Métabolisme des carbohydrates Chez la levure Exemple du Galactose.
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Métabolisme des carbohydrates Chez la levureExemple du Galactose
Mécanisme impliqué dans l’expression coordonnée des gènes Gal
Johnston, M. A model fungal gene regulatory mechanism: the GAL genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev 51, 458-76. (1987).
Etude des régulations transcriptionnelles1980-2000
- Génétique : identification des facteurs protéiques
- Gels retards, Empreintes à la Dnase etc. : identification des séquences de liaison.
- Expression d’un gène rapporteur sous le contrôle des séquences promotrices.
- Mutagenèse dirigée.
Modèle : le contrôle de la transcription se réduit à des interactions entre
- facteurs de transcription (protéines diffusibles) et séquences promotrices (ADN).
- Facteurs de transcription et corégulateurs (Protéines).
La chromatine, substrat de la machinerie transcriptionnelle
Le nucléosome : unité élémentaire de la chromatine
ADN : 1,67 tours ; 147 paires de bases
Structure du nucléosome :
- très compacte (forte densité électronique)
- Environ 150 liaisons Hydrogène entre les histones et l’ADN
- Forte distorsion de la double hélice
Les conditions expérimentales sont très éloignées du contexte physicochimique de la chromatine.
Dans le noyau, la fibre chromatinienne s’organise pour former des structures encore plus compactes
Régulation de la transcription dans le contexte de la chromatine
- Recrutement des facteurs de transcription
- Recrutement et mobilité de l’ARN polymérase
Remodelage de la chromatine- ATP-Dépendant- ATP-Indépendant
ATP-DependantTransitoireLocal (promoteurs)Non diffusibleNon transmissible
ATP-IndependantStableDiffusible à l’échelle d’un locusTransmissible (épigénétique)
Mécanismes de remodelage de la chromatine
- Déplacement des nucléosomes- Complexes de remodelage(SWI/SNF, ISWI etc.)
- Remplacement des histones canoniques par des variants d’histones- Chaperons moléculaires
Mécanismes de remodelage de la chromatine
- Modifications post-traductionnelles des histones- Enzymes de modification
HAT: Histone Acétyl Transférases
HDAC: Histones DésACétylases
HMT: Histones Méthylases
Histone Déméthylase: (LSD1 : Lysine-specific demethylase)
Enzymes de modification des histones
Modifications post-traductionnelles des histones
Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, 285-91. (2002).
Modifications post-traductionnelles des histones
Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, 285-91. (2002).
La chromatine est une structure hétérogène:
Euchromatine:Gènes actifsPeu condensée (configuration ouverte)ADN peu ou pas méthylé (CpG)
Hétérochromatine constitutive:Régions intergéniques, ADN répétitif, centromèresCondensée (configuration fermée)ADN méthylé (CpG)
Hétérochromatine facultative:Gènes réprimésCondensée (configuration fermée)ADN méthylé (CpG)
Euchromatine
Hétérochromatine
Les différents états de la chromatine sont caractérisés par des marques épigénétiques spécifiques :
« Code Histones »
Interpréter le « Code Histones » :Les marques épigénétiques permettent le recrutement de
protéines effectrices qui modulent la structure de la chromatine.
Margueron, R., Trojer, P. & Reinberg, D. The key to development: interpreting the histone code? Curr Opin Genet Dev 15, 163-76. (2005).
Etats de la chromatine
à l’échelle d’un locus
Exemple :
Les gènes de l’identité sexuelle
Chez la levure
Vengrova, S. & Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Genes Dev 18, 794-804 (2004).
Région Mat (mating type) chez Schizosaccharomyces pombe
Analyse moléculaire de la chromatine par immuno-
précipitation (ChIP)
HP
1Les gènes Mat réprimés sont enrichis en
HP1, une protéine spécifique de l’hétérochromatine
Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150-5. (2001).
Les gènes Mat réprimés sont enrichis en H3K9 méthylée, une modification spécifique de
l’hétérochromatine
Les gènes Mat réprimés sont appauvris en H3K4 méthylée, une modification spécifique de
l’euchromatine
Grewal, S. I. & Elgin, S. C. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. Curr Opin Genet Dev 12, 178-87. (2002).
