznek a D és E fibrin monomer
lebomlási termékek (FDP, fibrin degradation products). Ha idősebb, a XIII-as faktor révén keresztkötött fibrint
bont a plazmin, akkor a folyamat a merevebb, zártabb szubsztrát miatt egyrészt lassabban megy végbe, másrészt
a keresztkötések számától függően egyre magasabb arányban kapunk izopeptid-kötéssel összekötött ún, D2-
dimereket (10.7. ábra). A D2/D arány meghatározásának szív- és egyéb infarktusok esetében klinikai jelentősége
van; minél magasabb ez az érték, annál lassabban megy végbe a trombus feloldása, vagyis a beteg kilátásai
annál rosszabbak.
10.7. ábra -
A szerin-proteázok csoportjába tartozó plazmin inaktív zimogénje a plazminogén. A plazminogén proteolitikus
aktiválását a szöveti típusú (tPA), illetve urokináz típusú (uPA) plazminogén-aktivátorok katalizálhatják. A tPA
csak kofaktorok jelenlétében tudja a plazminogént hatékonyan aktiválni. A tPA legfontosabb segédfehérjéje
maga a fibrin, vagyis a fibrinháló a saját lebomlását elő tudja segíteni.
A rekombináns technológiával előállított plazminogén-aktivátorokat az orvosi gyakorlatban vérrögök
feloldására használják. Nyilvánvalóan a tPA használata mellett szól, hogy a fibrin felszínén aktiválja a
plazminogént, vagyis azon a helyen, ahol a fibrinolízisnek történnie kell; uPA használatával ezt kevésbé
célzottan tudjuk biztosítani.
Ahogy az alvadási, úgy a fibrinolitikus kaszkád is szigorú szabályzás alatt áll, amelynek két lényeges szintjét
lehet megkülönböztetni: (i) az uPA és a tPA gátlása plazminogén-aktivátor-inhibitor-1 és -2 (PAI-1/2)
segítségével; (ii) az aktív plazmin gátlása α2-plazmin inhibitorral (α2-antiplazminnal) vagy α2-makroglobulinnal
(10.8. ábra).
10.8. ábra - A fibrinolítikus rendszer szabályozása
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
133 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
10.5. A véralvadás legfontosabb zavarai és azok laboratóriumi vizsgálata
A keringésben folyamatosan jelen lévő alvadási és alvadást gátló mechanizmusok finom egyensúlyának
eltolódása egyrészt fokozott alvadékonyságot, artériás és vénás trombó-zist, másrészt vérzékenységet
eredményezhet. A klinikai gyakorlatban a trombózisok (infarktus, embólia) a vérzéses komplikációknál jóval
gyakrabban fordulnak elő, ugya-nakkor diagnózisukban a laboratóriumi módszerek a képalkotó eljárásokhoz
képest (érfestés, szcintigráfia, MRI) alárendelt szerepet játszanak. A vérzékenységgel járó állapotok, illetve a
véralvadás gyógyszeres gátlása (warfarin, heparin) kifinomult klinikai kémiai tesztekkel diagnosztizálhatók,
illetve nyomon követhetők.
10.5.10.5.1. A vérlemezkék rendellenességei és vizsgálatuk
A vérlemezkék mennyiségi vagy minőségi eltérései általában kisebb kiterjedésű bőr alatti bevérzések
formájában jelentkeznek.
A vérlemezkék csökkent száma (trombocitopénia) csontvelő-elégtelenség, vagy elsősorban autoimmun
folyamatok következtében fellépő fokozott vérlemezke-pusztulás számlájára írható. Az eltérés alvadásgátolt
teljes vérből, hematológiai automaták segítségével mutatható ki; a megakariociták csontvelő-aspirátumból vagy
csípőlapát-biopsziával nyert csontvelő-szövetből, megfelelő festési eljárásokkal vizsgálhatók.
Trombocitopátia esetén a vérlemezkék koncentrációja normális, azonban funkciójuk károsodott. Az okok között
elsősorban a von Willebrand-faktor, illetve a sejtfelszíni adhéziós glikoproteinek csökkent expressziója vagy
hiánya említendő, de a vérlemezke jelátviteli útjai, granulumai, vagy azok kiürítése is károsodhat. A
trombocitopátiák elkülönítése komoly differenciáldiagnosztikai feladat, amelynek részletes ismertetése
meghaladja a fejezet kereteit, ezért csak az adhéziós és az aggregációs zavarok egymástól való elkülönítését
tárgyaljuk.
A trombocita-adhézió zavarai úgy mutathatók ki, hogy az alvadásgátolt vérmintát üveggyapottal töltött csövön
engedik át. Az ép trombociták döntő többsége ilyenkor kikötődik a negatív felszínhez, míg von Willebrand-
faktor vagy a glikoprotein Ib hiányában a kitapadás mértéke erősen csökken. Az aggregáció zavarait egyszerű
fotometriás vizsgálattal is kimutathatjuk; ilyenkor ún. trombocitadús plazmára van szükség, amelyet teljes
vérből alacsony fordulatszámon (200 g) való centrifugálással lehet előállítani. Ilyen körülmények között a
nagyobb tömegű vörös- és fehérvérsejtek kiülepednek, de a trombocita-frakció döntő része a plazmában marad.
Az aggregációt a küvettába pipettázott ADP-vel, adrenalinnal vagy risztocetinnel (egy antibiotikum) lehet
indukálni (10.9. ábra). Az összecsapódott vérlemezkék gyorsan kiülepednek, így a szuszpenzió fényelnyelése ép
aggregáció esetén gyorsan és kifejezetten csökken. Aggregációs vizsgálatok teljes vérből is végezhetők.
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
134 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
10.9. ábra - Összecsapzódott vérlemezkék
10.6. A plazmatikus fázis (alvadási kaszkád) zavarai (koagulopátiák) és kimutatásuk
Az alvadás zavarai egyrészt fokozott, másrészt csökkent alvadékonyságban nyilvánulhatnak meg. Előbbit az
alvadási faktorok, elsősorban a fibrinogén túltermelése vagy az alvadási kaszkád inhibitorainak csökkent vagy
hiányzó expressziója okozhatja. A kórosan csökkent alvadás (vérzékenység, hemofília) pedig épp ellenkezőleg
az alvadási faktorok genetikai mutációk következtében fellépő hiányának vagy funkcionális károsodásának
köszönhető. Utóbbit leggyakrabban a K-vitamin hiánya okozza, ami elégtelen bevitel, felszívódási zavar vagy
warfarin-kezelés következménye lehet. Mivel zsíroldékony vitaminról van szó, a zsíremésztés és –felszívódás
zavarai állhatnak a hátterében, amelyek gyakori oka az epeutak epekő vagy tumorok okozta, sárgaságot is okozó
elzáródása. A K-vitamin-antagonista gyógyszerek rossz beállításból adódó túladagolása életet fenyegető
vérzéseket eredményezhet. Általános alultápláltság, fehérjehiányos állapotok, illetve az alvadási faktorokat
szintetizáló máj betegségei (alkoholos vagy vírusos májgyulladás, májelégtelenség) is okozhatnak alvadási
zavarokat.
10.6.10.6.1. A vérzékenység differenciáldiagnosztikája
A vérzékenység általában belső szervi vérzések, véres vizelet vagy széklet, illetve ízületi bevérzések formájában
jelentkezik. Az eltérés hátterének kimutatására in vitro alvadási módszereket dolgoztak ki, amelyek segítségével
a szöveti faktor indukálta extrinsic út és a kontakt aktiváláson alapuló intrinsic mechanizmus, valamint a végső
közös út elkülönítve vizsgálható. Az alvadási tesztek közös jellemzője, hogy nem a teljes vér, hanem a
sejtmentes plazma alvadási idejét vizsgálják, így pontosabb információ nyerhető az egyes alvadási faktorok
jelenlétéről és aktivitásáról.
ELISA-módszerrel (enzyme-linked immunosorbent assay), illetve mesterséges kro-mogén szubsztrátok
alkalmazásával lehetőség van az egyes alvadási faktorok plazmaszintjének, illetve aktivitásának közvetlen
meghatározására is.
10.6.10.6.1.10.6.1.1. Protrombin-idő (PI; Quick-teszt)
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
135 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Ez a leggyakrabban használatos alvadási eljárás az extrinsic és a végső közös út faktorainak együttes aktivitását
méri plazmamintából, vagyis a VII-es, X-es és V-ös faktorok, valamint a protrombin és a fibrinogén szintjéről
nyújt információt (10.10. ábra).
10.10. ábra - A protrombin idő által jellemzett véralvadási komponensek.
A vérvétel nátrium-citrátot tartalmazó vákuumcsőbe történik. A Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) és a WHO ajánlása szerint csak 3,2%-os = 109 mmol/l-es citrátos cső javasolt mintavételre, mert a
3,8%-os csőnél <80% csőtöltöttségnél szignifikáns eltérések mutatkoztak a PI-eredményekben. A szerves
anionok oldhatatlan csapadékot képeznek a plazma kalciumionjaival, így az alvadás nem indulhat be. A
laboratóriumban a vérmintát magas fordulatszámon lecentrifugálják (1500 g), így az alakos elemek kiülepednek.
Az áttetsző felülúszót elkülönítik, ez az ún. dekalcinált plazma, amelyhez szöveti faktort, foszfolipideket és
kalciumionokat kell adni, hogy az extrinsic alvadási út beinduljon. A szöveti faktort rekombináns módszerrel
nyerik, vagy állati eredetű szövetek homogenizálásával (agy, tüdő, placenta) készítik. Utóbbi esetben
foszfolipidek hozzáadására nincsen szükség, hiszen a szövetek nagy mennyiségű membránt tartalmaznak. A
szöveti faktort tartalmazó homogenizátumot szöveti tromboplasztinnak is nevezik.
A reakciót 37 °C-ra előmelegített dekalcinált plazma, kalcium és szöveti tromboplasz-tin összekeverésével
indítjuk; protrombin-időnek nevezzük a reakció kezdete és a fibrin megjelenése közötti időt, amelynek
referencia értéke az alkalmazott reagenstől és detektálási módszertől függően 10 és 14 másodperc között
változik. A hagyományos eljárás keretében kémcsőreakciót végzünk, egy hajlított végű üvegbotot mozgatunk a
plazmában, a reakció végpontját az első kihúzható fibrinszál megjelenése jelzi (az alvadási reakció végső fázisa
a pozitív visszacsatolások miatt annyira gyors lefolyású, hogy fibrinszál helyett gyakran az oldat gélesedését
észleljük). Ezt a módszert egy nagy kórházi laboratórium több száz vérmintáján bajos lenne kivitelezni, ezért
fejlesztették ki a koagulométereket, amelyek a plazma viszkozitásának mérésén vagy optikai elven működnek.
Előbbiek esetében egy kis mágnesezhető acélgolyó mozog a reakcióelegyben. A fibrinláncok képződésekor az
oldat viszkozitása ugrásszerűen megnő, ennek következtében a golyó sebessége ezzel arányosan lassul. Az
optikai koagulométerek tulajdonképpen fotométerek, amelyek folyamatosan követik a reakcióelegy
fényelnyelését (fényszórását), ami a fibrinpolimerizáció megindulásakor hirtelen növekedést mutat.
A kereskedelemi forgalomban kapható készítmények nagyon különböző hatékonyságúak lehetnek; az
eredmények összehasonlítása érdekében az egyszerű protrombin-idő (PI) helyett az INR-értéket (international
normalized ratio) célszerű megadni, amely a következő képlet alapján számolandó: INR = PRISI, ahol a PR
(protrombin-ráta) a vizsgált vérminta protrombin-idejének és a legalább húsz egészséges, alvadási zavarban nem
szenvedő donor poolozott plazmájának összeöntésével kapott kontroll plazma protrombin-idejének hányadosa.
A hatványkitevő ISI-érték (international sensitivity index) az általunk aktuálisan használt tromboplasztin-
preparátum érzékenységét fejezi ki az Egészségügyi Világszervezet (WHO) által referenciaként használt
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
136 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
standard preparátuméhoz viszonyítva. Mivel a jelenleg kereskedelmi forgalomban kapható állati eredetű
tromboplasztinok hatékonysága a standardénál kisebb, ezért ISI-értékük jellemzően egynél nagyobb érték.
Az alvadásgátlókkal kezelt beteg INR-célértékét az adott betegség befolyásolja, de jellemzően a 2,0 és 3,5
közötti tartományban mozog.
A protrombin-idő meghatározására leggyakrabban az orális antikoagulánsokkal (K-vitamin-antagonistákkal)
kezelt betegek alvadási státuszának nyomon követése, a gyógyszer dózisának pontos beállítása érdekében kerül
sor, ugyanis az extrinsic alvadási út a gamma-karboxilált faktorok közül hármat (protrombin, VII, X) tartalmaz.
A K-vitamin-antagonista dózisának növelése értelemszerűen a PI megnyúlását eredményezi.
10.6.10.6.1.10.6.1.2. Aktivált parciális tromboplasztin-idő (aPTI)
Ez az eljárás az intrinsic alvadási mechanizmus vizsgálatára alkalmas. A klinikai gyakorlatban a hemofíliák
differenciáldiagnosztikájában, illetve a nem frakcionált heparinnal történő antikoaguláns kezelés
hatékonyságának monitorozására alkalmazzák.
A klasszikus hemofíliák esetén hiányzó alvadási fehérjék (VIII-as faktor hiánya – hemofília A; IX-es faktor
hiánya – hemofília B, XI-es faktor hiánya – hemofília C; V-ös faktor hiánya – parahemofília) az intrinsic, illetve
a közös út elemei, így az aPTI megnyúlását okozzák (10.4. ábra).
Az aPTI elnevezésében az aktivált jelző arra utal, hogy negatív felszíni töltésű kaolinnal (alumíniumtartalmú
ásvány, a porcelángyártás alapanyaga) gyorsítjuk fel a kontakt aktiválás folyamatát; a kaolin itt a sérült érfal
kollagénrostjait helyettesíti. A „parciális tromboplasztin” pedig abban különbözik a PI meghatározásakor
használt szöveti tromboplasztintól, hogy csak foszfolipidet (kefalint, vagyis foszfatidil-etanolamint) tartalmaz,
szöveti faktor viszont nincsen benne, hiszen az az extrinsic utat is aktiválná.
Az eljárás kivitelezése és a reakció detektálása nagyon hasonlít a PI-nél leírtakhoz; a dekalcinált, előmelegített
plazmához kaolint és kefalint, majd kalciumot keverve koagulométer segítségével mérjük a fibrin képződéséig
eltelt időt. Lényeges, hogy a plazma és az aPTI-reagens (kaolin és kefalin keveréke) összekeverése után
kétperces előinkubálást végezzünk, hogy a kontakt aktiváló komplex (fXII, fXI, kininogén, prekallikrein)
kialakulhasson, s a kalcium-klorid oldatot csak ezt követően adjuk a reakcióelegyhez.
Az aPTI referencia-tartománya az alkalmazott reagensektől függően 22 és 40 mp között változik.
