ImmunoassayPemeriksaan Penunjang Imunologi

Putu Oky Ari T.

1. Definisi Immunoassay

2. Prinsip Immunoassay

3. Titer

4. Antiserum

5. Komponen Penting Dalam Immunoassay

6. Kategori Immunoassay

7. Macam Immunoassay

8. Imunohistokimia

1. Definisi Immunoassay

“Immuno” respon imun yang mengendalikan tubuhuntuk memproduksi Ab

“assay” test atau uji

• Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan untukmengukur konsentrasi suatu substansi pada cairan(spesimen bilogikal) menggunakan reaksi antiboditerhadap antigen spesifiknya

• Immunoassay dapat menggunakan satu atau lebih Abuntuk mendeteksi analyte yang diinginkan

• Analyte sesuatu yg diukur dengan tes laboratoriumdapat berupa Ag atau Ab dalam serum

2. Prinsip Immunoassay (Immunological testing)

• Diagnosa suatu penyakit ikatan spesifik Ab-Ag membentuk kompleks Ag-Ab (Imun)

• Serology : menggunakan serum dari Antibodi utkmendeteksi dan mengukur Antigen, atausebaliknya

• Immunoassay: test atau uji yang memanfaatkanreaksi antara Ag dengan Ab

• Pada immunoassays baik Ab monoklonal ataupunpolikonal mendeteksi Ag kompleks Imun(Ag-Ab) tsb dapat diukur secara kualitatif ataukuantitatif

• Pengumpulan sampel yang diuji dapat berasal dari :

– Antigen sample

• Cairan tubuh yang mengandung mikrobapenginfeksi dan toksin mikroba

Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, mucous, etc.

– Blood antiserum sample

• Antisrum/ antisera darah mengandung Ab yang dibentuk host terhadap infeksi tertentu jikapasien terinfeksi oleh patogen yang dicurigaimaka pada serumnya akan mengandung Abterhadap patogen tsb.

3. Titer

• Titer : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum

Dapat digunakan untuk menentukan sejauh manasuatu penyakit mengalami peningkatan padainfeksinya

• Tes Aglutinasi Direct dapat digunakan untukmendeteksi titer Ab pada seseorang

• Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab samasekali lalu Ab meningkat seroconversion.

4. Antiserum (antisera)

• Ketika suatu Ag tertentu (Ag X) diinjeksikan kehewan coba darah dikoleksi serum diisolasi dari darah mengandung banyak Abspesifik Ag XAntiserum

• Penggunaan antiserum cukup efektif terhadappatogen yg mampu menginvasi sistem imun

5. Komponen Penting DalamImmunoassay

1. Spesifisitas Antibodi

2. Valensi Antibodi

3. Aviditas Antibodi

4. Ukuran Kuantitas Antibodi

Spesifisitas Antibodi

• Ikatan Ag-Ab spesifik key-lock• Namun terkadang terjadi reaksi silang Ab

dengan Ag lain yg memiliki struktur miripterjadi jika kemurnian Ag rendah

Ab yang sangat spesifik : yang memiliki bimdingsite yang hanya dimiliki oleh Ag dg strukturmolekul yang unik

Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi :1. Spesifisitas Ab2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg

mengkontaminasi)

Valensi Antibodi

• Jumlah binding site yang potensial dari Abterhadap Ag yg spesifik

• Valensi Ab minimal 2 umumnya

Aviditas Antibodi

• Besarnya kemampuan Ab untuk mengikat Ag

• Ab dg Aviditas besarkecenderunganmengikat Ag yang banyak

• Aviditas refleksi afinitas (besarnya daya ikat) dan jumlah binding site (valensi)

Ukuran Kuantitas Antibodi

• Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahantertentu dalam serum harus dapat diukurdinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu

• Beberapa cara penentuan kadar Ab :1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu

bahan/ Ab dalam serum (uji + atau -)cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahanwarna pada penentuan Hbs Ag secaraELISA

2. Semikuantitatif : kadar Ab atau bahan lain pada serum dengan cara pengenceranserum secara progresif

• Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer

• Cth : uji Widal

3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan denganmembuat kurva baku standar terlebihdahulu terhadap kekeruhan (OD) didapat nilai korelasi

6. Kategori Immunoassay

• Competitive• Noncompetitive• Homogeneous• Heterogeneous

Competitive Format

• Analyte (umumnya Ag) pada sampel yg diujidiukur kemampuannya untuk berkompetisidengan Ag yg dilabel pd immunoassay

• Ag yg tidak berlabel memblok Ag berlabelutk berikatan dengan AbPada kompetitif Immunoassay, lebih sedikit

label yang terukur ditemukan lebih banyakAg tidak terlabel (sampel tes).Jumlah Ag pada sampel tes berhubungan

terbalik dg jumlah label yg terukur

Noncompetitive (Sandwich) Method

• Noncompetitive assay secara umum menunjukkan level tertinggi dlm tingkat sensitivtas dan spesifisitas appicablepada pengukuran marker cardiac dan hepatitis

• Format ini mengacu pada uji “sandwich” analyteberikatan antara 2 reagen Ab yg spesifik

• juga dapat menggunakan metode one or two step• uji two step menggunakan pencucian dimana sandwich

mengikat kompleks yang diisolasi dan dicuci utkmenghilangkan reagen terlabel yg tidak berikatan atausubstansi pengangu lainnya

• two step noncompetitive biasanya memberikan hasildengan spesifisitas dan sensitivitas yg