Comment ça marche ?
2
1
2 34
Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150-5. (2001).
H3K9-Me(Clr4)
RecrutementDe Swi6
H3K4-Me
+
_ _?
Méthylation de H3K9Indépendante de HP1/SWI6
Méthylation de H3K9Dépendante de HP1/SWI6
Rôle de CenH et de HP1/SWI6
cenH est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de Swi6
Swi6 est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de CenH
Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). “Establishment and maintenance of a heterochromatin domain.” Science, 297(5590), 2232-7.
H3K9-Me(Clr4)
RecrutementDe Swi6CenH H3K9-Me
(Clr4)
Hypothèse:Etablissement de l’hétérochromatine à partir de CenH
Maintien et propagation dépendante de Swi6
Rôle de HP1/SWI6 dans la propagation de l’hétérochromatine
CenH, une séquence répétée homologue des séquences centromériques, agit comme un point de nucléation de l’hétérochromatine.
HP1/Swi6 est ensuite nécessaire à la propagation de l’hétérochromatine en cis
Mécanismes de propagation de l’hétérochromatine
Ura4-On Ura4-Off Stable
Transmission épigénétiqueVariegation en absence de cenH
Transmission épigénétique des états Ura4-on et Ura4-ff
Spores His2+/Ura4-onSpores His2-/Ura4_off
Transmission des marques épigénétiquesSpécifiques des souches Ura4-On et Ura4-Off
Dans les souches Ura4-On, l'hétérochromatine est rétablie en présence d'un excès de Swi6 mais pas de Clr4
Ura4-on Ura4-off
H3K9-Me(Clr4)
RecrutementDe Swi6CenH H3K9-Me
(Clr4)
H3K9-Me(Clr4)
ExcèsDe Swi6CenH H3K9-Me
(Clr4)
XX X
X X
La machinerie d'ARN-interférence (RNAi) est nécessaire à la répression transcriptionnelle et à
l'établissement de l'hétérochromatine
Ago1 = ArgonauteDcr1 = DicerRdp1 = RNA-dep RNA-Pol
Construction Ectopique
Ade6 exprimé
Ade6 réprimé
TSA = TrichostatinInhibiteur des HDACs
La machinerie RNAi n'est pas nécessaire au maintien de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine
La machinerie RNAi est nécessaire à l'établissement de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine
Comment stopper l’hétérochromatine ?
Passées les bornes, y a plus de limite :Les Eléments Frontières ou Insulateurs
Des mécanismes similaires ont été mis en évidence chez la Drosophile…
Répression du gène White :- Associée à une propagation en cis de l’hétérochromatine, visible sur les chromosomes polythènes.- Stochastique (Concentration limitante d’un facteur de propagation ?)- Clonale (transmission à travers les mitoses).
Bigarrure à effet de position (PEV)
Grewal02
Chez la Drosophile aussi, l’établissement de l’hétérochromatine dépend de la
machinerie RNAi
… Et chez les mammifères
Maturation des Thymocytes
Thymocytes immatures Thymocytes matures
Expression des gènes Rag1, Rag2, Dntt
impliqués dans la recombinaison VDJ du récepteur TCR
Répression des gènesRag1, Rag2, Dntt
Modifications post-traductionnelles de la chromatine sur le gène Dntt (ChIP)
Su, R. C., Brown, K. E., Saaber, S., Fisher, A. G., Merkenschlager, M., and Smale, S. T. (2004). “Dynamic assembly of silent chromatin during thymocyte maturation.” Nat Genet, 36(5), 502-6. Epub 2004 Apr 18.
Propagation de l’hétérochrompatine sur le gène Dntt
Euchromatine Hétérochromatine
La répression du locus Dntt est corrélée à son association avec l’hétérochromatine
péricentromérique
Propagation de l’hétérochromatineEn trans ?
Ikaros
Liaison à l’ADN (ZF)
Cofacteur transcriptionnel spécifique de la lignée hématopoiétique
Activateur ou Répresseur
Répresseur des gènes Rag1/2 et Dntt pendant la maturation des thymocytes
Existe sous forme de complexe avec NuRD (nucleosome remodelling and deacetylation)
Ikaros -Satellites
IkarosHP1
Localisation d’Ikaros dans l’hétérochromatine péricentromérique
Brown, K. E., Guest, S. S., Smale, S. T., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). “Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin.” Cell, 91(6), 845-54.