A PI és az aPTI eredményeinek összevetésével számos koagulopátia felismerhető. Ha a PI megnyúlt, de az aPTI
normális, a VII-es faktor hiányára (vagy az azt blokkoló antitestek jelenlétére) következtethetünk, hiszen a
közös út enzimei az aPTI-ből adódóan jól működnek. Fordított helyzetben (normális PI, kórosan hosszú aPTI),
akkor a XI-es, IX-es vagy VIII-as faktorok hiánya jöhet szóba (a XII-es faktor, a kininogén vagy a kallikrein
hiánya klinikai vérzékenységgel nem jár, mert az intrinsic út alárendelt szerepet játszik a véralvadásban). A
három faktorhiányos állapot elkülönítése úgy történik, hogy a vizsgált plazmamintához ismert faktorhiányos
plazmát keverünk, és azt vizsgáljuk, hogy ennek hatására a vizsgált plazma aPTI-je normalizálódik-e. Pl. ha a
megnyúlt aPTI-jű plazmához ismert VIII-as faktor hiányos plazmát keverünk, és ennek hatására az aPTI nem
normalizálódik, akkor valószínűleg a vizsgált plazma is VIII-as faktor hiányos volt. Rekombináns faktor
hozzáadásával normalizálódó aPTI a hozzáadott faktor hiányát támasztja alá a vizsgált mintában. Kvantitatív
faktormeghatározásra PI vagy APTI alapú funkcionális tesztet vagy kromogén tesztet használunk megfelelő
kalibrációt követően.
Egy másik lehetőség a faktorhiány ELISA-val vagy kromogén szubsztrát segítségével történő kimutatása. Az
első esetben faktorspecifikus antitestet használunk, utóbbiban olyan mesterséges szubsztrátot, amelyet
specifikusan az adott alvadási proteáz hasít és a keletkező színes terméket fotometriával határozzuk meg.
Amennyiben mindkét alvadási teszt kóros eredményt ad, a közös út faktorainak (X, V, II, fibrinogén) defektusa
vagy gyógyszeres gátlása (warfarin és heparin a protrombint és a X-es faktort gátolják), esetleg a keletkező
fibrin túlzott ütemű lebontása (hiperfibrinolízis) állhat a háttérben. Ez utóbbi eshetőséget az euglobulin-lízis idő
meghatározásával lehet megerősíteni vagy kizárni.
10.6.10.6.1.10.6.1.3. A fibrinolízis sebességének meghatározása
Az euglobulin-lízis idő a fibrinolitikus rendszer aktivitásáról tájékoztat. Lényege, hogy a nátrium-citráttal
dekalcinált plazmát ecetsavval keverik össze és jégen inkubálják, majd centrifugálással leválasztják a
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
137 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
kicsapódott plazmafehérjéket. A csapadék a plazma ún. euglobulin frakciója, amely az alvadási proteázok
mellett döntően plazminogént, plazminogén-aktivátorokat és fibrinogént tartalmaz. A csapadékot ezt követően
borátpufferben visszaoldják, majd kalcium-klorid-oldat hozzáadása nyomán rövid idő alatt megtörténik a
fibrinképződés, ezzel párhuzamosan a fibrinolízis is beindul. A fibrin feloldódását régen hagyományos
módszerrel, az alvadék 10-15 percenként történő megtekintésével követték, manapság spektrofotométerrel
mérjük az optikai denzitás változását. Az alvadék feloldódásának normál ideje kb. 120-140 perc.
Hiperfibrinolízis esetén ez az érték akár 15 perc is lehet.
Egy további alkalmas eljárás az ún. fibrinháló-oldási idő. Ebben az esetben egy Petri-csészében fibrinhálót
állítunk elő fibrinogén és trombin összekeverésével. A megszilárdult fibrinlemezre a visszaoldott euglobulin-
frakcióból pipettázunk, majd 37 °C-on való inkubálás után meghatározzuk a litikus folt méretét, amely a
fibrinolízis sebességével arányos.
10.6.10.6.1.10.6.1.4. A trombinidő mérése
Ha a fenti tesztekkel a hiperfibrinolízis eshetőségét kizártuk, érdemes a trombinidőt meghatározni. Dekalcinált
plazmához nagy feleslegben aktív trombint adunk és üvegbottal vagy koagulométerrel meghatározzuk a
fibrinképződés idejét. Ekkor az alvadási idő kizárólag a fibrinogén mennyiségétől függ. Alacsony plazma
fibrinogénszint vagy diszfibrinogénémia esetén (kóros, nem funkcionális fibrinogén jelenléte a plazmában) a
teszt 20 másodperc körüli referencia értéke erősen megnyúlik.
Amennyiben a trombinidő és az euglobulin-lízis idő értékei normálisak, a PI és az aPTI együttes megnyúlása a
II-es, X-es vagy az V-ös faktorok defektusának, vagy warfarin-kezelésnek tulajdonítható. A faktorok hiányát a
fentiekben ismertetett módon, kromogén szubsztrátok segítségével végzett enzimreakcióval vagy faktorhiányos
plazma, esetleg tisztított faktorok hozzáadásával lehet tisztázni.
Ha a trombinidő, az aPTI és a PI is megnyúlt, de az euglobulin-lízis idő normális, elképzelhető, hogy magas a
vér heparin-koncentrációja. Ilyenkor a plazmához adott protamin-szulfáttal, a heparin antagonistájával
közömbösíthetjük a jelen lévő heparint, ami a trombinidő normalizálódásához vezet. A plazma
heparinszintjének pontos meghatározása az aktivált X-es faktor enzimaktivitásának kromogén szubsztráttal
történő meghatározásával lehetséges. Ha a heparintartalmú plazmához ismert mennyiségű aktivált X-es faktort
adunk, annak aktivitása a heparin koncentrációjával arányosan csökken. Ismert heparintartalmú oldatokkal
kalibrációs görbe készíthető, amelynek segítségével a vizsgált plazma heparintartalma nagy pontossággal
meghatározható.
10.6.10.6.1.10.6.1.5. A XIII-as faktor vizsgálata
A fibrinhálót kovalens keresztkötésekkel stabilizáló XIII-as faktor hiánya vérzékenységet és ismétlődő spontán
vetélést okozhat, azonban a rutin alvadási tesztekkel (PI, aPTI) nem diagnosztizálható, hiszen ezek az eljárások
az alvadási időt és nem a kialakult fibrinháló stabilitását vizsgálják.
A faktorhiány gyanúja esetén a vizsgált plazma alvadékát urea (karbamid) oldatban inkubálják. Az urea gyorsan
feloldja az alvadékot, amennyiben keresztkötések nincsenek jelen, mert a fibrin-monomereket összetartó
hidrogénhidakat megszünteti. Normális XIII-as faktor-aktivitás esetén a kovalens kötésekkel stabilizált alvadék
ureaoldatban is stabil.
10.7. A trombózisok laboratóriumi diagnosztikája
A trombózis vérmintából történt laboratóriumi vizsgálata a képalkotó eljárásokhoz képest alárendelt szereppel
bír, de a disszeminált intravaszkuláris koagulopátia (DIC) diagnózisában kiemelkedően fontos szerepet játszik.
E kórkép lényege, hogy különböző kórfolyamatok okozta nagymérvű szövetkárosodás eredményeképpen a
vérplazma nagy mennyiségű szöveti faktorral kerül érintkezésbe, így az egész érrendszer területén, de
elsősorban a kiserekben indul meg az alvadás (multiplex trombózis), amelynek sokszervi elégtelenség lehet a
következménye kiterjedt, az agyat, vesét és tüdőt érintő mikroinfarktusok miatt. A betegséget leggyakrabban
roncsoló szöveti trauma, égés, szisztémás fertőzések és különböző terhességi komplikációk váltják ki. Ilyenkor
egyidejűleg folyik fokozott alvadás és fibrinolízis, amelyek együttesen az alvadási faktorok „elfogyását”
eredményezik (10.11. ábra). A DIC laboratóriumi diagnosztikája tehát az alvadási faktorok aktiválódásának, az
alvadásgátló faktorok (antitrombin, alfa2-makroglobulin, protein C és S) csökkent plazmaszintjének és a
hiperfibrinolízis kimutatásán alapul. A családi halmozódást mutató vagy nagyon korai életkorban fellépő
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
138 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
trombózisok (trombofília) hátterében leggyakrabban az alvadásgátló fehérjék genetikailag meghatározott hiánya
(antitrombin, protein C és S) vagy aktivált protein C-rezisztencia állhat.
10.11. ábra - A DIC kialakulásának mechanizmusa
10.7.10.7.1. Az alvadási faktorok aktiválódásának kimutatása
Mint a faktorhiányok bemutatásánál említésre került, lehetőség van az egyes alvadási proteázok (pl. aktivált X-
es faktor vagy trombin) aktivitásának kolorimetriás mérésére, azonban az aktiváció során felszabaduló peptidek
koncentrációjának radioimmunoassay (RIA) vagy enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) módszerrel
történő pontos meghatározása sokkal elterjedtebb. A leggyakrabban mért aktivációs peptidek közé a protrombin
aktivációs peptidje (az ún. fragment 1-2), a fibrinogénből lehasított fibrinopeptid A és B, illetve a fibrin-
monomerek tartoznak. A RIA-módszer lényege, hogy a mérendő peptid vagy fehérje ismert mennyiségű,
radioaktív izotóppal jelzett változatát keverik a vizsgált plazmamintához, amelyet ismert mennyiségű antitesttel
inkubálnak. A szabad, illetve az antitesthez kötött peptidek egymástól elválaszthatók és mérhető a két frakció
radioaktivitása. A jelölt és a nem jelölt (hideg) peptid egymással vetélkedve kötődik az antitesthez, vagyis minél
magasabb az adott peptid plazmakoncentrációja, annál kisebb az antitesthez kötött radioaktivitás (lásd 11.
fejezetben). Megfelelő hígítási sor és kalibrációs egyenes segítségével a nem jelölt peptid abszolút plazmaszintje
is meghatározható.
Az ELISA-módszer ugyancsak antitestek használatán alapul, de nem igényli radioizotópok alkalmazását. Több
válfaja van, leggyakrabban az ún. szendvics-módszert használják. A vizsgálandó peptid-antigénre specifikus
primer ellenanyagot szilárd hordozóhoz, praktikusan egy lemez felszínéhez rögzítik, majd az antigénnel (vagyis
a mérendő peptidet tartalmazó plazmamintával) inkubálják. Az antigén az immobilizált antitesthez kötődik. A
lemez mosása után az így kikötött antigént primer és szekunder antitesttel reagáltatják, utóbbihoz van kötve az
enzim, amely kromogén szubsztrátot hasít. A keletkező színintenzitás arányos lesz az antigén mennyiségével,
feltéve, hogy az antigén koncentrációja nem olyan nagy, hogy a jelen levő kikötött antitestek kötőkapacitását
meghaladja.
Ezzel a módszerrel mérhetjük az alvadási faktorok plazmaszintjét is.
10.7.10.7.2. A hiperfibrinolízis kimutatása
A 10.6.1.3. pont alatt tárgyalt euglobulin-lízis idő és a fibrinháló-oldási idő meglehetősen specifikus, de nem
eléggé szenzitív és kvantitatív eljárások. A fibrinolízis ütemének mérésére jóval alkalmasabb és automatizálható
A véralvadás laboratóriumi
vizsgálata
139 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
eljárás a fibrin degradációs termékek, vagyis a D- és E-monomerek, illetve a D-dimer plazmaszintjének RIA
vagy ELISA-módszeren alapuló meghatározása (a mai laboratóriumi gyakorlatban egyéb, jobban
automatizálható immunoassay-ket használunk).
A DIC késői fázisára jellemző a fibrin degradációs termékek plazmaszintjének kifejezett emelkedése, ezzel
párhuzamosan az euglobulin-lízis idő megnyúlása, valamint az alvadási faktorok fokozott felhasználása miatt a
protrombin-idő és az aPTI szignifikáns megnyúlása.
10.8. Az aktivált protein C (APC) rezisztencia kimutatása
A rutin alvadási tesztek, így a PI és az aPTI nem alkalmasak az APC-rezisztencia kimutatására. Ennek oka
abban keresendő, hogy a protein C aktivációjához trombinra és trombomodulinra van szükség, utóbbi az
endotélsejtek membránjába ágyazott fehérje, amelyet a felsorolt tesztek nem tartalmaznak. Tehát az alvadási
kémcsőreakció során nem keletkezik aktivált protein C, vagyis az APC-rezisztencia sem vizsgálható.
A betegség molekuláris alapja, hogy az V-ös faktor mutációja miatt rezisztenssé válik az APC katalizálta
hasítással szemben. Vagyis APC-rezisztencia esetén a plazmához adott aktivált protein C a minta alvadási idejét
érdemben nem befolyásolja, ezzel szemben a vad típusú (egészséges) V-ös faktor aktivitását a hozzáadott APC
drasztikusan csökkenti, ami az alvadási idő megnyúlását vonja maga után.
Elméletileg mind a PI, mind az aPTI alkalmas az APC-rezisztencia ilyetén kimutatására, hiszen az V-ös faktort
tartalmazó közös alvadási út mindkettőnek része, de a gyakorlatban az aPTI-t szokták erre a célra használni.
Egészséges vérmintához adott, meghatározott mennyiségű aktivált protein C az alvadási időt legalább a
kétszeresére nyújtja. Amennyiben az aPTI sztenderdizált körülmények között mért megnyúlása ennél kisebb,
APC-rezisztenciáról van szó, amelynek biztos diagnózisát a Leiden-mutáció molekuláris biológiai módszerekkel
való kimutatása adja. Leggyakrabban PCR-RFLP (restrikciós fragmentum-hosszúságpolimorfizmus) vagy PCR-
ASA (allél-specifikus amplifikáció) módszereket használnak, de valós idejű PCR-eljárás is forgalomban van.
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
II. rész - Endokrinológia
141 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tartalom
11. Immunanalitikai eljárások ........................................................................................................ 142 11.1. Kompetitív immunanalitikai eljárások ......................................................................... 142 11.2. Immunometrikus, vagy nem kompetitív immunanalitikai eljárások ............................ 143
12. A pajzsmirigy funkciók laboratóriumi vizsgálata ..................................................................... 144 12.1. Pajzsmirigy hormonok ................................................................................................. 144
12.1.12.1.1. Biológiai funkciójuk ................................................................................ 144 12.1.12.1.2. Bioszintézis .............................................................................................. 144 12.1.12.1.3. Szállítás .................................................................................................... 145 12.1.12.1.4. Szabályozás ............................................................................................. 146
12.2. Hipotireózis .................................................................................................................. 148 12.2.12.2.1. Primer hipotireózis ................................................................................... 149 12.2.12.2.2. Másodlagos (szekunder) hipotireózis ...................................................... 149
12.3. Hipertireózis ................................................................................................................. 149 13. Mellékpajzsmirigy .................................................................................................................... 151
13.1. PTH szint reguláció ...................................................................................................... 151 13.2. A PTH hatása ............................................................................................................... 152 13.3. Primer hiperparatireózis ............................................................................................... 153 13.4. Szekunder hiperparatireózis ......................................................................................... 153 13.5. PTH hiány .................................................................................................................... 153 13.6. Kalcitriol – D-vitaminok .............................................................................................. 153 13.7. Kalcitonin ..................................................................................................................... 154
14. Mellékvesekéreg rendellenességek laboratóriumi vizsgálata ................................................... 155 14.1. ACTH-mellékvese tengely, glükokortikoidok ............................................................. 155 14.2. Selye János stressz elmélete és annak továbbfejlesztése .............................................. 155 14.3. Az ACTH-kortizol napszaki ingadozása, fontosabb szabályozókörök ........................ 158 14.4. Glükokortikoidok ......................................................................................................... 158 14.5. Mineralokortikoidok .................................................................................................... 159 14.6. A mellékvesekéreg rendellenességei ............................................................................ 160
14.6.14.6.1. A mellékvesekéreg hipofunkciói ............................................................. 160 14.6.14.6.2. A mellékvesekéreg hiperfunkciói ............................................................ 161 14.6.14.6.3. Congentitalis adrenális hiperplázia .......................................................... 161
15. Reproduktív rendellenességek laboratóriumi vizsgálata ........................................................... 163 15.1. Férfi nemi működés (reprodukció) ............................................................................... 163
15.1.15.1.1. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe .................................... 163 15.1.15.1.2. Androgén transzport a vérben .................................................................. 164 15.1.15.1.3. A tesztoszteron metabolizmusa ............................................................... 164 15.1.15.1.4. Férfi nemi fejlődés ................................................................................... 165 15.1.15.1.5. Szabad és gyengén kötött tesztoszteron meghatározások ........................ 166 15.1.15.1.6. 17-Ketoszteroidok meghatározása vizeletből .......................................... 166 15.1.15.1.7. Anabolikus szteroid meghatározások ...................................................... 167 15.1.15.1.8. Abnormalitások a férfi reprodukcióban ................................................... 167
15.2. Női reprodukciós biológia ............................................................................................ 167 15.2.15.2.1. Élettani összefoglaló ................................................................................ 168 15.2.15.2.2. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe .................................... 168 15.2.15.2.3. Ösztrogének ............................................................................................. 168 15.2.15.2.4. Biokémia, élettan ..................................................................................... 169 15.2.15.2.5. Női nemi fejlődés ..................................................................................... 170 15.2.15.2.6. Normális menstruációs ciklus .................................................................. 170 15.2.15.2.7. Női reprodukciós abnormalitások ............................................................ 171
16. Utószó ....................................................................................................................................... 173 17. Felhasznált és ajánlott irodalom ............................................................................................... 174
142 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
11. fejezet - Immunanalitikai eljárások
Az endokrinológiával foglalkozó fejezet elején pár bekezdés erejéig szeretnénk foglalkozni az igen alacsony
koncentrációban jelen levő hormonok meghatározásának módszerével az immunanalitikai eljárásokkal. Az
elsőként (ezzel a módszerrel) meghatározott hormon az inzulin volt, amelyet Rosalyn Yallow és Solomon Aaron
Berson kompetitív radioimmunassay (RIA) segítségével hajtott végre 1959-ben (Nobel díj Roslyn Yallow
számára 1977-ben). Az eljárás lehetővé tette, lehetővé teszi, hogy akár igen kis koncentrációban (10−21 M) jelen
lévő anyagot, analitet a mátrix akár ezerbilliószoros feleslege mellett is meghatározzuk. Az immunkomplexek
(antigén-antitest) specificitását és stabilitását felhasználó analitikai eljárásokat összefoglaló néven
immunanalitikai eljárásoknak nevezzük, a nevükön belül a detektálási módra szokott még utalás lenni.
