BIOCH1MIE, 1973, 55, 291-296.

Etude comparative des valyl tRNA cytoplasmique et mitochondrial de levure.

B. ACCOCEBERRY, J. M. SGHNELLER et A. J. C. STAHL.

Laboratoire de Biochimie, U.E.R. de Sciences pharmaceuliques, Universit~ Louis Pasteur, 3, rue de l'Argonne, 67083 Strasbourg Cedex.

(12/12/1972).

Summary. - - A method for preparing total mitochondrial aminoacyl-tRNA-ligases of the yeast Saceharomyces cereoisiae is described. The optimal conditions for 3,east cyto- plasmic tRNA and yeast mitochondrial tRNA aminoacylation with the mitochondrial and with the cytoplasmic ligase preparations have been worked out. Reversed phase cochro- matography of labeled valyl-tRNA from cytoplasmic and mitochondrial origins at pH 4.5 and pH 7.0 led to the caraeterization of a valyl-tRNA species, only present in mitochon- dria.

INTRODUCTION.

D a n s un travai l pr6c6dent [1] nous avions 6tudi6 le compor tement chromatographique de 4 aminoacyl- tRNA cytoplasmiques et mi tochon- dr iaux de la levure Saccharomyces cereoisiae (arginyl-, isoleucyl-~ ph6nyla lanyl - et lysyl-tRNA). Nous avons depuis am61ior6 les condi t ions d'isole- ment des mi tochondr ies [2] et mis au point une technique de pr6para t ion de l 'aminoacyl- tRNA ligase mi tochondr ia le . Dans la pr6sente note, nous avons appliqu6 ces m6thodes h l '6tude compar6e des valyl-tRNA d 'or ig ine cytoplasmique et mito- chondriale , conjo in tement /t une nonvelle techni- que de chromatographic en phase invers6e. Les diff6rences constat6es lors des aminoacyla t ions nous out amen6s ~ explorer le ph6nombne pour d 'autres acides amin6s.

MATERIEL ET METHODES.

a) Culture de la levure et isolement des mito- chondries.

Saccharomyces cerevisiae souche haploide IL8-8C, g6notype mi tochondr ia l p ( + ) , C R E R O s nous a 6t6 a imablement fournie par le D r Fuku- hara, Centre de G6n6tique Mol6culaire du C.N.R.S.

Gif-sur-Yvette. La levure est cultiv6e dans les condi t ions pr6c6demment d6crites [3]. I,e glucose a 6t6 remplac6 par I p . cent de galactose.

Les mi toehondr ies out 6t6 iso16es selon la m6- rhode pr6c6demment d6crite [4].

b) Extraction des tRNA.

- - tRNA cytoplasmique : a 6t6 pr6par6 selon la m6thode de Holley [5] ;

- - tRNA mi lochondr ia l : les mi tochondr ies lys6es en pr6sence de 0,25 p. cent de Tr i ton X-100 sont soumises ~ deux extract ions successives par 1,5 volume de ph6nol satur6 en eau ~ +4°C. Le RNA total est f ract ionn6 par chromatographic sur une colonne de DEAE-cellulose selon Holley [5]. Dans certaines exp6riences la pur i f icat ion des tRNA a 6t6 poursuivie par passage sur une colonne de Sephadex G-100.

c) Preparation des aminoacyl-tRNA-ligases.

- - l i g a s e cytoplasmique : elle a 6t6 pr6par6e selon la technique de Di rhe imer et coll. [6] ;

- - - l i g a s e m i t o c h o n d r i a l e : 400 /I 500 mg de prot6ines mi tochondr ia les (mi tochondr ies fralche- merit pr6par6es) sont homog6n6is6es darts 80 ml de tampon Tris-C1 0,01 M pH 8,0, MgC12 0,02 M, KCI 0,06 M, $-mercapto6thanol 0,01 M, glyc6rol 1 p. cent. On laisse en contact 45 minutes et le mil ieu est r endu 0,001 M e n ATP. 3.prbs 15 mi- nutes la suspens ion est soumise par fract ion de 10 ml ~ l 'act ion d 'un d isperseur Ultra Tur rax pendan t 2 minutes en posi t ion 120 du rh6ostat.

