Klónozás fogalma

Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségévelgazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunkSzubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása

vektor

Hasítás, A,B enzimekkel

A

A

B

B

inszert

ligálás

Transzformálás, felszaporítás,tisztítás

Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni,Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.

Hasítás, A,B enzimekkel

KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLTVEKTORTÍPUSOK

példa inszert méret

plazmidok pUC18,19 < 10 - 15 kbfonalas fágok mp18, 19 < 5 - 10 kbfagemidek pBluescriptKS, SK± < 10 - 15 kb

fágok EMBL3,4 néhányszor 10 kbkozmidok pHC79 néhányszor 10 kb

PLAZMIDOK

replikációs origoORI

rezisztencia marker

Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek

BAC, YAC néhány 100 kbpBAC108L, pYAC3

BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome

NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM

antibiotikum működési mód a rezisztencia módja koncentráció

(µg/ml)

ampicillin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor

a laktamáz elhidrolizálja az ampicillin laktám gyűrűjét

50 -100

klóramfenikol bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S

riboszoma alegységgel

klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt

20

kanamicin bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor

aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz

foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint

30 - 500

tetraciklin bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához

a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud

bejutni a sejtbe

15

PÉLDÁK PLAZMID REPLIKONOKRA PLAZMID INKOMPATIBILTÁSI CSOPORT KÓPIASZÁM GAZDASPECIFICITÁS

pBR322 ColE1 20 E. coli és még néhány

pUC19 ColE1 300 E. coli és még néhány

F plazmid FI 1-2 E. coli és még néhány

pRK356 (R1, R6)

FII 2 E. coli és még néhány

pRK2501 (RK2)

P 1-4 Gram-negatív

baktériumokban széles

RSF1010 Q 10 Gram-negatív

baktériumokban széles

pRK353 (R6K)

X 13-40 Gram-negatív

baktériumokban széles

P1 Y 1-2 Gram-negatív

baktériumokban széles

Egy ősi plazmid: pBR322

Replikációs kontroll

Magas kópiaszámú változat: pUC19

Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása

-antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges

- kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható

- plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos

- polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció

- kék fehér színszelekció,

- pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént megszűnik a letalitás

- auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén

Kolónia hibridizáció

LacZ komplementáció

F' plazmidon: defektív - galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosavközötti régió

bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiótés az 1-146 aminosavat

a kettő együtt: aktív – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep

a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad)ebbe lehet klónozni fragmentumot,

ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment X-gal szubsztráttal fehér telep

Egy pozitív szelekciós vektor

Vektor önligálását, üres vektorok képződését gátló módszerek

- kondicionálisan letális gének használata

- vektor defoszforilálása

-korrekt vektor/inszert arány megválasztása

A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tudösszekapcsolni,ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni

PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI

1. Kémiai transzformálás

Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejtA sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük,sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá

transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNSelvi szám a transzformációt£ 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre

:

normál érték: 106 – 108

nagyon jó: 109

a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők:-oldatok edények tisztasága,- sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete- hősokk hőmérséklete hossza- permeabilizáló faktor

a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé

egyéb fogások:-spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk- a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt

Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők I.

glicerin koncentráció, puffer pH, puffer koncentráció, sók

növesztési hőmérséklet, OD

Transzformálás hatékonyságát meghatározó

tényezők II.plazmid mérete

hősokk hőmérséklete, hossza

permealizáló ágenstárolhatóság

Elektroporáció

A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású 600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-igtranszformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása- az impulzus nagysága, hossza- permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása 

KONJUGÁCIÓ

Sejtből sejtbe történő DNS átadáslépései: párosodás: speciális kontaktus a donor és a recipiens között egy speciális sejtfelszíni ponton keresztül (pl. pilus) DNS átjuttatását közvetítő folyamatok, replikcáció (rolling circle,az egyik szál átjutása)konjugációs elemek

donorból donort csinálaz első ilyen a a szex faktor, F episzóma

másik: IncP csoportba tartozó: RP4, RK2 plazmidok (szilárd fázishoz

mobilizálható plazmidoka recipiensből nem lesz donora plazmid tartalmazza a DNS processzáló apparátust, oriT, mob régió tra gének, pilus: N-acetilált TraA

A KONJUGÁCIÓ MECHANIZUMSA

F pilusF sejt+

5’3’

F sejt-

5’3’

5’3’

5’3’

5’3’

F pilus

az F plazmid eltörik

a DNS egyik szála átmegy a recipiensbe, mialatt a donorba a másik szál szintetizálódik

F sejt+

F sejt+

DNS szintézis a recipiensben

A DNS szintézis befejezõdika sejtek szétválnak

TraI

Töréspont, nick

5’TraI

5’

donor recipiens donor recipiens

TraI

5’

donor recipiens

Egyszálú DNS kötő fehérje

TraC primáz

RNS primer

Replikatív DNS polimeráz

A DNS transzfer mechanizmusa a konjugáció során

Térképezés konjugációval

Konjugatív génátviteli stratégiák

Donor

Akceptor konjugáció

A konjugáció célja

“sima” konjugáció

Irányítottmutagenezis,

homológ rekombináción alapuló integráció

vektor replikációaz utód sejtben

+

-mob

Tn5

RP4 tra

mob

tra

RP4

RP4 tra

mob-

utánelõtt

Random, transzpozon

alapú mutagenezis

Mobilizálható vektorok

Nem tartalmazzák a tra géneket, csak a transzferhez szükséges oriT-ttra gének: integrálva a kromoszómába,

három komponensű konjugáció: sem a donor sejt sem a recipiens nem tartalmazza a transzferhez szükséges géneket, hanem egy harmadik sejt

Ar1Ar2 oriV

Ar2

Ar1

Ar2

oriV

Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis

poláris hatásvad típus mutáns

oriT

oriT

oriV: szűk gazdaspecificitás

Ar: antibiotikum rezisztencia

Ar1oriV

Ar1 oriV

vad típus mutáns poláris hatás ?

Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül

oriV: szűk gazdaspecificitás

oriT

oriT

Ar: antibiotikum rezisztencia