Napjainkra igen sokféle immunanalitikai eljárás terjedt el, az endokrinológiai vizsgálatokon kívül, különféle
terápiás gyógyszerellenőrzéseket, a tumor marker és az autoantitest, illetve vírusellenes antitest (pl. különféle
hepatitisz) vizsgálatokat is ezzel a módszerrel végezzük. Az immunanalitikai eljárások 1960-as években történt
bevezetésekor az indikátor valamilyen sugárzó izotóp volt általában 125I. Egy évtizeddel később vezették be a
nagy átviteli számú enzimeket (pl. torma-peroxidáz, alkalikus-foszfatáz), majd a fluoreszcens és
kemilumineszcens vegyületeket. Napjainkra a radioaktív jelölést tartalmazó immunanalitikai eljárásokat már
szinte teljes mértékben kiszorították ez utóbbiak.
Az immunanalitikai eljárások két alapelvre vezethetőek vissza: a kompetitív, és a nem kompetitív, vagy
immunometrikus meghatározásokra.
11.1. Kompetitív immunanalitikai eljárások
A kompetitív immunanalitikai eljárások során minden egyes reaktánst egyidejűleg, vagy egymást követően
összekeverünk. Az egyidejű összekeverés során a jelölt antigén (Ag*) és a nem jelölt antigén (Ag) versenyeznek
az antitesthez kötésért. Egy ilyen rendszerben az antitest teljesen egyforma (kötési) affinitást kell, hogy
mutasson a jelölt és nem jelölt antigén irányába. Ilyen körülmények között, az antitest-jelölt antigén kötés
valószínűsége fordítottan arányos a nem jelölt antigén koncentrációjával, tehát a kötött jelzés nagysága
fordítottan arányos a nem jelölt antigén koncentrációjával (11.1. ábra). Az egymást követően adagolt reaktánsok
esetében a nem jelölt antigént feles mennyiségű antitesttel keverjük össze és megvárjuk, hogy beálljon az
egyensúlyi állapot. Ezt követően adagoljuk a jelölt antigént és szintén megvárjuk az egyensúly beálltát. Az
antitest-antigén komplexek elválasztását követően meghatározzuk a jelzés nagyságát és ebből kiszámítjuk a nem
jelölt antigén koncentrációját.
11.1. ábra - Kompetitív immunanalitikai eljárás
Immunanalitikai eljárások
143 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az utóbbi kétlépéses módszert alkalmazva a nem jelölt antigének nagyobb hányada kötődik az antitesthez, mint
a szimultán módszer esetén, különösen alacsony antigén koncentráció esetén. Ezt kihasználva a szekvenciális
(két, vagy többlépéses) módszer esetén 2-4-szer alacsonyabb detektálási határ érhető el. Korábban a nehezen
felvehető (negatív meredekségű) kalibrációs görbe miatt nehézkes volt a minták számítása, de a számítógépek
elterjedésével ez a probléma teljesen megszűnt.
11.2. Immunometrikus, vagy nem kompetitív immunanalitikai eljárások
A tipikus immunometrikus eljárás során az elsődleges, vagy „befogó” antitestet egy szilárd felületre
adszorbeálják, vagy kovalensen kötik. Ezt követően a mintában található antigént hagyják vele reagálni, hogy
megkösse a szilárd felülethez kapcsolt antitest. A többi fehérjét kimossák, majd egy jelölt antitestet adnak, hogy
az elsődleges antitesthez már kötött antigén egy másik epitopjához kössön. Ezt egy újabb mosási lépés követi,
hogy a nem kötött másodlagos (jelölt) antitestet kimossák. Végül meghatározzák a jelölés mértékét, amely
egyenesen arányos az antigén koncentrációjával (11.2. ábra). A nem kompetitív eljárás során mind poliklonális,
mind monoklonális antitestet alkalmazhatunk, mint elsődleges, vagy másodlagos (jelölő) antitest. Amennyiben
olyan monoklonális antitestet alkalmazunk, amelyek különböző epitopokra specifikusak, akkor a mintát, az
elsődleges és a másodlagos, jelölő antitestet egyszerre inkubálhatjuk, így a vizsgálati protokoll lényegesen
leegyszerűsíthető.
11.2. ábra - Az immounometrikus eljárás
144 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
12. fejezet - A pajzsmirigy funkciók laboratóriumi vizsgálata
A pajzsmirigy, egy pillangó alakú mirigy a nyak frontális (elülső) részén a légcső felett. Teljesen kifejlett
állapotban hozzávetőlegesen 15-20 g tömegű. A pajzsmirigy follikulusok a mirigy szekretoros funkciójáért
felelős egységek. Minden egyes follikulus rendelkezik egy epitel sejtekből álló külső réteggel, amely egy amorf
anyagot, a kolloidot zárja közre. A kolloid javarészt tireoglobulinból és kis mennyiségű jódozott
tireoalbuminból áll. A pajzsmirigy hormon szintézisének kulcslépései, mint a jódozás és a hormonszekréció
kezdeti lépései (kolloid reszorpció) az epitel sejtek felszínén, vagy annak közelében történnek. A pajzsmirigyek
egy másik sejttípust a parafollikuláris, vagy C sejteket is tartalmazzák. Ezek a sejtek termelik a kalcitonint és
follikuláris alaprétegen belül vagy klaszterekbe tömörülve fordulnak elő a follikulusok közötti térben.
Az összes endokrin vizsgálat kétharmadát a pajzsmirigy tesztek teszik ki. Valószínűleg a legjobban ismert
endokrin szabályozás, a laboratóriumi diagnosztika számára gyakorlatilag minden pontja közvetlenül
vizsgálható. A pajzsmirigy hormonok túltermelése (hipertireózis) és elégtelen termelődése (hipotireózis)
egyaránt orvosi beavatkozást igényel, de ehhez elengedhetetlen a folyamat jellegének pontos ismerete. Mind a
hiper- mind a hipotireózis oka lehet maga a pajzsmirigy működészavara (primer hiper- ,illetve hipotireózis), de
kialakulhatnak másodlagos (szekunder) módon, szabályozási zavar következtében is.
12.1. Pajzsmirigy hormonok
A pajzsmirigyek kétféle (follikuláris eredetű) hormont szekretálnak: a tiroxint (3,5,3’,5’-L-tetrajódtironint) és a
trijódtironint (3,5,3’-L-trijódtironint), amelyeket leggyakrabban T4 és T3 névvel illetünk. Ezeken kívül a
pajzsmirigyek kis mennyiségben reverz T3-at (3,3’,5’-L-trijódtironint), egészen csekély mennyiségű
monojódtirozint és dijódtirozint a T3 és T4 bioszintézis prekurzorait is szekretálják (12.1. ábra).
12.1.12.1.1. Biológiai funkciójuk
A pajzsmirigy hormonok számos biológiai hatással rendelkeznek. A legfontosabb hatásuk, hogy a megnövelt
szöveti oxigénfogyasztáson keresztül kontrollálják az alap anyagcsere rátát (megnövelt Na+/K+ ATP-áz aktivitás,
terminális oxidáció és oxidatív foszforiláció). A pajzsmirigy hormonok stimulálják az idegi fejlődést és a normál
növekedést, elősegítik a szexuális érést, fokozzák az adrenerg aktivitást (fokozott szívfrekvencia és miokardiális
kontraktilitás), fokozzák a fehérje szintézist és a szénhidrátok metabolizmusát, megnövelik a koleszterin és a
trigliceridek szintézisének és degradációjának mértékét, megnövelik a vitaminszükségletet, fokozzák a kalcium
és foszfát anyagcserét, illetve megnövelik az adrenerg receptorok katekolaminok irányába mutatott
érzékenységét.
Mindezen hatások fokozódnak a pajzsmirigy túlműködés (hipertireozis) esetén és csökkennek pajzsmirigy
alulműködés (hipotireozis) esetén.
12.1.12.1.2. Bioszintézis
A pajzsmirigy hormonok bioszintézise magába foglalja a keringő jód pajzsmirigy általi felvételét, a jód tirozin
molekulákba történő beépítését, a jódozott tirozin molekulák tironinné (T4) történő összekapcsolását.
A pajzsmirigy hormonok tehát aromás gyűrűn jódozott tirozinszármazékok, amelyek a follikulussejtekben
szintetizálódnak. A pajzsmirigy hormonok szintézise során a follikulussejtekben termelődő nagy molekulájú
(Mr=660 kDa) tireoglobulin tirozin oldalláncai jóddal kapcsolódnak (12.1. ábra). A vérben keringő jodid
ionokat a pajzsmirigy follikulusok veszik fel. Aktív folyamatról van szó, ugyanis a szervezetbe kerülő kevés
jodid iont igen gyorsan akkumulálja a pajzsmirigy, amelynek jódtartalma 3-4 nagyságrenddel magasabb a többi
szöveténél. A pajzsmirigy jódfelvételét perklorát és rodanid ionok gátolják, innen származik
pajzsmirigyműködést gátló hatásuk.
A follikulusokban a jodid egy peroxidáz hatására elemi jóddá oxidálódik, a tirozin oldalláncok jódozása elemi
jód hatására megy végbe. Az oxidáció gátolható tiouracillel, ennek származékait így a hipertireozis
gyógyításában alkalmazzák. A jódtirozin oldalláncok ugyancsak egy peroxidáz hatására szemikinonná
oxidálódhatnak, ami egy másik tirozin oldallánc fenolos hidroxil csoportjához kapcsolódhat (12.1. ábra). A
A pajzsmirigy funkciók
laboratóriumi vizsgálata
145 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
másik tirozinmaradékra áthelyeződő dijódfenil csoport helyén egy szerin oldallánc marad vissza. Ha ez a
difeniléter proteolízis hatására kihasad a tireoglobulinból a kapott aminosav származék maga a pajzsmirigy
hormon (T4, 12.1. ábra).
A szekretált T4 mintegy 40%-a T3-má dejodinálódik a perifériális szövetekben, további 45%-a pedig a biológiai
aktivitással nem rendelkező reverz T3-má alakul. Normális T4 produkció (~100 nmol/nap, 80 μg/nap) mellett
tehát napi ~40 nmol (26 μg) T3 és ~45 nmol (29 μg) reverz T3 keletkezik a perifériális dejodinálással. Ha az
eutireoid állapotban valószínűsített napi produkciókat megnézzük, T3: 30 μg, rT3: 30 μg, akkor megállapíthatjuk,
hogy a T3 produkció legalább 85%-ban az rT3 produkció pedig teljes mértékben a T4 dejodinálásából ered és
nem pedig direkt pajzsmirigy szekrécióból. A T3 négy-ötször akkora biológiai aktvitással rendelkezik, mint a T4.
A T4 pool mintegy harmada T3-má konvertálódik, így tulajdonképpen prohormonként is tekinthetünk rá.
A T4 T3-má történő konverziója során a prohormont szolgáltató T4 hiányát fokozott konverzió kompenzálhatja.
Fordított helyzet is előfordulhat, a T4 csökkent mértékű konverziója hormonhiányt is okozhat.
12.1. ábra - Pajzsmirigyhormonok és szintézisük.
12.1.12.1.3. Szállítás
A pajzsmirigy funkciók
laboratóriumi vizsgálata
146 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Mind a T4, mind a T3 a keringésben reverzibilisen és csaknem teljes mértékben szállító fehérjékhez kötődik.
Ilyen szállító fehérje a tiroxin kötő globulin (TBG), a tiroxin kötő prealbumin (TBPA) és az albumin.
Együttesen a T4 99.97%-át és a T3 99.7%-át kötik. Ezért mindkét hormon csak igen csekély hányada található
szabad biológiailag aktív formában. Tekintve, hogy még normális körülmények között is meglehetősen nagy a
T4-kötő fehérjék koncentrációjának variabilitása, meglehetősen nagy a totál T4 koncentrációban tapasztalható
variabilitás az egyes emberek között eutireoid állapotban is. A totál T3 és kötőfehérje koncentráció is igen nagy
variabilitást mutat, igaz kisebb mértékűt, mint a T4 esetében. Éppen emiatt kevésbé specifikus és szenzitív a
meghatározásuk, a napi gyakorlatban szabad hormon szinteket mérünk első körben.
12.1.12.1.4. Szabályozás
A pajzsmirigy hormonok szintézisének minden egyes lépését az agyalapi mirigy által termelt tiroid stimuláló
hormon (TSH) regulálja. A TSH fokozza a jód aktív felvételét, a tireoglobulin szintézisét, a follikulus sejtek
kolloidális felvételét. A TSH szintén regulálja a tireoglobulin T3 és T4 felszabadulásához szükséges proteolízisét.
Ezen felül a TSH indukálja a follikulus sejtek számának és méretének növekedését. Az elhúzódó TSH
stimuláció a pajzsmirigy vaszkularizációjának növekedésével, illetve hipertrófiájával (golyva) jár.
12.2. ábra - A TRH: tireoid releasing hormone
A TSH a hipofízis elülső lebenyében termelődő rövid féléletidejű 28 kDa tömegű glikoprotein. Szintézise és
kibocsátása két eltérő reguláció alatt áll: a szintézist a hipotalamusz neuroszekrétuma, egy rövidke tripeptid
(piroglutamil-hisztidil-prolin-amid), a TRH (tireoid releasing hormone) szabályozza (12.2. ábra).