7. Macam Immunoassay

A. Immunoassay tak berlabel :

1. Uji Presipitasi

2. Uji Aglutinasi

3. Uji Hemaglutinasi

4. Lisis Imun

5. Uji Netralisasi

B. Immunoassay berlabel :

1. Berlabel Flouresens

2. Berlabel Radioisotop

3. Luminescent Assay (LIA)

4. Berlabel Enzim

Immunoasay tak berlabel1. Uji presipitasi

Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya

Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai :

1. Uji presipitasi lempeng/ slide

cth : uji VDRL mikro

2. Uji presipitasi tabung

3. Uji presipitasi tabung kapiler

cth : uji CRP

4. Uji presipitasi cincin

terbentuj cincin presipitasi (uji +)5. Imunoelektroforesis

prinsip sama dengan elektroforesis

2. Uji Agutinasi

• Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel• Macam-macam uji Aglutinasi :

1. Uji Aglutinasi lempengcth : uji Widal Lempeng deteksi Ab thd S. Paratyphi

2. Uji Aglutinasi tabung- Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat

3. Uji Hambatan Aglutinasi utk menentukan Ag larut yg tdk diketahuiidentitasnyacth : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive Hemagglutination Test) utk penentuan HBs Ag

3. Uji Hemaglutinasi• Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah

• Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah

Ab diletakkan pada well pada konsentrasi ygtepat ditambahkan sel darah merah amatipresipitasi yg terjadi antara Ag dan Ab

• Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tesagutinasi

Cth : uji penentuan golongan darah

• Jika darah memiliki Ag bergolongan A aglutinasijika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A

…

Anti-B Anti-A

Sample1

Sample 2

Sample 3

Sample 4

A

B

O

AB

Which blood group?

4. Lisis imun dan Fiksasi Komponen

Aglutinasi tidak selalu terjadi antara Abx terhadap Ag pada permukaan sel

Aglutinasi baru terjadi jika ditambahkan anti-imunoglobulin/ Ab thd Abx

Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemenlisis pada dinding sel

Macam uji lisis imun :

1. Uji Fiksasi Komplemen

cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit

2. Uji Hambatan Fiksasi Kompelemen

5. Uji Netralisasi

• Jarang digunakanmahal dan sukarPrinsip dasar :

• Berbagai pengenceran serum dicampur dg sejumlah tertentu toksin dan suspensimikrobacampuran tsb dibiarkan bereaksi uji reaktivitas toksin dan viabilitas mikroba

Antiktoksin + toksin netralisasi toksin

• Macam uji Netralisasi :1. Netralisasi toksin2. Netralisasi virus :

a. Uji in vivob. uji in Onoc. Uji Pembenihan Jaringand. Plague Reduction Teste. uji Hambatan Metabolik

Uji Netralisasi menggunakan hewan coba-- > experimental Researsch

Immunoassay berlabel1. Berlabel flourescent

• Uji immunoflourescent (IFA) ikatan/ kompleksAg-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaranflouresen dibawah mikroskop

• Immunoflourecent :1. Direct immunoflourescent :

• Ab dilabel dg marker flourescent Ab secaralangsung diberikan pada jaringan yg diinginkan

2. In-direct immunoflourescent• Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji

dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama)

• Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyalfloresen semakin menngkat

antigenFrozen tissue

section

Fluorescent marker

antibody

Direct Immunoflourescent

Indirect immunofluorescece2nd antibody with

label

1st antibodyantigen

Immunofluorescence microscopy of kidney glomeruli

2. Berlabel radioisotop

• uji laboratoris yg sensitif utk penentuankadar beberapa bahan (hormon)

• Diperlukan sampel dg bahan yg sedikitsudah dpt terdeteksi

• Cth : Uji RIA (Radioimmunoassay)

• Radioisotop yg dipakai pada uji RIA : 3H, 14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I

• Semakin sedikit Ag pada sampel semakinsedikit Radioaktif yang ada di presipitat

3. Berlabel luminescent uji immunoluminescent (LIA) prinsip samadg RIA dan IFA, hanya pada LIA label padareaksi Ag-Ab menggunakan luminescent luminescent : a. bioluminescent : kunang2

b. chemiluninescent4. Berlabel enzim pemberian label enzim pada Ag (ELISA)

• Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produkreaksi berwarna (chromogen) – intensitas warnamenunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel

• Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase

First antibody attached to solid support

Add sample containing antigen Incubate Wash to remove unbound molecules

ELISA

Add second antibody with attached enzyme

E

E

Wash to remove unbound second antibody Incubate with enzyme substrate

colourless

coloured

8. Imunohistokimia• Immunohistochemistry (IHC)

mengkombinasikan teknik histologi, imunologidan biokimia identifikasi komponen jaringantertentu dg reaksi spesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg penempelan label

• Ab mengikat Ag secara spesifik• Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein

pada jaringan/ organ di preparat/ slide• Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2

selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis

• The demonstration of a tissue or cellular constituenby detecting spesific antibody-antigen interactions where antibody has been tagged with a visible label/marker

Ranging from fresh frozen cell and sections to heavily fixed paraffin-or resin-embeded whole tissue sample

- fluorescent dye

-hapten

- radioactive marker

- enzyme

Pemberian LabelImmunolabeling

1. Direct Method

Ab Primer

2. Indirect Method

P = peroxidase

AP = alkaline phosphatase

= secondary antibody

= link antibody

P = peroxidase

B = biotin

A = avidin

ABC Method

Visualized antigen-antibody reaction by adding SUBSTRATE & CHROMOGENS

Deteksi apoptosis sel

Pustaka

• Baratawijaya• Handojo, I., 2003, Pengantar Imunoasai Dasar,

Airlangga University Press, Surabaya