On centr ifuge alors /t 105 000 X g pendan t 90 minutes (centrifugeuse Spinco L). Lc surna- geant est pr6cipi t6 par le sulfate d ' a m m o n i u m 80 p. cent de sa turat ion ~ + 4 ° C pendan t 12 heures.

Le pr6cipit6 recuei l l i par centr i fugat ion pen- dant 30 minutes ~ 70000 X g est dissout darts 3 ml de tampon Tris-HC1 0,05 M pH 7,5, MgC12 0,02 M, KC1 0,06 M, g-mercapto6thanol 0,01 M, glyc6rol 10 p. cent. La solution prot6ique est purifi6e par passage sur colonne de S6pha- dex G-25, puis de DEAE cellulose comme polw la

292 B. A c c o c e b e r r y , J. M. S c h n e l l e r el A. J. C. S lah l .

ligase cytoplasmique. Nous obtenons ainsi 16 fi 20 mg de prot6ines enzymatiques mitochondria lcs .

d) Condit ions de d~termination dn pouvoir accepteur des lRNA vis-fi-vis des acides aminds.

Nous ut i l isons un mil ieu contenant , pour un volume final de 100 ~1 : Tris-HC1 pH 7,4 ou Tris- Glycine pH 8,9, 10 ~moles cyst6ine-HC1 0,5 ~mole, s6rum a lbumine bovine 10 .ag, ATP 1 ~mole MgClu 2,5 i~moles, tRNA 0,5 unit6s D.O. h 260 nm, amino-

de 30 minutes h +37°C. la r6action est arr6t6e par addi t ion de 1,5 volume de ph6nol satur6 en eau. L 'aminoacyl- tRNA est recueil l i dans les con- di t ions d6jh d6crites I'1].

[) Cochromatographie en phase invers~e des amino-acyl tRNA.

Nous avons utilis6 le syst~me d6crit par Pear- sons, Weiss et Kelmers (RPC-5) [8] en op6rant avec des colonnes de taille r6duite (10 × 350 mm).

d e t - R N A

JO

• ° " / , ,

i

2 0 5 0 8 0

, i

FiG. 1. - - Aminoacylation par la valine du tRNA mitoehondrial (A) et du tRNA eytoplas- mique (B) de la levure Saccharomyces cere- visiae en pr6sence de ligase cytoplasmique ( - ) , de ligase mitochondriale ( ............ ).

acide-~C 10 m~moles, 0,25 ~tCi, prot6ine enzyma- tique 50 J~g. Aprbs une incuba t ion de 30 minutes h 37°C on pr61bve 80 J~l du mil ieu r6act ionnel que l 'on d6pose sur un disque de papier W h a t m a n n

L'61ution est r6alis6e par 260 ml d 'un gradient en NaC1 de 0,35 h 0,85 M dans un tampon ac6to- ac6tique pH 4,5 0,010 M, CleMg 0,010 M. Les frac- t ions (3 ml) recueil l ies sont transvas6es dans des

V a l m ~ M ~ g d e t - R N A

I I 6,0 6 0 7,0 8 ,0 9 ,0 1 0 , 0 P~

~ FIG. 2. - - Aminoacylation par la valine du tRNA mitochondrial (A) et du tRNA cyto- plasmique (B) en fonction du pH et h l'aide de ligase cytoplasmique ( -- ) et de ligase

, , p , 7,o 8,0 g,0 ~0,o ~ mitochondriale ( ........... ).

3 MM. Les disques sont lav6s et la radioact ivi t6 est d6termin6e selon la m6thode de Bonnet et coll. I7].

e) Preparat ion des aminoacyl - lRNA en oae de la chromatographie .

Dans un volume final de 1 m l l e mil ieu cont ien t : Tris-HC1 pH 7,4 ou Tris-glycine pH 8,9 100 umoles, cyst6ine-HC1 5 ~moles, ATP 10 mnoles, MgClu 25 ~moles, tRNA 5 h 10 unit6s D.O. h 260 nm, aminoac ide -14C (0,1 ~mole cor respondan t 10 ~Ci) ou 3H (0,1 ~moie cor respondant h 0,5 mCi), prot6ine enzymatique 1 mg. Apr~s une incuba t ion

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

flacons de comptage et la radioact ivi t6 est mesur6e dans les condi t ions d6crites an t6r ieurement FI].

