UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

BIOTECNOLOGIA

RAFAELA SANTOS GALANTE

ESTUDOS DE QUITINASES DE MONILIOPHTHORA

PERNICIOSA (STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA, FUNGO

CAUSADOR DA VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO:

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E MODELAGEM

COMPARATIVA

Fevereiro. 2008

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RAFAELA SANTOS GALANTE

ESTUDOS DE QUITINASES DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA

(STAHEL) AIME & PHILLIPS-MORA, FUNGO CAUSADOR DA

VASSOURA-DE-BRUXA NO CACAUEIRO: PURIFICAÇÃO,

CARACTERIZAÇÃO E MODELAGEM COMPARATIVA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Biotecnologia, da Universidade

Estadual de Feira de Santana como requisito parcial

para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.

Orientadora: Prof. Dra. Sandra A. de Assis (UEFS)

Co-Orientadores: Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto (UEFS)

Prof. Dr. Alex Guterres Taranto (UEFS)

Fevereiro. 2008

3

À minha família, dedico...

4

AGRADECIMENTOS

À Deus, por todos os momentos mais importantes de minha vida.

À Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).

Aos meus orientadores Profa. Dra. Sandra Aparecida de Assis, Aristóteles Góes-

Neto pelo incentivo inicial à pesquisa e ao Prof. Dr. Alex Gueterres Taranto..

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, tendo a frente o

Prof. Dr. Aristóteles Góes-Neto que se mostrou sempre atencioso e pronto a ajudar.

Aos amigos e colegas de Pós-Graduação Catiane, Indira, Viviane, Bruno, Suikinai,

Rodrigo e Manoelito pelas conversas de incentivo, idéias e pelos momentos de muita

risada!

Aos amigos do Laboratório de Enzimologia e Tecnologia das Fermentações

(LAEN), Departamento de Saúde da UEFS, que contribuíram para o desenvolvimento de

meu trabalho, assim como pelos momentos de alegria no laboratório.

A Helton, secretário do PPGBiotec, pelo apoio, amizade, dedicação e atenção aos

alunos da Pós-Graduação.

Aos professores e colegas do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, pela

contribuição para o meu desenvolvimento pessoal e profissional.

Aos meus pais Rafael Galante Neto e Sônia Maria S. Galante e aos meus irmãos

Sidnei, Francielle e Juliana.

Às minhas amigas da casa verde Carol, Aline, Denise e Verônica pela convivência e

paciência.

Às “agregadas” da casa Yvana e Bárbara pela amizade, incentivo e paciência...

À FAPESB pela concessão da bolsa de mestrado.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

À Profa. Dra. Sandra Aparecida de Assis pela insubstituível orientação, paciência,

disponibilidade e, principalmente, pela incrível e valiosa amizade. Ao meu co-orientador

Aristóteles Góes-Neto pelo incentivo inicial à pesquisa e pela excelência como professor.

Ao co-orientador Alex Gueterres Taranto pela dedicação exercida aos seus orientandos,

pela disponibilidade e preciosa amizade, além de seus contos de motociclista.

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RESUMO

As quitinases são responsáveis pela degradação da quitina, principal componente da parede celular de fungos, liberando resíduos de N-acetilglicosamina. Por estarem envolvidas diretamente na autólise e morfogênese das hifas em fungos filamentosos as quitinases tornaram-se alvos específicos na produção de compostos bioativos, sendo também utilizadas diretamente na inibição do crescimento de fungos patogênicos. Neste contexto, este trabalho objetivou a purificação e caracterização enzimática da quitinase, assim como a obtenção de sua estrutura 3D da região contendo o sítio catalítico. Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Philips-Mora, fungo causador da vassoura-de-bruxa, contém um sistema quitinolítico composto por quatro enzimas: ChitMp I, ChitMp II, ChitMp III e ChitMp IV, sendo ChitMp I e II semelhantes em suas propriedades enzimáticas. ChitMp III e IV possuem diferenças entre si e entre ChitMp I e II. Todas as enzimas tiveram 100% de perda de atividade enzimática a 90 ºC nos dez primeiros minutos de reação. Para a biologia computacional, a determinação da seqüência primária foi feita in silico a partir do banco de dados do Projeto Genoma/Proteoma do M. perniciosa, obtendo-se uma seqüência com 564 pb e 188 aminoácidos, que foram utilizados para a construção do modelo tridimensional pelas metodologias de threading e modelagem comparativa. Os modelos gerados foram submetidos à validação (Procheck 3.0. e ANOLEA). O modelo proposto para a quitinase, o qual foi submetido ao refinamento de 600 ciclos, obteve 99,4% de seus resíduos em locais favoráveis do gráfico de Ramachandran. Palavra-chave: glicohidrolase, Moniliophthora perniciosa, purificação, estrutura 3D, modelagem.