A kibocsátás, részben a szintézis sebességétől, részben a pajzsmirigy által termelt T4 szinttől függ, amely negatív
visszacsatolással hat a hipofízis sejtekre. alacsony T4 szint segíti, magas T4 szint gátolja a TSH felszabadulását
(12.3. ábra).
A pajzsmirigy működés diagnosztikájának első lépése tehát mindig a TSH meghatározása, ugyanis annak
normális szintje esetén jó eséllyel (de nem feltétlenül) normális a pajzsmirigyműködés (eutireózis) is. Normális
hipofízis működés esetén a keringő TSH koncentrációja a plazma pajzsmirigyhormon koncentrációjával
fordítottan arányos hipotireózisban magas, hipertireózisban pedig alacsony. A pajzsmirigyhormon szinthez
képest aránytalanul alacsony TSH koncentrációt találunk hipofízis szövet pusztulással járó betegségekben.
A pajzsmirigy funkciók
laboratóriumi vizsgálata
147 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Lényegesen gyakoribb, hogy a TSH koncentrációja magasabb annál, ami a pajzsmirigy hormonszintek alapján
várható lenne, ami arra utal, hogy az emelkedett pajzsmirigy hormonszint nem szabályozza vissza a TSH
kibocsátást. Ez az eset állhat elő TSH termelő hipofízis elülső lebeny adenoma esetén. A Graves, vagy Basedow
kórban stimuláló hatású autóantitestek kapcsolódnak a pajzsmirigy follikulussejtek TSH receptoraihoz. A
fokozott pajzsmirigy hormontermelés hatására a feed-back mechanizmus miatt a TSH szintézis igen alacsony.
Az autóimmun betegségben szenvedő betegeknek drámai arckifejezést kölcsönöz, hogy szemük a szemgolyó
mögötti kötőszövet ödémája következtében kidülled, a sclera (szemfehérje) a szivárványhártya felett is látható
(Graefe-jel).
12.3. ábra -
A pajzsmirigy funkciók
laboratóriumi vizsgálata
148 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
12.2. Hipotireózis
A hipotireózis a pajzsmirigyhormon csökkent szekrécióját, vagy csökkent mértékű hatását jelenti. Viszonylag
gyakori rendellenesség, különböző súlyosságú formái a lakosság 2-15%-át érinti. A nők között gyakrabban
előfordul, de mindkét nemben gyakorisága nő az életkor előrehaladtával. Klinikai tünetei igen változatosak
lehetnek a könnyen felismerhető letargiától, levertségtől és hideg intoleranciától kezdve, a kevésbé egyértelmű
szubklinikai esetekig, amelyeket nehéz diagnosztizálni. A mixödéma a hipotireózis súlyos formája, amelyben a
A pajzsmirigy funkciók
laboratóriumi vizsgálata
149 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
bőrben mukopoliszacharidok halmozódnak fel és az (orr két oldalán az) arcszerkezet megváltozását, a bőr
tésztás tapintását okozzák. Az újszülötteket érintő súlyos hipotireózis a kretenizmus.
A pajzsmirigy számos szerkezeti vagy funkcionális rendellenessége vezet pajzsmirigy hormon deficienciához. A
közvetlen pajzsmirigy szövetpusztulással, illetve pajzsmirigy hormonszint csökkenéssel járó betegségeket
primer hipotireózisoknak nevezzük. A másodlagos (szekunder) hipotireózisok hátterében valamilyen hipofízis
rendellenesség áll. (A harmadlagos, vagy tercier esetek pedig hipotalamikus problémákhoz köthetőek.)
12.2.12.2.1. Primer hipotireózis
Ahogy említettük primer hipotireózisról akkor beszélünk, ha a T4 és T3 szintézis csökkent valamely külsődleges,
vagy belsődleges, örökletes pajzsmirigy hormon bioszintézis defektus miatt. A feed-back szabályozás miatt
ezekben az esetekben megnő a TRH és TSH szintje és kompenzációs pajzsmirigy megnagyobbodás (golyva)
alakul ki. Az elsődleges golyvával nem járó hipotireózis esetén a pajzsmirigyszövet csökkenése, vagy atrófiája
figyelhető meg és a magas TSH szint ellenére ezért csökken a termelt hormon mennyisége. A Hashimoto
tireoditis a fejlett országokra jellemző leggyakoribb primer hipotireózis ok, melyben a jód felvétel szenved
hiányt. Világszerte a jódhiány áll a golyvával járó hipotireózis hátterében. A golyvával nem járó hipotireózis
hátterében leggyakrabban a pajzsmirigy műtéti vagy radiojódos eltávolítása áll, amely eljárások a Graves-
Basedow kór leggyakoribb terápiás formái. A primer hipotireózis esetén gyakran találunk a keringésben
antitireotikus autoantitesteket. Az emelkedett TSH szint az egyik legfontosabb laboratóriumi tünet primer
hipotireózisban. Enyhe, vagy szubklinikai hipotireózis esetén a T4, T3 szintek gyakran a referencia tartományon
belül vannak, azonban a TSH szint jelentős(ebb) emelkedést produkál.
A minden 3500-4000 élve születésre jutó congenitális hipotireózis oka lehet teljes pajzsmirigyhiány, vagy a
pajzsmirigy hormonok szintézisének defektusa. Az azonnali diagnózis és hormonpótló kezelés elengedhetetlen a
visszafordíthatatlan neurológiai károsodások elkerülése érdekében. A vizsgálatot központosítva szűrőpapírra
szárított vérmintákból végzik (1.7. ábra). Amennyiben a TSH szintje meghaladja 20 mU/l-es értéket, az
újszülöttet a veszélyeztett csoportba sorolják és további T4 vizsgálatot is végeznek rajta. A primer hipotireózis
napi rendszerességgel orálisan adagolt tiroxinnal kezelik. A kezelés megkezdését követően 4-8 hét alatt áll be a
plazma TSH szintje a steady state értékre.
12.2.12.2.2. Másodlagos (szekunder) hipotireózis
Másodlagos hipotireózis alakul ki a hipofízis, illetve hipotalamusz betegségek következtében, amikor a TSH,
TRH, vagy mindkét szint lecsökken. Izolált TSH hiány ritkán alakul ki és a másodlagos hipotireózissal
rendelkező betegek más hipofízis hormon hiányban is szenvednek. Szekunder hipotireózisban a plazma T4 szint
minden esetben alacsony a TSH szint vagy alacsony, vagy a referencia intervallumba esik. Amennyiben
mindkettő alacsony érdemes a TRH szintet meghatározni. Azokban a betegekben, akik hipofízis lézióval
rendelkeznek a külsődlegesen bejuttatott TRH nem váltja ki a TSH szint emelkedését. A hipotalamusz
rendellenességgel sújtott betegek, akik TRH, TSH deficienciával rendelkeznek a külsődlegesen adagolt TRH
normális TSH maximumot szokott kiváltani, ami gyakran a normális 20-30 perces maximum helyett késve 45-
60 perc elteltével jelentkezik.
12.3. Hipertireózis
A hipertireózis egy hipermetabolikus állapot, amelyet a pajzsmirigyhormonok túlzott termelődése vált ki.
Észak-Amerikában a hipertireózis leggyakoribb oka az autóimmun Graves-Basedow kór, amely az USA 0.4%-
át érinti. A pajzsmirigy hormonok túltermelése más okból kifolyólag is előfordulhat, mint például egyedüli,
illetve többszörös pajzsmirigy göbök általi autonóm hormon produkció, toxikus egyedüli adenóma, vagy a ritka
TSH túltermelő hipofízis következtében. Ritkábban bakteriális, vagy virális pajzsmirigygyulladás
következtében, amelyek akut, vagy szubakut hormonszivárgást idézhetnek elő a mirigyben tárolt
hormontartalékokból. További hipertireózist kiváltó okok lehetnek a külsődleges hormon bevitel, nagy
mennyiségű jódbevitel, tiroid karcinóma, gyógyszer kiváltotta tirotoxikózis, amelyet jód tartalmú gyógyszerek,
mint az amiodaron váltanak ki.
A hipertireózis nem túl gyakori a populáció mintegy 0.3-0.6%-át érinti. Nők körében gyakrabban fordul elő,
mint férfiakban. Diagnosztizálása általában könnyebb, mint a hipotireózisé, azonban elsősorban 60 év feletti
betegekben gyakran előfordul a tünetek félrediagnosztizálása, amelyeket szimplán csak a stressznek szoktak
betudni.
A pajzsmirigy funkciók
laboratóriumi vizsgálata
150 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A labordiagnosztikai kép primer hipertireózis esetén emelkedett T4 és T3 szinteket mutat, amelyekhez szinte
mérhetetlenül alacsony TSH szint társul. Ezen betegekben 0.05 mU/l alatti TSH szinteket lehet mérni. A
normális tartományba eső TSH szinte biztosan kizárja a hipertireózis valószínűségét. A szekunder hipertireózis
hátterében TSH túltermelő hipofízis tumor, vagy a pajzsmirigy hormonokra rezisztens hipofízis állhat.
A hipertireózis terápiás megoldásai között előfordulnak antitiroid gyógyszerek, radioaktív, vagy sebészi
pajzsmirigy ablációk. A terápia célja, hogy csökkentsék pajzsmirigyhormon produkciót, vagy a perifériális T4-T3
konverziót. A terápia közben folyamatosan monitorozni kell a szabad T4 (FT4) szintet, illetve a sikeres terápiát
követően évente 2-3 alkalommal is sort kell erre keríteni.
151 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
13. fejezet - Mellékpajzsmirigy
Az emberi szervezetben a 4, egyenként hozzávetőlegesen 40 mg-os mellékpajzsmirigy a pajzsmirigy
állományába beágyazódva foglal helyet. Műtéti eltávolításuk után a plazma Ca2+ koncentrációja az élettel
összeegyeztethetetlenül alacsony szintre csökken. Ez csak akkor élhető túl, ha megfelelő hormon, vagy
gyógyszeres kezeléssel megakadályozzuk a csökkenést. Pajzsmirigy műtét esetén erre különösen nagy gondot
kell fordítani.
A mellékpajzsmirigyek által termelt hormon a parathormon (PTH). A szekrécióra kerülő PTH 84 aminosavból
áll. Első lépésben a pre-pro-PTH-ból az N-terminálisan elhelyezkedő szignálszekvencia kihasadását követően
képződik a biológiailag még nem aktív 90 aminosavból álló pro-PTH. A pro-PTH-ban az N-terminális 6
aminosav megakadályozza a biológiai hatást. A szekréciót megelőzően ez a 6 N-terminális aminosav lehasad,
így jön létre a biológiailag aktív 84 aminosavból álló PTH.
13.1. PTH szint reguláció
A mellékpajzsmirigy PTH szekréciója negatív visszacsatolásokkal szabályozódik. Ezek egyik része a plazma
Ca2+ koncentrációjának közvetlen hatása: a plazma Ca2+ szintjének csökkenése megnöveli a PTH szekrécióját. A
PTH különböző célsejtekre hatva a plazma Ca2+ szintjét emeli. Ezzel a szabályozási kör bezárul, a
visszaemelkedett Ca2+ szint lecsökkenti a mellékpajzsmirigyben a PTH szekréciót. Ez a szabályozás 1.2 mM
körüli Ca2+ szint mellett működik. 1 mM Ca2+ szint mellett a mellékpajzsmirigy PTH szekréciója már maximális,
míg 1.3 mM Ca2+ koncentráció mellett a szekréció eléri az alsó határt, de ekkor sem szűnik meg teljesen:
bazális PTH szekréció még 2 mM feletti Ca2+ koncentráció mellett is van. A Ca2+ koncentráció igen kis változása
(0.05 mM) már jelentős PTH szekréció változással jár, a szabályozás igen érzékeny (13.1. ábra). A szabályozás
kulcseleme, érzékelője egy 7 transzmembrán szegmenssel rendelkező extracelluláris Ca2+ koncentrációra
érzékeny receptorfehérje.
A tartós (akár több héten át tartó) hipokalcémia nem csak a PTH szekréciót, hanem a mellékpajzsmirigy sejtek
hiperpláziáját (osztódásának fokozását) is kiváltja. Tekintve, hogy a fokozott PTH szekréció és sejtosztódás az
alacsony kalcium szint miatt jön létre, ezt az állapotot szekunder hiperparatireózisnek nevezzük. Ilyen állapot
jön létre D-vitamin hiány esetén, amikor a bélből történő Ca2+ felszívódás zavart szenved, illetve
veseelégtelenségben.
A szabályozás másik fontos eleme a PTH hatására bekövetkező kalcitriol szintézis. A PTH egyik hatása a
vesében az 1-α-hidroxiláz aktivitás fokozása, amely hatására a 25-OH-kalciferolból a biológiai aktivitással
rendelkező kalcitriol képződik. (Így már érthető, hogy veseelégtelenségben miért alakul ki Ca2+ szint csökkenés
és szekunder hiper-paratireózis.) A kalcitriol viszont negatív visszacsatolással gátolja a PTH szekréciót (13.1.
ábra). A két szabályozás időbeli lezajlása között lényeges különbség tapasztalható, míg a Ca2+ szint változása
pillanatokon belül szabályozza a PTH szekréciót, addig a kalcitriol szint emelkedése csak 12-24 óra alatt
csökkenti a PTH szekréciót. A kalcitriol PTH szekréciót csökkentő hatását használják fel terápiás lehetőségként
a vesebetegségeket kísérő szekunder hiperparatireózisban.
13.1. ábra - A PTH szekréció szabályozása (Az ábra az alábbi link alapján készült:
http://dualibra.com/wp-
content/uploads/2012/04/037800~1/Part%2015.%20Endocrinology%20and%20Metabol
ism/
Section%202.%20Disorders%20of%20Bone%20and%20Mineral%20Metabolism/346.
htm)
Mellékpajzsmirigy
152 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
13.2. A PTH hatása
A vese proximális tubulusokban a PTH csökkenti a foszfát reabszorpcióját. Ennek eredményeképpen a
foszfátürítés fokozódik, a plazma foszfát koncentrácója csökken.
Mellékpajzsmirigy
153 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Ettől függetlenül a PTH megnöveli a Ca2+ reabszorpcióját disztális tubulusokban, illetve az összekötő
csatornákban. A megnövekedett visszatartás miatt Ca2+ retenció és következményes plazma Ca2+ koncentráció
növekedés következik be. A PTH a vese sejtjeiben fokozza az 1-α-hidroxiláz működését, ezáltal a kalcitriol
szint emelkedését. A kalcitriol egyik funkciója a Ca2+ felszívódás elősegítése a bélből ezáltal is elősegítve a
plazma Ca2+ koncentrációjának emelkedését.
A PTH fokozza mind a rövid, mind a hosszú távú Ca2+ kilépést a csontokból, a csontlízist. A csontokból kilépő
Ca2+ a vérplazmába kerül ezáltal is növelve annak Ca2+ koncentrációját.
13.3. Primer hiperparatireózis
A mellékpajzsmirigy adenoma esetén a daganat kontroll nélküli PTH szekréciója jellemző. A tartósan magas
PTH szint, tartósan magas hiperkalcémiát okoz. A következményes csontlízis nem egyenletesen, hanem
forrópontokban jelentkezik. A fokozott csontreszorpció következtében csontciszták alakulnak ki és ezeken a
helyeken kis mechanikai behatásra is törnek.
13.4. Szekunder hiperparatireózis
Ahogy már említettük a tartós hipokalcémia PTH túlprodukciót vált ki és szekunder hiperparatireózis alakul ki.
A kiváltó ok (D-vitaminhiány, vesebetegség) nem teszi lehetővé, hogy a PTH emelje a plazma Ca2+ szintjét,
viszont a primer hiperparatireózishoz hasonló csonttünetek ugyanúgy létrejönnek.
