GENİSTEİN’İN POSTNATAL DÖNEMDEKİ SIÇANLARIN OVER VE … · 2019. 5. 10. · Sıçanlarda...

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

GENİSTEİN’İN POSTNATAL DÖNEMDEKİ

SIÇANLARIN OVER VE UTERUSLARI ÜZERİNE

OLAN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Emine GÜVEN

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI

Prof.Dr.Özgül TAP

ADANA-2011

T.C.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

GENİSTEİN’İN POSTNATAL DÖNEMDEKİ

SIÇANLARIN OVER VE UTERUSLARI ÜZERİNE

OLAN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Emine GÜVEN

YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMANI

Prof.Dr.Özgül TAP

Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından

Desteklenmiştir.

Proje No: TF2009YL21

ADANA-2011

iii

TEŞEKKÜR

Tez konumun seçiminde, tez çalışmalarının yürütülmesinde,

değerlendirilmesinde ve yorumlanmasında bana daima destek olan ve eğitimim

sırasında bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan tez danışmanım Prof. Dr. Özgül

Tap’a teşekkürü bir borç bilirim. Ayrıca tez çalışmalarım sırasında yardımlarını

esirgemeyen Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Sait Polat’a,

tüm Anabilim Dalı öğretim üyeleri ve öğretim elemanlarına, Anabilim Dalı

teknisyenleri Günseli Tuygun, Adile Sarıcalar, Nevriz Dural’a saygı ve teşekkürlerimi

sunarım.

İmmünohistokimya çalışmalarım sırasında yardımcı olan Patoloji Anabilim Dalı

Öğretim Üyesi Prof. Dr. Derya Gümürdülü ve Patoloji Anabilim Dalı teknisyeni

Kezban Bostaner’e, deneylerim sırasında yardımlarını esirgemeyen TIPDAM

sorumlusu veteriner Dr. Kenan Dağlıoğlu ve personeline, biyokimyasal kan değerlerinin

ölçümlerinin yapılmasında katkıları olan Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuvar’ı

sorumlusu Prof. Dr. Akgün Yaman ve personeline, Diş Hekimliği Fakültesi Öğretim

Üyelerinden Doç. Dr. Mehmet Kürkçü’ye teşekkürlerimi sunarım.

Birlikte uzunca bir süreyi beraber paylaştığım, her türlü manevi desteğini

esirgemeyen Feray Farsak, Leman Sencar, Gülsüm Küçük’e, yetişmemde ve yaşamımın

her alanında bana sonsuz destek olan, yardımlarını ve özverilerini esirgemeyen sevgili

annem Uray Güven, babam Süleyman Güven ve kardeşim Elifcan Güven’e sonsuz

teşekkürlerimi sunarım.

Yük.Lis.Öğr.Emine GÜVEN

iv

İÇİNDEKİLER

KABUL VE ONAY ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ÇİZELGE DİZİNİ v ŞEKİLLER DİZİNİ vi KISALTMALAR viii ÖZET ix ABSTARCT x 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİ 3 2.1. Sıçanlarda Over Histolojisi 3 2.1.1.Ovarian Folliküller 4 2.1.1.1. Primordiyal Folliküller 4 2.1.1.2. Gelişen Folliküller 5 2.1.1.3. Follikülogenez 7 2.1.1.4. Oogenez 9 2.1.1.5. Ovulasyon 10 2.1.1.6. Korpus Luteum 11 2.1.1.7. Atretik Folliküller 12 2.1.1.8. İnterstisyel Hücreler 13 2.2. Sıçanlarda Over Gelişimi 13 2.3. Sıçanlarda Uterus Histolojisi 15 2.4. Sıçanlarda Östrus Siklus 16 2.5. Sıçanlarda Uterus Gelişimi 18 2.6. Östrojen Reseptörleri 19 2.7. Genistein 20 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 24 3.1. Kullanılan Deney Hayvanları ve Hayvan Bakımı 24 3.2. Deneyin Yapılışı 24 3.3. Kan Örneklerinin Alınışı 25 3.4. Overlerin ve Uterusun Eksizyonu 25 3.5. Işık Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi 26 3.6. Elektron Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi 27 3.7. İstatistiksel Analizler 29 4. BULGULAR 30 4.1. Hayvan Ağırlıkları 30 4.2. Biyokimyasal Analizler 30 4.3. Işık Mikroskobik Bulgular 31 4.4. İmmünohistokimyasal Bulgular 34 4.5. Elektron Mikroskobik Bulgular 40 5. TARTIŞMA 83 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 88 KAYNAKLAR 89 ÖZGEÇMİŞ 94

v

ÇİZELGE DİZİNİ

Çizelge 1. Işık mikroskobik doku takip işlemi 26

Çizelge 2. Elektron mikroskobik doku takibinde dehidratasyon, şeffaflandırma ve

immersiyon işlemi 28

Çizelge 3. Gömme materyali hazırlanışı 28

Çizelge 4. Deney sonunda kontrol ve deney gruplarındaki sıçanların ağırlık (gr)

ortalamaları ve standart sapmaları 30

Çizelge 5. Deney bitiminde sıçanlardan intrakardiyak alınan kan örneklerindeki

serum FSH (ng/ml), LH (ng/ml), östrodiol (ng/ml) ve progesteron

(ng/ml) ortalama değerleri ve standart sapmaları 31

Çizelge 6. Over dokularından alınan seri kesitlerde follikül sayım sonuçları ve

standart sapmaları 31

Çizelge 7. Uterus tabaka kalınlıkları ve standart sapmaları 32

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 1. Kontrol grubuna ait over ve uterus ışık mikroskobik görüntüsü 35

Şekil 2. İkinci gruba ait over ve uterus ışık mikroskobik görüntüsü 36

Şekil 3. Üçüncü gruba ait over ve uterus ışık mikroskobik görüntüsü 37

Şekil 4. Dördüncü gruba ait over ve uterus ışık mikroskobik görüntüsü 38

Şekil 5. İmmünohistokimya 39

Şekil 6. Kontrol grubu. Over yüzey epiteli 50

Şekil 7. Kontrol grubu. Primordiyal follikül 51

Şekil 8. Kontrol grubu. Primer follikül 52

Şekil 9. Kontrol gurubu. Gelişen follikül 53

Şekil 10. Kontrol grubu. Granüloza hücreleri 54

Şekil 11. Kontrol grubu. Atretik follikül 55

Şekil 12. Kontrol grubu. Ovarian stroma 56

Şekil 13. Kontrol grubu. Uterus yüzey epiteli 57

Şekil 14. Kontrol grubu. Endometriyal stroma 58

Şekil 15. Kontrol grubu. Endometriyal bezler 59

Şekil 16. Kontrol grubu. Uterus miyometriyum tabakası 60

Şekil 17. Grup 2. Over yüzey epiteli 61

Şekil 18. Grup 2. Gelişen folliküller 62

Şekil 19. Grup 2. Gelişen folliküller 63

Şekil 20. Grup 2. Uterus yüzey epiteli 64

Şekil 21. Grup 2. Endometriyal stroma 65

Şekil 22. Grup 2. Endometriyal bezler 66

Şekil 23. Grup 3. Primordial follikül 67

Şekil 24. Grup 3. Primer follikül 68

Şekil 25. Grup 3. Gelişen follikül 69

Şekil 26. Grup 3. Atretik follikül 70





vii

Şekil 31. Grup 3. Endometriyal bezler 75

Şekil 32. Grup 4. Over yüzey epiteli 76

Şekil 33. Grup 4. Primordial follikül 77



Şekil 36. Grup 4. Gelişen follikül 80



viii

KISALTMALAR

AMH : Anti Müllerian Hormon

DMSO : Dimetil Sülfoksit

ER-β : Östrojen Reseptörü Beta

FSH : Follikül Stimülan Hormon

GER : Granüler Endoplazmik Retikülüm

hCG : İnsan Koryonik Gonadotropin

IU : İnternasyonel Ünite

IP : İntraperitoneal

IVF : In Vitro Fertilizasyon

LH : Luteinizan Hormon

PMSG : Gebe Kısrak Serum Gonadotropin

TBS : Tris Buffered Saline

TEM : Transmisyon Elektron Mikroskobu

TIBDAM : Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezi

ix

ÖZET

Genistein’ in Postnatal Dönemdeki Sıçanların Over ve Uterusları Üzerine Olan

Etkilerinin Araştırılması

Genistein’e maruz kalınmasının üreme sistemi gelişimi üzerine olumsuz etkileri olduğu bilinmektedir. Sunulan çalışmada, postnatal 1-21 günleri arasında; 4 mg/kg ve 40 mg/kg dozlarda, oral olarak verilen Genistein’in, sıçan over ve uteruslarının postnatal gelişimi üzerine olan etkilerinim ışık ve elektron mikroskobik düzeyde incelenmesi amaçlanmıştır.

Çalışmamızda, 200-250 gram ağırlığında Wistar albino türü 5 ergin, dişi sıçana 20 IU PMSG, 48 saat sonra ise 20 IU hCG i.p. enjekte edilerek, süperovulasyonu sağlandı. Süperovule dişiler ile erkek sıçanlar çiftleştirildi. 21 gün sonra doğan yavruların dişileri ayrılarak, her grupta 5’ er yavru olacak şekilde 4 gruba ayrıldı. 1. gruptaki yavrulara hiçbir madde verilmedi ve kontrol grubu olarak kabul edildi. 2. gruptaki yavrulara DMSO ve mısır yağı, 3. gruptakilere 4 mg/kg Genistein, 4. gruptakilere ise 40 mg/kg Genistein DMSO içerisinde çözülerek, mısır yağı ile birlikte, gavaj ile 21 gün boyunca verildi. 22. günde anestezi altındaki tüm sıçanlardan kan örnekleri alınarak FSH, LH, östradiol ve progesteron değerleri ölçüldü. Alınan over ve uterusla dokuları ise elektron ve ışık mikroskobik incelemeler için doku hazırlama yöntemlerine uygun olarak hazırlandı. Işık mikroskobik incelemeler için hazırlanan overler ER-β’nın gösterilmesi amacı ile immünohistokimya ve H&E ile boyama yöntemi uygulanırken, uteruslar ise Masson trikrom yöntemi ile boyandı. Işık mikroskobik incelemeler sırasında overlerde primordiyal, primer, antral ve atretik folliküller sayılırken, uterusun duvar kalınlıkları İmage J programı ile ölçüldü ve istatistiksel olarak değerlendirildi. Dokular Jeol 1400 TEM ve Olimpus BX 50 ışık mikroskobunda değerlendirilerek, mikrografları elde edildi.

Mikrografların değerlendirmeleri sonucunda, tüm gruplarda normal yapıda folliküllerin yanı sıra atretik folliküllerin varlığı da gözlendi. Ayrıca yüksek dozda Genistein verilen grupta iki veya daha fazla sayıda oositi içeren folliküllerin varlığı saptandı. Gelişen folliküllerin granuloza hücrelerindeki ER-β reseptörlerinin dağılım ve yoğunluğu gruplar arasında bir fark göstermemekteydi. Uterusların değerlendirilmesi sonucunda ise Genistein verilen gruplarda endometriyumu döşeyen epitel hücrelerinin, stromal hücrelerin ve stromanın belirgin yapısal değişiklikler gösterdiği, myometriyum tabakasının kalınlığının arttığı saptandı.

Sonuç olarak yüksek dozda Genistein’in overlerde follikül gelişimini etkileyerek, birden fazla sayıda oosit içeren folliküllerin gelişimine neden olduğu, endometriyumun luminal epitelinde, östrus evresindeki epitel özelliklerine benzer değişikliklere, endometriyal stromada kollajen liflerin artışına, miyometriyumda hiperplazi ve hipertrofiye neden olduğu saptandı. Dolayısı ile bu yapısal değişikliklerin üreme fonksiyonlarını etkileyebileceği dikkate alındığında, bu sıçanların ileriki yaşamlarında fertilitelerinin etkilenebileceği sonucuna varıldı.

Anahtar sözcükler: Over, Uterus, Fitoöstrojen, Genistein, İnce yapı.

x

ABSTRACT

The Effects of Genistein On The Postnatal Development of The Ovary and Uterus

In The Rat

It is known that, exposure to Genistein can cause adverse effects on the development of the reproductive system. In the present study, it was aimed to investigate the effects of Genistein, which was applied orally at 4 mg/kg and 40 mg/kg doses respectively during postnatal 1-21 days, on the development of the rat ovary and uterus with light and electron microscopy.

In this study, 5 adult, female Wistar albino rats, 200-250 gr. body weight, were injected with 20 IU PMSG i.p. and 48 hours later with 20 IU hCG i.p for estrous cycle syncronisation. Then females were mated with male rats. Newly born female puppies were divided into 4 groups each containing 5 pups. Puppies of the first group were untreated and defined as the control group. Puppies of 2nd group was given DMSO and corn oil, 3rd group was given 4 mg/kg Genistein while 4th group was given Genistein dissolved in DMSO and corn oil, via gavage, through 21 days. On postnatal 22nd day, blood samples were taken from the rats under anesthesia for measurement of the serum FSH, LH, estrogen and progesteron levels. Uteri and ovarian tissues of rats were prepared in accordance to the conventional methods of light and electron microscopic technique. While, immunohistochemistry for ER-β and H&E staining methods were applied for light microscopic examination of ovarian tissues, uterin tissues were stained with Masson’s Trichrome method. During light microscopic examination, primordial, primary, antral and atretic follicles were counted, thickness of the uterus wall was measured by Image J and the findings were evaluated statistically. Tissues were examined by Jeol 1400 TEM and Olimpus BX50 light microscope and micrographs were obtained.

Evaluation of the micrographs revealed normal follicles in addition to the atretic follicles. Moreover in the group treated with high dose Genistein, the presence of multioocyte follicles were observed at the forth group. ER-β immunreactivity in the granulosa cells of the developing follicles were similar in all groups. Epithelial cells lining the endometrium and the endometrial stromal cells showed significant structural changes, while myometrial layer was thickened in the rats exposured to the high Genistein dose as a result of the light and electron microscopic evoluation.

As a result, it was concluded that , high doses of Genistein effects follicle growth in the ovaries by causing multioocyte follicles and also effects uteri with oestrus-like uterin epithelial specifications and myometrial hyperplasia. Therefore these structural variations were considered to effect the reproductive function of the rats and may cause infertility in the future.

Key Words: Ovary, Uterus, Phytoestrogen, Genistein, Ultrastructure.

1

1. GİRİŞ

Bitkilerde yaygın olarak bulunan fitoöstrojenleri, izoflavon ve coumestan’lar

olmak üzere iki ana grup altında toplamak mümkündür. Fitoöstrojenlerin en çok bilinen

formu izoflavonlar olup, 70’ten fazla bitki türünde bulunmaktadır(1). İzoflavonlar

grubunda yer alan Genistein en aktif fitoöstrojen olarak bilinmektedir. En yüksek

Genistein konsantrasyonuna sahip bitkilerden birisi soya fasulyesidir(1-4). İnsanlar soya

ve soya katkılı besinlerle beslendiklerinde bu fitoöstrojene maruz kalmaktadırlar. Aynı

zamanda bebekler için satılan bazı katkılı süt ve mamalarda da fazla miktarda

fitoöstrojen bulunmaktadır. Bu gıdalarla beslenen bebeklerin önemli miktarda

fitoöstrojene maruz kaldığı rapor edilmektedir(4).

Fitoöstrojenler vücutta endojen östrojenlere benzer aktivite gösterdiklerinden

hedef organlardaki östrojen reseptörlerine bağlanabilme özelliğine sahiptirler(1,5,6,7).

Yapılan çalışmalarda fitoöstrojenlerin yetişkinlerde; kalbi koruyucu, osteoporozu ve

meme kanserini önleyici yararlı etkileri yanında, kadınlarda ağrılı adet, adet sırasında

aşırı kanama, endometriozis ve miyom oluşumuna neden olabilecek bazı zararlı

etkilerinin de olduğu rapor edilmektedir(8-10). Ayrıca fitoöstrojenlerin dişi üreme sistemi

gelişiminde de önemli etkilerinin olduğu bildirilmektedir. Postnatal dönemde 1-5.

günlerde Genistein’e maruz kalan farelerin overlerinde oositlerin birbirinden

ayrılamadığı ve multi oosit içeren folliküllerin geliştiği, ovulasyonun gerçekleşmediği,

östrus siklusun düzensizleştiği ve infertilitenin geliştiği rapor edilmektedir(11,12). Ayrıca

postnatal dönemde yüksek dozda Genistein’e maruz kalan sıçanlarda uterus ağırlığının

arttığı, ilk ovulasyonu simgeleyen vajinal açıklığın erken geliştiği bildirilmektedir(13).

Gebelik sırasında ve doğum sonrasında anne sütü yolu ile Genistein’e maruz kalan

sıçanlarda ise 2 aylık olduklarında progesteron reseptörlerinin önemli ölçüde arttığı

rapor edilirken, besin yolu ile düşük dozda fitoöstrojen seviyelerine maruz kalan

farelerin fötuslarında “Fötal Östrojenizasyon Sendromu”nun geliştiği

bildirilmektedir(14,15). Yine neonatal dönemde 1-5. günlerde Genistein’e maruz kalan

farelerin overlerinde östrojen reseptörü betanın, östrojen reseptörü alfaya göre daha

baskın bulunduğu ve yaşın ilerlemesi ile reseptör sayısının arttığı rapor edilmektedir(16).

2

Dişi üreme sisteminin önemli komponentleri olan over ve uterusun çevresel

etmenlerden, beslenmeden ve maruz kalınan kimyasallardan kolayca etkilendiği

bilinmektedir. Genistein ile ilgili yapılan çalışmaların genellikle overleri kapsadığı

görülmektedir. Ancak uterusun östrojenin etkilediği hedef organlardan biri olduğu

dikkate alındığında bu konuda çalışmaların oldukça sınırlı olduğu dikkati çekmektedir.

Bu nedenle çalışmamızda postnatal dönemde 21 gün boyunca düşük ve yüksek

dozlarda verilen Genistein’in over ve uterusun postnatal gelişimi üzerine olan

etkilerinin ışık, elektron mikroskobik ve immünohistokimyasal düzeyde araştırılması

amaçlanmıştır.

3

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Sıçanlarda Over Histolojisi

Hem endokrin hem de ekzokrin salgılama yapan overler, dişide bir çift olup,

pembemsi-beyaz renktedir. Her bir over periton katlantısı ile mezovaryuma

tutunmuştur. Üst kısımları pelvik duvara, ovaryan damar ve sinirleri taşıyan suspensor

ligament ile tutunurken, alt kısımları uterusa ovaryan ligamentler aracılığıyla

tutunmuştur(17,18).

Overlerin iki esas görevi bulunur(17-20);

• Olgun yumurta hücresinin üretmek,

• Endometriyumu gebelik için hazırlayan ve fertilizasyon sonrası hamileliğin

devamını sağlayan steroid hormonları üretmek.

Puberte öncesi overlerin yüzeyi pürüzsüz iken üreme periyodu sırasında giderek

düzensiz bir hal alırlar(18). Östrus siklusun farklı basamaklarında yüzey epiteli tek

tabakalıdan çok tabakalıya değişen, farklı morfolojik değişiklikler gösterir(21). Yüzey

hücreleri yassı, kübik veya prizmatik şekilli olabilir(21). Bazı yerlerde epitelyal kriptalar

gözlenir(21). Yüzey epiteli bir bazal lamina üzerine oturur ve onun da altında sıkı bağ

dokusundan oluşan Tunika albuginea yer alır(22). İlerleyen yaş ile birlikte tunika

albugineanın densitesi artar(17). Elektron mikroskobu ile incelendiğinde epitelin periton

boşluğuna bakan apikal yüzeyinde mikrovilluslar bulunur ve seyrek olarak silyuma

sahiptirler. Ayrıca mikrovillusların tabanında, küçük pinositotik veziküller ile yakın

yerleşimli çok sayıda mitokondriyonlar içerirler.

Over kesitlerinde 2 farklı alan ayırt edilir(17, 19-22);

Korteks: Overlerin periferinde, medullanın etrafında yer alır(18). Korteks,

primordiyal, büyüyen ve atretik folliküllerin farklı evrelerini ve değişik büyüklükteki

korpus luteumları içerir(17-22). Ovaryan follikülleri içeren bölge kompakt hücresel

stromadan oluşur(17). Stromada retiküler lif ağları ve iğ şekilli hücreler bulunur. İğ

şekilli hücreler hem fibroblast hem de düz kas hücrelerinin özelliklerini gösterirler ve

yumak şeklinde düzenlenirler. Bu hücrelerin sitoplazmaları ribozom ve

mikrofilamanlarca zengin olup, bol miktarda bulunan mitokondriyonlar, çekirdek

etrafında toplanırlar. Mikropinositotik veziküller hücre yüzeyi ile ilişkilidirler ve az

sayıda lipid damlacıkları içerirler.

4

Stromal hücreler;

• Gelişen yumurta hücresi için yapısal desteklik sağlarlar.

• Gelişen follikül etrafında teka hücrelerine köken oluştururlar.

• Gelişen follikülde steroid hormonları salgılayan hücrelere farklanırlar.

Farklı boyutlarda, her biri bir oosit içeren ovaryan folliküller, korteksin stroması

içine yayılmış halde bulunurlar(9-14). Folliküllerin boyutları, oositlerin gelişim

basamaklarını gösterir(10,13).

Medulla: Overlerin merkezi kısımlarında yer alır(18,21). Medulla, gevşek

fibroelastik bağ dokusu içerisinde çok sayıda geniş kan damarlarını, lenfatikleri ve

sinirleri içerir(17-22).

Korteks ve medulla arasında belirgin bir sınır yoktur(17,18). Hilus bölgesi, ovidukt

ile overleri gevşekçe birbirine bağlar(22).

2.1.1. Ovarian Folliküller

2.1.1.1. Primordiyal Folliküller

Sıçanlarda postnatal dönemde oluşan primordiyal folliküller; over korteksinde

tunika albugineanın hemen altında yerleşim gösterir(22). 17-20 mikron çapında olan

primordiyal folliküller(22), ortasında 11-15 mikron çapında primer oosit ve bunun

etrafında tek sıra halinde sıralanmış yassı folliküler hücrelerden oluşur(22). Primordiyal

folliküllerin içerdiği primer oositin sitoplazmasında, eksantrik yerleşimli büyük bir

çekirdek ve belirgin bir çekirdekçik bulunur(23). Organeller çoğunlukla primer oositin

kortikal veya perinüklear bölgelerinde yerleşmişlerdir. Elektron mikroskobu ile

incelendiğinde primordiyal folliküllerdeki primer oosit sitoplazmasında; lameller tip

kristaları ile açık renkte boyanan çok sayıda mitokondriyonlar, iyi gelişmiş birkaç Golgi

kompleksi, endoplazmik retikülüm ve çok sayıda ribozomlar gözlenmiştir(23).

Primordiyal folliküllerin etrafında primer oositi çevreleyen folliküler hücreler,

yassı şekilli olup primitif evrede stromal hücrelerden ayırt edilemezler. Çekirdekleri

düzensiz ve oval şekilli olup, sitoplazmalarında az sayıda mitokondriyonlar içerirler(18).