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ABSTRACT

Chitinases are responsible for the degradation of the chitin, principal component of the cell wall of fungi releasing residues of N-acetylglucosamine. Because of being wrapped straightly in the autolysis and morphogenesis of the hyphae in filamentous fungi, the chitinases became specific targets in the production of bioactive composed, being used also straightly in the inhibition of the growth of pathogenic fungi. In this context, this work aimed at the enzymatic purification and characterization of the chitinase, as well as getting its structure 3D. Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Philips-Mora, fungi which caused the witche's broom, contains a chitinolytic system composed by four enzymes: ChitMp I, ChitMp II, ChitMp III and IV. ChitMp I e II are similar in their enzymatic properties. ChitMp III and IV have significant differences amongst themselves and between ChitMp I and II. All the enzymes had 100 % of loss of the enzimatic activity to 90 ºC in the first ten minutes of reaction. For the computational biology, the determination of the primary sequence was done in silico from the database of the Genome/Proteome Project of M. pernicious, a sequence is obtained with 564 pb and 188 aminoacids. that were used for the three-dimensional desing by threading and comparative modelling methodologies. The generated models were submitted to the validation (Procheck 3.0. and ANOLEA). The model proposed for the chitinase was submitted to refinement by 600 cycles, resulting a model with 99,4% of their residues in favorable places of the Ramachandran plot. Key-words: glycohydrolasis, Moniliophthora perniciosa, purification, 3D structure, modeling

7

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 : Suplementações do Tampão Fosfato de Sódio (TFS), 50 mM, pH 7,0, para obtenção do melhor método de extração.

43

Tabela 02: Tabela de ensaios sem codificação utilizada para a interação entre pH e temperatura.

48

Tabela 03: Soluções utilizadas para a obtenção do extrato celular bruto (ECB) de basidiomas de M. perniciosa.

53

Tabela 04: Esquema de purificação da quitinase de M. perniciosa em coluna de permeação em gel.

59

Tabela 05: Reads retirados do banco de dados do Projeto Genoma de M. perniciosa para a formação do contig evidanciando os valores negativos de energia e suas respectivas fases de leitura.

71

Tabela 06: Identificação dos moldes utilizados para a construção do modelo PDB da quitinase de M. perniciosa.

75

Tabela 07: Sumário dos modelos gerados para a região do sítio catalítico da quitinase de M. perniciosa, destacando o resultado da validação representada pelo gráfico de Ramachandran realizada pelo Procheck 3.0.

77

8

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 01: Esquema da relação patógeno-hospedeiro evidenciando as alterações ocorridas na célula da planta em resposta à presença do fitopatógeno (Fonte: a Autora, baseado em TAIZ, ZEIGER, 2004).

21

Figura 02 : Ilustração de um segmento da quitina. Fonte: Trindade (2005). 23

Figura 03 : Quitina e suas três formas cristalinas encontradas no Reino Animal: α-quitina, β-quitina e γ-quitina (adaptado de Urich, 1993).

24

Figura 04 : Diferença estrutural entre celulose (a) e quitina (b). Em (a) é observado o grupo hidroxil (OH) no carbono 2, característico do polímero de celulose. Em (b) é observado o grupo acetamido (NHCOCH3) no carbono 2, característico do polímero de quitina (adaptado de COVAS, 2006).

25

Figura 05: a) Esquema do mecanismo de retenção da hidrólise das ligações glicosídicas propostos para a Família 18 das quitinases. A protonação do resíduo de GlcNAc leva a formação do intermediário oxazolina, o qual pode ser hidrolisado para formar um produto com retenção da configuração anomérica. b) Esquema do mecanismo de inversão da hidrólise proposto para a Família 19 das quitinases. Dois resíduos ácidos são requeridos no sítio ativo, mostrando a inversão do produto de hidrólise da configuração anomérica (DAHIYA et al., 2006).

27

Figura 06: Rota metabólica da quitina evidenciando as suas cinco etapas de formação (Fonte: Lopes, 2005).