RESULTATS.

a) Etude des condi t ions d 'aminoacylat ion du tRNA cy toplasmique et mi tochondr ia l par la valine.

- - In[luence de la quantit~ d' en zyme : la figure 1 montre que le max imum d 'aminoacyla t ion est at teint avec 40 ~g d 'enzyme pour 15 ug de tRNA, quelle que soit l ' enzyme utilis6e.

V a l y l t R N A c y t o p l a s m i q u e el m i t o c h o n d r i a l . 2 9 3

- - l n [ l u e n c e du pH : (fig. 2) la l igase cy to - p l a s m i q u e p r 6 s e n t e u n m a x i m u m d ' a c t i v i t 6 au v o i s i n a g e de p H 8,0. U n e p e r l e t r b s i m p o r t a u t e d ' a c t i v i t 6 es t e o n s t a t 6 e a u de la de p H 9,0. La

la c o n c e n t r a t i o n o p t i m a l e en Mg ++ est s i tu6e en g 6 n 6 r a l a u x e n v i r o n s de 25 mM (fig. 4) sau f p o u r l ' a m i n o a c y l a t i o n d u t R N A m i t o c h o n d r i a l en p r6 - s e n c e de la l igase m i t o c h o n d r i a l e h p H 7,5.

v . t ~?M mg de

t -RNA

A~

mlr d~ , - n N a

r ~ " ~ p H 7 5

; 1; 2'o CA,~ ~ 4'o

n l

.~ 1'o ~o t:,,,,'] -- 4'0

"~s ~ "~

1'0

Fro. 3. - - Aminoacyla t ion par la va l ine du tRNA mi tochondr i a l ( A e t B) et du tRNA eytoplasmique (G et D) en fonct ion de la quant i t6 d'ATP, la concent ra t ion en Mg ÷÷ dans le mil ieu 6tant 6gale ~t 25 mM. Incu- ba t ion h pH 7,5 (A et C) ou h pH 8,9 ( B e t D) ; l igase cy toplasmique ( ), l igase mi toehondr ia le ( ............ ).

l i gase m i t o c h o n d r i a l e p r 6 s e n t e u n o p t i m u m d ' a c t i - v i t6 a u x e n v i r o n s de p H 8,9 et ne m o n t r e p a s de c h u t e d ' a c t i v i t 6 b r u t a l e au de lh de p H 9,0. Ces r 6 s u l t a t s se s o n t r6v616s c o n s t a n t s p o u r t r o i s p r6 - p a r a t i o n s e n z y m a t i q u e s d i f f 6 r e n t e s .

- - l n [ l u e n c e de la quantit~ d 'ATP : q u e l que so i t le s y s t b m e 6 tud i6 el le p H d ' i n c u b a t i o n , le m a x i m u m d ' a m i n o a c y l a t i o n es t o b t e n u p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n en A T P de 10 mM (fig. 3).

- - I n [ l u e n c e de la concentrat ion en magne- s ium : que l s que s o i e n t le s y s t b m e et le p H u t i l i s6 s

- - In[luence de la concentrat ion en ~-mercap- to~thanol : ~ p H 8,9 la c o n c e n t r a t i o n o p t i m a l e de ~ - m e r c a p t o 6 t h a n o l es l de 0,10 M. A p H 7,5 l ' op t i - m u m est a t t e i n t p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n e n ~-mer- c a p t o 6 t h a n o l de 0,020 M, s a u l p o u r l ' e n z y m e m i t o - c h o n d r i a l e a v e c le tRNA m i t o c h o n d r i a l (fig. 5).