Yassı şekilli bu folliküler hücreler birbirlerine desmozomlar aracılığıyla bağlıdırlar(20).

En dış kısımda primordiyal follikülleri stromadan ayıran bir bazal lamina yer alır(20).

5

2.1.1.2. Gelişen Folliküller

Primordiyal folliküllerin büyümesi ile primer oositi çevreleyen yassı folliküler

hücreler kübikleşir(22,24). Primer oositi çevreleyen tek sıralı kübik hücrelere granüloza

hücreleri adı verilir(22). Folliküler hücrelerin kübikleşmesi ile primer folliküller

oluşur(22,24). Primordiyal follikülden primer follikül oluşurken, primer oosit hacmi ve

sitoplazma içerisinde mitokondriyonların sayısı artar(17,18).

Primer folliküllerde oosit merkezi olarak yerleşir ve sitoplazmasında merkezi

yerleşimli bir çekirdek ve çekirdek içerisinde birden fazla çekirdekçik ile germinal

veziküller, Golgi kompleksi, çok sayıda vezikül ve tübül bulunur(23). Ayrıca oosit

yüzeyinde çok sayıda mikrovillus bulunmaktadır(23).

Tek tabakalı granüloza hücrelerini içeren primer folliküle tek tabakalı

(unilaminar) primer follikül adı verilir(20). En küçük primer folliküller 8-13 adet

granüloza hücresi ile çevrili olup çapları 27,5 µm’dir(22). Oositin çapı ise 16,3 µm’dir(22).

Folliküler hücrelerin mitoz ile çoğalıp çok katlı hal alması sonucunda çok tabakalı

(multilaminar) primer folliküller oluşur(20). En büyük primer folliküller ise 25-29 adet

granüloza hücresi ile çevrili olup çapları 63,6 µm’dir(22). Bu büyüklükteki folliküllerde

oositin çapı ise 38,5 µm’dir(22). Kan damarları bazal membranı penetre etmediğinden

granüloza hücreleri avaskülerdir(21). Tek tabakalı granüloza hücrelerini içeren

folliküllerin 50-53 µm’ye ulaştığında granüloza hücreleri ve oosit tarafından

glikoprotein yapısında, refraktil olan zona pellusida tabakası üretilir(21). Zona pellusida,

granüloza hücrelerini oositten ayırır. Primer oositten uzanan mikrovilluslar ve granüloza

hücrelerinden çıkan sitoplazmik uzantılar zona pellusidayı deler ve birbirleriyle geçit

bağlantıları aracılığı ile iletişim kurarlar(23).

Primer folliküllerin büyümesi ile komşu stromada teka hücrelerine farklanacak

olan stromal hücreler belirginleşir. Folliküllerin etrafında teka hücreleri kapsül şeklinde

düzenlenirler(22). 1948’ de Dubreuil’e göre çok tabakalı granüloza hücreleri folliküler

sıvı salgılamaya başladığı sırada teka hücreleri oluşmaktadır(25). Teka hücrelerinin

kapsül şeklinde düzenlenmesi sonucunda oluşan tabakaya Teka folliküli adı verilir(17).

Teka folliküli, granüloza hücrelerinden ince bir bazal lamina ile ayrılır ve yaklaşık 85-

90 µm kalınlığındadır(21). Histolojik preparasyonlarda bazal membran ile

sınırlandırılmış olan granüloza hücreleri kolaylıkla ayırt edilebilirken, bazal membran

ile sınırlandırılmayan teka hücreleri komşu stromal dokudan kolaylıkla ayırt

6

edilemezler(25). Teka folliküli olarak adlandırılan hücresel kılıf daha sonra 2 tabakaya

ayrılır(21). İçte yer alan teka interna; follikülün bazal laminasına komşu, oval veya elips

şekilli çekirdek içeren, 3-4 sıralı, iğ veya polihedral şekilli hücreler içerir(22). İyi

gelişmiş bir kapiller ağa sahiptir. Teka internayı oluşturan hücrelerde belirgin agranüler

endoplazmik retikülüm sisternaları, çok sayıda serbest ribozomlar ve tübüler kristalı

mitokondriyonlar bulunur. Bu hücrelerde ovulasyon öncesinde mitokondriyonların ve

yağ damlacıklarının sayısında artış gözlenir. Dış kısımda yer alan teka eksterna; over

stromasıyla devamlılık gösteren, yassı hücrelere sahip olup, kapsül benzeri bir bağ

dokusu yapısındadır(22). Sıkıca paketlenmiş kollajen lifler ve iğ şekilli hücrelerden

oluşmuştur. Bu hücrelerin sitoplazmaları içerisinde mitokondriyonlar, yassılaşmış az

miktarda granüler endoplazmik retikülüm sisternaları, paralel membranlar ve oldukça

fazla miktarda serbest ribozomlar bulunur(26).

Çok tabakalı primer folliküller büyümeye devam eder ve çapları 200 µm’ye kadar

ulaşır(20). Bu sırada granüloza hücreleri arasında içleri follikül sıvısı ile dolu küçük

boşluklar oluşmaya başlar. Bu boşluklar Call-Exner cisimleri olarak adlandırılır(19).

Folliküler sıvı, plazma bileşenlerini ve follikül hücrelerinden salgılanan ürünleri içerir.

Folliküler sıvı içerisinde glikozaminoglikanlar, steroid-bağlayıcı proteinleri de içeren

bazı proteinler ve yüksek konsantrasyonda steroidler (progesteron, androjenler ve

östrojenler) bulunur(20). Bu boşluklar sıvı birikimi ve hücre proliferasyonu nedeniyle

birleşerek daha büyük, tek bir boşluk olan antrumu meydana getirirler(22). Antrum

oluşumunu tamamlamış follikül artık sekonder (antral) follikül adını alır(17). Sekonder

folliküldeki oositte; mitokondriyonlar yuvarlak veya oval şekilli, oldukça koyu

boyanmış lameller tipte kristalara sahip ve az sayıdadırlar(23). Az miktarda bulunan düz

endoplazmik retikülümler gruplar halindeki mitokondriyonlarla yakın yerleşim

gösterirler(23). Primer oosit çekirdeği içinde bir çekirdekçik ve ökromatin materyali

bulunur(23). Ayrıca primer oosit sitoplazması içerisinde küçük gruplar halinde, birbirine

paralel halde düzenlenmiş, membranöz yapılar olan lamellalara veya sitoplazmik

ışınlara rastlanılmaktadır(23). Antrumun hacmi, intrasellüler alanın uzamasıyla artar(22).

Sekonder (antral) follikülde primer oosit hızla büyür ve çapı 70 µm’ye ulaşır(22) ve

granüloza hücreleri 4-7 tabaka halindedir(21). Antrum oluşumu sırasında granüloza

hücreleri baskıya uğrar ve yeniden düzenlenme göstererek follikül duvarında belirli bir

yerde yoğunlaşırlar(20). Bu hücreler antrum içine doğru büyüme göstererek kumulus

7

ooforus hücrelerini meydana getirirler(20). Bir grup granüloza hücresi de oositi ışınsal

şekilde sararak yüzük şeklinde korona radiatayı oluştururlar(22). Korona radiata, oositin

etrafında 2-4 tabaka halinde granüloza hücrelerinden oluşmuştur ve bir sap ile

membrana granüloza tabakasına bağlanmıştır(21). Sekonder follikülde teka interna, ilk

oluştuğu haline göre daha belirgindir(22). Büyüyen sekonder folliküller, preovulatuar

follikülleri meydana getirirler(22). Yaklaşık 500 µm çapa sahip olan preovulatuar

folliküllerde primer oosit follikül merkezinde bulunur ve germinal vezikül eksantrik

yerleşimlidir(22).

En sonunda folliküller, gelişimlerinin son basamağı olan Graaf follikülü haline

gelirler(20,22). Graaf follikülü oluşumu sırasında granüloza hücrelerinin proliferasyonları

tamamlanır ve likör sıvısında artış meydana gelir(20). Over korteksinin büyük bir kısmı

Graaf follikülleri ile kaplıdır ve folliküller overlerin serbest yüzeylerinden çıkıntı

oluştururlar. Graaf follikülleri LH dalgalanmasından sonra gözlenir(22). Follikülün

duvarında bazal membran yok olmaya başlar ve teka tabakasındaki kan damarları teka

interna içerisinde derinlere girer(22). Sıçanlarda bir follikülün olgunlaşma süresi 4-5

gündür(27).

Bazı araştırmacılar ise follikülleri boyutlarına, genişliklerine ve antrumun

boyutundaki değişikliklere göre 7 evrede sınıflandırmaktadır(28).

Evre I; 2-3 granüloza hücre tabakası ile çevrili preantral follikül,

Evre II; 4-5 granüloza hücre tabakasına sahip preantral follikül,

Evre III; 6-7 granüloza hücre tabakasına sahip preantral follikül,

Evre IV; 8 veya daha fazla granüloza hücre tabakasına sahip preantral follikül,

Evre V; granüloza hücreleri etrafında küçük, açık lakünalar içeren antral kavitenin

erken oluşumunu işaret eden follikül,

Evre VI; oositin her iki yanında veya tek yanında orta hacimde gelişen antral

kaviteli follikül,

Evre VII; geniş ve iyice belirgin antral kaviteye sahip graaf follikülleridir.

2.1.1.3. Follikülogenez

Sıçanlarda doğum gerçekleştikten birkaç saat sonra over içerisinde bulunan oosit

ve destekleyici hücrelerden oluşan ovigeroz kordonlar parçalanmaya başlar(29,30).

Ovigeroz kordonların parçalanması ile ortada bulunan germ hücresini saran

8

pregranüloza hücrelerinin oluşturduğu tek tabakalı yassı folliküler hücreler ve bunların

da etrafını saran, devamlılık gösteren bazal lamina ile çevrili primordiyal folliküller

oluşur(29,31).

Sıçanlarda gebeliğin 18. gününden sonra oogoniumlar mitotik aktivitelerini

kaybederek, geç intrauterin ve erken postnatal dönemde mayoz bölünmeye

başlarlar(27,32). Sıçan overlerinde mayoz bölünme başladığı sırada steroid hormon

üretimi görülmemektedir(27). Postnatal 2. günde mayoz bölünmenin profaz evresinde

diktiyoten safhasına giren oositler dinlenme haline girerler(32). Mayoz bölünmenin

profaz evresinin diktiyoten safhası başladığında steroid hormon üretimi (Follikül

Stimülan Hormon ve Luteinizan Hormon) başlamaktadır(27). Doğum gerçekleştikten

kısa süre sonra Follikül Stimülan Hormon (FSH) seviyesi artarak, postnatal 12. günde

maksimum değerine ulaşmaktadır(27). Artan FSH ve Luteinizan Hormon (LH)

dalgalanmasını takiben postnatal 3. günde primodiyal folliküllerin etrafında bulunun tek

katlı yassı folliküler hücrelerin kübikleşmesi ile overlerin merkezi kısımlarında primer

folliküller meydana gelir(33). Postnatal 3. günde oluşan primer folliküllerin yapısında ilk

kez zona pellusida gözlenir(33). Primer folliküllerin büyümeye devam etmesi ile

folliküllerin etrafını saran stromal hücreler farklaşarak teka interna ve teka eksterna

olmak üzere iki tabakalı teka folliküli yapısını meydana getirir. Teka interna dışında

oluşan teka eksterna ise follikülü koruyucu bir kapsül görevi görmektedir(18). Postnatal

5. günde oositin etrafını saran kübik şekilli çok tabakalı granüloza hücreleri arasında

küçük boşluklar meydana gelir(33). Postnatal 10. günde antruma sahip sekonder

folliküllerin oluştuğu görülmektedir(33). Geniş antral folliküller postnatal 17. günde

gözlenirken, yine postnatal 17. günde gelişen folliküllerin atrezisi sonucunda interstisyel

bezlerin oluşumu gözlenmektedir(33). Postnatal 30-32. günler arasına gelindiğinde ise

postnatal 12. günde ulaşılan FSH ve LH’ın maksimum değerinin 5'te 1'i civarına düşüş

görülmektedir(27).

Sıçanlarda ilk ovulasyon postnatal 35-45. günlerde gerçekleşmektedir.

Ovulasyondan birkaç gün önce ise sıçanlar puberteye girmektedirler(27).

Erişkin sıçanlarda ise kortekste yer alan primordiyal folliküller tükeninceye kadar

düzenli olarak büyüyen folliküllerin havuzuna katılmaktadırlar. Primordiyal folliküller

büyümeye başladıklarında oositin etrafını saran hücreler kübikleşir ve granüloza

hücrelerine farklanırlar. Granüloza hücrelerinin proliferasyonu ile folliküller büyüyerek

9

primer, sekonder ve tersiyer folliküller meydana gelir. Primer ve preantral folliküller

gonadotropinlerin yokluğunda da bulunmalarına rağmen, bu folliküller

gonadotropinlere yanıt oluşturabilmektedirler. Sağlıklı preantral folliküllerin

gelişebilmesi için bu hormonlara ihtiyaç vardır. Buna karşın, antral folliküller daha

sonraki gelişimleri, olgunlaşmaları ve yaşamlarının devamı için gonadotropinlere

gereksinim duyarlar(29).

2.1.1.4. Oogenez

Gebeliğin 14-17. günleri arasında fetus overinde bulunan tüm germ hücreleri

oogonium yapısındadır. Oogoniumların mitoz bölünme geçirerek yeni germ hücrelerini

oluşturmaları gebeliğin 18. gününe kadar devam eder. Gebeliğin 18. gününden sonra

oogoniumlar mitotik aktivitelerini kaybederek, geç intrauterin ve erken postnatal

dönemde mayoz bölünmeye başlarlar(27,32). Gebeliğin 18. gününden sonra oogonialarda

mitoz bölünmenin durması ile oositler mayoz bölünmenin profaz evresinin leptoten

safhasına girerler(27,34). Bu safhada çekirdek içerisinde dağınık, kromatin iplikçikleri

bulunmaktadır(32). Çekirdek aynı zamanda bir veya iki adet çekirdekçik içermektedir(32).

Çekirdek kılıfı dıştan oldukça düzenli görünüp çekirdek porları belirgin olarak

gözlenmektedir(32). Sitoplazma içerisinde Golgi apparatus ve endoplazmik retikülüm

görülmektedir(32). Gebeliğin 19. gününde oositler çoğunlukla mayoz bölünmenin profaz

evresinin zigoten ve erken pakiten safhasına girerler(32). Doğumdan önce 21. günde tüm

oositler mayoz bölünmenin profaz evresinin pakiten safhasına girerler(34). Pakiten

safhasında kromozom çiftleri belirgin olarak kısalıp, kalınlaşmış haldedir(32,34).

Çekirdek kılıfı oldukça düzensiz bir hal almıştır(32). Sitoplazma içerisinde görülen düşük

densiteli alanlarda pek çok mitokondriyonlar görülmekte olup, sitoplazma içerisinde bol

miktarda endoplazmik retikülüm bulunmaktadır(32). Gebeliğin 21. gününün sonunda,

doğum gerçekleştiğinde normal oositlerin yarısı pakiten safhasında kalırken diğer yarısı

mayoz bölünmenin profaz evresinin diploten safhasına girerler(32). Diploten safhasının

süresi diğer safhalara göre daha kısadır(32). Diploten safhasındaki oositlerin çekirdekleri

açık şekilde görülebilmektedir(32). Çekirdek kılıfı artık nispeten düzenli bir hal alır ve

çıkıntılı porlar içermektedir(32). Diploten safhası pakiten safhası ile kıyaslandığında

endoplazmik retikülüm sayısında belirgin şekilde artış görülmektedir(32). Golgi

10

apparatus daha büyük ve kompleks halde olup çok sayıda şişkin veziküller

içermektedir(32).

Postnatal 2. günde mayoz bölünmenin profaz evresinde diktiyoten safhasına giren

oositler dinlenme haline girerler(32). Oositler bu safhaya ulaştıkları sırada kromatin

iplikçikleri boyaya karşı afinitelerini kaybederler, bu nedenle oositler interfaz evresinin

karakteristik özelliğini gösterirler(32). Diktiyoten safhasına giren az sayıdaki oositin

çekirdeği homojen nükleoplazma ile doludur ve iplikçiklerin tüm elektron densliği

kaybolmuştur(32). Çekirdek kılıf genelde düzenlidir ve çekirdek oogonia da görülen

kompleks, yapısal modelini geri kazanmış haldedir(32). Sitoplazmada inklüzyonlar

oldukça fazla sayıda olup multiveziküler ve multilamellar cisimler değişik sayılarda

bulunmaktadır(32).

Birinci mayoz bölünme ovulasyondan hemen önce tamamlanır. Kromozomlar

yavru hücreler arasında eşit dağılır, ancak oluşan yavru hücrelerden biri sekonder oosit

olup, sitoplazmanın hemen hemen tümünü sahip olurken, diğeri birinci polar cisim

olarak adlandırılır(17-20). Birinci polar cisim çekirdek ile çok az miktarda sitoplazma

içeren, çok küçük bir hücredir(17-20). Birinci polar cismin atılmasından hemen sonra,

sekonder oositin çekirdeği ikinci mayoz bölünmeye başlar. Bu bölünme metafaz

evresinde durur(17-20). Metafaz II’ de dinlenme haline geçen oositin bulunduğu

folliküller preovulatuar folliküllerdir. Metafaz II, fertilizasyon ile tamamlanır. Sonuçta

ovulasyon ile atılan hücre, haploid sayıda kromozom taşıyan sekonder oosittir (17-20).

2.1.1.5. Ovulasyon

Dişi sıçanlarda ovulasyon östrus fazından 8-11 saat sonra gerçekleşir(27).

Östrus sırasında, over korteksin büyük bir kısmı olgun (Graaf) folliküller ile

kaplıdır. Olgun folliküller overlerin serbest yüzeylerine yakın yerleşimli olarak

bulunurlar. Olgun folliküller; germinal vezikülün kaybolduğu, metafaz II evresindeki

sekonder oosit varlığı ile karakterizedirler. Bu folliküllere LH dalgalanmasından sonra

gelişir(22).

Ovulasyon gerçekleşmeden önce olgun (Graaf) follikülündeki granüloza hücreleri

daha fazla hiyaluronik asit üreterek gevşek bir hal alırlar. Follikül duvarının bir kısmı,

tunika albugineadaki kollajenlerin yıkımı, iskemi ve bazı hücrelerin ölmesi ile zayıflar.

Ovulasyon anında, folliküllerin bulunduğu overlerin yüzeyine yakın kısımlar incelmeye

11

başlar(22). Bu alanda yüzey epiteli yassılaşır(22). Folliküler sıvı basıncındaki artış ve düz

kas hücrelerinin kasılması sonucuyla follikül dış duvarı yırtılır(20). Oositin serbest

kalması ile ovulasyon gerçekleşir(20).

Folliküler sıvı, kumulus ooforusla çevrili oosit ile beraber peritoneal kaviteye

sızar. Bu sırada; tuba uterinanın saçak şeklindeki fimbria adı verilen kısmı overlere

yaklaşır. Fimbrial kısım ovumu süpürme hareketi ile tuba uterina kanalına iter. Ovumun

tuba uterina içerisindeki hareketi tuba uterinanın yüzey epitelindeki hücrelerin silya

hareketleri ile de desteklenir. Sonuçta ovum fertilizasyonun gerçekleşeceği ampulla

bölgesine ulaşır(17). Her seferde tek bir ovum atılır(17-20).

Ovulasyon 4,5-5 günde bir gerçekleşir(27).

2.1.1.6. Korpus Luteum

Ovulasyon sırasında luteal faz, çok sayıda korpus luteum ile karakterizedir(22).

Ovulasyondan sonra yırtılan follikül duvarı luteinizasyon geçirerek korpus luteum halini

alır(22). Follikül duvarı kollabe olup geçici bir bez yapısı kazanır. Korpus luteum

oluşumu sırasında follikülün bazal laminası yıkılır. Başlangıçta damarsız olan folliküler

hücreler içine kan damarları girer. Antrum boşluğuna kan dolar ve pıhtılaşır. Follikülün

pıhtı dolu lümeni zamanla aşamalı olarak fibrozis geçirir(20). Asıl değişim, granüloza

hücreleri ve teka interna hücrelerinde olur. Granüloza hücreleri genişleyerek granüloza-

lutein hücrelerine dönüşür(21-22). Yaklaşık 20-35 µm çapa sahip olan bu hücreler tipik

steroid sentezleyen hücre özelliği gösterirler(20). Bu hücrelerde lipid damlacıkları,

gelişmiş agranüler endoplazmik retikülüm sisternaları ve tübüler kristalı

mitokondriyonlar gözlenir(18). Granüloza hücreleri granüloza-lutein hücrelerine

dönüştükten sonra FSH ve LSH uyarısına yanıt olarak progesteron ve östrojen

salgılar(18).

Teka interna hücreleri de teka-lutein hücrelerine dönüşür(21,22). Bu hücreler

granüloza-lutein hücrelerine göre daha küçük, yaklaşık 15 µm çapa sahiptirler(20). LH

uyarsına yanıt olarak androstenedion ve progesteron üretirler(19).

Böylece oluşan korpus luteum; merkezinde fibrözleşen kan pıhtısı ve onun

etrafında sarı renkli, lipidden zengin olan granüloza lutein hücreleri ve daha küçük ve

seyrek yerleşimli teka lutein hücrelerinden ibarettir.

12

Korpus luteum büyümeye devam eder ve fertilizasyon gerçekleşmemiş ise

gerileme evresine girer. Her bir siklusta oluşan korpus luteum günlerce varlığını

sürdürür ve overler içerisinde önceki sikluslardan köken alan 3 veya daha fazla korpus

luteum gözlenir(21). Luteal fazın sonunda korpus luteum dejenere olur ve korpus

albikans oluşur(22).

2.1.1.7. Atretik Folliküller

Overlerde gelişmeye başlayan folliküllerin bir kısmı maturasyonlarını

tamamlarken, pek çok follikülün gelişimlerinin kesintiye uğraması sonucunda folliküler

atrezi meydana gelir. Dejenerasyona uğrayan bu folliküllere atretik folliküller adı

verilmektedir(18). Atrezi fetal dönemde primordiyal germ hücrelerinde ve folliküllerde

olabileceği gibi erken postnatal dönemde ve puberteden sonra primordiyal ve gelişme

sürecine girmiş tüm folliküllerde gözlenebilir. Sıçanlarla yapılan çalışmalara göre,

toplam dişi germ hücre populasyonunun sayısı gebeliğin 18. gününde 75.000

civarındadır(34). Fakat bazı oogoniumların atreziye gitmeleri sonucu, normal germ hücre

sayısında % 30 civarında bir azalma olur(32). Ayrıca doğum sırasında oosit popülasyonu

yaklaşık 52.000 iken bunların sadece 39.000' i normaldir. Doğumdan sonraki 2. günde

toplam germ hücresi sayısı 75.000' den 27.000' e düşerken, normal germ hücresi sayısı

64.000' den 19.000'e düşer(34). Böylece mayoz bölünme ve follikül oluşumu sırasında

germ hücrelerinin % 70’i kaybedilir.