Lymphocytes BImmatures Matures
CD19
CD8
5
CD2
+
-
+
- -
+
+
-
Corrélation inverse entre l’expression des gènes et leur localisation à proximité des foyers Ikaros
IkarosFISH
(NuRD)
Su, R. C., Sridharan, R., and Smale, S. T. (2005). “Assembly of silent chromatin during thymocyte development.” Semin Immunol, 17(2), 129-40.
Comment échapper à la répression ?
Le rôle des Enhancers
Promoteur -globine
+ Enhancer -globine
Enhancer du gène -Globine(lignée érythroïde)
Francastel, C., Walters, M. C., Groudine, M., and Martin, D. I. (1999). “A functional enhancer suppresses silencing of a transgene and prevents its localization close to centrometric heterochromatin.” Cell, 99(3), 259-69.
T0 = Arrêt de la sélection néomycine (G418)--> FACS
5’HS2: Enhancer -GlobinPr: Promoteur -GlobinGeo: Fusion -Gal – Néo
Stratégie utilisée
En absence d’enhancer fonctionnel, le transgène est fortement réprimé lorsqu’il est intégré aux sites 6.2 et C30
La présence d’un enhancer fonctionnel retarde la répression du transgène
Site 6.2
Lorsque le transgène est actif, la chromatine est en configuration ouverte, même en absence d’enhancer fonctionnel
Sensibilité à la Dnase I
FACS
_ +
Position du transgène par rapport aux centromères
En Cis
TransgèneCentromèresDAPI
Position du transgène par rapport l’hétérochromatine péricentromérique
En Trans
FACS
_ +
TransgèneCentromèresDAPI
Enhancer fonctionnel: le transgène s’éloigne du centromère, uniquement lorsqu’il est exprimé.
Enhancer inactif: le transgène est au voisinage du centromère, même lorsqu’il est exprimé
FACS
_ +
PCH PCH PCH
PCH PCH PCH
E
E E
Répression stableDNAse HS-
Expression transitoireDNAse HS +
Expression transitoireDNAse HS +
Expression transitoireDNAse HS +
Répression transitoireDNAse HS-
?
PCH PCH PCH
E
E E
Expression transitoireDNAse HS +
Répression transitoireDNAse HS-
Où vont les gènes lorsqu’ils s’éloignent de l’hétérochromatine péricentromérique ?
La LCR (Locus Control Region) est nécessaire au recrutement du gène -Globine dans les usines de
transcription.
Cellules érythroïdes matures de foie foetalSouris WTSouris -LCR parrecombinaison homologue
WT
-LCR
Ragoczy, T., Bender, M. A., Telling, A., Byron, R., and Groudine, M. (2006). “The locus control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation.” Genes Dev., 20(11), 1447-57. Epub 2006 May 16.
Recrutement des gènes transcrits dans les usines de transcription.
Organisation et expression allélique des gènes du chromosome 7 dans les cellules érythroïdes de la Rate
Cellules érythroides de Souris
Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., and Fraser, P. (2004). “Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.” Nat Genet, 36(10), 1065-71. Epub 2004 Sep 7.
Expression allélique
Localisation dans les foyers RNAP-II
Hbb-b1RNAP-II
RNA FISH DNA FISH
Recrutement des gènes actifs dans les foyers de RNAP-II
Hbb-b1ErafRNAP II
Des gènes distants peuvent être recrutés dans les mêmes foyers de RNAP-II
Confirmation Biochimique : Chromosome Conformation Capture (3C)
Hbb-b1
dezaded
Hypothèse : le co-recrutement des gènes dépend de la distance qui les sépare
Délocalisation des gènes Hox
Cellules ES + RA
Expression des gènes du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES
Chambeyron, S., and Bickmore, W. A. (2004). “Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.” Genes Dev, 18(10), 1119-30.