Les m e i l l e u r e s c o n d i t i o n s d ' a m i n o a c y l a t i o n d u tRNA c y t o p l a s m i q u e et d u t R N A m i t o c h o n d r i a l p a r Ia v a l i n e en u l i l i s a n l les d e u x l i gases cy to - p l a s m i q u e ou m i t o c h o n d r i a l e s o n t : u n e c o n c e n - t r a t i o n d ' A T P de 10 mM, u n e c o n c e n t r a t i o n de

~-nNA

25 100 25 100

25 loo C-,*'~ ~M ' J

25 100

Fro. 4. Aminoaevla t ion par ta va l ine du tRNA mi tochondr i a l ' (A et B) du tRNA cyto- p lasmique (C et D) en fonct ion de la quan- t i t6 de Mg ÷÷, la concent ra t ion en ATP 6tant 6gal h 10 mM. Incuba t ion /t pH 7,5 (A el C) ou h pH 8,9 ( B e t D) ; l igase cy toplasmique ( ) ; l igase mi tochondr ia l e ( ........... ).

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

294 B. Accoceberrg, J. M. Schneller el A. J~ C. Stahl.

Mg ++ de 25 mM et u n e q u a n t i t d de 40 ~g de p ro - t 6 ine e n z y m a t i q u e p o u r 15 t~g de tRNA. La l igase c y t o p l a s m i q u e p r 6 s e n t e u n e a c t i v i t 6 o p t i m a l e

s a v o i r le pH, s u r l ' a m i n o a c y l a t i o n p a r 11 a u t r e s a c i d e s a m i n 6 s . N o u s a v o n s u t i l i sd l ' a m i n o a c y l tRNA l igase c y t o p l a s m i q u e et l ' a m i n o a c y l tRNA

w l m M

t - a N A

rAI V~I ~ M

~ \ " t -RNA

~r

I I J I

~ M

c~

a~

Fit;. 5. - - Aminoacyla t ion par la val ine du tRNA mi tochondr ia l (A et B) et du tRNA

, cytoplasmique (C et D) en fonct ion tie la concent ra t ion en ~ mercaptodthanol , lncuba-

" . t ion h pH 7,5 (A et C) ou h pH 8,9 ( B e t D) : ligase ey top lasmique ( - ) , tigase mito-

'6 s'0 [~.,o.~ ...... ,] ,60 ch°ndr ia l e ( ........... )"

TABLEAU [.

Poavoir accepteur (mamoles Aa/m 9 de tRNA) du IRNA mitochondrial el du tRNA cytoplasmique vis-ti-vis de 12 aminoacides en presence de ligase cytoplasmique et mitochondriale et h 9 pH di[[drents.

pH

Alanine . . . . . . . . . . . . .

tRNA mitochondrial

Ligase cy toplasmique

7,5 8,9

1,11 0 ,2 l

7,5 8,9

0 0

tRNA cytoplasmiqu,.

Ligase Ligase Ligase eytoplasmiquc mitoehomlriale

1,77 0 , 0,40 0,15 Arginine . . . . . . . . . . . . . Ae. aspartique . . . . . . . . Ae. glutamique . . . . . . . Glycine . . . . . . . . . . . . . . Isoleucine . . . . . . . . . . . . Leucine . . . . . . . . . . . . . . Lysine . . . . . . . . . . . . . . . Ph4nylalanine . . . . . . . . . Sdrine . . . . . . . . . . . . . . . . Tyrosine . . . . . . . . . . . . . Valine . . . . . . . . . . . . . . .

2,41 0,56 0,22 0,24 1,22 2,58 0,81 I ,48 1 ,24 1,56 0 ,9

1,55 0,52 0,83 0,13 1,52 2 ,0 0,69 1,52 1,72 1,77 1,10

1 , 5 2 0 0,18 0 0,22 0 O O 0,1O 0,18 0,75 i

0,93 0,21 0,43 0,69 0,78 1,66 0,70 1,37 1,72 1 , 6 6 1,35

3 ,0 1,30 1,27 1,31 3,25 3,32 0,70 0,89 2,37 0,70 2,02

4 ,0 1,02 2,48 1,3 0 ,09 1,31 0,37 0,06 0,07 0 0,25 0 2,96 0,37 1,55 3,14 0,23 1,33 1,15 0 0.85 1,74 0,28 1,52 2,22 0,22 2,08 1,85 0,25 2,04 3 ,3 1,85 3,7

p H 7,5 a v e c u n e b a i s s e d ' a c t i v i t 6 b r u t a l e au de lh de p H 9,0 a l o r s q u e la l igase m i t o c h o n d r i a l e es t p l u s a c t i v e /~ p H 8,9 et c o n s e r v e s on a c t i v i t 6 a u deh l de ce pH.

b) Influence du pH sur l'aminoacylation du tRNA cytopIasmique et du tRNA milochondrial pour douze acides aminds.