Ovaryan atrezinin ardında yatan mekanizmanın asıl nedeninin apopitoz olduğu

bilinmektedir. Primordiyal folliküllerin atrezisi nadir olarak gözlenirken, primordiyal ve

preantral folliküllerde atretik değişiklikler ilk olarak oositte ortaya çıkar(35). Küçük

folliküllerin atrezisi sonucunda over stromasında oluşan boşluk overin stroma tarafından

doldurulur(18).

Geniş antral folliküllerde atrezinin ilk işaretleri ise granüloza hücrelerinde gözlenir

ve bu hücreler; çekirdekte kromatin marjinasyonu, sitoplazmik çıkıntıların oluşumu ve

sitoplazmik vakuolizasyon, sitoplazmik ve nüklear kondensasyon ve fragmentasyon ile

karakterize değişikliler gösterirler(23). Granüloza hücreleri antrum içerisine dökülürken,

granüloza hücreleri arasında makrofajlar bulunur ve teka interna hücreleri hipertrofiye

uğrar. Hipertrofiye uğrayan teka interna hücreleri interstisyel hücreleri oluşturur(18).

Atretik folliküllere ait oositlerin ultrastrüktürel özelliklerinin ise organellerin görünüm

13

ve dağılımında değişiklik, mikrovillusların yitirilmesi ve oositin segmentasyonu ile

karakterize olduğu rapor edilmektedir(23). Granüloza hücreleri ve teka tabakası arasında

yer alan bazal membran, granüloza hücrelerinden ayrılır ve kalınlığı artar. Bu dalgalı

yapıda görülen hiyalin tabakasına glassy membran denir. Bu yapı atrezinin geç

dönemleri için karakteristiktir(18). Gelişimin ileri dönemindeki folliküllerin atrezisi

sonucunda ovaryan stromada oluşan yapı korpus atretikum olarak adlandırılır(18).

2.1.1.8. İnterstisyel Hücreler

İnterstisyel hücreler, atreziye uğrayan folliküllerin teka interna tabakasından

köken alırlar(21). Atrezi artarsa, interstisyel hücrelerin miktarı da artar. İnterstisyel

hücreler küçük, sferikal şekilli, bol lipit damlacıkları içeren hücrelerdir(17). Steroid

salgılayan hücrelerde olduğu gibi bol miktarda, tübüler tipte agranüler endoplazmik

retikülüm sisternaları ve tübüler tipte kristalara sahip mitokondriyonlar içerirler(36).

Golgi kompleksleri küçük veziküller ile ilişkili olup az sayıdadır(36). Ribozomları,

sitoplazma boyunca rastgele dağılmıştır(36). İnterstisyel hücreler; insanda östrojen

üretirken, diğer türlerde progesteron üretirler(17).

2.2. Sıçanlarda Over Gelişimi

Sıçanlarda overler, erken prenatal dönemde gelişmeye başlayıp, postnatal

dönemde de gelişimlerini sürdürmektedirler.

Sıçanlarda gebeliğin 10. gününden itibaren embriyoda genital çıkıntıların

oluşması ile gonadlar gelişmeye başlar(27). Dişi ve erkek gonadları aynı yapılardan

köken alırlar(30). Erkek ve dişide farklanmamış gonadlar mezonefrozun ventrolateral

yüzeyindeki kölomik epitelin kalınlaşması ile ortaya çıkarlar(29,32). Yolk kesesi

duvarında gelişen primordiyal germ hücreleri, göç ederek genital çıkıntılara ulaşırlar.

Mitotik yönden oldukça aktif ve ileride gametleri oluşturacak olan primordiyal germ

hücreleri gebeliğin yaklaşık 8. gününde allantoise yakın yolk kesesi endoderminde

oluşurlar(27,34). Gonadlar dışında oluşan primordiyal germ hücreleri 9. günde pasif

transfer ile son bağırsağın endodermal epiteline gelirler, daha sonra gebeliğin 10-12.

günleri arasında ameboid hareketler ile dorsal mezenter boyunca hareket ederek, 10-11.

günlerde gelişen gonadlar içerisindeki nihai yerlerine ulaşırlar(27).

14

Gebeliğin 11.gününde gonadlar içerisine ulaşan primordiyal germ hücrelerinin

elektron mikroskobik incelemelerinde kölom epiteli ile doğrudan ilişkili oldukları rapor

edilmiştir(30). Yine primordiyal germ hücrelerinin yuvarlak çekirdeğe sahip oldukları ve

çekirdek içerisinde belirgin 1-2 adet çekirdekçiğin bulunduğu gözlenmiştir(30).

Primordiyal germ hücrelerinin sitoplazmasında iyi gelişmiş Golgi kompleksinin,

sferikal şekilli mitokondriyonların, granüler endoplazmik retikülüm sisternalarının,

membranla çevrili granüllerin, polizomların ve örtülü veziküllerin olduğu rapor

edilmiştir(30).

Gebeliğin 12. gününde, kölomik epitel prolifere olarak subepitelyal alana doğru

ilerler ve burada primordiyal germ hücreleri ile ilişkili hale gelerek ovigeroz kordonları

oluşturur. Ovigeroz kordonlar over yüzey epiteli ile devam eder. Ovigeroz kordonlar

ince bir bazal lamina ile çevrilidir ve dış tarafta mezenşimal hücreler tarafından

sınırlandırılmıştır. Böylece farklanan over, erken dönemde ovigeroz kordonlar ve

interstisyel doku şeklinde iki farklı kompartman olarak organize olur(29). Hem germ

hücrelerinin, hem de somatik hücrelerin proliferasyonu genital çıkıntıların hızla

genişlemesine neden olur(27).

Fetus overinde ovigeroz kordonlar içerisindeki oogoniumların hücre membranı ve

çekirdek kılıfı düzenlidir. Genellikle eksantrik yerleşim gösteren çekirdek, sitoplazmaya

göre daha iyi görünen, elektron dens, granüler bir nükleoplazmaya sahiptir(32). Eksantrik

yerleşimli, geniş ve sferikale yakın şekle sahip olan çekirdek, bir veya daha fazla sayıda

geniş çekirdekçik içermektedir(32,34). Çekirdekçik kaba, düzensiz ve parçacıklar halinde

partikül ağı ile karakterizedir(32). Mitokondriyonlar büyük ve oval şekle sahip olup,

değişik sayıda paralel kristalar içermektedirler(32). Golgi kompleksi juxtanüklear

yerleşimli olup, multiveziküler cisimler ile yakın yerleşimlidir(32). Bir veya daha fazla

sayıda sentriyol görülmektedir(32). Komşu oogonia hücreleri arasında, değişik genişlikte

hücresel devamlılığı sağlayan köprüler bulunmaktadır(32).

Doğum gerçekleştikten birkaç saat sonra over içerisinde bulunan ovigeroz

kordonlar parçalanmaya başlar(29,31). Kordonların parçalanması için öncelikle kordonlar

içerisinde bulunan germ hücreleri, pregranüloza hücreleri ve bunların yanı sıra

kordonlar arasında bulunan interstisyel doku içerisindeki mezenşimal hücrelerden,

kordonların etrafını saran bazal laminanın parçalanması için proteaz enzimleri salınır(31).

Bazal laminanın parçalanması ve kordonlar içerisinde bulunan germ hücrelerinin bir

15

kısmının apopitoza uğramaları sonucu ovigeroz kordonlar küçülmeye başlar(29).

Kordonlar içerisindeki germ hücrelerinin de apopitoza uğramaları ile oosit grupları da

küçülmeye başlar. Sonuçta ortada bulunan germ hücresini saran pregranüloza

hücrelerinin oluşturduğu tek tabakalı yassı granüloza hücreleri ve bunlarında etrafını

saran, devamlılık gösteren bazal lamina ile çevrili primordiyal folliküller oluşur(29).

Doğum gerçekleştiğinde overler böbreklerin kaudal kısmında, ekstra ovaryan

reteyi kuşatan kısa bağ dokusu ligamenti ile asılı haldedir. C şeklinde bulunan overlerde

postnatal 1. ve 2. günlerde belirgin kortikal ve medullar alanlar gözlenmektedir. Over

medullasının merkezinde bulunan stromal hücreler overin periferine doğru yayılım

gösterirler(37).

Postnatal 3. günde primodiyal folliküllerin etrafında bulunun tek katlı yassı

granüloza hücrelerinin kübikleşmesi ile overlerin merkezi kısımlarında primer

folliküller oluşmaktadır. Antral folliküller postnatal 17. günde meydana gelirken, yine

postnatal 17. günde gelişen folliküllerin atrezisi sonucunda interstisyel bezlerin oluşumu

gözlenmektedir(33).

Sıçan overinde Mayoz bölünmenin profaz evresinin diktiyoten safhası

başladığında steroid hormon üretimi başlamaktadır. Doğum gerçekleştikten kısa süre

sonra FSH seviyesi artarak, postnatal 12. günde maksimum değerine ulaşmaktadır.

Postnatal 30-32. günler arasına gelindiğinde ise postnatal 12. günde ulaşılan maksimum

değerin 5'te 1' i civarına düşüş görülmektedir(27).

2.3. Sıçanlarda Uterus Histolojisi

Sıçanlarda uterus bicornis yapıda olup, 2 adet cornu uteri ve 1 adet cervix uteriden

oluşmaktadır(38). Uterus duvarı; endometriyum, miyometriyum ve perimetriyum olmak

üzere üç tabakadan ibarettir(17-20).

• Endometriyum; uterusun iç kısımdaki mukozal bölümdür ve duktus

mezenşiminin iç tabakasından meydana gelmektedir. Histolojik olarak

endometriyum luminal ve glandular olmak üzere iki tip epitel içerir. Bunlar

sıkıca organize olmuş stratum compactum ve daha gevşek organize olmuş, aynı

zamanda kan damarları ve immün hücreleri içeren stratum spongiosum adı

verilen iki stromal bölüm ile desteklenir.

16

• Miyometriyum; uterus duvarının düz kas kısmı olup, duktus mezenşimal

hücrelerinin ara tabakasından meydana gelen iç sirküler kas tabakasını ve

perimetriyumun altındaki mezenşimden meydana gelen dış longitudinal kas

tabakasını içermektedir.

• Perimetriyum; uterusun en dışta yer alan tabakası olup, visseral periton ile

örtülüdür. Mezotel ve ince gevşek bağ dokudan oluşur.

Endometriyum sıçanlarda görülen östrus siklusla bağlantılı olarak değişiklikler

gösterir. Diöstrus evresinin başında, uterus küçük ve inaktif durumdadır ve lümeni oluk

şekilde görülmektedir(39). Uterus epiteli, alçak kübik veya prizmatik epitel ile

döşelidir(39). Diöstrus evresinin başlarında bezler inaktif durumda iken devamında

bezlerin aktivitesinde artış görülmektedir(39). Diöstrus sonuna doğru ise endometrial

epitele bitişik, stromada hafif ödem görülebilmektedir(39). Proöstrus evresinde, uterus

endometriyum epitel hücelerinin boyları uzayarak kübikten prizmatiğe doğru değişim

göstermektedir(39). Proöstrusun sonuna doğru endometriyal kan damar ağı göze

çarpmaktadır ve stromada ödemin görülmesi ile uterus lümeni belirgin şekilde

genişlemektedir(39). Östrus evresinin başlangıcında endometriyal epiteldeki

değişiklikler, ilk olarak bezlerdeki hücresel dejenerasyon ile olmaktadır. Bu mitotik

aktivite ve lökosit infiltrasyonu ile birlikte gerçekleşir(39). Geç östrus evresinde uterus

lümeni genişlemeye devam eder(39). Östrus sonunda endometriyal epitelde mitotik

aktivite yeniden kazanılır(39). Metöstrus evresinde ise östrus evresinde yeniden

kazanılan mitotik aktivite devam eder(39).

2.4. Sıçanlarda Östrus Siklus

‘Estrus’ kelimesi yunanca kökenli ‘oistros’ kelimesinin Latince adaptasyonu olup

coşkunluk, çılgınlık anlamındadır(27,39). İlk olarak 1900 yılında Heape tarafından

kullanılan bu terim seksüel isteklerin olduğu özel periyod olarak tanımlanmıştır(27,39).

Dişilerin cinsel arzulamaya özgü periyodlarını ifade eden bu dönemi Heape 4

bölümde ifade eder(27,39). Sıçanların üreme sistemleri postnatal 4. haftadan önce

inaktiftir(39). Dişi sıçanlar cinsel olgunluklarının başından 12 aylık oluncaya kadar siklus

uzunlukları yaklaşık 4-5 gün sürer(40-42). Fakat 1 yıl sonra sıçanlarda uzayan progesteron

sekresyonundan ötürü östrus ve diöstrus fazlarının sürelerinin uzamasına bağlı olarak

siklus uzunlukları artar (41) ve üreme hayatının sonuna doğru 6 gün sürer(42). Düzenli

17

olan sikluslar düzensiz hale gelir ve birbirlerini takipleri aksar(41). Aynı zamanda

sikluslar fotoperiyodik kontrol altındadır(27,42). LH salınışındaki değişiklik ilk

proöstrusdan 8-9 gün önce görülür(39). Sıçanların LH salınım modunda iken anöstrus

fazında oldukları düşünülür(39). Sonra ilk proöstrus, östrus, metöstrus ve diöstrus fazları

takip eder(40,41). Üreme organlarının dinlenmede olduğu, çiftleşmenin gerçekleşmediği

periyod Anöstrus olarak tanımlanır(27). Bu periyodun ardından ön anlamında kullanılan

pro- ekiyle Proöstrus periyodu gelir. Bu dönem hayvanların kızgınlık dönemini ifade

ederken yaklaşık 12-14 saat sürer(27,41). Proöstrusdan sonra yaklaşık 25-27 saat süren

östrus periyodu gelir ki bu periyod erkeğin kabul edildiği dönemdir(27). Östrus sırasında

overde, dejenere korpus luteumlar sık olarak bulunurken yeni şekillenen korpus

luteumlar küçüktür. Merkezi fibröz doku genelde görülmez(39). Bunun ardından gebelik

gerçekleşmez ise metöstrus periyodu gelir. Metöstrus yaklaşık 6-8 saat sürer ve yine

erkek reddedilir. Metöstrusu, yaklaşık 55-57 saat süren diöstrus periyodu takip

eder(27,41). Diöstrusda ovumun implantasyonu için ovaryan sekresyonlar üreme yollarını

hazırlar. Fertilizasyon gerçekleşirse gebelik dönemi yaklaşık 21-23 gün sürer(38).

Gebeliğin olmaması halinde siklus tekrar başa döner, yeniden proöstrus safhası başlar.

Tüm foliküller metöstrus evresinde maksimum sayılarına ulaşırken proöstrus

evresinde minimum sayıya ulaşırlar. Proöstrus evresinde birçok follikül Evre I-V

arasındadır. Yine de östrus, metöstrus ve diöstrus evrelerinde tüm follikül grupları

gelişir. Proöstrus evresinde Evre V’ de folliküllerinin sayıları maksimumdur(21).

Metöstrus ve diöstrus evrelerinde atretik folliküllerin sayısı çok fazla iken

proöstrus ve östrus evrelerinde atretik folliküllerin sayıları daha azdır(21).

Siklus değişimler sırasında; proöstrus fazının ortalarında prolaktin, FSH ve LH

seviyeleri artışa geçer. Metöstrus fazında östradiol seviyesi artmaya başlar, proöstrus

fazı boyunca en yüksek seviyelerine ulaşır ve östrus fazında başlangıç seviyesine döner.

Östradiolün azalmasından sonra metöstrus ve diöstrus fazlarında progesteron

sekresyonu artar. Proöstrus fazının sonunda progesteronun 2. kez en yüksek seviyeye

ulaşmasına rağmen progesteron değeri yükselir(40).

Overde tüm siklus safhalarında foliküllerin tüm gelişim basamaklarını görmek

mümkündür(39). Kısa östrus siklusa sahip olan sıçanlarda siklus basamaklarını tayin

etmede en iyi belirteç korpus luteumların morfolojileridir(39). Çünkü overler içerisinde

her ovulatuar siklusta bir önceki ovulasyona ait korpus luteumları görmek mümkündür.

18

2.5. Sıçanlarda Uterus Gelişimi

Gonadların oluşumlarından farklı olarak erkek ve dişi üreme yolları Wolfian ve

Müllerian duktuslardan meydana gelmektedir. Wolfian duktus mezonefrozun boşaltıcı

duktusu olup gonadlar oluşmadan önce mevcuttur. Müllerian duktus ise gonadların

oluşumu sırasında, kranial-kaudal yönde Wolfian duktus boyunca gelişmektedir.

Cinsiyetin farklaşması tamamen bu duktusların gelişimlerine bağlıdır(27).

Duktusların farklaşmalarının erken basamağında, hem Wolfian hem de Müllerian

duktuslar yassıdan silindiriğe değişen hücreleri içeren tek tabakalı, basit, düz tübül

yapısındadır. Duktuslar gelişirken, bazal kısımda yerleşim gösteren çekirdeğe sahip olan

epitel hücrelerinin boyları uzar(27).

Sıçanlarda Müllerian duktus, cinsiyet farklaşması sırasında, yani gebeliğin 14.

gününde küçük lümene sahiptir. Lümeni döşeyen prizmatik hücreler serbest

ribozomlardan zengin olup, supranüklear yerleşimli ve iyi gelişmiş Golgi apparatusa

sahiptirler. Epitel hücrelerinin gelişimi ile paralellik gösteren mezenşimal hücreler,

duktuslar etrafında konsantrik tabakalar halinde düzenlenirler(27).

Erkeklerde, testisten salınan testosteron, Wolfian duktustan; epididimis, vas

deferens ve seminal veziküllerin oluşmasından sorumlu iken yine testisten salınan Anti-

Müllerian Hormon (AMH) ise Müllerian duktusun erkekte gerilemesinden

sorumludur(27).

Dişilerde, duktuslar farklanacağı sırada ne testosteron nede AMH bulunur(27).

Testosteron yokluğuna bağlı olarak Wolfian duktus dejenere olurken, Müllerian duktus

gelişmeye devam eder ve Müllerian duktusun kranial kısmından fallop tüpleri, orta

kısmından uterus ve kaudal kısmından ise vajinanın kranial kısmı gelişir(21,43). Dişilerde

Müllerian duktus bicorni yapısını oluşturacak şekilde ikiye bölünür ve öylece kalır.

Uterusun farklanması, fallop tüpleri ile aynı zamanda başlamaktadır. Uterus çapının

beklenmedik artışı nedeniyle uterus ve fallop tüpleri arasındaki bağlantı alanı erken

dönemde belirgin hale gelmektedir(27).

Tüm memeli türlerinin uterus gelişimi sırasında ortak olan bazı morfogenetik

olaylar vardır(43):

1. Endometriyal stromanın katmanlara ayrılması ve organizasyonu,

2. Endometriyumun farklılaşması ve miyometriyumun gelişimi,

3. Endometriyal bezlerin gelişiminin düzenlenmesidir.

19

Sıçanlarda gebelik süresi 21 gündür(38,43). Müllerian duktusun kaynaşması

gebeliğin 15 ila 16. gününde kısmi olarak oluşur ve bicornis uterusu meydana getirir(43).

Doğumda sıçanlarda uterus, endometriyal bezlerden yoksundur ve uterus, farklanmamış

mezenşim ile desteklenen basit tipte epitelden ibarettir(43).

Postnatal dönemde uterus bezlerinin oluşumu sırasında; luminal epitelin

tomurcuklanma yolu ile farklanarak glandular epiteli oluşturduğu görülür. Glandular

epitelin oluşturduğu tübüler yapılar uterus stroması içerisine penetre olur(43).

Doğumdan sonra 5. günde uterus da glandular epitel tomurcuklarının oluşumunu

sağlayacak olan epitel invajinasyonları meydana çıkar. Endometriyal bezlerin oluşumu

farelerde doğumdan sonraki 7. güne, sıçanlarda ise 9. güne kadar meydana gelmez(43).

Sıçan uterusunda adenogenezis, doğumdan sonraki 9. günden 15. güne kadar

devam eder ve sonuçta diğer türlerin endometriyal bezlerinden farklı olarak, gelişen

basit tübüler bezler ne sıkıca bükülmüş nede yaygın olarak dallanma göstermiş halde

bulunur(43).

2.6. Östrojen Reseptörleri

Dişi üreme sistemi dokularının fonksiyonları ve gelişimleri, iki büyük ve önemli

steroid hormon olan östrojen ve progesteronun etkilerinin dengeli olması ile

düzenlenmektedir(44). Bu hormonlardan östrojen, çekirdek reseptörleri süper ailesinin

bir üyesi olan östrojen reseptörlerine bağlanarak dişi üreme sistemi dokularının

fonksiyonları, farklanmaları ve gelişimleri üzerine etki etmektedir(44-46). Bu hormonların

etki mekanizmaları, steroide cevap oluşturan genlerin transkripsiyonel aktivitesini

etkileyen hedef hücrelerdeki spesifik reseptör proteinine bağlanmayı

gerektirmektedir(44,46).

Yapılan çalışmalar ile iki adet östrojen reseptörü alt tipinin olduğu rapor

edilmiştir. Birincisi klasik olarak adlandırılan östrojen reseptörü α (ER-α) dır(44,47). ER-α

ilk olarak östrojen reseptörü aktive eden mediatör olarak tanımlanmıştır(44). Sıçanlarda

595 aminoasit dizisine sahip olan ER-α çekirdek hormon ailesinin bir üyesi olup,

ligand-aktive eden transkripsiyon faktörü karakterindedir ve birçok önemli fizyolojik

fonksiyona sahiptir(44). ER-α dokularda oldukça geniş alanlarda eksprese

edilmektedir(44).

20

İkinci östrojen reseptörü ise ilk kez 1996 yılında Kuiper ve arkadaşları tarafından

overdeki granüloza hücreleri, teka hücreleri, korpus luteum ve oositte tanımlanan

östrojen reseptörü β (ER-β)dır(48). ER-β’ ya aynı zamanda testis ve prostatta da

rastlanmaktadır(48). ER-β 485 aminoasit dizisine sahip olup ER-α’ dan daha küçüktür.

ER-β, ER-α proteini ile % 95 oranında DNA bağlanma alanlarında benzerlik

gösterirken, C terminalindeki ligand bağlama alanlarında ise % 55 oranında benzerlik

göstermektedir(45,49). Fakat ER-β seviyesine bağlı mRNA ekspresyonu ile ER-β doku

lokalizasyonu, ER-α’ dan farklılıklar göstermektedir(44,47). Sıçan overinde hem ER-α

hem de ER-β mRNAsı eksprese olurken, ER-β mRNAsı çoğunlukla küçük, gelişen ve

preovulatuar folliküllerin granüloza hücrelerinde lokalize olmaktadır(45). ER-α

sıçanlardaki üreme organlarından uterus, over, testis ve epididimde orta düzeyde

eksprese olmasına rağmen ER-β ekspresyonu over, uterus ve testiste yüksek

düzeydedir(44).