13.5. PTH hiány
Ahogy arról is esett már szó, hogy a mellékpajzsmirigyek a pajzsmirigy állományába ágyazva, esetenként
nehezen felismerhetően, helyezkednek el és a pajzsmirigyet érintő műtéti beavatkozások során eltávolításra
kerülhetnek. A PTH hiány miatt a plazma Ca2+ szintje igen jelentős mértékben lecsökken. A Ca2+ szint
csökkenése olyan nagymértékű, hogy az idegek ingerlékenységének fokozódása vázizom görcsöket okoz, idővel
az általánossá váló görcsrohamok átterjedhetnek a légző izmokra és fulladásos halált idézhetnek elő. Normális
PTH szekréció esetén is kieshet a PTH hatása, amennyiben valamilyen defektus alakul ki a PTH receptortól való
jeltovábbításban. Ebben az állapotban a beadott PTH hatástalan.
13.6. Kalcitriol – D-vitaminok
A ma ismert két D-vitamin közül az ergokalciferol (D2-vitamin) a táplálékkal jut be az emberi szervezetbe. A
másik a kolekalciferol forrása lehet a táplálék, vagy valamilyen táplálék kiegészítő (pl. tőkehal-májolaj,
csukamájolaj). A kalciferol nagyobb része a bőrben keletkezik. A bőr koleszterin anyagcseréje során 7-
dehidrokoleszterin keletkezik és az UV sugarak hatására fotokémiai úton több lépés során átalakul
kolekalciferollá (D3-vitaminná).
A D-vitamin két egymást követő hidroxilációs folyamat során alakul át biológiailag aktív hormonná, kalcitriollá.
Az első hidroxilációs lépés helye a máj. A kalciferol a 25-ös szénatomon hidroxilálódik és 25-OH kalciferollá
alakul át, amely kimértékű biológiai aktivitással már rendelkezik. A lépés nem szabályozott kizárólag a D-
vitamin kínálat befolyásolja (túlzott D-vitamin bevitel, így kóros hipervitaminózishoz vezethet).
A második hidroxilációs lépés a vesében következik be és ez már szabályozott folyamat. A hidroxilációt az 1-a-
hidroxiláz végzi, a reakció során 1,25-(OH)2-kalciferolt, kalcitriolt képez. ez a biológiailag hatásos hormon.
Ahogy már említettük a vesében zajló hidroxiláció egyik legfontosabb aktivátora a PTH.
A szabályozás során több negatív feed-back loop is található. A kalcitriol hatására növekszik a plazma Ca2+
szintje, ami a PTH szekréció csökkenésén keresztül gátolja az 1-α-hidroxiláz aktivitását, továbbá a kalcitriol 12-
24 óra alatt csökkenti a PTH szekrécióját (lásd korábban). A kalcitriol negatívan visszahat az 1-α-hidroxiláz
génexpressziójára is.
A kalcitriol hiányában fellépő hipokalcémia különösen súlyos következményeket von maga után csecsemő és
kisgyerekkorban. Az alacsony plazma Ca2+ szint miatt a csontképződés, pontosabban az újonnan szintetizálódott
csontok ásványi anyag beépülése hiányt szenved. A kialakult csöves csontok nem bírják a rájuk nehezedő súlyt
és elgörbülnek, így alakul ki a rachitis, vagy más néven angolkór. Felnőtt korban a kalcitriol hiánya
csontlágyuláshoz vezet.
Mellékpajzsmirigy
154 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
13.7. Kalcitonin
A kalcitonint a parafollikuláris, vagy C sejtek (clear, mert világos árnyalatúak) termelik. A kalcitonin a több más
hormonhoz hasonlóan nagyobb 124 aminosavból álló prohormon formájában szintetizálódik, amelyből kihasad
a 32 aminosavból álló kalcitonin molekula. A hasadás közben mind a C-, mind az N-terminálisáról lehasad egy-
egy peptid. A kalcitonin hatására megszűnik a csont lebontása, az egyensúly a Ca2+ beépülés felé tolódik el és a
plazma Ca2+ koncentrációja csökken. A plazma Ca2+ koncentrációja pedig közvetlenül szabályozza a kalcitonin
szekrécióját.
155 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
14. fejezet - Mellékvesekéreg rendellenességek laboratóriumi vizsgálata
A mellékvesék a vesék felső csúcsán helyezkednek el. Mindkét mellékvese piramis alakú, 2-3 cm széles, 4-6 cm
hosszú, 1 cm vastag és 4 g súlyú kortól, testsúlytól, nemtől függetlenül. Mindegyik mellékvese egy sárga külső
kéregből, és a szürke velőből áll. A külső kéreg alatt fekszik a zona glomerulosa, amely a kéreg mintegy 15%-át
alkotja. A következő réteget a zona fasciculata nagy, lipid tartalmú sejtjei alkotják, amely a kéreg mintegy 75%-
át teszi ki. A legbelső kéregréteget pedig a zona reticularis szabálytalan kinézetű alacsony lipidtartalmú sejtjei
alkotják. A mellékvesekéreg sejtjei szteroid hormonokat szintetizálnak. A mellékvese velő sejtjei
katekolaminokat, mint a dopamin, norepinefrin és epinefrin aromás aminokat, amelyek komoly hatást
gyakorolnak a vérnyomás szabályozására.
A humán mellékvesekéreg a szteroid hormonok 3 fő osztályát szekretálja: a glükokortikoidokat, a
mineralokortikoidokat és a mellékvese androgéneket.
Szekréciójuk szabályozását tekintve a hipotalamusz neuroszekretoros sejtjei, az adenohipofízis és a
mellékvesekéreg funkcionális egységet képeznek. Az esetleges működészavar még akkor is kihat az egész
rendszerre, ha az autonóm jellegű, például a mellékvesekérget tuberkulózis tette tönkre.
14.1. ACTH-mellékvese tengely, glükokortikoidok
Az ACTH (adrenocorticotrop hormon) termelődését a hipotalamusz által termelt CRF/CRH (Corticotropin
Releasing Factor/Hormon) szabályozza. Az ACTH a hipofízisben termelődő POMC (Pro Opio Melano
Corticotrotin) gén termékének limitált proteolízissel keletkező terméke (14.1. ábra).
14.1. ábra - A POMC és hasítási termékei
Az ACTH molekula 39 aminosavból áll, azonban biológiai aktivitását a 24 N-terminális aminosav is közvetíteni
képes. A POMC gén termékének további hasítási termékei az MSH (melanocita stimuláló hormon), a lipotropin
és az endorfin hatású peptidek (14.1. ábra). Ezen peptidek együttesének biológiai értelme valószínűleg egy
általános stresszadaptációs reakció biztosítása, amely az anyagcsere átcsoportosítása, fájdalom-, fáradtságtűrés
és rejtőzködés révén hozzájárul az élőlény fennmaradásához vészhelyzetekben. Itt mintegy érdekességképp
beékelve szeretnénk röviden ismertetni a magyar vonatkozással is bíró stressz elméletet.
14.2. Selye János stressz elmélete és annak továbbfejlesztése
Mellékvesekéreg rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
156 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Selye János (édesapja révén) részben magyar származású kanadai biokémikus az 1930-as évek közepén,
patkányokon végzett kísérletek során ismerte fel, hogy egészen különböző természetű károsító behatások azonos
(vész)reakciót váltanak ki: ennek tüneteként a mellékvese kéregállománya megnövekszik. A károsító tényezők
között szerepelnek a kémiai ártalmak, sérülés, sebészi beavatkozás, égés, fertőzés, nagyobb izomtevékenység,
hideg, vérveszteség. A későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy ezekben az állapotokban fokozódik az ACTH és a
glükokortikoidok szekréciója. Az aktiválódás idegi (az idegi pályák megszakítása a reakciót megakadályozza), a
CRH neuronok aktiválódását az idegrendszer felől jövő impulzusok indítják meg és tartják fenn. Emberekben a
pszichés megrázkódtatás is hasonló reakciót hoz létre. Selye a kialakult állapotot stressznek, a létrehozó
tényezőket stresszoroknak nevezte el. A kísérleti állatok bizonyos, egyébként nem letális megterheléseknek csak
akkor voltak képesek ellenállni, ha mellékvesekérgük működőképes volt. Így eltávolított mellékveséjű
állatokban közepes vérveszteség letálisnak bizonyult, míg ép mellékvesekéreg esetén ilyen következménnyel
nem kellett számolni. Hiányzó mellékvesekéreg esetén glükokortikoidok adása helyreállította a stresszorokkal
szembeni ellenálló képességet.
14.2. ábra - A CRH-ACTH-glükokortikoid tengely (Az ábra az alábbi link alapján
készült: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/endocrine/adrenal/gluco.html)
Mellékvesekéreg rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
157 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A két különböző megközelítésből azt az összefoglaló következtetést vonták le, hogy a CRH-ACTH-
glükokortikoid tengely aktiválódása és a megnövekedett glükokortikoid szint lehetővé teszi a stresszorok által
okozott ártalom túlélését. A glükokortikoidok szerepe a szervezet túlélésében nem látszik kérdésesnek. A
glükokortikoid védelem egyik lehetséges magyarázata, hogy a glükokortikoidok korlátozzák a stresszorok által
létrehozott védelmi reakciókat, amelyek ellensúlyozás nélkül a szervezet pusztulásához vezetnének. A protektív
hatás lényege a gyulladásos reakciók, az immunreakciók, a citokinek és egyéb mediátorok túlzott hatásának
korlátozása.
A CRH-ACTH-glükokortikoid tengely egyik jellemző vonása a negatív visszacsatolás: az emelkedett CRH-
ACTH szintre bekövetkező glükokortikoid szekréció gátolja a CRH és az ACTH szekrécióját (14.2. ábra).
Mellékvesekéreg rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
158 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Krónikus stressz állapotában azonban – legalábbis állatkísérletekben – ez a negatív visszacsatolás nem, vagy
csak kevéssé érvényesül és a krónikus stresszben fellépő újabb akut stressz állapot az ACTH és a glükokortikoid
szekréció további növekedéséhez vezet. A jelenségnek az a valószínű magyarázata, hogy a krónikusan
fenntartott stressz állapotban jelentősen növekszik a CRH-val együtt szecernált arginin-vazopresszin
elválasztása is, amely utóbbi a CRH-val együttesen fokozza a kortikotróp sejtek ACTH szekrécióját. Az arginin-
vazopresszin szekréciója – szemben a CRH szekréciójával – csak kevéssé érzékeny a glükokortikoid negatív
visszacsatolással szemben. Ez a kombinált CRH-arginin-vazopresszin szekréció biztosítja újabb stressz
alkalmával az újabb ACTH szekréciós többletet.
14.3. Az ACTH-kortizol napszaki ingadozása, fontosabb szabályozókörök
A glükokortikoid hormonok, melyek közül a legfontosabb a kortizol az ACTH hatására szekretálódnak, míg ők
maguk negatív visszacsatolással gátolják az agyalapi mirigy ACTH termelését. Az egészséges emberekben
megfigyelhető napszaki ingadozás az ACTH és a kortizol egymást szabályozó tükörképszerű változásainak
köszönhető. Az ACTH szint reggel 4 és 8 óra között a legmagasabb, ezt követően folyamatosan csökken és
legalacsonyabb értékét 21-22 óra között éri el. Az alvás ébrenlét szokások megváltozása az ACTH cirkadián
ciklus eltolódásában is megmutatkozik. Ahogy a stresszelmélet kapcsán kifejtettük az ACTH szint jelentősen
emelkedik stressz hatására (pl műtéti trauma, lázkeltő anyagok, vérzés, hipoglikémia). A stresszhatás
érvényesüléséhez ép idegrendszeri összeköttetések szükségesek. Nemcsak a stresszhelyzet közvetlen fizikai
megélése, hanem a stresszhelyzetre utaló szóbeli, írásbeli jelzés is kiválthatja a hormonális stressz
válaszreakciót.
Az ACTH meghatározása technikailag nehézkes feladat. Ennek oka az, hogy a hormon féléletideje igen rövid (5
perc körül van), emellett könnyen áldozatul esik proteolítikus enzimek hatásának. Igen erősen tapad üveg
felszínre, ezért ACTH meghatározás céljára a mintát EDTA-t tartalmazó műanyag vérvételi csőbe célszerű
venni. A levételt követően készített plazmát -20 °C-on kell tárolni. A meghatározás immunanalitikai módszerrel
történik. A különböző antitestekkel működő kitek eltérő eredményeket adnak, amely problémát jelenthet a
különböző laboratóriumok (kitek) által kapott eredmények összehasonlítása során. A legjobbak az ACTH N-
terminálisára termeltetett antitestek, mivel ez a rész hordozza a biológiai aktivitást. Természetesen a referencia
tartomány napszak és stressz(állapot) függő.
14.4. Glükokortikoidok
A glükokortikoid hormoncsalád a sztreroid hormon szintézis C21 ágán képződik. Prekurzorai a pregnenolon,
progeszteron, 17α-hidroxi-progeszteron (14.3. ábra). A legfontosabb glükokortikoid hatású természetes szteroid
a kortizol. A kortizol a mellékvesekéreg zona fasciculata és reticularis rétegeiben képződik koleszterinből.
Hatástanilag közeli rokona a kortikoszteron. A glükokortikoid termelés szabályozója az ACTH. A keletkezett
kortizol 90%-a a plazmában transzkortin fehérjéhez, 7%-a albuminhoz kötötten kering. A fennmaradó nagyjából
3%, a szabad, biológiailag aktív hormon. A kötőfehérjék elsősorban a transzkortin mennyiségét befolyásoló
állapotok, a terhesség, az ösztrogénkezelés, az elhízás, az orális fogamzásgátló szedés, az éhezés, a
fehérjevesztéses állapotok. Ezek mind a szabad kortizol mennyiségének megváltozását eredményezhetik. A
kortizol a májban metabolizálódik és több mint 95%-a glükuronsavval konjugálódik (ahogy a kortizon is) és a
vizeletbe szekretálódik. A glükokortikoidok biológiai hatásai szinte a teljes intermedier anyagcserét érintik.
Emlékeztetünk rá, hogy az ACTH-glükokortikoid tengelyt az általános stresszadaptáció részének tekinthetjük. A
glükokortikoidok a vércukorszint emelését eredményezik, elsősorban a glükoneogenezis stimulációja révén.
Ennek szubsztrátját a plazma, izom, kötőszövet állomány fehérjéinek mobilizálása proteolízise során
felszabaduló glikoplasztikus aminosavak szolgáltatják. Emiatt a glükokortikoidok erősen fehérje katabolikus
hatásúak. Ez magyarázza immunszupresszív, kötőszöveti reakcióikat, a sebgyógyulást, hegesedést gátló
hatásukat is, amit elsősorban a szintetikus glükokortikoidok esetében terápiásan is kihasználunk.
A kortizol meghatározásának referenciamódszere a GC-MS-sel történő meghatározás, a klinikai kémiai rutin
laboratóriumban azonban nem ezt használjuk. A klinikai laboratóriumokban immunanalitikai módszerrel
történik meghatározása. Ennek hátránya, limitált specificitása lehet. Ezen tesztek elvégzése előtt a
hordozófehérjékhez kötött hormonmolekulákat szabaddá kell tenni.
A kortizol szintje jelentős napszaki változásokat mutat. Referenciatartománya felnőttekben reggel 8 órakor
levett mintákban 50-250 ug/l. Éjfélkor levett mintában pedig 50 μg/l alatt van.
Mellékvesekéreg rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
159 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
14.3. ábra - Szteroid hormon szintézis (Az ábra az alábbi link alapján
készült:http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg)
14.5. Mineralokortikoidok
A mineralokortikoidok a sóháztartás szabályozásáért felelősek (Na+ visszaszívás és K+ ürítés). A
mellékvesekéreg zona glomerulosa rétegében képződnek a szteroid bioszintézis C21 ágán (14.3. ábra).