P o u r 6 t e n d r e les r 6 s u l t a t s o b t e n u s l o r s de l ' a m i n o a c y l a t i o n p a r ]a v a l i n e , n o u s a v o n s 6 tud i6 l ' i n f l u e n c e d u p a r a m 6 t r e le p l u s i m p o r t a n t , {,

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

l i gase m i t o c h o n d r i a l e . Les r 6 s u l t a t s r e g r o u p 6 s dar ts le t a b l e a u I m e t t e n t en 6 v i d e n c e uric t r6s fo r t e a u g m e n t a t i o n de l ' a m i n o a c y l a t i o n des tRNA en p r 6 s e n c e d e la l igase m i t o c h o n d r i a l e h p H 8,9, c o m p a r a t i v e m e n t a u x c o n d i t i o n s p r d c 6 d e m m e n t u t i l i s6es ( pH 7,5).

c) Cochromatographie en phase invers~e des valyl-tRNA.

P o u r e s s a y e r de m e t t r e en d v i d e n c e u n e a m i n o - a c y l a t i o n p r 6 f 6 r e n t i e l l e ou i n c o r r e c t e au n i v e a u

Valy l t R N A c y t o p l a s m i q u e et m i t o c h o n d r i a l . 295

des tRNA isoaccepteurs , nous avons compar6 le compor temen t ch romatograph ique des valyl tRNA cytoplasmiques et m i tochondr i aux aminoacy16s h

par la valine-14C, en pr6sence de synth6tase mito- chondr ia le h pH 8,9, les profils d'61ution (fig. 6B) sont exac tement superposables aux pr6c6dents.

A)

J J

4 0 60

t , r l

J I

J l , , I I I t ~f

S)

J

4 0 6 0

FI6. 6 A. - - Cochromatographie fi pH 4,5 du valyl-tRNA cytoplasmi(~ue et du valyl- tRNA mitochondrial charges par la ligasc eytoplasmique /t pH 7,4 ( © - - © ) tRNA cyto- plasmique ; 11,5 DO ~ 260 nm, 20 000 CPM de 14C, ( • - - • ) tRNA mitochondrial, 15 DO /~ 260 nm, 20 0O0 CPM de 0H. Volume d'~lu- tion 250 ml. Fractions 3 ml.

FIG. 6 B. - - Cochromatographie h pH 4,5 du valyl-tRNA cytoplasmique et du valyl-tRNA mitochondrial charg6s par la ligase mito- chondriale h pH 8,9 (O ...... ©) tRNA cytoplas- mique, 9 DO h 260 nm, 20000 CPM de a l l ; { • ...... • ) tRNA mitochondrial, 18 DO 260 nm, 20 000 CPM de 14C. Volume d'61u- tion 250 ml ; Fractions de 3 ml.

pH 7,5 et pH 8,9 et en effeetuant par ai l leurs la ch romatograph ie en phase invers6e h deux pH diff6rents : 4,5 et 7,0 :

- - chromalographie ~ pH 4,5 :

en pr6sence de ligase cy toplasmique h pH 7,4, le valyl-tRNA cytoplasmique est marqu6 par la valine -14C, le valyl-tRNA mi tochondr i a l est mar- qu6 par la valine-3H. La figure 6A mont re que le valyl-tRNA mi tochondr ia l est 61u6 sous forme de 2 pics ne t tement individual is6s ; le valyl-tRNA cel lula i re total est 61u6 sous forme d 'un p ic majeur co ine idan t avec le p r emie r p ie rn i toehondr ia l et d 'une f ract ion mineure 61u6e en m6me temps que le deuxi~me pic mi tochondr ia l .