Her iki östrojen reseptörü yüksek affinite ve özgüllük ile 17-β östradiole

bağlanmaktadır(44). Vücudumuzda endojen östrojenlere benzer aktivite gösteren

fitoöstrojenler, hedef organlardaki östrojen reseptörlerine bağlanabilme özelliğine

sahiptirler(48). Genistein kimyasal yapısı bakımından en güçlü östrojen olan 17-β-

estradiol ile fenol halkası ve 4’- ve 7’ hidroksil grupları arasındaki mesafe açısından

benzerlik gösterir(1,2,4,50). Bu benzerlikleriyle isoflavonlar reseptör düzeyinde östradiol

ile yarışarak hem östrojenik hem de anti-östrojenik etkiye sahip olup, östrojen

reseptörlerine bağlanmak için 17-β-estradiol ile yarış halindedir(1-3,6-8,10,11,50,51). 17-β-

östradiol ER- α ve β’ ya eşit derecede affinite gösterirken, fitoöstrojenlerden Genistein

ER- β’ ya 7-30 kat daha fazla affinite gösterir(1,2,11,48,52).

Bu maddeler vücutta hem östrojen agonisti hem de antagonisti olarak rol

alırlar(1,2,4,50,52). Östrojen agonisti olarak östrojenik etki yaparken, antagonistik etkilerini

ise östrojen reseptörlerine bağlanıp, doğal östrojenleri baskılayarak yaparlar(1,2,7,50,53).

2.7. Genistein

İnsan vücudunda doğal östrojenler gibi davranan ve endojen östrojene benzer

aktiviteler gösteren kimyasallara Fitoöstrojenler denir(2,3).

Flavonoidler bitkisel pigmentler olarak bilinirler ve C halkalarındaki değişimlere

göre 6 gruba ayrılırlar(1-3);

21

• Flavonlar,

• Flavanoller,

• Flavanonlar,

• Katekinler,

• Antosiyanidinler ve

• İsoflavonlar.

Etkileri nedeniyle, üzerinde en çok çalışılan fitoöstrojenler isoflavonlardır(1,2).

İsoflavonlar içerisinde Genistein, Daidzein, Glistein, Biokanin A ve Formonentin yer

alır(1-3,5,50). İsoflavonlar meyve, sebze, bütün tahıllar ve inek sütünde bulunur(1). İnsanlar

için majör isoflavon kaynağı soya fasulyesi olup, Genistein ve Daidzein soya fasulyesi

ve soya ürünleri yanı sıra kızıl yonca yaprağında da bulunur(1-5,7,9,11,42,51,53-55).

İnsanlar Genistein’e en çok, soya içeren diyetler, soya içeren bebek mamaları ve

yetişkin besinlerine ilave olarak alınan diyetlerle maruz kalmaktadır(4,6,53). Bebek

mamaları içerisinde soya protein izolatları bulunmaktadır(4,53). Bebekler Genistein’e

intrauterin gelişimleri sırasında, laktasyon döneminde ve bebek mamaları ile maruz

kalmaktadırlar(42).

İsoflavonlar içerisinde en güçlü östrojenik etkiye Genistein sahiptir(2,5,55). 1 gr

soya fasulyesinde 800 µg Daidzein ve 500 µg Genistein bulunurken, 1 gr soya

proteininde 150 µg Daidzein ve 250 µg Genistein bulunur(1). Genistein’in kimyasal

yapısı 5,7,4-trihidroksi izoflavondır(6,56). Genistein’in östrojenik aktivitesi tirozin kinaz

inhibitörü aktivitesi ile benzerlik gösterir(12,57).

Genistein kimyasal yapısı bakımından en güçlü östrojen olan 17-β-estradiol ile

fenol halkası ve 4’- ve 7’ hidroksil grupları arasındaki mesafe açısından benzerlik

gösterir(1,2,4,50). Bu benzerlikleriyle isoflavonlar reseptör düzeyinde östradiol ile

yarışarak hem östrojenik hem de anti-östrojenik etkiye sahip olup, östrojen

reseptörlerine bağlanmak için 17-β-estradiol ile yarış halindedir(1-3,6-8,10,11,50,51). 17- β-

östradiol ER- α ve β’ ya eşit derecede affinite gösterirken, fitoöstrojenlerden Genistein

ER- β’ ya 7-30 kat daha fazla affinite gösterir(1,2,11,52). Bu maddeler vücutta hem

östrojen agonisti hem de antagonisti olarak rol alırlar(1,2,4,5,50,52). Östrojen agonisti olarak

östrojenik etki yaparken, antagonistik etkilerini ise östrojen reseptörlerine bağlanıp,

doğal östrojenleri baskılayarak yaparlar(1,2,7,50,53).

22

Fitoöstrojenlerin östrojenik etkileri, ilk olarak 1946 yılında Batı Avustralya’da,

izoflavonca zengin bir çeşit yonca (Trifolium subterraneum) ile beslenen koyunlarda

üreme bozukluğunun geliştiğinin fark edilmesi ile anlaşılmıştır(6). Benzer etkiler 2.

Dünya Savaşının sonlarına doğru, yaşanan besin kıtlığı nedeniyle, lale soğanlarını gıda

olarak tüketen Almanlarda da kaydedilmiş; birçok kadında menstrüel bozukluklar

gözlenmiştir(2).

Fitoöstrojenlerin östrojenik ve anti-östrojenik etkileri dışında östrojen

reseptörlerinden bağımsız olarak antioksidan, antiproliferatif ve antianjiogenik

fonksiyonları da bulunmaktadır(1,2,10,53).

Son yıllarda yapılan epidemiyolojik çalışmalarda, zengin fitoöstrojenik moleküller

ile beslenen toplumlarda osteoporozun, kardiyovasküler hastalıkların, hormona bağlı

kanserlerin (göğüs ve prostat) daha az görüldüğü ve postmenopozal kadınlarda östrojen

yetersizliğine bağlı semptomların daha hafif seyrettiği saptanmıştır(1-3,7,8,50,51,54).

Fitoöstrojenler özellikle hormon bağımlı kanserlerin kontrol edilmesi ve

önlenmesinde rol oynar. Meme, testis ve prostat kanseri gibi östrojenle ilişkili kanserler

fitoöstrojen alımının fazla olduğu yerlerde daha az insidansta gözlenmektedir(1,3,53,58).

Epidemiyolojik çalışmalara göre Asya diyeti ile beslenen toplumlarda Batılı

toplumlara göre meme ve prostat kanserinin daha az görüldüğü bulunmuştur(1,3,53,58,59).

Fitoöstrojenler etkilerini yaşa, doza ve maruz kalındığı süreye bağlı olarak

göstermektedirler.

Yapılan çalışmalarda yeni doğanlar fitoöstrojenlere veya kimyasallara maruz

kaldıklarında organogenezde ve gonadlardaki cinsiyet farklanması üzerine önemli

etkileri görülmüş(53). Sıçanlar gebeliğin 17. gününde Genistein’e maruz kaldıklarında

over ağırlıklarının azaldığı ve atretik folliküllerin varlığı gözlenirken, uterusta total

Genistein konsantrasyonunda, doza bağlı artış olduğu ve overler gibi uterusta da

ağırlığın azaldığı gözlenmiş(53).

Yapılan bir başka çalışmada gebeliğin 16-20 günleri arasında sıçanlara 5 mg/kg

dozda Genistein verildiğinde; doğumda küçük anogenital açıklık varlığı ve yavrularda

pubertenin geciktiği gözlenirken, farelerde durum biraz farklılık göstermiş. Gebeliğin

15-20 günleri arasında 20 mg/kg Genistein verilen farelerin puberteye erken ulaştıkları

gözlenmiştir(53).

23

Sıçanlarla yapılan başka bir çalışmada ise yüksek dozda Genistein’e maruz

kalmanın vücut ağırlığını azalttığı, östrus siklusu düzensizleştirdiği, fertiliteyi azalttığı

ve üreme organlarında histopatolojik değişikliklere neden olduğu rapor edilmiştir.

Ayrıca Genistein’e maruz kalma sonucunda overlerde atretik folliküllerin oluşması,

korpus luteum hipertrofisi ve luteal hücrelerde asidofilik değişiklikler, uterus epitel

hücrelerinde ve miyometriyumda hipertrofi ile karakterize histopatolojik bulgular

bildirilirken, düzensiz östrus siklusların sayısının arttığı, ancak siklus uzunluğunun

etkilenmediği rapor edilmiştir(11).

Bir başka çalışmada ise 40 mg/kg Genistein’e maruz kalan yavrularda uterus

ağırlığını arttığı, vajinal açıklığın geç geliştiği ve sürekli östrusun teşvik edildiği

gözlenmiş. Aynı zamanda yetişkinlerde progesteron konsantrasyonu da azalmış(13).

Newbold ve arkadaşları, neonatal dönemde Genistein’e maruz kalan farelerde,

yaşamlarının ileri dönemlerinde, uterin adenokarsinomaların arttığı sonucuna varmışlar.

Ayrıca bu fitoöstrojenlerin overlerde, doza bağlı zıt etkiler gösterebildikleri de

bildirilmiş. Yine neonatal dönemde Genistein’e maruz kalan dişilerin over

farklanmalarının ve gelişimlerinin etkilenerek, yaşamlarının ileri dönemlerinde birden

fazla sayıda oosit içeren folliküllerin görüldüğü bildirilmiş. Yüksek Genistein dozları

dişilerde infertiliteye neden olurken, düşük dozları ise daha küçük ve daha az

implantasyon alanları ile önemsiz ikizlik oranının görülmesine neden olmaktadır(42).

24

3. GEREÇ VE YÖNTEMLER

3.1. Kullanılan Deney Hayvanları ve Hayvan Bakımı

Deneye başlanmadan önce Çukurova Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik

Kurulundan onay alındı (6 Ekim 2009, 8 nolu toplantı). Ağırlıkları 200-250 gram olan

Wistar albino türü, ergin 5 adet dişi, 5 adet erkek sıçan Çukurova Üniversitesi TIBDAM

biriminden temin edildi. Dişi sıçanlar gebe bulunma olasılıklarına karşı, 21 gün süre ile

erkek sıçanlardan izole edildi. Her dişi sıçan bir kafese konuldu. Kafeslerin içine altlık

olarak talaş serildi ve her gün talaşları değiştirildi. Tüm hayvanlara su ve besin ad

libidum olarak verildi. Ortam ısısı 22±2oC’ de sabit tutuldu. Havalandırma pencere tipi

aspiratörle sağlandı. Aydınlık-karanlık döngüsü otomatik denetleyici bir aygıt yardımı

ile 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık olacak şekilde ayarlandı.

3.2. Deneyin Yapılışı

Gebe olmadığı belirlenen her dişi sıçana; 20 IU Pregnant Mare’s Serum

Gonadotropin (PMSG), 48 saat sonra ise 20 IU insan koryonik gonadotropin (hCG)

intraperitonal olarak enjekte edilerek sıçanlarda süperovulasyon sağlandı. Aynı günün

akşamı her bir dişi sıçanların kafesine bir erkek sıçan bırakıldı. Hayvanların

çiftleşmeleri sonrasında vajinal plak oluşumları izlendi. Vajinal plak oluşumu gözlenen

dişilerin yanından erkekler sıçanlar alınarak dişi sıçanların gebeliğin 0. gününde

oldukları kabul edildi. Gebe olan dişilerin, 21 gün sonunda doğum yapmaları beklendi.

Doğan yavrular cinsiyetlerine göre ayrıldı. Doğan erkek yavrular, ayrı kafeslerde başka

annelerin yanına alınırken, dişi yavrular, her grupta 5’er yavru olacak şekilde anneleri

ile aynı kafese konuldu ve doğdukları gün 0. gün olarak kabul edildi.

1. grupta yer alan yavrulara herhangi bir madde verilmedi, her gün saat 10.00 da

21 gün boyunca ağırlıkları ölçülerek kaydedildi ve bu hayvanlar kontrol grubu olarak

değerlendirildi.

2. gruptaki yavrulara laktasyon periyodu olarak kabul edilen 21 gün boyunca,

Genistein’in çözülmesinde kullanılan Dimetil sülfoksit (DMSO) (Simga-Aldrich Co.)

bir miktar mısır yağı ile birlikte her sabah saat 10.00’ da gavaj yolu ile verildi. Bu

hayvanlar çözgen grubu olarak değerlendirildi.

25

3. gruptaki yavrulara, her yavruya 4 mg/kg dozda Genistein (Sigma-Aldrich Co.)

DMSO içerisinde çözülerek, mısır yağı ile birlikte, 21 gün boyunca aynı saatte, gavaj

yolu ile verildi.

4. gruptaki yavrulara ise DMSO içerisinde çözülen Genistein 40 mg/kg dozda

olacak şekilde, mısır yağı ile birlikte, her gün saat 10.00’da 21 gün boyunca, gavaj yolu

ile verildi.

Tüm gruplardaki yavru sıçanların her gün ağırlıkları ölçülerek Genistein’in doz

ayarlanması yapıldı.

3.3. Kan Örneklerinin Alınışı

22. gün saat 10.00’da ağırlıkları ölçülen sıçanlara 10 mg/kg Rompun (% 2’lik,

Bayer) ve 80 mg/kg ketamin (Ketalar, Parke-Davis) intraperitonel (i.p.) olarak verilerek

anestezi uygulandı. Hayvanlar sırt üstü yatırıldıktan sonra hormonal tetkikler için

enjektör yardımı ile intrakardiyak kan alınarak, tüplere konuldu. Kanlar 3600 devirde 5

dakika santrifüj edilerek serum ve plazma kısımları ayrıldı. Serum kısmı ependorf

tüplere alınarak -200C’de bekletildi.

Serum örnekleri oda ısısında bekletilerek çalışma periyoduna getirildi. Kan serum

düzeyinde FSH, LH, östradiol ve progesteron değerleri, Roche, Modular Analytics

sistem (E-170) cihazı kullanılarak, Electrochemiluminescence immunoassey yöntemi ile

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarında analiz

edildi.

3.4. Overlerin Ve Uterusun Eksizyonu

Kanları alınan hayvanların karın yüzeyi batikonla silinerek abdominal kavitesi

derin bir insizyon ile açıldı. Deri ve periton klemplerle tutturularak abdominal kavite

içerisinde kolayca çalışılması sağlandı. Bağırsaklar bir forseps yardımı ile tutularak

yukarı doğru itildi. Açıkta kalan overler ince bir forseps ile tutularak eksize edildi. Her

sıçanın overlerinden biri ve uterusun yarısı ışık mikroskobik ve immünohistokimyasal

inceleme için %10’luk nötral formalin solüsyonu içerisine alınırken, diğer over ve

geriye kalan uterus ise elektron mikroskobik inceleme için pH’sı 7,4 olan % 5’lik

gluteraldehit solüsyonu içerisine konuldu.

26

3.5. Işık Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi(60)

İmmünohistokimya uygulamaları ve ışık mikroskobik incelemeler için alınan

doku örnekleri % 10’luk nötral formalin içerisine alınarak 3 gün süre ile tespit edildi ve

çizelge 1’ de belirtilen doku takip yöntemi uygulandı.

Çizelge 1. Işık mikroskobik doku takip işlemi Oda sıcaklığında % 50’lik etil alkol 1 saat

Oda sıcaklığında % 70’lik etil alkol 1 gece

Oda sıcaklığında % 85’lik etil alkol 30 dakika

Oda sıcaklığında % 95’lik etil alkol 30 dakika

Oda sıcaklığında % 95’lik etil alkol 1 saat

Oda sıcaklığında Absolute Alkol 1 saat

Oda sıcaklığında Absolute Alkol 30 dakika

Oda sıcaklığında Absolute Alkol + Ksilen 30 dakika

Oda sıcaklığında Ksilen 30 dakika

Oda sıcaklığında Ksilen 1 saat

58oC’ de Parafin + Ksilen 15 dakika

58oC’ de Parafin 45 dakika

58oC’ de Parafin 45 dakika

Bloklama

Bloklanan dokulardan mikrotom yardımı ile 4 μm kalınlığında kesitler alınarak

overler Hematoksilen-Eozin, uteruslar ise Masson trikrom yöntemi ile boyandı ve ışık

mikroskobunda incelenerek, histolojik özellikleri değerlendirildi. Olimpus BX50

mikroskopta resimleri çekildi. Ayrıca overlerden her bir bloktan50 mikronda bir seri

kesitler alınarak H&E ile boyandı ve overlerdeki primordiyal, primer, antral ve atretik

folliküller sayıldı. Uteruslardan ise 5 µm kalınlığında kesitler alınarak, Masson trikrom

yöntemi ile boyandı. Her sıçandan rasgele seçilen 3 alanda endometriyum,

miyometriyum ve perimetriyum tabakaları ile total uterus duvar kalınlığı Image J

programı kullanılarak ölçüldü.

27

İmmünohistokimya;

Over dokularında ER-β’nın yoğunluk ve dağılımının gösterilmesi amacı ile

standart immünohistokimyasal teknik olan Avidin-Biotin-Peroksidaz yöntemi

uygulandı. ER-β’nın ortaya çıkartılması için, reseptörün C-terminal ucunda 467-485

aminoasit dizisi arasındaki bölgeye bağlanan poliklonal rabbit anti-rat ER-β antikoru

(Thermo Scientific, PA1-310B) kullanıldı.

Işık mikroskobik doku hazırlama yöntemine uygun olarak hazırlanan over

dokularından 5 µm kalınlığında kesitler polilizinli lamlar üzerine alındı. Polilizinli

camlar üzerinde bulunan dokular alkol ve ksilol serilerinden geçilerek deparafinizasyon

işlemi tamamlandı. Ardından distile su ile hazırlanmış % 3’lük Hidrojen peroksit

(H2O2) içerisinde 5´–7´ bekletilerek endojen peroksidaz elimine edildi. Saf suda

yıkandıktan sonra, 600 W gücünde mikrodalga fırında, Citrat buffer solüsyonunda

(pH=6) 15´ bekletilerek, antijen toplanması işlemi uygulandı. Mikrodalga fırından

çıkarılan dokuların kapağı açılmadan oda ısısına gelmesi için bekletilerek saf su ve Tris

Buffer Saline (TBS) (pH=7,2- 7,4) ile yıkanan dokulara, daha önceden 1/600 oranında

dilüe edilmiş olan poliklonal rabbit anti-rat ER-β antikoru (Thermo Scientific, PA1-

310B) damlatılarak kapalı ve nemli ortamda +4 °C’ de 1 gece inkübe edildi. Ertesi

gün oda ısına gelmesi için beklenildi ve Saf su ile TBS’ den geçildi. Biotin damlatılarak

oda ısısında 30´ inkübe edildi. Saf su ve TBS’ den geçirildi. Avidin damlatıldı ve yine

oda ısısında 30´ inkübe edildi. Saf su ve TBS’ den geçildi. Ardından AEC damlatıldı ve

10´-20´ aralığında mikroskop altında kontrol edilerek boyanma gözlendiğinde

preparatlar çeşme suyunda yıkandı.

Saf suda yıkanarak, hematoksilende 3´-5´ bekletilip tekrar çeşme suyu ile yıkandı.

En sonunda dokunun etrafı kurulanıp su bazlı kapama maddesi ile kapatıldı.

Negatif kontrollerin elde edilmesinde ise nötralize edici sentetik ER-β peptidi (PEP-

007 Afinity Bioreagents) kullanıldı.

3.6. Elektron Mikroskobik Doku Hazırlama Yöntemi(61)

Elektron mikroskobik değerlendirme için alınan over ve uterus dokuları 1 mm3

büyüklüğünde parçalara ayrılarak, Millonig fosfat tamponu ile hazırlanmış % 5’lik

gluteraldehit solüsyonunda (pH= 7,4) 4 saat boyunca tespit edildi. Dokular Millonig

fosfat tamponu ile iki kez yıkanarak, aynı tampon içerisinde bir gece bekletildi. Ertesi

28

gün dokular Millonig fosfat tamponu ile hazırlanmış % 1’lik osmium tetraoksit

solüsyonu ile ikinci defa tespit edildi ve yine fosfat tamponu ile iki kez yıkandı. Dokular

daha sonra çizelge 2’te belirtildiği gibi dehidrate edilerek, gömme materyali içerisinde

immerse edildi.

Çizelge 2. Elektron mikroskobik doku takibinde dehidratasyon, şeffaflandırma ve immersiyon işlemi. % 50’lik Etil alkol +4 oC’ de 15 dakika

% 70’lik Etil alkol +4 oC’ de 15 dakika



% 100’lük Etil alkol +4 oC’ de 15 dakika

%100 Etil alkol +4 oC’ de 15 dakika

%100 Etil alkol Oda sıcaklığında 15 dakika

Propilen oksit Oda sıcaklığında 15 dakika

Propilen oksit Oda sıcaklığında 15 dakika

Propilen oksit+Gömme materyali Oda sıcaklığında 30 dakika

Propilen oksit+Gömme materyali Oda sıcaklığında 30 dakika

Bu işlemlerden sonra doku parçaları içerisinde yeni hazırlanmış gömme materyali

(rezin) bulunan tüplere alınarak bir gece boyunca rotatorda döndürüldü. Resin çizelge

3’te belirtildiği gibi hazırlandı.

Çizelge 3. Gömme materyali hazırlanışı Araldite CY 212 20 ml

Sertleştirici HY 964 20 ml

Hızlandırıcı DY 064 0,6 ml

Plastikleştirici- Dibütil Fitalat 1 ml

29

Ertesi gün doku parçaları taze hazırlanmış gömme materyali kullanılarak Beem

kapsüllere gömüldü ve 60ºC etüvde 48 saat polimerize edildi. Daha sonra elde edilen

bloklar etüvden çıkarılarak soğumaya bırakıldı. Bloklardan Reichert Ultracut S

ultramikrotomu ile yarı ince kesitler alınarak toludin mavisi ile boyandı ve belirlenen

alanlardan 500 Aº kalınlığında kesitler alındı. Kesitler 200-300 gözenekli bakır gridlere

toplandı ve % 70’lik etil alkolde doymuş uranil asetat ve Reynolds’un kurşun sitrat

solüsyonları ile boyandı. Boyanan kesitler JEOL-JEM 1400 Transmisyon Elektron

Mikroskobu ile incelendi.

3.7. İstatistiksel Analizler

Tüm gruplarda, her bir sıçanın overinden 5 μm kalınlıkta seri kesitler alınarak, 50

μm’de bir seçilen 3 alanda primordiyal, primer, antral folliküller ile atretik folliküller

sayılırken, Masson trikrom yöntemi ile boyanan uterusların endometriyum,

miyometriyum, perimetriyum tabakaları ve total duvar kalınlıkları Image J programı

kullanılarak ölçüldü. Çalışma kapsamındaki 4 gruba ait, deneyin son günü ölçülen, tüm

sıçanların vücut ağırlıkları, biyokimyasal analiz sonuçları, overlerdeki primordiyal,

gelişen ve atretik follikül sayıları ile uterus duvar kalınlığına ait ölçümlerin istatistiksel

analizleri Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik Anabilim Dalında yapıldı.

Verilerin istatistiksel analizinde SPSS 11.0 paket programı kullanılarak değerler

Kruskal Wallis testi ile karşılaştırıldı. Farklılığın bulunduğu ve farklılığı yaratan grup

veya gruplar Mann-Whitney U testi ile araştırılıp, tüm testlerde istatistiksel önem

düzeyi 0,05 olarak kabul edildi.

