Immunohistokemi

Cecilia OttossonLaboratoriemetodik, grundläggande, vt14

Biomedicinska analytikerprogrammet, inr laboratoriemedicin

Litteratur

• Cellular pathology

- kap 10, 13

• Immunohistochemical Staining Methods

(finns i pingpong)

- kap 1, 2, 3, 8, 9 och 17

Immunohistokemi

• Identifiering av vävnadskomponenter med hjälp av antikroppar

• Immunohistokemi – vävnadsproverImmunocytokemi – cellutstryk

• Antigener, ag - epitop

• Antikroppar, ak – Immunoglobuliner (Ig)-plasmaceller (B-lymfocyt)-IgG, IgM

Immunohistokemi

• Polyklonala antikroppar- immunisering av värddjur- ak mot ett flertal olika epitoper

• Monoklonala antikroppar-hybridomteknik-högt specifika, riktade mot endast en epitop

Immunohistokemi

• Bindning ag-ak- samverkan mellan jonbindningar, vätebindningar, Van der Waals krafter och hydrofoba bindningar

• Visualisering av ak- markörer- kovalent bindning- konjugering, biotinylering

Markörer

• Enzymer- horseradish peroxidas (HRP)- alkaliskt fosfatas (AP)

• Horseradish peroxidas- substrat: väteperoxid- PRP: syre- kromogen: DAB (diaminobenzidin)

AEC (aminoetylkarbazol)

• Alkaliskt fosfatas- substrat: α-naftolfosfat- PRP: : α-naftol- kromogen: diazosalter (Fast Red)

Substrat primär reaktionsprodukt (PRP)

PRP + kemiskt ämne slutlig reaktionsprodukt (SRP)

SRP – olöslig (precipitat)

Markörer

• Fluorescerande molekyler- FITC, Texas Red

- fluorescensemikroskop- nackdel: speciellt mikroskopmörkt rumsvårt att orientera sigbleknar med tiden

• Metaller- guld, silver- vid elektronmikroskopi

• Biotin- avidin- ej visualisering!

Ospecifik bakgrund

• Ospecifik inbindning av ak- inkubering med proteinlösning innan ak- normalserum

• Endogent enzymaktivitet- peroxidas – väteperoxid- alkaliskt fosfats - levamisol

• Endogent biotin- avidin

Korsreaktioner

• Ak reagerar med en snarlik epitop på annat ag

• Ak korsbinder till varandra

Spädning av ak

• Optimal spädning – högsta spädningen på ak som ger stark färgningsreaktion med låg bakgrundsfärgning

• Högre affinitet – lägre koncentration (hög spädning)

• Affinitet – dragningskraften/bindning mellan ak-ag

• ”Smarta” spädningar

Inkubering

• Tid

• Temperatur

• Fuktig kammare

Avmaskering

• Formaldehydfixerat, paraffininbäddat material

• Fixering – maskering av antigen

• Enzymatisk behandling- proteolytiska enzymer (trypsin, proteinase K)- kritisk steg: tid för kort tid – ej tillräcklig avmaskering för lång tid – tar bort antigen

• Värmebehandling- mikrovågsugn, tryckkokare- citratbuffert, EDTA-buffert

Metoder i ett och två steg

• Direkt metod- endast en ak- ak märkt med markör- fördel: snabb metod- nackdel: låg sensitivitet

• Indirekt metod- omärkt primär ak- märkt sekundär ak riktad mot primär ak- fördel: känsligare metod, mer ekonomisk- nackdel: långsammare

Metoder i tre steg

• PAP – peroxidas-anti-peroxidas

• APAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas

• ABC – avidin biotin komplex

• LSAB – labelled streptavidin biotin

Enzym-anti-enzymkomplex

• PAP – peroxidas-anti-peroxidasAPAAP – alkaliskt fosfatas-anti-alkaliskt fosfatas

• Naturlig affinitet hos en antikropp mot ett antigen (här: enzym)

- omärkt primär ak- sekundär ak – ”bro”- enzym-anti-enzymkomplex- substrat och kromogen

Avidin-biotin

• ABC (avidin-biotin-komplex)LSAB (labelled streptavidin biotin)

• Avidins höga affinitet mot biotin

- omärkt primär ak- sekundär biotinylerad ak- avidin-biotin/avidin konjugerat med enzym- substrat och kromogen

Immunogold

• Ej naturligt i kroppen

- primär omärkt ak- sekundär ak märkt med guldpartikel- om ljusmikroskopi: intensifiering med silver- om elektronmikroskopi: olika storlekar på guldpartiklarna → dubbelinfärgning

Polymerkonjugerade system

• Dextranmolekyl

• Direkt metod- ex EPOS (Enhanced Polymer One-Step Method)

• Indirekt metod- ex Envision

Kontroller

• Vävnadskontroller- positiv- negativ

• Blank

In situ hybridisering• Lokalisering på vävnad

• Märkta DNA strängar – fluorescense (FISH)kromogen (CISH)silver (SISH)

In situ hybridisering

• Små mängder prober

• DEPC, EDTA, formamid, NaCl

• Förbehandling:- avmaskering av DNA- blockering av ospecifik inbindning