Lorsque le valyl-tRNA cytoplasmique est mar- qu6 par la valine-aH, le valyl- tRNA mi tochondr ia l

. 2 0 0 0

~ c l M

0 ,5

FIG. 7. - - Cochromatographie fi pH 7,0 du valyl- tRNA cytoplasniique et du valvl-tRNA mitochondrial charges par la ligase cytoplasm~que ~ pH 7,5 ( © - - O } tRNA cytoplasmique ; 11,5 DO /~ 260 nm, 20 0O0 CPM de 14C ; ( e - - e ) tRNA mdtochondrial 15 DO ~ 260 nm, 20 000 CPM de 3H. Volume d'61ution 500 ml. Fractions de 4,5 ml.

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 3.

Nous pouvons conclure de ces r6sultats que le p remie r pic de valyl- tRNA cor respond aux iso- esp6ces pr6sentes duns le cytoplasme, le deuxibme pic h une ou plusieurs isoespbces pr6sentes duns les mi tochondr ies . Les r6sultats sont superposa- bles lorsque l ' aminoacy la t ion est r6alis6e en pr6- sence de la ligase mi tochondr ia l e ou en pr6sence de ligase cytoplasmique.

- - chromalographie & pH 7,0 :

le valyl-tRNA cytoplasmique marqu6 par la valine-14C en pr6sence d 'enzyme cy toplasmique (fig. 7) est 61u6 sous forme de 2 pics. Le p r e m ie r pic de l ' exp6r imenta t ion pr6cbdente est d6doubl6. Le valyl-tRNA mi tochondr i a l marqu6 par !a va- line-all en pr6sence de ligase cy toplasmique est 61u6 sous forme de 3 pics dont les deux p remie r s co inc ident avec les isoespbces cytoplasmiques.

DISCUSSION.

Lors d 'une 6tude pr6c6dente nous avions constat6 des diff6rences de compor t emen t chro- ma tograph ique des aminoacy l tRNA d 'o r ig ine cytoplasmique et mi tochondr i a l e de la ]evure Saccharomyces cerevisiae. Nous ne disposions alors que de pr6para t ions mi tochondr ia les impar - fa i tement purifi6es et l ' aminoacy la t ion avait 6t6 r6alis6e duns t o u s l e s cas par une ligase cyto- plasmique. Nous avons mis au point depuis une t echn ique de puri f icat ion plus pouss6e des mito- chondr ies de levure [21 et une m6thode de pr6- para t ion des aminoacyl- tRNA ligases mi tochon- driales. Nous avons appl iqu6 ces per fec t ionne- ments, h l '6tude ch romatograph ique compara t ive

296 B . A c c o c e b e r r y , J . M. S c h n e l l e r e t A . J . C. S t a h l .

des valyl-tRNA cytoplasmiques et mi tochondr iaux . L 'Oude des condi t ions de fixation de la val ine sur les tRNA des deux origines, nous a permis de constater que l ' aminoacyla t ion h l 'a ide de Fen- zyme mi tochondr ia le pouvai t 6tre am61ior6e en 6levant le pH h 8,9, les concent ra t ions optimales en ATP, en CI2Mg et en enzyme 6tant respective- men t de 10 raM, 25 mM et 40 I~g d 'enzyme pour une quanti t6 de 15 Jt~g de tRNA.

L'6tude de l ' inf luence du pH sur l ' aminoacyla- t ion des tRNA en pr6sence de la ligase mi tochon- driale (tableau I) nous a montr6 que les r6sultats favorables observ6s pour la val ine h pH 8,9 s ' appl iquaient 6galement ~ d 'autres acides amin6s (sauf Ala). I1 est h noter qne la charge dn tRNA cytoplasmique catalys6e par la ligase mi tochon- driale h pH 8,9 est parfois aussi bonne que celle ohserv6e avcc la ligase cytoplasmique a pH 7,5 (Arg, Asp, Lys, Phe, Ser, Tyr, Val). Ces propri6tds pour ra ien t Ore attribu6es h l 'existence de synth6- rases sp6cifiquement mi tochondr ia les comme cela a d6jh 6t6 d6montr6 [9, :10, 11]. I1 est 6galement possible que les prot6ines soluhles extraites des mi tochondr ies par notre m6thode con t i ennen t un facteur d ' i nh ib i t ion de la r6action d 'aminoacy- lat ion nmins actif /~ pH 8,9 qu'/~ pH 7,5. Cette deuxi6me hypoth6sc est en cours d '6tude au labo- ratoire, /~ l 'heure actuelle.