30

4. BULGULAR

4.1. Hayvan Ağırlıkları

4 grupta yer alan sıçanların vücut ağırlıkları deney bitiminde ölçülerek gruplar

arasında farklılık olup olmadığı Kruskal Wallis test yöntemi ile incelendi ve gruplardan

en az birisinin farklı olduğu saptandı (p<0,05). Bu farklılığı yaratan grup veya grupların

saptanması için çoklu karşılaştırma tekniklerinden Mann-Whitney U yöntemi

uygulanarak, farklılığı yaratan grubun kontrol grubu olduğu ve diğer gruplar ile

kıyaslandığında kontrol grubunundaki hayvanların, deney sonunda, daha düşük vücut

ağırlığınlarına sahip oldukları saptandı (Çizelge 4).

Çizelge 4. Deney sonunda kontrol ve deney gruplarındaki sıçanların ağırlık (gr) ortalamaları ve standart

Kruskal Wallis testi sapmaları.*=p<0,05 Vücut ağırlıkları (gr)

(X ± SD) Median (Min - Max)

1. grup 33,3 ± 1,56 32,5 (32-35)

2. grup 44,4 ± 4,9* 48 (38-48)

3. grup 44,4 ± 4,9* 48 (38-48)

4. grup 41,6 ± 5,8* 42 (32-48)

4.2. Biyokimyasal Analizler

Deney sonunda, anestezi altındaki sıçanlardan alınan kan örneklerinde östradiol,

progesteron, FSH ve LH değerleri incelendi. FSH ve LH değerlerinde, gruplar arasında

istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı görüldü. Östradiol değerlerinde, kontrol

grubu ile 2. grup arasında, istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı görülürken,

kontrol grubu ile kıyaslandığında 3 ve 4. gruplarda östradiol değerlerinin arttığı izlendi.

3. ve 4. gruplar kendi aralarında karşılaştırıldığında ise istatistiksel olarak anlamlı bir

fark olmadığı saptandı. Progesteron değerleri incelendiğinde; kontrol grubu ile 2. grup

arasında da istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı görülürken, kontrol grubu ile

karşılaştırıldığında 3 ve 4. gruplarda progesteron değerlerinin düştüğü görüldü. 3. ve 4.

31

gruplar kendi aralarında karşılaştırıldığında ise 3. gruba oranla 4. Grupta progesteron

değerlerinin daha düşük olduğu izlendi.(Çizelge 5).

Çizelge 5. Deney bitiminde sıçanlardan intrakardiyak alınan kan örneklerindeki serum FSH (ng/ml), LH (ng/ml), östradiol (ng/ml) ve progesteron (ng/ml) ortalama değerleri ve standart sapmaları.*=p<0,05

Östradiol (ng/ml) Progesteron (ng/ml) FSH (ng/ml) LH (ng/ml) 1, Grup 21,8 ± 3,07

20,4 (19,4 - 27,1) 10,3 ± 4,5

10,4 (3,6 - 16,5) 0,1 ± 0 0,1 ± 0

2, Grup 20,4 ± 9,28 19 (12 - 36)

12,1 ± 6,6 10 (6,6 - 23,6)

0,1 ± 0 0,1 ± 0

3, Grup 45,1 ± 11,4* 43,7 (28,8 - 59,5)

4,6 ± 4,1* 1,8 (1,1 - 9,2)

0,1 ± 0 0,1 ± 0

4, Grup 48,6 ± 6,2* 47,2 (42,9 - 58,2)

0,6 ± 0,4* 0,6 (0,1 - 1,3)

0,1 ± 0 0,1 ± 0

4.3. Işık Mikroskobik Bulguları

İstatistiksel analizler sonucunda kontrol grubu ile kıyaslandığında tüm deney

gruplarında bulunan antral ve atretik follikül sayılarının benzer olduğu ve gruplar

arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı saptandı. Primordiyal follikül

sayılarının kontrol grubu ile kıyaslandığında 4. grupta arttığı görüldü. Primer follikül

sayılarının ise kontrol grubu ile kıyaslandığında 2. grupta azaldığı görülürken,

Genistein verilen 3. ve 4. gruplardaki primer follikül sayılarında, istatistiksel olarak

anlamlı bir farklılık görülmedi. Çizelge 6. Over dokularından alınan seri kesitlerde follikül sayım sonuçları ve standart sapmaları. *=p<0,05

Primordiyal Follikül

Primer Follikül

Antral Follikül Atretik Follikül

1, Grup 13,5 ± 11,5 9,3 (6 - 34)

51,6 ± 10,5 49,5 (39,3 - 67,3)

4,9 ± 1,3 4,8 (3 - 6,7)

10,4 ± 2,5 11 (6,3 - 13)

2, Grup 21,2 ± 7,6 22,3 (9,3 - 28,3)

29,5 ± 10,2* 27,5 (20,3 - 47)

7,7 ± 3,3 7,3 (3,7 - 13)

7,9 ± 1,4 7,6 (6,7 - 10,3)

3, Grup 27,4 ± 17,8 22,8 (11,3 - 57,3)

40 ± 26,1 32,1 (18,3 - 85,3)

6,4 ± 1,7 6,3 (5 - 9,3)

7,9 ± 2,4 7,8 (4,7 - 11,7)

4, Grup 32,7 ± 6,9* 33,3 (25 - 41,3)

44,1 ± 9,6 44,6 (30 - 55,7)

5,6 ± 2,5 5,3 (2 - 8,7)

11,3 ± 4,1 10,5 (7,3 - 18,3)

Uterus duvar kalınlıkları kontrol grubu ile kıyaslandığında tüm gruplarda, tüm

tabaka kalınlıkları, endometriyum ve perimetriyum kalınlıklarında istatistiksel olarak

32

anlamlı bir fark olmadığı görüldü. Miyometriyum tabakasının ise kontrol grubu ile

karşılaştırıldığında 4. grupta arttığı izlendi.

Çizelge 7. Uterus tabaka kalınlıkları ve standart sapmaları. *=p<0,05 Tüm Tabaka

Kalınlığı Endometriyum Miyometriyum Perimetriyum

1, Grup 316,2 ± 40 321,3 (255,4 - 352,2)

197,3 ± 18,5 197,4 (169,8- 219,3)

70,4 ± 12,5 70 (58 - 87,1)

46,6 ± 11,3 48,2 (27,6 - 57,1)

2, Grup 299,2 ± 99,5 303,5 (145,5 - 399,9)

178 ± 67,4 203,1 (59,1 - 221,3)

68,8 ± 19,2 69,6 (46,2 - 98,5)

52,3 ± 28,5 37,9 (26,8 - 86,3)

3, Grup 311 ± 91,6 335,2 (186,9 - 414,9)

187,7 ± 51,6 193,9 (111,6 - 249,2)

81,2 ± 36,9 69,8 (46,2 - 133,1)

42,0 ± 13,8 40,2 (29 - 60,8)

4, Grup 366,5 ± 140,3* 363,1 (199,3 - 586,2)

169,4 ± 76,3 179 (58,1 - 251,3)

148,5 ± 122* 101 (79,6 - 365,4)

47,4 ± 19,3 43,8 (24,3 - 86,3)

1. grup

Kontrol grubuna ait over kesitlerinin ışık mikroskobunda incelenmesi sonucunda,

over yüzeyinin kübik veya yassı şekilli epitel ile çevrili olduğu, epitelin hemen altında

ince bir tunika albuginea tabakasının bulunduğu görülmekteydi. Tunika albuginea

tabakasının altında, over boyunca, primordiyal ve gelişimin farklı evrelerindeki

folliküllerin yer aldığı görülmekteydi. Over kesitlerinde medulla tabakasının ayırt

edilemediği, gelişme sürecine girmiş folliküllerin tüm overi kapladığı dikkati çekti.

Primordiyal folliküller tunika albugineanın hemen altında, periferal olarak yerleşmiş

olup, sferikal şekilli, merkezi yerleşimli bir oosit ve oositi çevreleyen yassı şekilli

folliküler hücreleri içerirken over korteksinde gelişen folliküllerin büyük çoğunluğunu

oluşturan primer folliküller ise merkezi yerleşimli, belirgin çekirdekçiğe sahip bir oosit

ve oositin etrafını saran çok tabakalı kübik şekilli granüloza hücrelerini içermekteydi.

Oosit ile granüloza hücreleri arasında belirgin bir zona pellusida tabakası izlenirken,

gelişimin daha ileri evrelerinde yer alan folliküllerde granüloza hücreleri arasında içi

sıvı dolu boşlukların oluşmaya başladığı görülmekteydi. Bu boşlukların birleşmesi ile

oluşan antruma sahip antral folliküllerin etrafında düzenli bir teka tabakası

bulunmaktaydı. Gelişim sürecine girmiş folliküllerin bazıları ise atretik değişiklikler

göstermekteydi. Bu folliküllerde granüloza hücrelerinde çekirdek densitesinin arttığı,

bazı granüloza hücrelerinin birbirleri ile olan ilişkilerini yitirdiği görülmekteydi.

Folliküllerin arasında iğ şekilli stromal hücreler ve lifler ile kan damarları yer

almaktaydı (Şekil 1A).

33

Kontrol grubuna ait Masson trikrom ile boyanmış uteruslar incelendiğinde

endometriyumda; lümeni döşeyen epitel hücrelerinin alçak prizmatik şekilli oldukları,

bazı alanlarda epitelin prolifere olarak, altta yer alan lamina propria tabakasına invajine

olduğu ve endometrial bezleri oluşturduğu gözlenmekteydi. Endometrial stromada yer

alan bezlerin düzgün bir sınıra sahip olduğu ve kübik epitel tarafından döşendiği izlendi.

Endometrial stroma içerisinde sferikal şekilli çekirdekleri ile stromal hücreler,

miyometrium tabakasına yakın alanda yoğunlaştığı görülen kollajen lifler ve stromal

hücreler arasında kan damarları yer almaktaydı. Miyometriyum tabakasında ise sirküler

şekilde düzenlenmiş, iğ şekilli düz kas hücreleri ve hücreler arasında kollajen lifler

bulunmaktaydı. Hücreler, kollajen lifler ve kan damarlarını içeren perimetriyum

tabakası, dış kısımda mezotel hücreleri tarafından sınırlandırılmıştı (Şekil 1B).

2. grup

Çözgen grubuna ait over kesitleri incelendiğinde, over yüzey epiteli ve epitelin alt

kısmında yerleşen primordiyal ve gelişen folliküller, kontrol grubundakine benzer

morfolojik özelliklere sahiplerdi. Normal folliküllerin yanı sıra atretik değişiklikler

gösteren folliküllerin varlığı bu grupta da izlendi (Şekil 2A).

Bu grup kapsamında yer alan uterusların endometriyum tabakasının prizmatik

şekilli epitel ile döşendiği, endometrial stromada kollajen liflerin yaygın olduğu,

bezlerin ve stromal hücrelerin ise 1. grup bulguları ile benzerlik gösterdiği saptandı.

Miyometriyum ve perimetriyum tabakasıda normal yapıda izlendi (Şekil 2B).

3. grup (4mg/kg)

Bu grupta yer alan sıçanlara ait over dokularında normal yapıda primordiyal ve

gelişen folliküllerin yanı sıra atretik folliküllerin varlığı da dikkati çekmekteydi.

Granüloza hücrelerinde piknotik çekirdek varlığı ve granüloza hücrelerinin dökülmesi

ile karekterize atretik değişiklikler çoğunlukla primer folliküllerde görülmekteydi.

Bununla birlikte, gelişimin daha ileri evrelerindeki bazı antral folliküllerde de granüloza

hücrelerinin antral kavitede serbest halde bulundukları dikkati çekmekteydi (Şekil 3A).

Uterusların endometriyum tabakasında prizmatik epitel, endometriyal stromada

yer alan bezler, stromal hücreler normal olarak izlenirken, hücreler arasında kollajen

liflerin yaygın olduğu izlendi. Miyometriyum tabakasında düz kas liflerinin iyi geliştiği

34

gözlenirken, perimetriyum tabakası diğer gruplardaki ile benzerlik göstermekteydi

(Şekil 3B).

4. grup (40mg/kg)

Bu grupta; over boyunca, primordiyal folliküllerle birlikte gelişme sürecine

girmiş çok sayıda primer ve antral folliküllerin varlığı izlendi. Ayrıca bu grupta atretik

folliküllerin diğer gruplardan daha yaygın olduğu dikkati çekti. Atretik görünümlü bu

folliküllerde granüloza hücrelerinin koyu çekirdeğe sahip oldukları, granüloza hücreleri

arasındaki bağlantıların kaybolarak, birbirlerinden ayrıldıkları görülmekteydi (Şekil

4A).

Bu gruba ait uterusların endometriyum tabakasının prizmatik epitel ile döşeli

olduğu, endometriyal bezlerin miktarının attığı, lümenlerinin oldukça genişlediği,

stromada kollajen liflerin miktarının arttığı görülmekteydi. Miyometriyum ve

perimetriyum tabakaları normal olarak görülmekteydi (Şekil 4B).

4.4. İmmünohistokimyasal Bulgular

Östojen reseptörü β’nın açığa çıkarılması için uygulanan immünohistokimyasal

yöntem sonucunda tüm gruplara ait overlerde primordiyal folliküllerde, gelişen

folliküllerin oositlerinde, teka tabakasına ait hücrelerde ve atretik folliküllerin granüloza

hücrelerinde spesifik boyanmanın olmadığı saptandı. Ancak gelişme sürecine girmiş

folliküllerdeki granüloza hücrelerinin çekirdeklerinin belirgin olarak boyandığı gözlendi

(Şekil 5). Tüm gruplarda gelişme sürecine girmiş folliküllerin granüloza hücrelerinde

gözlenen boyanma şiddetinin gruplar arasında belirgin bir fark göstermediği saptandı.

35

Şekil 1: A. Kontrol grubuna ait overi en dıştan örten, tek katlı yassı epitel hücreleri (ok), tüm overi kaplayan primer folliküller (PF), antral folliküller (AF) ve atretik folliküller (AtF) izlenmekte. B. Kontrol grubuna ait uterus kesitinde lümeni döşeyen alçak prizmatik epitel hücreleri (ok), endometriyal stroma (Str), endometriyal stromada kübik epitel ile döşeli endometriyal bezler (EB), miyometriyum (M) ve perimetriyum (P) izlenmekte.

PF AtF

AF

AF

AtF

PF

EB

M P Str

A

B

EB

36

Şekil 2: A. Kontrol grubuna benzer özellikler gösteren, 2. Grupta yer alan over kesitlerinde primer folliküller (PF), antral folliküller (AF) ve atretik folliküller (AtF) izlenmekte. B. 2. grupta yer alan uterus lümenini döşeyen prizmatik epitel hücreleri (ok), endometriyal stroma (Str) içinde yer alan kübik şekilli hücreler ile döşeli endometriyal bezler (EB), miyometriyum (M) ve perimetriyum (P) izlenmekte.

AtF

AtF

PF

PF

AF

EB

M P

Str

AtF

PF

A

B

37

Şekil 3: A. 3. Grupta normal yapıda izlenen primer (PF) ve antral (AF) folliküllerin yanı sıra piknotik çekirdekleri ve antral kaviteye dökülen granüloza hücreleri (ok) ile karakterize atretik folliküller (AtF) izlenmekte. B. 3. grupta uterus lümenini döşeyen prizmatik epitel hücreleri (ok), endometriyal stromada (Str) yer alan endometriyal bezler (EB), yeşil renkte boyanmış kollajen lifler (*), miyometriyum (M) ve perimetriyum (P) tabakaları izlenmekte.

EB

AtF AtF

AtF

AF

PF

PF

EB

Str

P M

B

A

*

38

Şekil 4: A. 4. grupta overlerde normal yapıda primer folliküllerin (PF) ve antral folliküllerin (AF) yanı sıra atretik folliküller (AtF) de görülmekte. B. 4. grupta uterusun endometriyum tabakasında prizmatik epitel hücreleri (ok), endometriyal stroma (Str) içerisinde artmış, endometriyal bezler (EB), normal yapıda miyometriyum (M) ve perimetriyum (P) görülmekte.

B

PF

PF

PF PF

AtF

AtF AtF

M

EB

Str

EB

P

A

AF

39

Şekil 5: A. 1.gruba ait overlerde gelişen folliküllerin granüloza hücre çekirdeklerinde ER-β’nın immün pozitif boyandığı izlenmekte. B. 2. grupta yer alan overlerde pozitif boyanan granüloza hücreleri. C ve D. 3. grupta overlerde pozitif boyanmış gelişen folliküllerin granüloza hücreleri ve boyanmanın olmadığı atretik folliküller (*) görülmekte. E. 4. grupta yer alan overlerde gelişen folliküllerin pozitif boyanmış granüloza hücreleri izlenmekte. F. Negatif kontrol. Overlerde hiçbir şekilde immün boyanmann olmadığı görülmekte.

A B

C D

E F

*

40

4.5. Elektron Mikroskobik Bulgular

1. grup

Over yüzeyini örten epitel hücreleri genellikle yassı şekilli olup, apikal

kısımlarında kısa, küt mikrovilluslar seyrek olarak izlenmekteydi. Hücrelerin geniş ve

düzensiz olan çekirdekleri hafif indentasyonlar içermekteydi ve heterokromatin

granülleri çekirdek membranı ile yakın ilişkili olarak bulunurken, ökromatin granülleri

çekirdek boyunca dağılmışlardı. Sitoplazmalarında sferikal şekilli, koyu görünen,

mitokondriyonlar genellikle apikal sitoplazmada yerleşirken, yaygın serbest ribozomlar

sitoplazma boyunca dağılmışlardı. Hücrelerin lateral yüzeyleri düzgün olup, hücreler

birbirlerine bağlantı kompleksleri aracılığı ile bağlanmışlardı. Epitel hücreleri, altlarında

bulunan tunika albuginea tabakasından ince bir bazal lamina aracılığı ile ayrılmaktaydı.

Tunika albuginea içerisinde iğ şekilli çekirdekleri ile fibroblastlar ve fibroblastlar

arasında dağılmış halde kollajen lifler yaygın olarak izlenmekteydi (Şekil 6).

Over korteksinde yer alan primordiyal folliküllerin kapsamında bir oosit ve bunu

çevreleyen yassı şekilli folliküler hücreler bulunmaktaydı. Merkezde yerleşen oosit

geniş ve düzgün sınırlara sahip ökromatik bir çekirdek içermekteydi. Oosit

sitoplazmasında lamellar tarzda kristalar içeren, sferikal şekilli mitokondriyonlar ve

dağınık halde bulunan serbest ribozomların varlığı gözlenmekteydi. Ayrıca çekirdeğe

yakın yerleşimli olan Golgi kompleksine ait sisternaların hafif genişlemeler gösterdiği

dikkati çekmekteydi. Yine ooplazma içerisinde elektron dens görünümlü, membranla

çevrili yapıların varlığı da izlenmekteydi. Yer yer membranla çevrili elektron lusent

görünümlü, değişik hacimlerde vesiküller de ooplazma içerisinde izlenirken, bazı

alanlarda bu yapılar içerisinde elektron dens granüllerin varlığı da dikkati çekmekteydi.

Düzgün bir yüzeye sahip olan oositin folliküler hücreler ile çevrili olduğu

görülmekteydi. Yassı şekilli folliküler hücreler ince, uzun çekirdeklerinde periferal

yerleşimli heterokromatin granüllerini içerirken, az miktarda ökromatin granülleri

çekirdek boyunca dağılmıştı. Dar bir sitoplazmaya sahip olan folliküler hücreler,

sitoplazmalarında ince, uzun mitokondriyonlar ve granüler endoplazmik retikülüm

(GER) sisternaları ve serbest ribozomları içermekteydiler. Aynı zamanda bu folliküler

hücrelerin sitoplazmaları içerisinde elektron dens yapıların varlığı da görülmekteydi.

41

Yassı şekilli folliküler hücreler oosit ile yakın ilişkili olup ince bir bazal lamina ile

ovaryan stromadan ayrılmaktaydılar (Şekil 7).

Primer folliküller merkezi yerleşimli bir oosit ve oositi çevreleyen 2-3 tabakalı,

kübik şekilli granüloza hücrelerinin varlığı ile karakterizeydi. Oosit çekirdeği merkezi

yerleşimli olup hafif girinti ve çıkıntılar içermekteydi. Çekirdekte ökromatin granülleri

yaygın olup çekirdek boyunca homojen olarak dağılmıştı. Ooplazma boyunca yaygın,

değişik hacimlerde, sferikal şekilli mitokondriyonlar genellikle kümeler halinde

bulunurken, Golgi kompleksi mitokondriyonlar ile yakın yerleşimli sisternalar halinde

bulunmaktaydı. Ender kortikal granüller perinüklear bölgede ve oolemmaya yakın

alanlarda yerleşmişlerdi. Oosit yüzeyinde bulunan çok sayıda, kısa mikrovilluslar

granüloza hücreleri ile oosit arasında yer alan zona pellusida içerisine doğru

uzanmaktaydı. Zona pellusidanın dışında yer alan granüloza hücrelerinin ökromatik

görünümlü, sferikal şekilli, yer yer indentasyonlar gösteren çekirdeklerinde belirgin 1-2

çekirdekçiğin varlığı gözlendi. Bazı granüloza hücrelerinin mitoz bölünmenin metafaz

evresinde olduğu gözlendi. Granüloza hücrelerinin sitoplazmaları içerisinde ince, uzun

veya sferikal şekilli mitokondriyonlar, serbest ribozomlar ve supranüklear yerleşimli

Golgi kompleksi bulunmaktaydı. Bazı mikrograflarda gelişen folliküllerin granüloza

hücreleri arasında, follikül sıvısını içeren küçük boşlukların varlığı dikkati çekmekteydi.

Granüloza hücreleri ince bir bazal lamina aracılığı ile teka tabakasından ayrılmaktaydı.

Teka tabakasındaki hücrelerin merkezi yerleşimli, oval şekilli, veziküler tipte

çekirdekleri olduğu izlenmekteydi (Şekil 8).

Gelişimin daha ileri evresindeki folliküllerde merkezi yerleşimli oositin

ökromatik çekirdeğinin girintiler çıkıntılar içerdikleri görülürken, ooplazma içerisinde

elektron dens kortikal granüllerin sayılarının arttığı ve tüm ooplazmaya dağıldıkları

dikkati çekti. Ayrıca ooplazma içerisinde birbirlerine paralel tarzda düzenlenmiş,

membranöz yapıların varlığı da yaygın olarak izlenmekteydi. Serbest ribozomlar tüm

ooplazmaya dağılmış halde bulunurken, ooplazma içerisinde bazı alanlarda lizozomal

yapılar da bulunmaktaydı. Oositin yüzeyinden çıkan mikrovillusların oldukça yaygın

olduğu ve zona pellusida içerisine uzanan granüloza hücrelerinin sitoplazmik uzantıları

ile ilişkili oldukları izlenmekteydi (Şekil 9). Kübik şekilli granüloza hücrelerinin;

ökromatin granüllerinden zengin yer yer heterokromatin granüllerini de içeren

çekirdeklerinin oldukça fazla indentasyonlara sahip olduğu görüldü. Bazı granüloza

42

hücrelerinin mitoz bölünmenin değişik aşamalarında olduğu görülürken, interfaz

evresindeki hücrelerin sitoplazmalarında iyi gelişmiş GER sisternaları, yaygın

mitokondriyonlar, serbest ribozomlar ve lizozomal yapıların varlığı saptandı (Şekil 10).