Etat de la chromatine sur le locus HoxB (ChIP) pendant la différenciation des cellules ES
Hoxb1 Hoxb9
L’acétylation de H3K9 ne permet pas d’expliquer l’activation séquentielle de Hoxb1 et Hoxb9
Hoxb1Hoxb9DAPI
Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules
ES
Hoxb1Hoxb9DAPI
Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules
ES
- RA + RA
Délocalisation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES
- RA + RA
Délocalisation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES
RA
Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules
ES
L’expression séquentielle des gènes Hox est corrélée à leur délocalisation
hors du territoire chromosomique
Des observations similaires ont été faites dans les embryons de souris
Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., and Bickmore, W. A. (2005). “Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.” Development., 132(9), 2215-23.
+ Rapamycin - Rapamycin
Voir bouger la chromatine
Chuang, C. H., Carpenter, A. E., Fuchsova, B., Johnson, T., de Lanerolle, P., and Belmont, A. S. (2006). “Long-range directional movement of an interphase chromosome site.” Curr Biol., 16(8), 825-31.
Le noyau est organisé en domaines fonctionnels :
Domaines activateurs : Euchromatine, usines transcriptionnelles - usines d’épissage
Domaines répresseurs : Hétérochromatine
Les gènes sont recrutés de manière coordonnée dans ces domaines.
Le recrutement des gènes dans ces domaines est couplé à des modifications post-traductionnelles des histones.
Ces modifications contribuent à la stabilité et à l’héritabilité (transmission épigénétique) de leur état (activé ou réprimé).
Etat de l’art
Rôle des modifications post-traductionnelles des Histones
Rendre les gènes plus accessibles aux facteurs de transcription?
Le facteur de transcription UBF1 (genes ribosomiques; RNA-Pol I) est rapidement remplacé
sur les chromosomes mitotiques
GFP-UBF1
Pas si simple…
Chen, D., Dundr, M., Wang, C., Leung, A., Lamond, A., Misteli, T., and Huang, S. (2005). “Condensed mitotic chromatin is accessible to transcription factors and chromatin structural proteins.” J Cell Biol, 168(1), 41-54. Epub 2004 Dec 28.
Les modifications post-traductionnelles des histones sont-elles nécessaires à l’organisation
nucléaire de la chromatine?
Séquentialité des événements ?
Relations de causalité ?
Bibliographie
Brown, K. E., Guest, S. S., Smale, S. T., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). “Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin.” Cell, 91(6), 845-54.
Chambeyron, S., and Bickmore, W. A. (2004). “Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.” Genes Dev, 18(10), 1119-30.
Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., and Bickmore, W. A. (2005). “Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.” Development., 132(9), 2215-23.
Chen, D., Dundr, M., Wang, C., Leung, A., Lamond, A., Misteli, T., and Huang, S. (2005). “Condensed mitotic chromatin is accessible to transcription factors and chromatin structural proteins.” J Cell Biol, 168(1), 41-54. Epub 2004 Dec 28.
Chuang, C. H., Carpenter, A. E., Fuchsova, B., Johnson, T., de Lanerolle, P., and Belmont, A. S. (2006). “Long-range directional movement of an interphase chromosome site.” Curr Biol., 16(8), 825-31.
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Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). “Establishment and maintenance of a heterochromatin domain.” Science, 297(5590), 2232-7.
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Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., and Fraser, P. (2004). “Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.” Nat Genet, 36(10), 1065-71. Epub 2004 Sep 7.
Ragoczy, T., Bender, M. A., Telling, A., Byron, R., and Groudine, M. (2006). “The locus control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation.” Genes Dev., 20(11), 1447-57. Epub 2006 May 16.
Su, R. C., Brown, K. E., Saaber, S., Fisher, A. G., Merkenschlager, M., and Smale, S. T. (2004). “Dynamic assembly of silent chromatin during thymocyte maturation.” Nat Genet, 36(5), 502-6. Epub 2004 Apr 18.
Su, R. C., Sridharan, R., and Smale, S. T. (2005). “Assembly of silent chromatin during thymocyte development.” Semin Immunol, 17(2), 129-40.
Turner, B. M. (2002). “Cellular memory and the histone code.” Cell, 111(3), 285-91.