Dans le but de rechercher d '6ventuelles diff6- rences quali tat ives au niveau des tRNA isoaccep- teurs de la valine, nous avons r6alis6 une s6para- t ion chromatographique des tRNA-Val amino- acyl6s dans diverses condit ions. La chromatogra- phie en phase invers6e a 6t6 r6alis6e sur des colonnes de RPC 5 /~ pH 4,5 [8] plus favorable

la stabilit6 des aminoacyl tRNA : la r6solution des isoespbces cytoplasmiques est imparfa i te ; le valyl-tRNA est 61n6 sons forme d 'un seul pic qui pent 6tre d6doubl6 lots de la chromatographie pH 7,0. Le valyl-tRNA mi tochondr ia l pr6sente, quel que soit le pH de la chromatographie , un pic suppl6menta i re 61u6 plus t a rd ivement que les iso- esp6ces cytoplasmiques. Nous avons v6rifi6 qne la na ture du marqnage n '6tai t pas en mesure d ' inf luencer leg r6sultats en u t i l i san t des valyl- tRNA cytoplasmiques et mi tochondr i aux marqn6s tantSt avec la valine-~4C, tantSt avec la valine-~H. Dans leg denx s6ries d 'exp6riences les profils chro- matographiques ont 6t6 par fa i tement superposa- bles. Nous avons constat6 d 'au t re par t un compor- tement chromatographique ident ique des tRNA cytoplasmiques et mi toehondr iaux charg6s avec un systbme enzymatique homologue ou h6t6ro- logue.

Cette 6tude nous permet de conclure /l la pr6- sence dans les mi tochondr ies de la levure S a c c h a - r o m y c e s c e r e v i s i a e de diff6rentes espbces de valyl-tRNA : deux d 'ent re elles se compor tent dans le syst6me 6tudi6 d 'une mani6re ident ique /~ celles trouv6es dans le cytoplasme. Une iso- esp6ce est caract6rist ique des mi toehondr ies , elle n 'est retrouv6e qu'h l '6tat de trace dans le tRNA cytoplasmique. Des recherehes actuel lement pour- suivies en col laborat ion avec H. Fukuhara de- vra ient pouvoir mont re r si eette isoesp6ce sp6cifi- quement mi toehondr ia le est synth6tis6e dans la mi tochondr ie de levure, l ' i n format ion p rovenan t du DNA mitochondr ia l . D'autres exp6riences en cours devraient pouvoir d6montrer une 6ventuelle p6n6trat ion des tRNA d 'or ig ine cytoplasmique l ' in t6r ieur des mi tochondr ies .

Remerciements .

Ce travail a b6n6fici6 d'une aide de la Ddl6gation G6n6rale h la Recherche Scientifique et Technique, de la Ligue Nationale Fran~aise contre le Cancer et du D6partement de Biologic du Commissariat h l'Energie Atomique.

R~su~f~.

Une m6thode de pr6paration des aminoacyl-tRNA ligases totales des mitochondries de levure Saccharo- mffces cerevisiae est d6crite. Les conditions optimales d'aminoacylation du tRNA cytoplasmique et du tRNA mitochondrial de levure h l'aide des pr6parations de ligase mitochondriale et de ligase cytoplasmique sont 5tudi6es. La eoehromatographie en phase invers~e des valyl-tRNA marqu6s, d'origine cytoplasmique et d'ori- gine mitochondriale, h pH 4,5 et h pH 7,0 permet de mettre en 6videnee une esp6ce de valyl-tRNA n'appa- raissant que dans le tRNA mitochondrial.

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