İleri gelişim evresindeki bazı folliküller normal yapıda izlenirken, bazılarında ise

dejeneratif değişikliklerin olduğu dikkati çekmekteydi. Bu folliküllerde granüloza

hücrelerinin oosit ve zona pellusidadan tamamen ayrıldığı, oosit ile ilişkili zona

pellusidanın oldukça kalınlaştığı, oosit yüzeyinin düzensizleştiği, mikrovilluslarını

yitirdiği, ooplazma içerisinde yaygın vezikül ve vakuollerin oluştuğu saptandı. Ayrıca

bu follikülde zona pellusida ile yakın yerleşimli, çok sayıda veziküller içeren,

sitoplazmik densitesi artmış, hücre kalıntılarının varlığı da izlendi (Şekil 11).

Over stroması içerisinde bulunan, iğ şekilli fibroblast benzeri hücreler yassı

şekilli bir çekirdeğe sahip olup, sitoplazmalarında mitokondriyonlar ve yaygın GER

sisternaları içermekteydiler (Şekil 12). Yine over stroması içerisinde yer alan

interstisyel hücrelerin çekirdekleri yuvarlak olup, sitoplazmalarında yaygın lipid

damlacıkları ve tübüler tipte agranüler endoplazmik retikülüm (SER) sisternaları yaygın

olarak bulunmaktaydı (Şekil 8).

Bu gruba ait uterusların prizmatik şekilli yüzey epitel hücrelerinin derin

indentasyonlar içeren çekirdeklerinde belirgin bir çekirdekçik içermekteydiler.

Hücrelerin apikal yüzeylerinde kısa, küt mikrovilluslar gözlenirken, lateral yüzeylerinin

apikalinde bağlantı komplekslerinin varlığı görülmekteydi. Ayrıca hücrelerin apikal

sitoplazmalarında birkaç mikropinositik veziküllerin varlığı görülürken, elektron opak

bir matrikse sahip, sferikal veya oval şekilli mitokondriyonların apikal sitoplazmada

yaygın olmakla birlikte sitoplazma boyunca dağıldığı görüldü. Yaygın GER sisternaları,

lizozomal yapılar ve supranüklear yerleşimli, iyi gelişmiş bir Golgi kompleksinin varlığı

izlenirken, bazal sitoplazmada iri, sferikal şekilli ender lipid damlacıklarının bulunduğu

da gözlendi. Hücreler; bazal yüzeylerinde bulunan belirgin bir bazal lamina tarafından

endometriyal stromadan ayrılmışlardı (Şekil 13). Yüzey epiteli altında yer alan

endometriyal stromada, stromal hücrelerin yassı şekilli, heterokromatin granüllerinden

zengin çekirdeklerinde belirgin bir çekirdekçik, sitoplazmalarında iyi gelişmiş GER

sisternaları, yaygın mitokondriyonlar ve serbest ribozomlar içerdikleri görülmekteydi.

Stromal hücrelerin ince, uzun sitoplazmik uzantılara sahip olduğu ve bu uzantılar

içerisinde mitokondriyonlar ve serbest ribozomları içerdiği gözlendi. Stromal hücrelerin

43

demetler tarzında düzenlenmiş kollajen lifler ile yakın ilişkili olduğu saptanırken,

stromal hücreler arasında geniş hücrelerarası mesafenin varlığı dikkat çekiciydi. Ayrıca

stromada endotel hücreleri ile döşeli kapillerler de normal olarak izlenmekteydi (Şekil

14). Stromada yer alan bez epitel hücreleri alçak prizmatik şekilli olup, oval şekilli

çekirdeklerinde heterokromatin granülleri periferal olarak yerleşmişti. Hücrelerin apikal

yüzeylerinde bulunan mikrovillusların kısa, küt ve seyrek oldukları dikkati

çekmekteydi. Bu hücrelerin sitoplazmaları içerisinde çekirdeğe yakın yerleşimli Golgi

kompleksi, sferikal şekilli mitokondriyonlar, GER sisternaları, serbest ribozomlar ve

agranüler endoplazmik retikülüm sisternaları yer almaktaydı. Bu hücreler de belirgin bir

bazal lamina ile çevrili olup, hücreler birbirlerine bağlantı kompleksleri aracılığı ile

tutunmuşlardı (Şekil 15). Endometriyumun altında yer alan miyometriyum tabakası

içerisinde düz kas hücreleri ve bu hücrelerin arasında yer alan kollajenler lifler ve

fibroblastlar yer almaktaydı. Düz kas hücreleri hafif indentasyonlar içeren,

heterokromatin granüllerinden zengin bir çekirdeğe sahip olup, sitoplazmalarında

yaygın miyofilamentler, sferikal şekilli mitokondriyonlar, glikojen partikülleri

içerdikleri görülmekteydi. Belirgin bir bazal lamina ile çevrili olan düz kas hücreleri

arasında demetler halinde kollajen lifler ve kan damarları yer almaktaydı.

Miyometriumun altında yer alan ince perimetriyum tabakasında fibroblastlar, kollajen

lifler, kan damarları ve dış yüzeyinde, yassı şekilli mezotel hücreleri yer almaktaydı.

Mezotel hücreleri oldukça yassı bir çekirdek ve dar bir sitoplazmaya sahip olup, apikal

yüzeylerinde ince, seyrek mikrovilluslar içermekteydiler (Şekil 16).

2. grup

Over yüzeyini örten epitel, hafifçe yassılaşmış hücrelerden oluşmaktaydı.

Hücrelerin apikal yüzeyinde bulunan seyrek, ince, uzun mikrovillusların yanı sıra bazı

hücrelerin tek bir silyum içerdiği de dikkati çekmekteydi. Hücrelerin indentasyonlar

gösteren çekirdeklerinde heterokromatin granülleri çekirdek kılıfına yakın alanlarda

yoğun kümeler oluştururken, nükleoplazma boyunca da ökromatin granülleri ile birlikte

küçük kümeler halinde bulunmaktaydılar. Ribozomlar sitoplazma boyunca dağılmış

halde bulunurken, sferikal veya ince, uzun şekilli mitokondriyonların genellikle apikal

sitoplazmada yerleştikleri dikkati çekmekteydi. Yüzey epitel hücrelerinden ince bir

44

bazal lamina ile ayrılan belirgin tunika albuginea tabakası, iğ şekilli çekirdekleri ve dar

sitoplazmaları ile fibroblastlar ve yaygın kollajen lifleri içermekteydi (Şekil 17).

Ovariyan folliküller 1. gruptaki folliküller ile benzer ultrastrüktürel özellikler

göstermekteydiler. Gelişme sürecine girmiş folliküllerde merkezi yerleşimli oosit, hafif

girinti ve çıkıntılara sahip, ökromatin granüllerinden zengin bir çekirdek içermekteydi.

Geniş oosit sitoplazması içerisinde sferikal şekilli mitokondriyonlar, serbest ribozomlar,

birbirine paralel halde düzenlenmiş membanöz yapılar, endoplazmik retikülüm

sisternaları ve elektron dens, membranla çevrili yapılar çekirdek yakınında ve periferal

sitoplazmada kümeler halinde bulunmaktaydılar. Oosit yüzeyinden çok sayıda, kısa, küt

mikrovilluslar görülmekteydi. Oositin etrafını saran kübik şekilli granüloza

hücrelerininde sitoplazmik uzantılarının da zona pellusida içerisine doğru uzandıkları ve

bazı alanlarda oosit yüzeyi ile yakın ilişkili oldukları izlenmekteydi. Granüloza

hücrelerinin yuvarlak şekilli çekirdekleri hafif indentasyonlar içermekteydi.

Sitoplazmalarında sferikal şekilli mitokondriyonlar ve serbest ribzomlar normal olarak

görülmekteydi. Granüloza hücreleri arasında follikül sıvısı ile dolu küçük boşlukların

varlığı da gözlendi (Şekil 18). Bu grupta da ekzantrik yerleşimli oosit çekirdeği,

granüloza hücrelerinde çekirdekte heterokromatin artışı, sitoplazmik densitede artış,

endoplazmik retikülüm sisternalarında ve perinüklear sisternada genişlemeler ile

karakterize değişiklikler gösteren folliküllerin varlığı gözlendi (Şekil 19).

Over stromasında yer alan fibroblast benzeri hücreler ve interstisyel hücreler

normal ultrastrüktürel özelliklerde izlendi.

Uterus lümenini döşeyen prizmatik şekilli epitel hücreleri, ince, uzun,

indentasyonlar içeren çekirdeklerinde belirgin bir çekirdekçik içermekteydiler.

Hücrelerin apikal sitoplazmalarında sferikal şekilli mitokondriyonlar, GER sisternaları,

lizozomal yapılar ve serbest ribozomlar yer almaktaydı. Hem apikal sitoplazmada

hemde bazal sitoplazmada lipid damlacıklarının varlığı dikkati çekmekteydi. Hücrelerin

apikal yüzeylerinde kısa küt mikrovilluslar yer alırken, lateral kısımlarında birbirlerine

bağlantı kompleksleri aracılığı ile bağlı oldukları görülmekteydi. Uterus lümenini

döşeyen epitel hücreleri ince bir bazal lamina ile endometriyal stromadan

ayrılmaktaydılar (Şekil 20). Endometriyal stromada yer alan stromal hücreler

indentasyonlar içeren çekirdekleri, sitoplazmalarında yaygın GER sisternaları,

mitokondriyonları ve ince, uzun sitoplazmik uzantıları ile normal yapıda izlenirken

45

stromada yer alan kollajen liflerin 1. gruptakilere göre bir miktar artmış olduğu dikkati

çekti (Şekil 21).

Endometriyal bezlerin lümenini döşeyen kübik şekilli hücrelerin yuvarlak şekilli

çekirdeklerinde belirgin bir çekirdekçiğe sahip olduğu, sitoplazmalarında sferikal şekilli

mitokondriyonların, iyi gelişmiş Golgi komplekslerinin ve lizozomal yapıların varlığı

görülmekteydi. Hücrelerin apikal yüzeyindeki mikrovilluslar normal yapıda

izlenmekteydi. Bezlerin lümenini döşeyen epitel hücreleri belirgin bir bazal lamina

aracılığı ile endometrial stromadan ayrılmaktaydı (Şekil 22).

Miyometriyum tabakası ve perimetriyum tabakası kapsamındaki hücreler ve lifler

1. gruptakine benzer ultrastrüktürel özellikler göstermekteydi.

3. grup

Normal ultrasütrüktürel özelliklere sahip olan over yüzey epitel hücrelerinin

altında bulunan, tunika albuginea tabakasına yakın yerleşimli olarak bulunan

primordiyal folliküller; merkezi yerleşimli bir oosit ve etrafında tek tabaka halinde

düzenlenmiş yassı şekilli folliküler hücreler içermekteydiler. Oosit merkezi yerleşimli

ve geniş olup ökromatin granüllerinden zengin bir çekirdeğe sahipti. Sitoplazmaları

içerisinde dağınık halde büyük, sferikal şekilli mitokondriyonlar, çekirdeğe yakın

yerleşimli Golgi kompleksi, serbest ribozomlar, değişik hacimlerde, sferikal şekilli

elektron dens granüller ve seyrek elektron lusent vakuoller bulunmaktaydı. Oositin

etrafını saran yassı şekilli folliküler hücrelerin çekirdekleri oval şekilli olup,

indentasyonlar içermekteydiler. Dar sitoplazmalarında az sayıda, sferikal şekilli

mitokondriyonlar ve GER sisternaları görülmekteydi. Primordiyal folliküller ince bir

bazal lamina aracılığı ile ovaryan stromadan ayrılmaktaydılar (Şekil 23).

Gelişme sürecine girmiş folliküllerin oositlerinde ökromatin granüllerinden

zengin çekirdeği hafif girinti ve çıkıntılar içermekteydi. Oosit sitoplazması içerisinde

organellerin perifere yakın yerleşimli oldukları ve kümeler teşkil ettikleri dikkati

çekmekteydi. Sitoplazmanın periferinde GER sisternaları, Golgi kompleksi, sferikal

şekilli mitokondriyonlar, az miktarda elektron dens kortikal granüller, multiveziküler

cisimler, birbirine paralel halde düzenlenmiş membranöz yapılar ve serbest ribozomlar

bulunmaktaydı. Oosit yüzeyinde yer alan yaygın mikrovilluslar oositi çevreleyen zona

pellusida içerisine doğru uzanmıştı. Oosit etrafını saran kübik şekilli granüloza hücreleri

46

yuvarlak, derin indentasyonlara sahip, heterokromatin granüllerinden zengin

çekirdeklere sahipti. Sitoplazmaları organel yönünden zengin olup yaygın

mitokondriyonları, iyi gelişmiş GER sisternalarını ve serbest ribozomları içermekteydi

(Şekil 24). Bazı mikrograflarda oosit ile granüloza hücreleri arasında geçit

bağlantılarının olduğu dikkati çekerken, granüloza hücreleri ile oositin yakın ilişkili

oldukları alanlarda, granüloza hücrelerinin sitoplazmasında mitokondriyonların yaygın

olduğu, GER sisternalarının genişlediği ve lümenlerinde elektron opak bir materyal

içerdikleri dikkati çekti (Şekil 24 inset).

Gelişimin daha ileri evrelerinde sağlıklı folliküllerin yanı sıra dejeneratif

değişiklikler gösteren folliküllerin varlığı da dikkati çekmekteydi. Bazı folliküllerde

oosit, zona pellusida ve granüloza hücrelerinin çoğunluğu normal ultrastrüktürel

özelliklere sahip iken, granüloza hücrelerinin bazılarında çekirdek ve sitoplazmik

densite artışı, endoplazmik retikülüm sisternalarının ve perinüklear sisternalarının

genişlemesi ile karakterize yapısal değişiklikler gözlenmekteydi (Şekil 25). Bazı

folliküllerde ise granüloza hücrelerinin tamamında gözlenen, çekirdek ve sitoplazmik

densite artışı, yaygın vakuolizasyon ve perinüklear sisterna genişlemesi ile karekterize

dejeneratif değişikliklere oosit sitoplazmasında da benzer değişikliklerin eşlik ettiği ve

zona pellusidanın kalınlaşarak ondülalı bir hal aldığı görüldü (Şekil 26). Bazı

folliküllerde ise oosit sitoplazması içerisinde, çekirdek materyalini içeren membran ile

çevrili yapıların olduğu, vesikül ve vakuollerin geliştiği, lizozomal yapıların arttığı ve

birden fazla oosit sitoplazmasının zona pellusida ile çevrelendiği izlenmekteydi (Şekil

27). Muhtemelen oositin segmentasyonu sonucunda oluşmuş, oosite ait sitoplazmik ve

nüklear materyali içeren bu yapıların zona pellusida ile ilişkili olan yüzeylerinde,

mikrovillusların olmadığı görülürken, birbirlerine komşu yüzeylerinde ise

mikrovillusların belirgin bir şekilde varlığını sürdürdüğü saptandı (Şekil 28). Oosite ait

sitoplazma parçalarını çevreleyen zona pellusidanın ise oosit ve granüloza hücrelerinden

kaynaklanan sitoplazmik uzantılardan tamamen yoksun olduğu dikkati çekmekteydi. Bu

folliküle ait granüloza hücreleri arasında yaygın apoptotik cisimlerin varlığı da ilgi

çekiciydi. Apoptotik cisimler; membranla çevrili olup, sitoplazmik ve çekirdeğe ait

materyali içeren, yaygın vakuollerin varlığı ile karekterizeydiler (Şekil 27 inset).

47

Ovaryan stromada yer alan stromal hücreler ve interstisyel hücreler ile follikülleri

çevreleyen teka tabakasına ait hücreler normal morfolojik yapıda izlenmekteydiler

(Şekil 23, 24, 26)

Bu grupta yer alan sıçanların uterusları elektron mikroskopta incelendiğinde;

endometriyumu döşeyen yüzey epitel hücrelerinin 1 ve 2. gruplardakilerden farklı

ultrastrüktürel özellikler gösterdiği dikkati çekti. Bu değişiklikler; epitel hücrelerinde

çekirdeklerin derin indentasyonlar içermesi, hücrelerin apikal yüzeylerinde bulunan

mikrovillusların sayılarının artarak, boylarının uzaması, hücrelerin apikal sitoplazması

içerisinde yer alan mikropinositik veziküllerin sayılarının artması, endoplazmik

retikülüm sisternalarının hafifçe genişlemesi, mitokondriyonların hacim ve sayılarının

artması ve yaygın lizozomal yapıların varlığı ile karakterizeydi (Şekil 29). Endometriyal

stromada yer alan stromal hücreler ise indentasyonlar içeren çekirdekleri,

sitoplazmalarında yaygın serbest ribozomları, iyi gelişmiş GER sisternaları ve yaygın

mitokondriyonları ile aktif bir hücrenin ince yapı özelliklerini göstermekteydi. Ayrıca,

stromada kollajen lif demetlerinin artarak hücreler arasındaki boşlukları tamamen

kaplamış olması ilgi çekiciydi (Şekil 30). Stromada yer alan endometriyal bezleri

döşeyen kübik şekilli hücrelerde ise mikrovillusların sayıları ile mitokondriyonların

hacim ve sayılarının arttığı ve lipid damlacıklarının daha yaygın olduğu dikkati çekti.

Supranüklear yerleşimli Golgi kompleksinin sisternalarının hafifçe genişlemiş olduğu

görülürken, lizozomal yapıların da arttığı izlenmekteydi (Şekil 31).

Miyometriyum tabakasındaki düz kas hücreleri ve perimetriyum tabakası

içerisinde bulunan fibroblastlar, kollajen lifler ve mezotel hücreleri normal

ultrastrüktürel yapıda izlendi.

4. grup

40 mg/kg Genistein verilen deney grubuna ait mikrograflarda over yüzeyini örten

epitel hücreleri ve tunika albuginea tabakasının diğer gruptakiler ile benzer özelliklere

sahip oldukları saptandı (Şekil 32).

Bazı primordiyal folliküler merkezi yerleşimli oosit ve oosit ile ilişkili yassı

şekilli folliküler hücreleri ile normal yapıda izlenirken (Şekil 32), bazı primordiyal

folliküllerde ise iki oositin birbirine geçit bağlantıları aracılığı ile bağlı olduğu ve bu iki

oositin folliküler hücrelerce çevrilendiği gözlendi. Aynı follikül içerisinde bulunan bu

48

oositlerin sitoplazmik sınırları bazı alanlarda ayırd edilememekteydi (Şekil 33). Oositler

sitoplazmalarında sferikal şekilli, lamellar tip kristalara sahip mitokondriyonlar,

çekirdeğe yakın yerleşimli Golgi kompleksi ve serbest ribozomlar içermekteydi. Ayrıca

sitoplazma içerisinde genişlemiş endoplazmik retikülüm sisternaları ve elektron dens

yapılar gözlenmekteydi. Primordiyal follikülde oositin etrafını saran folliküler

hücrelerde sitoplazmanın büyük çoğunluğunu işgal eden yassı şekilli çekirdekleri,

ökromatin granülleri yanı sıra çekirdeğin periferal kısımlarında kümelenen

heterokromatin granüllerini de içermekteydi. Dar sitoplazmaları içerisinde GER

sisternaları, serbest ribozomlar ve mitokondriyonları içermekteydiler. Primordiyal

folliküller ince bir bazal lamina aracılığı ile ovaryan stromadan ayrılmaktaydılar (Şekil

32, 33).

Bu gruptaki overlerde de gelişme sürecine girmiş folliküllerin bazıları normal

morfolojik yapılarını korur iken bazılarında ise oosit ve granüloza hücrelerinde

dejeneratif değişikliklerin olduğu saptandı. Bu değişiklikler 3. grupta tanımlanan

değişikliklere benzer olup, oosit sitoplazmasında vezikül ve vakuollerin oluşumu, oosit

çekirdeğinin girintili, çıkıntılı hal alması, granüloza hücreleri arasında makrofaj ve

apoptotik cisimlerin varlığı, membrana granüloza tabakasının incelmesi, granüloza

hücrelerinin yassı bir hal alması, granüloza hücrelerinde GER sisternalarının

genişlemesi, vakuollerin oluşumu ve mitokondriyonların genişleyerek matrikslerinde

elektron lusent alanların oluşması ile karakterizeydi (şekil 34, 35).

Bazı mikrograflarda ise gelişimin ileri dönemindeki follikül içerisinde birden

fazla oositin varlığı dikkati çekmekteydi. Bu oositler oldukça iyi gelişmiş, tek bir zona

pellusida ile çevrili olup, sitoplazmalarında vezikül ve vakuollerin oluştuğu, yaygın

mitokondriyonlar ile birlikte plazma membranına yakın alanda kortikal granüllerin

bulunduğu, birbirine paralel tarzda düzenlenmiş membranöz yapıların ooplazma

boyunca dağıldığı, oositlerin birbirine komşu olduğu yüzeylerinde mikrovillus

içermediği ve düzgün olan oosit yüzeylerinin birbiri ile oldukça yakın yerleşimli

olduğu, zona pellusida ile ilişkili olan oosit yüzeylerinde ise seyrek mikrovillusların

varlığı saptandı (Şekil 36 A ve B).

Over stromasında yer alan interstisyel hücreler, fibroblast benzeri stromal hücreler

ve follikülleri çevreleyen teka tabakasındaki hücreler, diğer gruplarda olduğu gibi

normal morfolojik özellikleri göstermekteydiler.

49

40 mg Genistein verilen grupta yer alan sıçanların uterusları ince yapı düzeyinde

değerlendirildiğinde; endometriyumu döşeyen, epitel hücrelerinde diğer gruplardakilere

göre GER sisternalarının iyi geliştiği, apikal sitoplazmada yer alan örtülü veziküllerin,

mitokondriyonların ve lipid damlacıklarının sayılarının arttığı dikkati çekmekteydi.

Ayrıca hücrelerin apikal kısımlarında, sitoplazmanın lümene doğru, piramit şeklinde,

geniş çıkıntılar oluşturması ilgi çekiciydi. Bu çıkıntıların üzerinde çok sayıda

mikrovillusların olduğu görüldü. Hücrelerin apikal yüzeyinde bulunan mikrovillusların

sayılarının arttığı da saptandı (Şekil 37).

Endometriyal stromada yer alan stromal hücrelerin, kollajen liflerin ve

endometriyal bezleri döşeyen epitel hücrelerinin ultrastrüktürel özellikleri 4 mg

Genistein verilen grupta tanımlanan bulgulara benzer nitelikte olup, stromada kollajen

liflerin belirgin demetler teşkil ettiği görüldü (Şekil 38).

Miyometriyum ve perimetriyum tabakaları kapsamındaki hücrelerin de

ultrastrüktürel yönden diğer gruplarlardakiler ile aynı özelliklere sahip oldukları izlendi.

50

Şekil 6: 1. grupta over yüzeyini örten yassı epitel hücrelerin (E) apikal kısımlarında seyrek mikrovilluslar (Mv), hafif indentasyonlar içeren çekirdekleri (Ç) sitoplazmalarında koyu mitokondriyonlar (beyaz ok) izlenmekte. Epitel hücrelerinin lateral kısımlarında bağlantı komplekslerini (siyah ok) içerdikleri, altında yer alan tunika albuginea (TA) içerisinde fibroblastlar (Fb) bulunmakta.