Legfontosabb képviselőjük az aldoszteron. A zona glomerulosa egyedülálló módon tartalmazza az aldoszteron
bioszintézis nélkülözhetetlen enzimét az aldoszteron szintázt. Az aldoszteronhoz hasonló hatású hormon még a
deoxikortikoszteron és a 18-hidroxi- deoxikortikoszteron.
A mineralokortikoid szintézis alapvetően a renin-angiotenzin rendszer szabályozása alatt áll, a CRH-ACTH
rendszer csak csekély mértékben befolyásolja.
A renin egy proteolítikus enzim, amely a vese juxtaglomeruláris epitéliális sejtekben szintetizálódik és tárolódik.
Ezek a specializált sejtek a vese glomerulusok afferens artelioláinak terminális része mentén helyezkednek el és
állandó részét képezik a juxtaglomeruláris apparátusnak. A juxtaglomeruláris apparátus stimulációjának
(vértérfogat csökkenése, hiponatrémia, a vese vérátáramlásának csökkenése, stressz hatás) hatására a renin a
keringésbe kerül. Itt hasítja szubsztrátját az angiotenzinogént, egy dekapeptiddé, az angiotenzin I-gyé. Az
angiotenzin I ezt követően a keringésben található angiotenzin konvertáló enzim (ACE) hatására egy
oktapeptiddé, az angiotenzin II-vé hasad. Az angiotenzin II egy hatásos vazokonstriktor, ezen kívül stimulálja a
zona glomerulosa sejtjeinek aldoszteron szintézisét. Az aldoszteron pedig elsősorban a vese disztális tubulusaira
hatva fokozza a nátrium visszaszívást, a kálium és a protonok ürítését, melynek következménye a fokozott
vízvisszaszívás és vérnyomás emelkedés.
Mellékvesekéreg rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
160 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A plazma aldoszteron szintjének meghatározása gondos körültekintést igényel, mivel a mintavétel
körülményeire igen érzékeny: a testhelyzet, a só-, vízfogyasztás sztenderdizálása elengedhetetlen az eredmények
összevetéséhez. Koncentrációja hozzávetőlegesen 3 nagyságrenddel alacsonyabb a kortizol koncentrációjánál,
így a kortizol jelenléte zavarhatja meghatározását. A meghatározás kromatográfiás és immunanalitikai
módszerekkel történhet. A plazma aldoszteronszint ingadozása miatt érdemes lehet a vizelet aldoszteron-18-
glükuronid koncentrációjának meghatározása 24 órás gyűjtött vizeletből.
A reninszint meghatározása sem egyszerű feladat, figyelembe véve a saját és más rokon proteolítikus rendszerek
gyors önemésztő, emésztő hatását. Helyette ezért a renin biológiai aktivitása határozható meg, a keletkező
angiotenzin I, vagy II mennyiségének mérésével. Természetesen ez esetben is nagyon oda kell figyelni a mérés
körülményeinek betartására, még így is nehezen összehasonlíthatóak az egyes laborokban elvégzett mérési
eredmények.
Csökkent aldoszteron produkció előfordulhat a vese elégtelen renintermelése (másodlagos aldoszteron hiány),
az aldoszteron bioszintetikus enzimek öröklött hiánya, illetve szerzett aldoszterin deficiencia (pl. heparin
kezelés) miatt.
14.6. A mellékvesekéreg rendellenességei
A mellékvesekéreg rendellenességeket, a pajzsmirigy rendellenességekhez hasonlóan, aszerint csoportosítjuk,
hogy alulműködés (hipofunkció), vagy túlműködés (hiperfunkció) váltja ki.
14.6.14.6.1. A mellékvesekéreg hipofunkciói
A mellékvesekéreg hipofunkcióit aszerint osztályozzuk, hogy azok elsődlegesek, másodlagosak, vagy
harmadlagosak.
Elsődleges mellékvese hipofunkció
Az elsődleges mellékvesekéreg elégtelenség, amelyet Addison-kórnak is neveznek, hátterében a mellékvese
progresszív destrukciója, vagy diszfunkciója áll, amelyet egyaránt okozhat valamilyen helyi, vagy szisztémás
rendellenesség. Tekintve, hogy a teljes mellékvesekéreg érintett az elsődleges mellékvesekéreg elégtelenségben,
a mellékvesekéreg által termelt valamennyi szteroid csökkent mennyiségű, vagy hiányzik. A klinikai
manifesztáció rendszerint fokozatos és a tünetek súlyossága attól függ, hogy milyen mértékű a mellékvese
károsodása. A korai vagy enyhe elsődleges mellékvesekéreg elégtelenség nem feltétlenül egyértelműen
diagnosztizálható, különösen nem, ha a beteget stressz éri. A teljes glükokortikoid deficiencia levertséget,
fáradtságot, súlyvesztést, gasztrointesztinális zavarokat és posztprandiális (étkezést követő) hipoglikémiát okoz.
A mineralokortikoid hiány dehidratációhoz (kiszáradás), hipotenzióhoz (alacsony vérnyomás), hiponatrémiához
és hiperkalémiához vezet. A negatív visszaszabályozás kiesése miatt (14.2. ábra) az ACTH szint, illetve az
összes POMC hasítási termék szintjének emelkedéséhez vezet, amely a bőr és a nyálkahártyák
hiperpigmentációjához vezet (14.1. ábra). Ez elsősorban az MSH szintjének megnövekedésére vezethető vissza,
amely a melanocitákat stimulálja, így okozva hiperpigmentációt, ezért ezt a kórformát Bronz-kórnak is
nevezték.
Amennyiben a beteg klinikai története és tünetei felvetik az elsődleges mellékvesekéreg elégtelenség gyanúját
bazális ACTH és kortizol szint meghatározása és egy ACTH provokációs teszt elvégzése indokolt. Amennyiben
a bazális ACTH koncentráció meghaladja a 150 ng/l-es értéket és a kortizol szint alacsonyabb, mint 100 μg/l az
diagnosztikus a mellékvesekéreg elégtelenségre. Az ACTH provokációra adott elégtelen kortizol válasz
megerősíti az elsődleges mellékvesekéreg elégtelenség diagnózisát.
Másodlagos, harmadlagos mellékvese elégtelenség
A másodlagos, illetve harmadlagos mellékvese elégtelenség esetén, az elégtelen kortizol produkció hátterében
valamilyen hipofízis, vagy hipotalamusz destrukció következtében kialakuló, csökkent mértékű ACTH
(másodlagos), illetve CRH (harmadlagos) szekréció áll (14.2. ábra). A leggyakoribb harmadlagos elégtelenséget
kiváltó ok a glükokortikoidok gyógyszer formájában történő adagolása miatt kialakuló folyamatos CRH
szupresszió. Ez mind csökkent ACTH felszabaduláshoz, mind csökkent kortizol szekrécióhoz vezet (14.2. ábra).
A másodlagos és harmadlagos elégtelenség az elsődlegeshez hasonló klinikai tünetekkel jár, csak ebben az
esetben (az alacsony ACTH, POMC szint miatt) nem alakul ki hiperpigmentáció és a hipotenzió kevésbé súlyos
Mellékvesekéreg rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
161 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
mértékű (14.2. ábra). Ez utóbbi oka, hogy a mineralokortikoid hiány ez esetben nem alakul ki. Az ACTH
stimulációs teszt ez esetben is segít a másodlagos, harmadlagos elégtelenség diagnosztizálásában.
A CRH stimulációs teszt segít a másodlagos és harmadlagos elégtelenség differenciáldiagnosztikájában.
Amennyiben intravénás CRH komoly ACTH emelkedést idéz elő, harmadlagos, amennyiben csak csekély
emelkedést eredményez másodlagos elégtelenségről beszélhetünk.
14.6.14.6.2. A mellékvesekéreg hiperfunkciói
A mellékvesekéreg hiperfunkciója következtében glükokortikoid, mineralokortikoid és androgén túlsúly alakul
ki.
Cushing szindróma
Az autonóm kortizol túltermelés Cushing szindrómához vezet, amelyre igen jellegzetes tünetek jellemzőek. A
klinikai kép törzsi elhízást, holdvilágarcot, hipertenziót (magas vérnyomás), hirsutizmust, hipokalémiával társult
metabolikus alkalózist, csökkent glükóztoleranciát, reprodukciós rendellenességeket, neuropszichiátriai
tüneteket mutat. A kiváltó ok gyakran iatrogén, a túlzott külsődlegesen bevitt szteroid terápia következménye.
Az endogén okok ez esetben is lehetnek primerek (ACTH független), vagy szekunderek (ACTH függő). A
hipofízis túlzott mértékű ACTH termeléséből fakadó Cushing-szindrómát, Cushing-kórnak nevezzük. Ez felel a
klinikai esetek nagyjából 70%-áért. A Cushing-kór hátterében egy hipofízis mikroadenoma következtében
kialakuló túlzott ACTH szekréció áll, amely a mellékvesék kétoldali hiperpláziájához és kortizol túltermeléshez
vezet. Ektopiás (nem tipikus) ACTH szindrómában nem endokrin tumorok (pl tüdő, bél petefészek, karcinoid
tumorok) termelnek ACTH-t, amely a mellékvese hiperpláziájához, nem regulált kortizol termeléshez és az
agyalapi mirigy ACTH szekréciójának szupressziójához vezet (14.2. ábra). A primer mellékvesekéreg adenoma,
vagy karcinóma következtében kialakult magas kortizol szint szupresszálja mind a CRH, mind az ACTH
szekréciót. Ez a nem tumoros mellékvese szövetek atrófiájához vezet.
A Cushing-szindróma diagnosztikája: A Cushing-szindróma meglehetősen ritka elváltozás, egyes tünetei még
normális mellékvese funkcióval rendelkező emberek esetében is láthatóak, különösen a szindróma korai
fázisában, illetve enyhe eseteiben, ennélfogva/így a diagnózis a laboratórium kezében van, hogy kimutassa a
megnövekedett és autonóm kortizol termelést. Két egyszerű tesztet is alkalmaznak a Cushing-szindróma
diagnosztizálására.
Az első szerint a 24 órás gyűjtött vizeletben határozzák meg a szabad kortizol mennyiségét. (Normális
körülmények között a szekretált kortizol kevesebb, mint 2%-a megjelenik a vizeletben, mint szabad kortizol.
Általában az ily módon ürített kortizol mennyisége kevesebb, mint 100 μg/nap. Ha ez a feltétel megáll,
kizárhatjuk a Cushing szindrómát, amennyiben azonban az ürített kortizol mennyisége meghaladja a 120 μg/nap
értéket a Cushing-szindróma valószínűsíthető. A módszer klinikai diagnosztikai pontossága meghaladja a 90%-
ot, ha pontosan az előírásoknak megfelelően végzik.
A másik teszt során egész éjszakán át tartó alacsony dózisú dexametazon szupressziót alkalmaznak (1 mg
éjfélkor), majd másnap reggel 8 órakor meghatározzák a kortizol szintet. Normálisan ennek 50 μg/l alá kellene
levinnie a kortizol szintet.
Szintén érdemes a kortizol cirkadián ingadozását megfigyelni, ugyanis Cushing-szindrómában szenvedő betegek
esetében a cirkadián ingadozás eltűnik.
14.6.14.6.3. Congentitalis adrenális hiperplázia
A congenitalis adrenális hiperpláziás (CAH) esetek több mint 95%-áért a szteroid 21-hidroxiláz enzimdefektus a
felelős. A hibát a 6-os kromoszóma rövid karján található CYP21 gén mutációi okozzák, melyek az
enzimaktivitás részleges, közel teljes, illetve teljes mértékű kieséséhez vezethetnek. Ennek tükrében a
betegségnek három különböző súlyosságú klinikai formáját különböztetjük meg: a legsúlyosabb sóvesztő (SW),
a közepesen súlyos szimpla virilizáló (SV), és a legenyhébb nem klasszikus (NC) (korábbi nevén: későn
manifesztálódó) formát. A klasszikus formák (SW és SV) gyakorisága Magyarországon 1/15000 élve születés,
míg a nem klasszikus forma gyakorisága ~ 1/1000. A 21-hidroxiláz defektus esetében az enzim által katalizált
progeszteron→11-dezoxikortikoszteron, ill.a 17-OH-progeszteron→11-dezoxikortizol átalakulás sérül, melynek
következtében az aldoszteron és a kortizol keletkezése elégtelenné válik (14.4. ábra). A 21-hidroxiláz defektus
egyike azon kevés betegségeknek, amelyek prenatálisan sikeresen kezelhetők, így a leánymagzatok virilizációja
megelőzhető. Prenatális vizsgálatokat olyan családokban végeznek, ahol már született beteg gyermek. Ilyenkor
Mellékvesekéreg rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
162 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
az anyával az újabb terhesség megállapítása után rögtön dexamethason kezelést kezdenek, ami megakadályozza
a magzat külső nemi szerveinek a magas androgénszint miatti torzulását. A dexamethason a placentán átjutva
szupresszálja a magzati hypophysis ACTH túltermelését, ezzel megelőzve az androgénszint túlzott emelkedését.
Bár a kezelés a magzat virilizációját segít megakadályozni, tartós adása mellékhatásokkal járhat az anyára
nézve, ezért szükség van a magzat érintettségének mielőbbi tisztázására.
14.4. ábra - 21-hidroxiláz defektus a szteroid hormon szintézisben. (Az ábra az alábbi
link alapján készült:http://en.wikipedia.org/wiki/File:Steroidogenesis.svg)
163 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
15. fejezet - Reproduktív rendellenességek laboratóriumi vizsgálata
A szaporodási (reproduktív) endokrinológia magában foglalja a hipotalamusz-hipofízis-gonádok tengelyt, illetve
a mellékvesekéreg hormonjait. Ezek a hormonok elengedhetetlenek a normális reproduktív funkciókhoz és
magukba foglalják a 1. gonadotropin-releasing hormont (GnRH-t), 2. a luteinizáló hormont (LH-t), 3. a
follákulusstimuláló hormont (FSH-t) 4. a számtalan szexuális szteroidot. A szexuális szteroidok a
petefészekben, a herékben és a mellékvesekéregben szintetizálódnak, mind az elsődleges, mind másodlagos
nemi jegyek kialakulásáért felelősek.
A feminin jegyekért felelőseket ösztrogéneknek, a maszkulinokért felelőseket pedig androgéneknek nevezzük.
15.1. Férfi nemi működés (reprodukció)
A herék feladata, hogy mind a spermiumokat, mind az androgéneket szintetizálják. A Sertoli – sejtek központi
szerepet játszanak a spermiumok érésében, illetve inhibint szekretálnak, amely gátolja az FSH hipofízisbeli
felszabadulását. A kanyarulatos csatornái felelősek a tesztikuláris androgének előállításáért, illetve szükségesek
a spermiumok éréséhez.
15.1.15.1.1. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe
A GnRH egy dekapeptid, amely a hipotalamuszban szintetizálódik a hipofízis anterior (elülső) lebenyében, ahol
mind az FSH, mind a LH felszabadulást stimulálja.
Férfiakban mind a GnRH, LH és FSH pulzáló mintázat szerint szekretálódik, nagyobb koncentrációkban a kora
reggeli, kisebb koncentrációkban a késő esti órákban. Az LH a Sertoli-sejtekre hat, fokozza a tesztoszteron
szintézisét. Az FSH pontos szerepe férfiakban ismeretlen, azonban azt tudjuk, hogy a Sertoli-sejtekre hatva
stimulálja a gametogenezist, illetve az inhibin szintézisét és felszabadulását.