Mv

TA

Fb

Ç

EH

51

Şekil 7: Kontrol grubuna ait primordiyal follikülde merkezi yerleşen oosit (O) ve oositi çevreleyen yassı folliküler hücreler (FH) görülmekte. Çekirdek (Ç), Golgi kompleksi (G), mitokondriyonlar (M).

Ç

O

Ç

M

G

FH

52

Şekil 8: Kontrol grubuna ait primer follikülde merkezi yerleşimli oosit (O), zona pellusida (ZP), granüloza hücreleri (GH) izlenmekte. Primer follikül dıştan bazal lamina (BL) aracılığı ile etrafında yer alan teka hücrelerinden (TH) ayrılmakta. İnterstisyel hücreler (İH).

İH

TH

BL

GH ZP

O

53

Şekil 9. Kontrol grubuna ait gelişen follikülde oositin merkezi yerleşimli çekirdeği (Ç), birbirine paralel membranöz yapıları (siyah ok), elektron dens kortikal granülleri (beyaz ok) izlenmekte. Oositten çıkan mikrovillusların (Mv) ve granüloza hücrelerinin (GH) sitoplazmik uzantılarının (*) zona pellusidaya (ZP) uzandıkları görülmekte.

GH

Mv

Ç

ZP *

54

Şekil 10: Kontrol grubunda gelişme sürecindeki folliküllerde, kübik şekilli granüloza hücrelerinin (GH) indentasyonlar içeren çekirdekleri (Ç) izlenmekte. Bazı granüloza hücrelerinin mitoz bölünmenin değişik aşamalarında olduğu (beyaz ok) görülmekte. Antrum (A).

GH

GH

GH

Ç

Ç

Ç Ç

A

55

Şekil 11: Kontrol grubuna ait atretik follikülde, dejeneratif değişiklikler gösteren oosit (O), kalınlaşmış zona pellusida (ZP), oosit ve zona pellusidadan ayrılan granüloza hücre kalıntıları (GH) izlenmekte. Oosit yüzeyinde mikrovillusların kaybolduğu (beyaz ok) ve oosit sitoplazmasında çok sayıda vezikül ve vakuolün geliştiği (siyah ok) görülmekte.

ZP

O

GH

56

Şekil 12: Kontrol grubunda over stromasında iğ şekilli fibroblast benzeri stromal hücrelerin (SH) yassı şekilli çekirdekleri (Ç), sitoplazmalarında yaygın granüler endoplazmik retikülüm sisternaları (GER) izlenmekte.

SH

Ç

Ç

Ç

SH

SH

GER

57

Şekil 13: Kontrol grubuna ait uterusun prizmatik şekilli epitel hücrelerinde derin indentasyonlar içeren çekirdek (Ç), sferikal şekilli mitokondriyonlar (M), Golgi kompleksi (G) ve iri, sferikal şekilli, ender lipid damlacıkları (Ld) izlenmekte. Hücrelerin apikal yüzeylerinde kısa, küt mikrovilluslar (Mv), lateral yüzeylerin apikal kısımlarında ise bağlantı kompleksleri (beyaz ok) görülmekte. Ayrıca hücreler altlarında yer alan endometriyal stromadan belirgin bir bazal lamina (BL) aracılığı ile ayrıldığı görülmekte.

G

Ld

Ld

M

M

Ç

Ç

G

Mv

BL

58

Şekil 14: Kontrol grubuna ait uterusların endometriyal stromasında, stromal hücrelerin (SH) çekirdekleri (Ç) sitoplazmik uzantıları (*) izlenmekte. Stromal hücreler arasında bu hücreler ile ilişkili kollajen lifler (Kol), kapillerler (kap) ve geniş intersellüler mesafeler (ok başı) yer almakta.

Ç

Ç SH

SH

SH

Kol

Kol

kap

Kol

Ç *

* *

59

Şekil 15: Kontrol grubuna ait uterusun endometriyal bezlerinin lümenini döşeyen alçak prizmatik hücrelerin oval çekirdekleri (Ç), mitokondriyonlar (M), apikal kısımlarda mikrovilluslar (Mv), lateral kısımlarda hücrelerarası bağlantı kompleksleri (beyaz ok) izlenmekte. Bez, endometriyal stromadan belirgin bir bazal lamina (BL) aracılığı ile ayrılmakta.

M

M

Ç

Ç

Mv

BL

60

Şekil 16: Kontrol grubuna ait uterusların miyometriyum tabakasında yer alan belirgin bir bazal lamina ile çevrili düz kas hücreleri (KH), kollajen lifler (Kol), kan damarları (Kd) izlenmekte. Miyometriyum dışında yer alan perimetriyum tabakasında ise apikal kısımlarında mikrovilluslara (Mv) sahip yassı mezotel (M) hücreleri görülmekte.

Kol

Mv

Kd

KH

M

61

Şekil 17: 2. grupta over yüzeyini örten, apikal kısımlarında mikrovillular (Mv) ve tek bir silyum (siyah ok) içeren epitel hücrelerinde hafif indentasyonlu çekirdek (Ç), sitoplazmalarında mitokondriyonlar (M) izlenmekte. Epitel, ince bir bazal lamina (BL) aracılığı ile fibroblastlar (Fb) ve kollajen lifleri içeren tunika albugineadan (TA) ayrılmakta.

Fb

Fb

Fb

TA

BL

M Mv

Ç Ç

62

Şekil 18: 2. grupta yer alan gelişen folliküldeki oositte (O) çekirdek (Ç), mitokondriyonlar (siyah ok), membranla çevrili elektron dens yapılar (beyaz ok), oositten çıkan mikrovilluslar (Mv), zona pellusida (ZP) ve en dışta granüloza hücreleri (GH) izlenmekte. Granüloza hücreleri arasında içi folliküler sıvı ile dolu boşluklar (*) görülmekte.

GH

Mv

ZP

Ç O

GH

*

63

Şekil 19: 2. grupta yer alan bazı folliküllerde oosit (O) ekzantrik yerleşimli çekirdeği (Ç), granüloza hücrelerinin (GH) apikal sitoplazmalarında endoplazmik retikülüm sisternalarında ve perinüklear sisternalarda genileşlemeler (siyah ok) izlenmekte. Bazal lamina (BL), teka hücreleri (TH) ve interstisyel hücreler (İH).

İH

TH

BL

GH

Ç O

GH

GH

GH

64

Şekil 20: 2. grupta bulunan uterus yüzey epitel hücrelerinin ince, uzun çekirdeklerinde (Ç) belirgin çekirdekçikleri (Çkç), sitoplazmasında mitokondriyonlar (M), lipid damlacıkları (Ld) izlenmekte. Hücrelerin apikal kısımlarında mikrovilluslar (Mv), lateral kısımlarında hücrelerarası bağlantı kompleksleri (beyaz ok) görülmekte.

Ld

Çkç

Ç

Ld

M Mv

65

Şekil 21: 2. grupta yer alan uterus endometeriyal stromasında stromal hücrelerin (SH) çekirdekleri (Ç), sitoplazmik uzantıları (beyaz ok) ve kollajen lifler (Kol) izlenmekte.

Ç Ç

Ç

Kol

SH

Ç

SH

SH

66

Şekil 22: 2. grupta endometriyal stromada yer alan bezlerin lümenini döşeyen kübik şekilli hücrelerin yuvarlak çekirdekleri (Ç) içerisinde belirgin çekirdekçikleri (Çkç), apikal yüzeylerinde mikrovillusları (Mv) izlenmekte. Hücreler etraflarında yer alan endometriyal stromadan belirgin bir bazal lamina (BL) ile ayrılmakta.

Mv

Çkç

Ç

BL

67

Şekil 23: 3. grupta yer alan primordiyal folliküllerin oositlerinde (O) merkezi yerleşimli çekirdek (Ç), sferikal şekilli mitokondriyonlar (M), elektron dens granüller (beyaz ok), elektron lusent vakuoller (siyah ok) izlenmekte. Oositin etrafını saran derin indentasyonlu çekirdeğe (Ç) sahip folliküler hücreler (FH) ince bir bazal lamina (BL) aracılığı ile over stromasından ayrılmakta. Ovarian stromada yer alan, lipid damlacıkları (Ld) içeren interstisyel hücreler (İH).

BL

Ld İH

Ç FH

FH M

Ç

O

68

Şekil 24: 3. grupta primer follikülde oositin (O) merkezi yerleşimli çekirdeği (Ç), oosit ile granüloza hücreleri (GH) arasında yer alan zona pellusida (ZP), follikülü over stromasından ayıran bazal lamina (BL) ve en dışta stromal hücreler (SH) izlenmekte. İnset: Granüloza hücrelerinin oosit ile geçit bağlantıları aracılığı ile bağlandıkları (siyah ok) görülmekte. Mitokondriyonlar (M), granüler endoplazmik retikülüm sisternaları (beyaz ok ).

SH

BL

GH

GH

Ç O

GH Mv M

ZP

69

Şekil 25: 3. grupta gelişen follikülde normal yapıda izlenen granüloza hücreleri (GH) yanı sıra çekirdek densitesinde artış (*), endoplazmik retikülüm sisternalarında genişleme (beyaz ok) ile karekterize dejeneratif değişiklikler gösteren granüloza hücreleri de izlenmekte. Oosit (O), zona pellusida (ZP).

O

ZP GH

GH GH GH *

*

70

Şekil 26: 3. grupta yer alan atretik follikülde; oositte (O) yaygın vakuoller (V), ondülalı hal almış zona pellusida (ZP), granüloza hücrelerinde (GH) yaygın vakuolizasyon (*) ve kalınlaşmış bazal lamina (BL) izlenmekte.

GH

GH

GH

V O

ZP * *

* *

BL

71

Şekil 27: 3. grupta yer alan bazı atretik folliküllerde oosit (O) içerisinde membranla çevrili çekirdek materyali (*), lizozomal yapılar (siyah ok), granüloza hücrelerinde (GH) yaygın apoptotik cisimler (beyaz ok) izlenmekte. İnset: Granüloza hücreleri arasında membranla çevrili, sitoplazma ve çekirdek materyali içeren apoptotik cisimler (ok başı) görülmekte.

*

GH

O

GH

GH

72

Şekil 28: 3. grupta yer alan atretik folliküllerde zona pellusida (ZP) ile çevrili, oosit segmentasyonu sonucu oluşmuş sitoplazmik parçalarda çekirdek materyalini içeren membranla çevrili yapılar (beyaz ok), vakuoller (V), lizozomal yapılar (L) izlenmekte. Oosit parçalarının birbirlerine bakan yüzeylerinde mikrovilluslar (Mv) görülürken oositlerin zona pellusida ile ilişkili olan yüzeylerinde mikrovillusların olmadığı (*) görülmekte. Mitokondriyonlar (M).

L

V

O

O

V

Mv

* ZP

M M

73

Şekil 29: 3. grupta bulunan uterusların yüzeyini döşeyen epitel hücrelerinde derin indentasyonlara sahip çekirdek (Ç), hacim ve sayıları artmış mitokondriyonlar (M), genişlemiş endoplamik retikülüm sisternaları (ok başı) izlenmekte. Hücrelerin apikal kısımlarında mikrovillusların (Mv) sayılarının arttığı ve apikal sitoplazmada mikropinositik veziküllerinde arttığı (beyaz ok) görülmekte.

Mv

M Ç

Ç Ç

M

M

74

Şekil 30: 3. Grupta endometriyal stromada bulunan stromal hücreler (SH), çekirdek (Ç), iyi gelişmiş granüler endoplazmik retikülüm sisternaları (GER) ile aktif bir hücre yapısında izlenmekte. Stromal hücreler arasında artan kollajen lif (Kol) demetleri görülmekte.

SH Ç Ç

Ç

SH GER

GER

Kol

Kol

75

Şekil 31: 3. grupta endometriyal stromada bulunan bezlerin lümeninin döşeyen kübik şekilli hücrelerin çekirdekleri (Ç), hacim ve sayıları artmış mitokondriyonları (M), hafifçe genişlemiş sisternaları ile Golgi kompleksi (G), lizozomal yapılar (L), lipid damlacıkları (Ld) izlenmekte. Hücrelerin apikal kısımlarında mikrovilluslar (Mv), birbirlerine komşu olan lateral kısımlarında bağlantı kompleksleri (beyaz ok), belirgin bazal lamina (BL) görülmekte.

L

G

M Ç

Mv

BL Ld

76

Şekil 32: 4. Grupta yer alan overleri örten yassı şekilli epitel hücreleri (EH), tunika albuginea (TA) tabakası, tunika albugineanın hemen altında yerleşen primordiyal follikül izlenmekte. Primordiyal follikül kapsamında merkezi yerleşimli oosit (O), oositi çevreleyen yassı şekilli folliküler hücreler (FH) izlenmekte. Stromal hücreler (SH), çekirdek (Ç).

SH

Ç

FH

O

SH

TA

Ç

EH

77

Şekil 33: 4. grupta primordiyal follikül içerisinde iki oositin (O) birbirleri ile yakın ilişkili oldukları ve iki oosit arasında geçit bağlantılarının (siyah ok) varlığı görülmekte. Oositleri çevreleyen yassı şekilli folliküler hücreler (FH) izlenmekte. Çekirdek (Ç), mitokondriyonlar (M), granüler endoplazmik retikülüm sisternaları (GER).

M

M

M

FH

O

O

Ç

GER

78

Şekil 34: 4. grupta gelişim sürecine girmiş folliküle ait oositte (O) vakuollerin arttığı (siyah ok), mikrovillusların kaybolduğu (*), granüloza hücrelerinin (GH) yassılaştığı, granüloza hücreleri arasında makrofajların olduğu (Mak), granüloza hücrelerinde mitokondriyonların (M) genişlediği izlenmekte.

Mak M

GH

GH O

*

*

79

Şekil 35: 4. grupta yer alan gelişen follikülde oositin (O) girintili çıkıntılı çekirdeği (Ç), granüloza hücrelerinde (GH) vakuoller (siyah ok), genişlemiş endoplazmik retikülüm sisternaları ve granüloza hücreleri arasında makrofaj (Mak) izlenmekte.

GH

GH

GH

Ç

O

GH

Mak

80

Şekil 36: A. 4. grupta yer alan gelişim sürecine girmiş folliküllerde birden fazla oositin (O) varlığı, oositi çevreleyen tek bir zona pellusida (ZP) ve etraflarında granüloza hücreleri (GH) izlenmekte. B. Oositlerde mitokondriyonlar (M), birbirlerine paralel membranöz yapılar (siyah ok) izlenmekte. Oositlerin birbirine komşu olan yüzeylerinde mikrovilluslar (*) görülmezken zona pellusidaya bakan yüzeylerinde kısa, küt mikrovillusların bulunduğu (beyaz ok) dikkati çekmekte.

A

B

GH GH ZP

O O

O

M

M

M

M

* * *

81

Şekil 37: 4. Grupta yer alan uterusların yüzey epitel hücrelerinin sitoplazmasında artan mitokondriyonlar (M), lipid damlacıkları (Ld), apikal kısımda örtülü veziküller (siyah ok), apikal yüzeyinde sık ve uzun mikrovilluslar (M), hücrelerin lateral kısımlarında bağlantı kompleksleri (beyaz ok) izlenmekte. Ayrıca hücrelerin apikal kısımlarında, sitoplazmanın piramit şeklinde geniş çıkıntılar oluşturması ( ) dikkati çekmekte.

M M

M

Ld

Mv Mv

82

Şekil 38: 4. grupta uterusların endometriyal stromasında 3. gruptakiler ile benzer özelliklere sahip stromal hücreler (SH), kollajen lifler (Kol) ve kan damarları (Kd) izlenmekte. Çekirdek (Ç).

Ç

Kd

SH Kol Ç

SH

Ç

83

5. TARTIŞMA

Genistein; fitoöstrojenlerin izoflavon alt grubuna ait olup, güçlü östrojenik

aktiviteye sahiptir ve vücudumuzdaki endojen östrojenlere benzer aktivite

göstermektedir. Yetişkin insanlar Genistein’e, soyalı yiyecekler tüketerek maruz

kalırlarken, bebekler ise fötal dönemde ve doğumdan sonra laktasyon döneminde

annenin beslenmesi nedeniyle veya soya katkılı bebek mamalarını tüketerek Genistein’e

maruz kalmaktadırlar. Daha önce Genistein ile ilgili yapılan çalışmalarda, Genistein’in

meme ve prostat kanserini, kardiyovasküler hastalıkları önleyici, postmenopozeal

dönemdeki kadınlarda osteoporozu engelleyici ve menopozun olumsuz etkilerini

azaltıcı yararlı etkilerinin olduğu rapor edilmiştir, bu nedenle Genistein içeren ürünlerin

tüketimi önemli ölçüde artmıştır(2,50). Ancak, fetal dönemde Genistein’e maruz kalan

bireylerde üreme bozukluklarının, yetişkinlerde ise menstrüel siklusta düzensizliklerin

olması Genistein’in üreme sistemi üzerine olan etkilerinin kapsamlı olarak

araştırılmasına neden olmuştur.

Sunulan çalışmada; 21 gün boyunca 4 mg/kg ve 40 mg/kg dozlarda Genistein’e

maruz kalan sıçanlarda over ve uterus morfolojilerinin yanı sıra vücut ağırlıkları, FSH,

LH, östradiol ve progesteron değerleri ile follikül gelişimi ve uterus duvar kalınlığı

üzerine etkileri değerlendirildi. Vücut ağırlıklarının 22 günlük sıçanlarda 4 mg/kg ve 40

mg/kg dozlarda Genistein uygulanan gruplarda çözgen grubuna göre farklılık

göstermediği ancak kontrol grubuna oranla üç grupta da artmış olduğu görüldü. Yüksek

dozda Genistein’e maruz kalan yavru sıçanlarda vücut ağırlığının azaldığı pek çok

araştırmacı tarafından rapor edilmiş olmasına rağmen, bu gruplarda görülen ağırlık artışı

muhtemelen Genistein ile verilen mısır yağından kaynaklanmaktadır.

22. günde alınan kan örneklerinin biyokimyasal analizleri sonucunda FSH ve LH

seviyeleri, tüm gruplar arasında karşılaştırıldığında, istatistiksel olarak anlamlı bir fark

olmadığı görüldü. Kontrol ve çözgen gruplarındaki progesteron ve östradiol değerleri ile

Genistein verilen iki gruptaki progesteron ve östradiol değerleri karşılaştırıldığında,

progesteron değerlerinin iki grupta da düştüğü görülürken, yüksek doz Genistein verilen

grupta bu düşüşün oldukça belirgin olduğu, östradiol değerlerinin ise her iki grupta da

arttığı dikkati çekti. Nitekim Lewis ve arkadaşları postnatal 21 gün boyunca sıçanlara

Genistein verdikleri çalışmalarında; kontrol ve Genistein verilen gruplar arasında LH

84

değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık olmadığını, progesteron

değerlerinin ise yüksek doz Genistein verilen grupta düşük olduğunu rapor

etmişlerdir(13). Cotreneo ve arkadaşları ise puberte öncesi Genistein’e maruz kalan

sıçanlarda endokrin sistemin bozulduğu varsayımı ile yaptıkları çalışmalarında östradiol

ve progesteron değerlerini karşılaştırdıklarında, Genistein verilen gruptaki östradiol

değerlerinin kontrol grubuna oranla daha yüksek olduğu, progesteron değerlerinin ise

daha düşük olduğunu bildirmişlerdir(59). Bu araştırmacılar; Genistein uygulanan

gruplarda östrojen reseptörlerinin proteolizisi sonucunda, kandaki östradiol oranlarının

arttığını ileri sürmektedirler. Ancak çalışmamızda ER-β’nın immünhistokimyasal olarak

gösterilmesinde, kontrol ve deney grupları arasında immünpozitif boyanma yoğunluğu

açısından bir fark olmaması, Genistein’in östrojen reseptörlerinde proteolizise neden

olduğu görüşünü desteklememektedir. Östradiol oranlarındaki bu artış; muhtemelen

Genistein’in östrojen reseptörlerine bağlanması nedeniyle, endojen östradiolün

plazmada serbest halde kalmasından kaynaklanmaktadır.

Hughes ve arkadaşları ise geç gebelik ve laktasyon sırasında Genistein’e maruz

kalan sıçanlarda progesteron reseptörlerinin arttığını bildirmişlerdir(14). Çalışmamızda

progesteron değerlerinin düşük olması muhtemelen muhtemelen artmış progesteron

reseptörleri ile ilgili olabilir. Progesteron; uterusta artmış progesteron reseptörlerine

büyük oranda bağlandığından, dolaşımdaki progesteron seviyesi düşecektir.

Tüm gruplara ait overler ışık ve elektron mikroskobik düzeyde

değerlendirildiğinde over yüzeylerinin genellikle yassı şekilli epitel ile çevrili olduğu ve

bu epitel hücrelerinin tüm gruplarda benzer ultrastrüktürel özellikler gösterdiği saptandı.

Overler boyunca dağılmış primordiyal ve gelişme sürecine girmiş follikülllerin bazıları

normal ultrastrüktürel özellikleri gösterirken, bazıları ise oositte ve granüloza

hücrelerinde dejeneratif değişikliklerin varlığı ile karekterize özellikler göstermekteydi.

Bu değişiklikler oositte kromatin yoğunlaşması olmaksızın çekirdeğin küçük parçalara

ayrılması, sitoplazmada sekonder lizozomların ve vakuollerin artışı, granüloza

hücrelerinde apopitozisin varlığı ile karekterizeydiler. Dişi gonadları gelişmeye

başladıktan sonra, gelişim sürecinde ve yaşam sırasında üreme siklusunun sonuna kadar

olan süreçte, germ hücreleri veya ovarian folliküllerin atreziye uğradıkları

bilinmektedir(29). Atrezi fetal dönemde primordiyal germ hücrelerinde veya folliküllerde

olabileceği gibi erken postnatal dönemde, puberte öncesinde ve puberteden sonra hem

85

primordiyal hem de gelişme sürecine girmiş tüm folliküllerde gözlenebilir. Sıçanlarda

mayoz bölünme ve follikül oluşumu sırasında germ hücrelerinin % 70’inin dejenere

olarak bertaraf edildiği bildirilmektedir(29). Overlerde görülen follikül atrezisinin

apopitoz veya nekroz yolu ile olduğunu rapor eden, Devine ve arkadaşları sıçanlarda

primordiyal ve gelişme sürecine girmiş folliküllerdeki atrezi işaretlerini ultrastrüktürel

olarak tanımlamışlardır. Gelişen folliküllerin atrezisinde oosit segmentasyonunun

sonucunda oluşan, oosite ait sitoplazmik ve nüklear materyali içeren yapıların zona

pellusida ile ilişkili olan yüzeylerinde, mikrovillusların olmadığını ancak birbirlerine

komşu olan yüzeylerinde ise mikrovillusların varlığını sürdürdüğünü, ooplazmada

vakuollerin ve sekonder lizozomların arttığını, granüloza hücrelerinde ise tipik apopitoz

bulgularının geliştiğini bildirmişlerdir(23). Bazı folliküllerde tanımladığımız apoptotik

değişiklikler Devine ve arkadaşlarının bulguları ile uyumlu iken, bazı folliküllerde

tanımladığımız, granüloza hücrelerinde endoplazmik retikülüm ve perinüklear sisterna

genişlemeleri, sitoplazmik ve nüklear densite artışı ve vakuolizasyon ile karekterize

değişiklikler apopitoz bulguları ile uyumlu değildi. Bu bulgularımız son yıllarda

tanımlanan, apopitozdan farklı bir yolakla oluşan, programlı hücre ölümü şekillerinden

biri olan parapitoz bulguları ile örtüşmekteydi(62,63). Dolayısı ile tüm gruplarda gözlenen

follikül atrezisinin programlı hücre ölüm şekillerinden olan apopitoz ve parapitoz yolu

ile gerçekleştiği düşünüldü.