A szexuálszteroidok és az inhibin együttesen negatív visszacsatolással gátolják az LH és FSH szekréciót. Az
FSH szint megemelkedhet a Sertoli-sejtek számának csökkenésével, csökkent inhibin szekrécióval járó
állapotokban. Ehhez hasonlóan a Leydig-sejtek számának csökkenése, vagy csökkent tesztoszteron elválasztása
az LH koncentráció növekedéséhez vezet.
Androgének
Az androgének a C19 szteroid ághoz tartozó hormonok.
Funkcióik: Az androgének a genitális traktus maszkulinizációjáért felelősek, a férfi másodlagos nemi jegyek
kifejlődéséért, illetve fenntartásáért. Ezen kívül hozzájárulnak 1. az izomtömeg és 2. a csonttömeg, 3. a libidó, 4.
és a szexuális aktivitás kialakulásáért.
A tesztoszteron a legfontosabb Leydig-sejtek által termelt androgén. Termelődése jelentős mértékben
megnövekszik a pubertás idején. A nők a férfi tesztoszteron - termelés 5-10%-ával rendelkeznek.
A tesztoszteron direkt módon befolyásolja 1. a hang mélyülését, 2. az izomtömeg növekedését és a libidót.
Indirekt hatása van a magas 5 α-reduktáz aktivitással rendelkező szövetekben, itt prekurzorként szolgál a
dihidrotesztoszteron (DHT) számára.
Más, a mellékvesekéreg által termelt androgének:
1. dehidroepiandroszteron (DHEA)
2. dehidroepiandroszteron-szulfát (DHEA-S)
3. androszténdion
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
164 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4. androszténdiol
A gonádok szintén hozzájárulnak az androszténdion és DHEA szintéziséhez. Ezek a szteroidok a
célszövetekben tesztoszteronná és DHT-vé alakulnak.
Az androgének bioszintézise, a pregnenolon koleszterinből történő képződésével kezdődik, az oldallánc
lehasításával. A tesztoszteron bioszintézis útvonala az ábrán látható módon (14.4. ábra), a preferált útvonalat
vastag nyilakkal kiemeltük.
15.1.15.1.2. Androgén transzport a vérben
A tesztoszteron és a DHT mintegy 2-3%-a található meg szabadon a vérplazmában, a többi plazmafehérjékhez
kötődik. Ilyen a specifikus szex hormonkötő globulin (sex hormone- binding globulin: SHBG) és a nem
specifikus albumin. Az SHBG affinitása nagy, kapacitása viszont kicsi, míg az albumin kis affinitással, de nagy
kapacitással bír.
Korábban csak a szabad tesztoszteronnak tulajdonítottak biológiai aktivitást. A jelenlegi nézet szerint azonban a
fehérje-kötött tesztoszteron is (disszociációja eredményeként) megjelenik a kapilláris vérben. Így a biológiailag
hozzáférhető tesztoszteron a teljes tesztoszteron mintegy 35%-a, a szabad és az albuminhoz kötött (vagyis a kis
affinitással gyengén kötött) forma.
15.1.15.1.3. A tesztoszteron metabolizmusa
A keringő tesztoszteron az 5α-reduktáz által katalizált reakcióban a szintén aktív DHT-vé, aromatáz által
katalizált reakcióban pedig ösztradiollá alakul (15.1. ábra). A DHT az androgén célszövetekben, mint például a
bőr és a prosztata képződik. Aromatáz aktivitással számos szövetben találkozhatunk. Perifériásan (mind
férfiakban, mind nőkben) elsősorban a zsírszövetben, ahol nagy az aromatáz aktivitása, ezért a perifériális
aromatáz aktivitás a zsírszövet nagyságával nő
15.1. ábra - a tesztoszteron metabolizmusa
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
165 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A DHT 3α-androszténdiollá, illetve 3α-androszténdiol-glükuroniddá alakul. Ezeket a metabolitokat a DHT-
termelés markereként használjuk. A tesztoszteron, az androszténdion és a DHEA metabolitjai 90%-ban a
vizelettel ürülnek.
15.1.15.1.4. Férfi nemi fejlődés
A férfi reprodukciós fejlődés 4 szakaszra osztható:
1. fötális
2. posztnatális
3. pubertás
4. andropauza
1. fötális
A főtusz a korai embriogenezis során mind a női genitális csővel (Müller-cső), mind a férfi genitális csővel
(Wolf-cső) rendelkezik.
A Müller-cső a 1. petevezetékké, 2. az uterusszá (méhhé), 3. a vagina felső részévé differenciálódik.
A Wolf-cső a 1. spermavezetékké (vas deferens), 2. a mellékherékké, 3. és az ondóhólyaggá differenciálódik.
Fiú főtuszban a tesztoszteron felelős a Wolf-cső fenntartásáért, a virilizációért. A mülleri inhibeáló anyag (MIS)
felelős a Müller-cső visszafejlődéséért. A normális férfi nemi fejlődéshez szükséges 1. a MIS termelés, 2. a
tesztoszteron termelés, 3. a tesztoszteron DHT konverzió, 4. funkcionáló androgén receptorok.
2. posztnatális
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
166 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Születéskor csak kevéssel magasabb a fiúk tesztoszteron szintje a lányokénál, majd nő, 3 hónapig emelkedett
marad, de visszaesik. A pubertásig csak kis mértékkel magasabb, mint a lányoké.
3. pubertás
Az androszténdion, a DHEA és a DHEA-S szintje nőni kezd 6-7 éves kor körül.
A pubertás megkezdődése az LH éjszakai szintugrásaival jár együtt. Kisebb mértékben az FSH esetében is
hasonló tapasztalható.
A hipotalamusz-hipofízis rendszer a pubertással kapcsolatos változások idején kevésbé lesz érzékeny az
androgének feed-back gátló hatására, ennek következtében nő az androgének szintje, amely szükséges a normál
csontsűrűséghez. A pubertás normálisan 16-19 éves kor között lezajlik.
4. andropauza
50 éves életkor felett fokozatos csökkenés tapasztalható a gonádfunkcióban. Az andropauza romló közérzettel,
csökkenő vitalitással és szexuális funkcióval jár együtt. A nőkkel ellentétben nincs teljes gonádfunkció kiesés és
jóval fokozatosabb. Mind a teljes, mind a szabad tesztoszteronszint folyamatosan csökken: egy 80 éves
tesztoszteronszintje például hozzávetőlegesen 60%-a egy 20-50 éves férfiének.
A tesztoszteron koncentráció függ a kortól, az elhízás mértékétől, a napszaktól, a kötőfehérjék (albumin, SHBG)
koncentrációjától.
Meghatározása: A teljes tesztoszteron koncentráció meghatározása a napi rutin diagnosztikában
immunanalitikai módszerrel történik (ELISA). A referenciamódszer a GC-MS. Az LC-MS/MS elterjedésével
arra számítanak, hogy az extrém alacsony tesztoszteron koncentrációk meghatározásához ezt a módszert
alkalmazzák majd.
Az endogén kötőfehérjékről szalicilátokkal, a pH-, hőmérséklet megváltoztatásával, illetve kompetáló
szteroidokkal (ösztron, ösztradiol) lehetséges felszabadítása. A DHT-val a legtöbb tesztoszteron immunassay ad
kisebb mértékű (3-5%) keresztreakciót! Amennyiben a [DHT] = 10-20% tesztoszteron, akkor ez komolyabb
zavart nem okoz. A két legfontosabb androgén, ezért sem gond, ha összemérik őket. A specifikus
meghatározásukhoz előzetes kromatográfiás tisztítás szükséges.
A mintavétel előtt nem szabad gyógyszerterápiás céllal szteroidot, tiroidot, ACTH-t, ösztradiolt, illetve
gonadotropint adni. Néhány esetben indokolt lehet az SHBG meghatározása is.
15.1.15.1.5. Szabad és gyengén kötött tesztoszteron meghatározások
Meghatározásukra számos módszer terjedt el.
DHEA és DHEA-S: A mellékvesekéreg által termelt androgénszintről ad információt. Fontos lehet a következő
kórképek megállapításában: 1. hiperplázia, 2. adrenális tumorok, 3. a mellékvesekéreg túlzott (zona reticularis)
aktivitásából fakadó korai szexuális érés (6-8 éves kor), 4. késői pubertás, 5. hirsutizmus.
A DHEA koncentrációja cirkadián ingadozást mutat (az ACTH ingadozása miatt). A DHEA-S esetében nem
tapasztalható ilyen cirkadián ingadozás a hosszabb cirkulációs féléletidő miatt.
Meghatározásuk elsősorban immunanalitikai eljárásokkal történik, ritkábban GC-vel és kompetitív fehérje-
kötődési vizsgálattal.
Fontos megjegyeznünk, hogy a DHEA-S-sel a DHEA, az androszténdion és az androszteron keresztreakciót
adnak! Az utóbbi kettő alacsony koncentrációjuk miatt azonban nem zavaró. A mintavétel előtt a már ismertetett
szabályok ez esetben is mérvadóak.
15.1.15.1.6. 17-Ketoszteroidok meghatározása vizeletből
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
167 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A 17-Ketoszteroidok (17-KS) a mellékvesék, herék és nőkben az ovárium által szekretált prekurzorok
metabolitjai. Férfiakban 1/3-a here tesztoszteron metabolit, 2/3-a pedig mellékvese eredetű. Nőkben mellékvese
eredetűek. Meghatározásuk célja általában a mellékvesekéreg androgén produkciójának meghatározása.
A vizelet 17-KS maghatározására számos fotometriás eljárás terjedt el. Ezek mind eredetileg Zimmerman
kolorimetriás reakcióján alapulnak, melynek főbb lépései: 1. a 17-KS glükuronát, vagy szulfát savas hasítása, 2.
extrakció, 3. alkalikus mosás, 4. színreakció (17-KS m-dinitrobenzénnel alkoholos KOH-ban, melynek hatására
vöröses ibolya termék jön létre amely 520 nm-en fotometrálható.
15.1.15.1.7. Anabolikus szteroid meghatározások
Doppingolás céljával külsődlegesen visznek be szteroidokat, mint például tesztoszteront és DHT-t. Kimutatásuk
a tesztoszteron/epitesztoszteron (tesztoszteron 17α epimere) arány meghatározásán alapul, amennyiben ez az
arány nagyobb, mint 1 az külsődleges tesztoszteron bevitelre utal.
Más eljárások a vizelet tesztoszteron, LH arány GC-MS-sel történő maghatározásán alapulnak.
15.1.15.1.8. Abnormalitások a férfi reprodukcióban
1. Hipogonadotrópiás hipogonadizmus: a herék csökkent működéséből fakadó korai életszakaszban
manifesztálódó visszamaradt szexuális fejlődés. Hipotalamikus, vagy hiperfizis probléma miatt nem
megfelelő a gonád stimuláció. A kiváltó okok között szerepelhet 1. kongenitális, vagy szerzett hipofízis
alulműködés, 2. hipotalamusz szindrómák, 3. GnRH deficiencia, 4. hiperpolaktinémia, 5. malnutrició, 6.
iatrogén ártalom
Alacsony tesztoszteron és gonadotrpoin szint jellemzi. A leggyakoribb ilyen rendellenesség a a Kallmann-
szindróma, amely egy kongenitális rendellenesség. A szindrómát alacsony GnRH szint jellemzi a
hipotalamuszban az embrionális fejlődés során. Hipogonadizmus és anosmia (szaglási érzék elvesztése)
jellemzi, ötször gyakoribb férfiakban, mint nőkben.
1. Hipergonadotropikus hipogaonadizmus
Ennek hátterében valamilyen gonád diszfunkció áll. Az LH és FSH szint emelkedett, a tesztoszteron szint
csökkent.
A kiváltó okok lehetnek: 1. herekárosodás (irradiáció, betegség, drog következtében), 2. kromoszóma defektus,
3. androgén szintézis enzimatikus defektje, 4. here agenezis, 5. kanyarulatos csatorna betegsége
2. Az androgén hatás defektusa
A háttérben leggyakrabban az androgén receptor defektusa áll, amely tesztikuláris feminizációs szindrómát
okoz. Női habitus alakul ki, mellszövet fejlődik ki. A vagina azonban (természetesen) vakon végződik.
Normális, vagy magas tesztoszteronszint mérhető.
3. Impotencia
Széles organikus és lelki abnormalitás halmaz állhat a hátterében.
4. Ginekomasztia
Jóindulatú, ösztrogén/tesztoszteron túlprodukcióval együtt járó, mirigyes mellszövet burjánzás férfiakban.
Újszülöttekben: 60-90%-ban a placentán átjutó ösztrogén miatt alakul ki.
Pubertás korban: 50-70%-ban ösztrogén irányába eltolt hormonarány miatt alakul ki.
Idős korban 50-80 év: tesztikuláris diszfunkció miatt, vagy elhízás miatt eltolódott hormon arány következtében
alakul ki.
15.2. Női reprodukciós biológia
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
168 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A női reprodukciós rendszer a 1. vaginából, 2. az uteruszból, 3. a petevezetékből, 4. a petefészekből áll. Az
utóbbiból származnak a petesejtek és a női szex hormonok, a progeszteron és az ösztrogén.
15.2.15.2.1. Élettani összefoglaló
Minden lány újszülött megközelítőleg 400.000 follikulust tartalmaz, amelyek mindegyike egy éretlen petesejtet
tartalmaz. Egy felnőtt nő reproduktív élettartama alatt 300-400 follikulust érlel meg. A menstruációs ciklus 14.
napján megérik egy follikulus. Az ovuláció során az érett follikulus megreped és egy petesejtet bocsát a
petevezetékhez közeli térbe. Az ovulációt követően a follikulus granulosa és theca sejtjei a sárgatestté (corpus
luteum) alakulnak. Ezek a luteális sejtek termelik az ösztrogént és a progeszteront.
Amennyiben a megtermékenyülés bekövetkezik, a corpus luteum fennmarad és folytatja az ösztrogén és
progeszteron termelését. Amennyiben nem következik be megtermékenyítés, a sárgatest visszafejlődik és
hegszövet lesz a helyén.
A petevezetékek a méhből vezetnek és elősegítik a spermiumok vándorlását, helyet biztosítva a
megtermékenyítésnek. A megtermékenyített petesejt visszavándorol a méhbe. A méh felé történő transzportot az
endometrium segíti elő, amely ciklikus változáson megy keresztül. A luteális szakaszban megvastagszik és
vaszkularizációja is megnő. A menstruáció alatt az endometrium leválik.
15.2.15.2.2. A hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely szerepe
Felnőtt nőkben a hipotalamusz, a hipofízis anterior és az ovárium között egy szigorúan koordinált feedback
rendszer biztosítja a menstruáció összehangolását. Az FSH stimulálja a follikuláris növekedést, az LH stimulálja
az ovulációt és a fejlődő corpus luteum progeszteron szintézisét.
15.2.15.2.3. Ösztrogének
Az ösztrogének nemi hormonok, amelyek a női nemi szervek, másodlagos nemi jellegek kialakulásáért,
fenntartásáért felelősek. A progeszteronnal együtt szintén részt vesznek a menstruációs ciklus szabályozásában,
a mellek, a méh növekedésében és a terhesség fenntartásában. Az ösztrogének befolyásolják a Ca2+
homeosztázist, kedvezően hatnak a csonttömegre. Csökkentik a csont reszorpcióját, pubertás idején gyorsítják a
lineáris csontnövekedést, az epifízis záródását eredményeznek.
A hosszú távú ösztrogén hiány a csont ásványi anyag tartalmát csökkenti, csonttöréshez illetve
posztmenopauzális oszteoporózishoz vezet.