Yüksek dozda Genistein uygulanan grupta bazı primordiyal folliküllerde iki

oositin ve gelişme sürecine girmiş folliküllerde üç oositin olduğu gözlendi. Over

gelişimi sırasında primordiyal germ hücreleri, pregranüloza hücreleri ve bazal

laminadan oluşan ovigeroz kordonlar, ilerleyen dönemde kırılarak, birbirinden ayrılan

ve mayoz bölünmeye giren oositleri çevreleyen pregranüloza hücreleri ile birlikte

primordiyal follikülleri oluşturmaktadır(29). Jefferson ve arkadaşları yaptıkları

çalışmalarında erken postnatal dönemde östrojen seviyesinin düşmesi ile birlikte

ovigeroz kordonların kırıldığını ve primordiyal germ hücrelerinin birbirinden ayrılarak,

her bir oositin pregranüloza hücrelerince çevrelendiğini, ancak yüksek dozda

Genistein’e maruz kalan yavruların overlerinde, Genistein’in östrojenik aktivitesine

bağlı olarak primordiyal germ hücrelerinin birbirinden ayrılamadığını ve birden fazla

sayıda oosit içeren primordiyal folliküllerin oluştuğunu ileri sürmüşlerdir(64).

Bulgularımızda primordiyal follikülde ve gelişme sürecine girmiş follikülde bulunan

86

oositlerin birbirleri ile çok yakın ilişkili oldukları ve gelişen folliküldeki oositlerin

birbirlerine komşu oldukları yüzeylerde mikrovillusların bulunmadığı, tek bir zona

pellusida tarafından çevrelendiği dikkati çekmekteydi. Ancak Nagao ve arkadaşları

postnatal 1-5. günlerde Genistein uyguladıkları yavruların 21. günde alınan overlerinde,

gelişen folliküllerde 2-3 oositin birbirinden ayrı olarak, aynı follikül içerisinde

bulunduğunu rapor etmişlerdir(11). Sunulan çalışmada follikül içerisindeki birden fazla

oositin birbirleri ile çok yakın ilişkili olmaları ve tek bir zona pellusida ile çevrili

olmaları muhtemelen 21 gün boyunca süren Genistein alımından kaynaklanmaktadır.

Genistein verilen sıçanlarda östrojen seviyesi 21 gün boyunca düşmediği için oositler

birbirinden ayrılamamakta ve etraflarında tek bir zona pellusida gelişmektedir. Nitekim

biyokimyasal analizlerde östradiolün Genistein verilen gruplarda belirgin bir şekilde

yüksek çıkması bu görüşümüzü destekler niteliktedir. Genistein’in östrojen reseptörü-β

ile bağlandığı bilinmektedir(12). Jefferson ve arkadaşları çalışmalarında çok oositli

folliküllerin oluşmasında ER-β reseptörlerinin etkili olduğunu ve Genistein’in immatür

fare overlerinde granüloza hücrelerinde bulunan ER-β reseptörlerini hafifçe artırdığını

rapor etmiştir(16). Ancak çalışmamız kapsamındaki tüm gruplarda ER-β reseptörlerinin

boyanma yoğunluklarını karşılaştırdığımızda gruplar arasında bir fark olmadığı

sonucuna vardık.

Uterusun ışık mikroskobik değerlendirilmesi sonucunda Genistein verilen

gruplarda endometriyumda yeşil renkte boyanmış kollajen liflerin arttığı, miyometriyum

tabakasının kalınlaştığı görüldü. Uterusun ultrastrüktürel düzeyde incelemesi sonucunda

ise Genistein verilen gruplarda endometriyumu döşeyen epitel hücreleri kontrol

grubundakilere oranla belirgin ultrastrüktürel değişiklikler göstermekteydi. Luminal

epitelde; hücrelerin boylarının uzaması, apikal sitoplazmada örtülü veziküllerin artması,

GER sisternalarının iyi gelişmesi, mitokondriyonların hacim ve sayılarının artması,

lizozomal yapıların ve lipid damlacıklarının artması ve apikal yüzeydeki

mikrovillusların sayılarının ve uzunluklarının artması ile karakterize değişikliklerin

olduğu görüldü. Ayrıca yüksek doz Genistein verilen gruba ait uterusların yüzey epitel

hücrelerinde bu farklılıkların yanında hücrelerin apikal kısımlarında, yüzeylerinde

mikrovilluslar içeren, geniş, piramit şeklinde sitoplazmik çıkıntıların oluştuğu görüldü.

Bu yapıların henüz puberteye ulaşmamış sıçanlarda görülmesi dikkat çekiciydi.

Spornitz ve arkadaşları siklik sıçanlarda endometriyum luminal epitelinin ultrastrüktürel

87

özelliklerini tanımladıkları çalışmalarında proöstrus, östrus, diöstrus I ve diöstrus II

evrelerinde luminal epitelin ultrastrüktürel değişiklikler gösterdiğini vurgulamışlar.

Östrus siklusta en büyük hacimlerine ulaşan epitel hücrelerinin apikal yüzeylerindeki

mikrovillusların sayı ve uzunluklarının arttığını, GER ve mitokondriyonların iyi

geliştiğini rapor etmişlerdir(65). Ultrastrüktürel bulgularımız Spornitz ve arkadaşlarının

tanımladıkları östrus siklusdaki luminal epitel ince yapı özellikleri ile benzerlik

göstermekteydi. Kontrol grubundan belirgin olarak ayrılan bu özellikler muhtemelen

Genistein’in luminal epitel üzerine olan etkisinden kaynaklanmaktadır. Nitekim yüksek

dozda Genistein uygulanan grupta bu özellikleri daha belirgin olarak görmekteyiz.

Ayrıca Genistein verilen her iki grupta da endometriyum stromasında kollajen lif

miktarının oldukça artarak, kontrol grubunda görülen, stromal hücreler arasındaki

boşlukları tamamen kapladığı görüldü. Pastore ve arkadaşları immatür sıçanlarda

yaptıkları çalışmalarında; östriolün endometriyumda hiperplazi ve hipertrofiye neden

olduğunu, stromal hücreleri etkileyerek kollajen lif yapımını stimüle ettiğini rapor

etmişlerdir(66). Dolayısı ile Genistein’in de bir fitoöstrojen olduğu ve endojen östrojenler

gibi davrandığı dikkate alındığında Genistein’in; endometriyumda stromal hücrelerin

aktivitesi sonucunda kollajen liflerin miktarında bir artışa neden olabileceği sonucuna

varıldı. Ayrıca düz kas hücrelerinde ultrastrüktürel bir farklılığın olmamasına rağmen,

yapılan ölçümlerde, yüksek dozda Genistein verilen grupta miyometriyum tabakasının

oldukça kalınlaştığı dikkati çekti. Nitekim Nagao ve arkadaşları da postnatal dönemde

yüksek dozda Genistein’e maruz kalan sıçanların hem uterus lümenini döşeyen epitel

hücrelerinde hem de miyometriyum tabakalarında hipertrofinin olduğunu rapor

etmişlerdir(11). Tüm bu bulgular değerlendirildiğinde; postnatal 21 gün boyunca maruz

kalınan Genistein’in, uterusun erken gelişimine neden olabileceği düşünüldü.

Sonuç olarak postnatal dönemde, laktasyon süreci boyunca yüksek dozda

Genistein’e maruz kalmanın; sıçanların overlerinde çok oositli folliküllerin gelişimine,

uterusda endometriyum tabakasının luminal epitel ve endometriyal stromasında

zamanından önce gelişime, miyometriyumda hiperplazi ve hipertrofiye neden

olabileceği kanaatine varıldı.

88

6. SONUÇ VE ÖNERİLER

Postnatal 1-21 günleri arasında oral yoldan, Genistein verilen sıçanlarda; FSH,

LH, östradiol ve progesteron değerleri, vücut ağırlıkları, overlerde primordiyal, primer,

antral, atretik folliküllerin sayısı ve uterusun duvar kalınlığı istatistiksel olarak

irdelenirken, over ve uterus dokularının morfolojik özellikleri ışık ve elektron

mikroskobik düzeyde değerlendirilmiştir. Elde edilen bulgular kontrol ve çözgen

gruplarına ait bulgular ile karşılaştırıldığında; yüksek dozda Genistein verilen grupta,

aşağıdaki sonuçlara ulaşılmıştır.

1- Kontrol ve deney grupları arasında; FSH ve LH değerleri açısından

istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmazken östradiol değerlerinin arttığı,

progesteron değerlerinin ise azaldığı görüldü.

2- Yüksek dozda Genistein’e maruz kalan sıçanların overlerinde çok oositli

folliküllerin geliştiği gözlendi.

3- Yüksek dozda Genistein’e maruz kalan sıçanların uteruslarında

endometriyum tabakasındaki epitelin siklik sıçanlardaki östrus dönemine ait

ultrastrüktürel özelliklere sahip olduğu, endometriyal stromada kollajen lif miktarının

arttığı saptandı.

4- Uterusun miyometriyum tabakasında hiperplazi ve hipertrofiye neden olduğu

görüldü.

5- Sıçanlarda görülen tüm bu değişikliklere postnatal 21 gün boyunca gavaj ile

verilen Genistein’in neden olduğu kanaatine varıldı.

6- Gebelik ve laktasyon dönemlerindeki kadınların, üreme sistemi gelişimi

üzerine önemli etkileri olduğu düşünülen Genistein’i içeren besinlerden uzak durması

gerektiği düşünüldü.

89

KAYNAKLAR

1. Duvan CI, Turhan N, Bolkan F. Fitoöstojenler. Dep. Of Obstetrics and Gynecology, 2005. 2. Büyüktuncer Z. Başaran AA. Fitoöstrojenler ve sağlıklı yaşamda önemleri. 2005; 79-94. 3. Coşkun T. Fonksiyonel besinlerin sağlığımız üzerine etkileri. 2005; 48:69-84. 4. Setchell KDR, Zimmer-Nechemias L, Cai J, Heubi JE. Isoflavone content of infant

formulas and the metabolic fate of these phytoestrogens in early life. Am J Clin Nutr, 1998; 68:1453S-61S.

5. Adlercreutz H. Phyto-oestrogens and cancer (Review). 2002. 6. Barnes S. Soy Isofavones-Phytoestrogens and What Else?. 2004; 134:1225-1228. 7. Bingham SA. Atkinson C. Liggins J. Bluck L. Coward A. Phytoestrogens:Where are we

now?. British Journal of Nutrition, 1998; 79:393-406. 8. Davis SR, Dalais FS, Simpson ER, Murkies AL. Phytoestrogens in health and disease.

Recent Prog Horm Res, 1999; 53:185-210. 9. Chandrareddy A, Munneyyirci-Delale O, M.Da, McFarlane SI, Murad O.M, MDb.

Adverse effects of phytoestrogens on reproductive health: A report of three cases. Complementary Therapies in Clinical Practice, 2008;14,132-135.

10. Cassidy A. Potential risks and benefits of phytoestrogen-rich diets. Int. J. Vitam Nutr Res.

2003;73(2):120-6. 11. Nagao T, Yoshimura S, Saito Y, Nakagomi M, Usumi K, Ono H. Reproductive effects in

male and female rats of neonatal exposure to genistein. Reproductive Toxicology, 2001;15:399-411.

12. Jefferson WN, Padilla-Banks E, Newbold RR. Disruption of the developing female

reproductive system by phytoestrogens: Genistein as an example. Mol Nutr Food Res, 2007;51:832-844.

13. Lewis RW, Brooks N, Milburn GM, Soames A, Stone S, Hall M, Ashby J. The effects of

the phytoestrogen genistein on the postnatal development of the rat. Toxicological Science, 2003;71,74-83.

14. Hughes CL, Liu G, Beall S, Foster WG, Davis V. Effects of genistein or soy milk during

late gestation and lactation on adult uterine organization in the rat. Exp Biol Med, 2004;229:108-117.

15. Ruhlen RL, Howdeshell KL, Mao J, Taylor JA, Bronson FH, Newbold RR, Welshons

WV, Saal FS. Low phytoestrogen levels in feed increase fetal serum estradiol resulting in the fetal estrogenization syndrome and obesity in CD-1 mice. Environ Health Perspect, 2008;116:322-328.

90

16. Jefferson WN. Couse JF, Padilla-Banks E. Korach KS. Newbold RR. Neonatal Exposure to Genistein Induces Estrogen Receptor (ER)a Expression and Multioocyte Follicles in the Maturing Mouse Ovary: Evidence for ERb-Mediated and Nonestrogenic Actions. Biology of Repr, 2002; 67: 1285-1296.

17. Kaya M, Polat S, Mete UÖ, Tap Ö. Özel Histoloji Ders Notları. Adana, ÇÜ Tıp Fak Yay,

2006. 18. Ross MH, Pawlina W. Histology: A text and atlas: with correlated cell and molecular

biology. Baltimore, Philadelphia, 6th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2010. 19. Kierszenbaum AL, MD, PhD. Histoloji ve Hücre Biyolojisi, Patolojiye Giriş. Palme

Yayınları, Ankara, 2006. 20. Junqueira LC, Carneiro J, Kelley RO. Basic Histology, 8th Ed, USA, 1995. 21. Guraya M, Kaur P, Guraya SS. Morphology of the house rat ovary during the oestrous

cycle. Z Mikrosk Anat Forsch, 1987;101:815-828. 22. Boubekri A, Gernigon-Spychalowicz T, Khammar F, Exbrayat JM. Histological and

immunohistological aspects of the ovarian cycle of the algerian wild sand rat, Psammomys obesus Cretzschmar. Folia Histochemica Et Cytobiologica, 2007; 45: 41-49.

23. Devine PJ, Payne CM, McCuskey MK, Hoyer PB. Ultrastructural evaluation of oocytes

during atresia in rat ovarian follicles. Biology of Reproduction, 2000;63:1245-1252. 24. Mulheron GW, Quattropani SL, Nolin JM. On the intrinsic ovarian control of the

developmental transition from primordial to primary follicle. Adv Exp Med Biol, 1987; 219:737-42.

25. Hirshfield AN. Theca cells may be present at the outset of follicular growth. Biology of

Reproduction, 1991; 44:1157-1162. 26. O’Shea JD. An ultrastructural study of smooth muscle-like cells in the theca externa of

ovarian follicles in the rat. Anat Rec, 1970;167(2):127-31. 27. Neill JD. Knobil and Neill’s physiology of reproduction. London, USA, 3rd ed, Elsevier

Academic Press, 2006. 28. Kaur P, Guraya SS. Follicular growth and kinetics during the estrous cycle, pregnancy and

postpartum in the Indian mole rat (Bandicota bengalensis). Am J Anat, 1983;166(4):469-82. 29. Guigon CJ, Magre S. Contribution of germ cells to the differentiation and maturation of the

ovary: Insights from models of germ cell depletion. Biology of Reproduction, 2006; 74: 450-458.

30. Satoh M. The histogensis of the gonad in rat embryos. J Anat, 1985; 143:17-37.

91

31. Mazaud S, Guyot R, Guigon CJ, Coudoel N, Magueresse-Battistoni BL, Magre S. Basal membrane remodeling during follicle histogenesis in the rat ovary: contribution of proteinases of the MMP and PA families. Developmental Biology, 2005;277:403-416.

32. Franchi LL, Mandl AM. The ultrasturcture of oogonia and oocytes in the foetal and

neonatal rat. Proceedings: Biological Sciences, Vol. 157, No. 966, Dec. 18, 1962. 33. Guraya SS, Uppal J. Morphological and histochemical studies on the foetal and postnatal

ovaries of the field rat (Millardia meltada). Andrologia, 1977;9(4):371-8. 34. Beaumont HM, Mandl AM. A quantitative and cytological study of oogonia and oocytes

in the foetal and neonatal rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, Vol. 155, No. 961, Apr. 10, 1962.

35. Koçyiğit A, Çevik M. Memeli Reprodüktif Dokuları, Gamet Hücreleri ve Embriyolarında

Apoptozis. Erciyes Üniv. Vet. Fak. Derg, 2011; 8(1):33-41. 36. Carithers JR, Green JA. Ultrastructure of rat ovarian interstitial cells I. Normal structure

and regressive changes following hypophysectomy. J Ultrastructure Research, 1972; 39:239-250.

37. Rajad R, Glaser EM, Hirshfield AN. The changing architecture of the neonatal rat ovary

during histogenesis. Developmental Dynamics, 1992;194:177-192. 38. Mulazımoglu SB, Ide T, Aslan S. Ratlarda üreme. Journal of clinical and Analytical

Medicine, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji ABD, Ankara, Türkiye, 2011.

39. Westwood FR. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging.

Toxicologic Pathology, 2008; 36:375-384. 40. Marcondes FK, Bıanchı FJ, Tanno AP. Determination of the estrous cycle phases of rats:

some helpful consideration. Brazilian Journal of Biology, Vol. 62, No. 4a, 2002. 41. Hubscher CH, Brooks DL, Johnson JR. A quantitative method for assessing stages of the

rat estrous cycle. Biotechnic and Histochemistry, 2005;80(2):79-87. 42. Spornıtz UM, Socın CD, Dravıd AA. Estrous stage determination in rats by means of

scanning electron microscopic images of uterine surface epithelium. The Anatomical Record, 1999;254:116-126.

43. Gray CA, Bartol FF, Tarleton BJ, Wiley AA, Johnson GA, Bazer FW, Spencer TE.

Developmental biology of uterine glands. Biology of reproduction, 2001; 65:1311-1323. 44. Hong W. Britt M. Hakan E. Lena S. A comparative study of estrogen receptors alfa and

beta in the rat uterus. Biology of Repr, 1999; 61:995-964. 45. Madhabananda S. Frank W. Differential expression of estrogen receptor beta and

estrogen receptor alfa in the rat ovary. Endocrinology,1999; 140: 963-971.

92

46. Pelletier G. Labrie C. Labrie F. Localization of oestrogen receptor alfa, oestrogen receptor beta and androgen receptors in the rat reproductive organs. Journal of Endocrinology, 2000; 165:359-370.

47. Pelletier G. Labrie C. Labrie F. Localization of oestrogen receptor alfa, oestrogen receptor

beta and androgen receptors in the rat reproductive organs. Journal of Endocrinology, 2000; 165:359-370.

48. Drummond AE, Fuller PJ. The importance of ER- beta signalling in the ovary. Journal of

Endocrinology, 2010;205;15-23. 49. Hiroi H. Inoue S. Watanabe T. Goto W. Orimo A. Momoeda M. Tsutsumi O. Taketani

Y. Muramatsu M. Differential immunolocalization of estrogen receptor alfa nad beta in rat ovary and uterus. Journal of Molecular Endocrinology, 1999; 22: 37-44.

50. Dixon RA. Ferreira D. Genistein. Phytochemistry, 2002; 60:205-211. 51. Rimoldi G. Christofell J. Seidlova-Wuttke D. Jarry H. Wuttke W. Effects of chronic

genistein treatmenr in mammary gland, uterus and vagina. 2007; 115:62-68. 52. Tousen Y. Umeki M. Nakashima Y. Ishimi Y. Ikegami S. Effects of genistein an

isoflavone, on pregnancy outcome and organ weights of pregnant and lactating rats and development of their suckling pups. 2006; 52:174-182.

53. Miller KP. Borgeest C. Greenfeld C. Tomic D. Flaws JA. In utero effects of chemicals on

reproductive tissues in females. 2004; 198:111-131. 54. Nilüfer D. Boyacıoğlu D. Functıonal food components of soy and soy products. 2008;

33(5): 241-250. 55. Jefferson WN. Padilla-Banks E. Newbold RR. Distruption of the female reproductive

system by the phytoestrogen genistein. 2007; 23:308-316. 56. Perel E. Lindner HR. Dissociation of uterotrophic action from implantation-inducing

activity in two non-steroidal oestrogens. 1970; 21:171-175. 57. Akiyama T. Ishida J. Nakagawa S. Ogawara H. Watanabe S. Itoh N. Shibuya M.

Fukami Y. Genistein, a spesific inhibitor of tyrosine-spesific protein kinases. 1986; 5592-5595.

58. Franke AA. Custer LJ. Daidzein and genistein concentrations in human milk after soy

consumption. 1996; 42:6 955-964. 59. Cotroneo MS, Wang J, Eltoum IA,Lamartiniere AC, Sex steroid receptor regulation by

genistein in the prepubertal rat uterus. Molecular and Cellular Endocrinology. 2001;173:135-145.

60. Luna LG. Manual of Histologic Staining Methods of The Armed Forces İnstitue of

Pathology. 3th Ed., New York: Van Nostrad Reinhold Company, 1972. Chapter 53.

93

61. Kaya M. Elektron mikroskobi teknikleri. Ç.Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 1984; 9(1):1-21. 62. Sperandio S, Poksay K, Belle de I, Lafuente MJ, L,u B, Nasir J, Brendesen DE.

Paraptosis: mediation by MAP kinases and inhibition by AIP-1/Alix. Cell Death and Differentiation, (2004) 11, 1066-1075.

63. Bröker LE, Kruyt FAE, Giaccone G. Cell Death Independent of Caspases: A Review.

Clin Cancer Res. 2005; 11:3155-3162. 64. Jefferson W, Newbold R, Padilla-Banks E, Pepling M. Neonatal genistein treatment

alters ovarian differentiation in the mouse: İnhibition of oocytes nest breakdown and increased oocytes survival. Biology of Reproduction, 74, 161-168 (2006).

65. Spornitz UM, Rinderknecht BP, Edelmann A, Scheidegger B, Cairoli F. Ultrastructure

as a basis for dating rat endometrium. The Anatomical Record, 238: 163-176 (1994)

66. Pastore GN, Dicola LP, Dollahon NR, Gardner RM. Effect of estradiol on the structure and organization of collagen in the lamina propria of the immature rat uterus. Biology of Reproduction, 47,83-91 (1992).

94

ÖZGEÇMİŞ

Emine Güven 1986 tarihinde Adana’nın Ceyhan ilçesinde doğdu. İlköğretim ve

lise eğitimini Adana’da tamamladı. 2008 yılında Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi

Biyoloji Bölümünden mezun oldu. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi

Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans eğitimine başladı. Emine

Güven halen aynı anabilim dalında eğitim-öğretimini sürdürmektedir.

GENİSTEİN’İN POSTNATAL DÖNEMDEKİ SIÇANLARIN OVER VE … · 2019. 5. 10. · Sıçanlarda...

Documents

Transcript of GENİSTEİN’İN POSTNATAL DÖNEMDEKİ SIÇANLARIN OVER VE … · 2019. 5. 10. · Sıçanlarda...