Az ösztrogének növelik az SHBG koncentrációját. (A lányoknak, fiúknak hasonló az SHBG koncentrációja, de
felnőtt férfiakban a nőkben mérhető fele az SHBG koncentráció.) Szintén növelik a kortikoszteroid kötő, illetve
a tiroxin kötő globulin koncentrációját.
Kémiailag az ösztron alapváz származékai. Szerkezetükben a fenolos A gyűrű és a C-17 pozíciójú O szükséges
a biológiai aktivitáshoz (15.2. ábra). A többi helyen történő szubsztitúció csökkenti a feminizáló hatást.
15.2. ábra - Az ösztrogének
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
169 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
15.2.15.2.4. Biokémia, élettan
Az ösztrogének petefészek follikulus, illetve sárgatest eredetűek lehetnek, azonban terhesség alatt a placenta is
termeli. E mellett a mellékvesék és a herék is termelhetnek minimális mennyiségű ösztrogént.
Az ovárium a szex szteroidok mindhárom osztályát termeli (ösztrogének, progesztinek, androgének). A fő
termékek az ösztradiol és a progeszteron. Az igen kifejezett aromatáz aktivitás miatt gyorsan lezajlik az
androgén (tesztoszteron) ösztrogén konverzió.
Több mint 20 ösztrogént azonosítottak, de mindössze a 17 β-ösztradiolt (E2) és az ösztriolt (E3) határozták meg
a klinikai laborban. A 17 β-ösztradiol (E2) a leghatékonyabb ösztrogén. Szinte kizárólag az ováriumban
szintetizálódik, ezért kiválóan alkalmas ovárium funkciós teszt céljára. A terhesség alatt az ösztrogén szintézis
megváltozik. A placenta lesz a fő ösztrogén bioszintetizáló szerv. Mennyiségileg pedig nagyságrendekkel
megugrik (µg → mg). A placentáris fő ösztrogén az ösztriol lesz, amely a DHEA-S-ből szintetizálódik szulfatáz
és aromatáz aktivitás révén. Csak terhesség alatt releváns a meghatározása, mivel nem terhes nőkben szinte
kizárólag ösztradiolból keletkezik. Down-szindróma szűrésére használatos, mivel az ösztriol szint 0.72-szer
kevesebb a 16. héten, ha a magzat Down-szindrómában szenved.
Ösztrogén transzport a vérben
Több mint 97 %-ban plazma fehérjékhez kötötten szállítódik, SHBG-hez kötve nagy affinitással, illetve
albuminhoz kis affinitással. Az SHBG koncentrációja megnő ösztrogénhatásra, terhességben, fogamzásgátló
tabletta, hipertireózis, antiepilepsziás gyógyszerek pl.: Dilantin hatására. Az SHBG koncentráció csökken
hipotireózis, elhízás, illetve androgén túlsúly esetén.
Ösztrogén metabolizmus: Az ösztradiol ösztronná alakul reverzibilis reakcióban. Az ösztron ezt követően két
alternatív módon alakulhat tovább, elhízás, illetve hipotireózis esetén fokozott ösztriol szintézis, alacsony
testsúly, illetve hipertireózis esetén pedig katekol ösztrogének keletkeznek. Az ösztrogén májban zajló
biotransz-formációja során glükuronsavas konjugáció, illetve szulfatálás során vízoldhatóvá válik és vizelettel
ürül.
Progeszteron
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
170 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Felkészíti a méhet a blasztocita beágyazódásra. Nem terhes nőkben forrása a sárga test, terhes nőkben fő forrása
a placenta lesz (feladata a terhesség fenntartása). Kis mértékben a mellékvesék és férfiakban a herék is termelik.
Kémiailag C21-es szteroid. Szerkezetileg pedig a C3 keto csoport és a C4=C5 szénatomok közötti kettős kötés
szükséges a biológiai aktivitáshoz.
Biokémia, élettan
Bioszintézise a petefészekben az Ac-KoA → koleszterin → pregnenolon úton zajlik. A sárgatestben az LDL-ből
származó koleszterinből indul ki. Itt a folyamat az LH és FSH által kontrollált módon zajlik.
Transzportja a vérben: nincs specifikus transzportfehérje, kortikoszteroid kötő fehérjéhez kötődik, 2-10%-a
található szabadon.
Metabolizmusa: Inaktiválásához redukciója és konjugációja vezet (UDP-GT), majd a vizelettel ürül.
15.2.15.2.5. Női nemi fejlődés
Fötális
Női genotípus esetén nincs tesztoszteron és MIS termelés, ennek következtében a Wolf cső visszafejlődik a
Müller cső fenntartása viszont biztosított. A gonadotropin szint alacsony a magas anyai ösztrogén szint miatt.
Posztnatális
5-7 nap alatt lecsökken a magas anyai ösztrogén szint. 2-5 hónap között egy LH és FSH csúcs tapasztalható,
majd a pubertásig alacsony szinten állapodik meg.
Pubertás
A negatív feedback hatása a férfiakhoz hasonlóan ez esetben is csökken. 8-13 éves kor között megindul a
szexuális fejlődés. Éjszakai LH-FSH csúcsok következtében szexuál szteroid csúcsok alakulnak ki. 16,5 éves
korig az első menstruációnak be kell következnie. Az USA-ban 12,43 éves kor az átlag.
A mellékvese androgének szintje 6-7 éves kor körül megnövekszik lányokban és a pubertásig magasabb szinten
marad. Az ovárium ösztrogén termelése, az uterus és a mellek megnövekedését okozzák.
15.2.15.2.6. Normális menstruációs ciklus
A menstruációs ciklust a vérzés első napjától számítjuk és 2 fáziból áll.
Follikuláris fázis: A follikuláris fázis elején az FSH szint emelkedett, de az ovulációig folyamatosan csökken.
Az LH szekréció a follikuláris fázis közepe táján kezd el emelkedni. Közvetlenül az ovuláció előtt a follikulus
ösztrogén szekréciója hirtelen megugrik, ami serkenti a hipotalamuszt és triggereli az LH hullámot/csúcsot. Az
LH csúcs jó előjelzője az ovulációnak, hisz a hullám kezdete 24-36 órával, a csúcs 10-12 órával előzi meg az
ovulációt. Az ovuláció a 14 nap körül esedékes (15.3. ábra).
15.3. ábra - Normális menstruációs ciklus
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
171 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Luteális fázis: Ez a ciklus második felét fedi le. Folyamatosan emelkedő ösztrogén és progeszteron szinttel
jellemezhető, amelyeket a sárgatest termel, az LH és FSH szint pedig csökken. A progeszteron szint az ovulációt
követő 8. napon tetőzik (8 mg/nap). Ha nem következik be az ovuláció, akkor nincs sárgatest képződés és nincs
ciklikus progeszteronnövekedés.
Amennyiben bekövetkezik a megtermékenyítés a human korion gonadotropin (hCG) fenntartja a sárgatestet és a
progeszteron szint tovább nő.
Megtermékenyítés hiányában a sárgatest elsorvad, csökken az ösztrogén és progeszteron szint és leválik az
endometrium. A menstruáció 4-6 napig tart és átlagosan 30 ml vérveszteséggel jár.
15.2.15.2.7. Női reprodukciós abnormalitások
1. Női pszeudohermafroditizmus: a gonadiális nem és a genitális nem különbözik. Genetikailag nő, de
fenotípusosan különböző mértékben férfi. Újszülöttekben itt, a már mineralokortikoidoknál említett
congenitális adrenális hiperpláziát (CAH) kell megemlítenünk.
2. Korai pubertás: Ebbe a kategóriába a lányoknál 8, fiúknál 9 éves kor előtt kifejlődő másodlagos nemi
jellegek tartoznak, mint a korai mellnagyobbodás, korai szeméremszőrzet, korai nemi szervnagyobbodás. Ha
ezek közül csak egyik jelentkezik és nem jár jelentős csont növekedéssel az nem diagnosztikus, ellenkező
esetben korai pubertásról beszélünk. Két fajtáját különböztetjük meg: 1. GnRH-dependens: korai
hipotalamusz-hipofízis tengely aktiváció 2. GnRH-independens: korai szex szteroid szekréció függetlenül a
hipotalamusz-hipofízis tengely aktivációtól. A hátterében CAH, mellékvese-, ovárium-, illetve here tumor
állhat.
Ösztrogén és mellrák
A korai (első) menstruáció, majd a késői természetes menopauza megnövekedett mellrák kockázattal jár. A
folyamatnak két fázisa van:
1. A prekancerózus állapotot a korai reprodukciós évek petefészek működése inicializálja.
2. A második fázisban a petefészek működése folytatódik, befolyást gyakorolva a már megindult tumor
sejtekre.
Reproduktív rendellenességek
laboratóriumi vizsgálata
172 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A mellrák kockázata nő a korai első menstruációval (nemi érés), késői első teljes (kihordott) terhességgel (30év
fölött), késői menopauza. A 25 éves kor körüli terhesség védő hatású.
Irreguláris menstruáció
Normálisan 28 naponként ismétlődik a menstruációs ciklus. A nőknél 25-30 nap között szokott változni. A
menstruációs vérzés hiányát (amenorrhoea) két csoportra oszthatjuk:
elsődleges: sohasem volt vérzése
másodlagos: menstruált, majd megszűnt a havi vérzése
Elsődleges amenorrhoea: A másodlagos nemi jellegektől függetlenül 16 éves korig nem jelentkezik vérzés. Az
esetek 40%-ban a háttérben Turner-szindróma (55X kariotípus) áll. Ez esetben általában a másodlagos nemi
jegyek sem fejlődnek ki. Ezen kívül a háttérben meghúzódhat gonadiális diszgenezis (46XX vagy 46XY
kariotípussal), Müller cső diszgenezis, vagina és uterus hiánnyal, illetve tesztikuláris feminizáció XY kariotípus
androgén receptor hiánnyal.
Másodlagos amenorrhoea: Legalább 6 hónapig kimaradó menstruáció, olyan nőknél, akik már korábban
menstruáltak., illetve 12 hónapig marad ki olyan nőknél, akiknél oligomenorrhea (rendszertelen, 9-nél kevesebb
menstruáció/év) állt fenn. Leggyakoribb oka a terhesség. Ezen kívül állhat a háttérben tumor vagy iatrogén okok
miatt kialakuló emelkedett prolaktin szint, amely csökkenti az LH és FSH felszabadulást. A háttérben
meghúzódhat hipo-, illetve hipertireózis is.
Az androgén túlsúlyú páciensek esetében különböző mértékben a kelleténél több szőrzetet az arcon, mellen,
hajlatokban, aknéket, illetve túlsúlyt figyelhetünk meg. A háttérben felnőttkori CAH, szekunder Cushing-
szindróma, illetve policisztás ovárium szindróma (PCOS) állhat.
Policisztás ovárium szindróma (PCOS)
A premenpoauzális nők 5-10%-ban jelentkezik, amelynek háttérben valamilyen eddig nem pontosan definiált
hipotalamikus rendellenesség állhat. Hipofízis vagy mellékvese betegségek hiányában fennálló
hiperandrogenicizmus és krónikus anovuláció jellemzi. Jellegzetes tünetei, velejárója a terméketlenség, a
hirsutizmus, a túlsúly (az esetek 50%-ában) és változatos menstruációs rendellenességek (a teljes hiánytól a
rendszertelen vaginális vérzésekig).
A policiszták jelenléte nem feltétlenül szükséges a diagnózishoz. Relatív alacsony FSH és igen magas LH
koncentráció gyakoran megfigyelhető a PCOS-ban. A szérum androszténdion és tesztoszteron koncentráció 50-
150%-kal magasabb, mint normál esetben. A PCOS-ben szenvedő betegek ösztrogén produkciója elegendő, hisz
a periférián az androgéneket ösztrogénné konvertálják. Az anovuláció a folyamatos ösztrogén általi
endometrium stimulációból fakad.
173 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
16. fejezet - Utószó
Reméljük, hogy sikerült, átfogó képet adnunk a laboratóriumi diagnosztika jelentőségéről, szépségéről. A
részletesebb ismeretekre vágyó olvasót arra bíztatjuk, hogy bátran válogasson a tankönyv irodalmi listájában
szereplő szakkönyvek, szakcikkek közül.
A tankönyv a leggondosabb írás és többszöri korrektúra, lektorálást követően is tartalmazhat hibákat. Ezúton
arra szeretném kérni az olvasót, amennyiben hibát észlel, vagy bármilyen javaslata, észrevétele van a
tankönyvvel kapcsolatban, tegye azt meg a következő e-mail címen: [email protected]
Köszönettel
Szarka András
174 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
17. fejezet - Felhasznált és ajánlott irodalom
Ádám Veronika (szerk.): Orvosi biokémia, 3. kiadás, Medicina 2006.
Andreoli; Benett; Carpenter, Plum: Cecil A belgyógyászat lényege. Medicina, 1999.
Bates I., Bain B. J.: Approach to the diagnosis and classification of blood diseases. Chapter 23 in „Dacie and
Lewis: Practical Haematology” (11th edition, Churchill Livingstone, 2002).
Bates S. M., Weitz J. I (2005): Coagulation Assays. Circulation. 112:e53-e60.
Boda Z., Rák K., Udvardy M.: Klinikai hemosztazeológia. 2. kiadás, Springer, Budapest, 2000.
C. Y. Daniel Lee, Jeffrey P. Cantle and X. William Yang (2013) Genetic manipulations of mutant huntingtin in
mice: New insights into Huntington’s disease pathogenesis FEBS Journal 280:4382–4394.
DeRossi SS., Garfunkel A., Greenberg MS.: Hematologic diseases. Chapter 16 in Burket’s Oral Medicine,
Diagnosis and Treatment, 10th edition).
Fonyó Attila (szerk.): Az orvosi élettan tankönyve, 2. kiadás, Medicina, 1999.
Francis O. Walker (2007) Huntington’s Disease. Seminars in Neurology/Volume 27, number2.
Funk DM.: Coagulation assays and anticoagulant monitoring. Hematology Am Soc Hematol Educ Program.
2012: 460–465.
Gáti, Szollár, Szombath (szerk).: Kórélettani Vademecum. Semmelweis Kiadó, 2008.
Halmos Tamás, Jermendy György (szerk.): Diabetes mellitus. A cukorbetegség klinikai vonatkozásai, Medicina,
1997.
Juhász Péter, Dux László: Klinikai laboratóriumi diagnosztika, Springer, 2000.
Machovich Raymund, Mandl József (szerk.): Orvosi patobiokémia, Medicina, 2007.
Maurizio Ferrari, Laura Cremonesi, Paola Carrera and Pierangelo Bonini (1991) Diagnosis of genetic diseases
by DNA technology Pure & Appl. Chem. 63:1089–1096.
McKenzie S. B., Williams JL.: Clinical Laboratory Hematology (2010, 2nd edition).
McKenzie S. B. Textbook of Hematology. (1996, 2nd edition). Carl A. Burtis, Edward R. Ashwood, David E.
Bruns (ed.): Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, 6th edition, Saunders 2007.
Richard A. McPherson, Matthew R. Pincus (ed.): Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods, 21st edition, Saunders, 2007.
S. Blanco, A. Suarez, S. Gandia-PLA, C. Gómez-Llorente, A. Antúnez, J. A. Gómez-Capillam, E. R. Fárez-
Vidal (2008) Use of capillary electrophoresis for accurate determination of CAG repeats causing Huntington
disease. An oligonucleotide design avoiding shadow bands The Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory
Investigation, 68:577–584.
Tadej Pajic Factor V. Leiden and FII 20210 testing in thromboembolic disorders Clin Chem Lab Med
2010;48(Suppl 1):S79–S87.
William J. Marshall: Klinikai kémia, Medicina, 2003.
Zehnder J. L.: Clinical use of coagulation tests. http://www.uptodate.com/contents/clinical-use-of-coagulation-
tests