29

Figura 07: A - estrutura 3D de quitinase da Família 18 das Glicohidrolases do fungo Streptomyces griseus HUT6037 (KESUKA et al., 2006); B - estrutura 3D de quitinase/lisozima da Família 19 das Glicohidrolases, complexado com o inibidor alosamidina (SCHELTINGA et al., 1995); C - estrutura 3D de uma β-N-acetilhexosaminidase da Família 20 das Glicohidrolases da bactéria Streptomyces plicatus (MARK et al., 2001).

32

Figura 08: Representação esquemática entre as diferentes estruturas das classes de quitinases. As quitinases das classes I, II e IV compartilham alta similaridade exceto por algumas deleções encontradas nos domínios catalíticos das quitinases da classe II e IV e pela ausência do domínio rico em cisteína nas quitinases da classe II. As quitinases da classe II podem ter múltiplos domínios. (Fonte: Lopes, 2005).

32

Figura 09 : Esquema das etapas de obtenção de quitinases purificadas de M. perniciosa. 49

Figura 10: Esquema das etapas de construção da estrutura 3D da quitinase de M. perniciosa

52

Figura 11: Cromatografia de permeação em gel da quitinase utilizando coluna Sephacryl S-100 eluídas com Tampão Fosfato de Sódio 50 nM, pH 7,0 e suas respectivas atividades específicas

54

Figura 12 : Cromatografia de permeação em gel da quitinase 1 (ChitMp I) em coluna de Sephacryl S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0.

55

9

Figura 13 : Cromatografia de permeação em gel da quitinase 2 (ChitMp II) em coluna de Sephacryl S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0.

55

Figura 14 : Cromatografia de permeação em gel da quitinase 3 (ChitMp III) em coluna de Sephacryl S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0.

56

Figura 15 : Cromatografia de permeação em gel quitinase 4 (ChitMp IV) em coluna de Sephacrey S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0,

56

Figura 16: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp I de M. perniciosa (Tabela 01). 60

Figura 17: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp I. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (44 a 73 ºC) e pH ótimo (7,0 a 8,3) da enzima

61

Figura 18: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp II de M. perniciosa (Tabela 01). 62

Figura 19: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp II. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (45 a 73 ºC) e pH ótimo (7,0 a 8,3) da enzima.

62

Figura 20: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp III de M. perniciosa (Tabela 01). 63

Figura 21: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp III. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (54 a 67 ºC) e pH ótimo (7,3 a 7,8) da enzima.

63

Figura 22: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp IV de M. perniciosa (Tabela 01). 64

Figura 23: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp IV. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (58 a 70 ºC) e pH ótimo (7,4 a 8,2) da enzima.

65

Figura 24: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp I a 80 ºC e a 90 ºC. 67

Figura 25: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp II, a 80 ºC e a 90 ºC.

68

Figura 26: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp III, a 80 ºC e a 90 ºC.

68

Figura 27: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp IV, a 80 ºC e a 90 ºC.

69

Figura 28: Reads retirados do banco de dados do Projeto Genoma de M. perniciosa alinhados pelo Seqman/Lasergene (BURLAND, 2000), com destaque para a região que compreende a região catalítica da quitinase. Em a é visualisada a seqüência consenso; b corresponde ao read CP02-S2-041-309-B06-EM.F; em c encontra-se o read CP02-S2-039-551-C11-UC.F e em d o read CP02-S3-033-414-B07-UC.F. As setas em verde se referem ao sentido direto e a seta em vermelho representa o sentido reverso. Em destaque está o nucleotídeo não identificado pelo programa.

70

Figura 29: Conversão de da seqüência nucleotídica de quitinase de M. perniciosa em seqüência de aminoácidos (aa) através da ferramenta Six Frame Translator of Sequence, obtido através do site <http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/cgi-bin/seq-util/sixframe.pl>. Em destaque estão os aa que compõem o sítio catalítico da enzima.

72

Figura 30: Alinhamento das seqüências do produto gênico das quitinases de M. perniciosa, Grifola umbelata (AAO42981.1), Coprinopsis cinerea (EAU80760.1) e Aspergilus fumigatus (AAO61686.1) através do programa TCoffee 5.56, disponível no site

74

10

<http://www.tcoffee.org/> (NOTREDAME et al., 2000). Destaque, em preto, para a região do sítio catalítico.

Figura 31: Alinhamento da seqüência problema com os moldes 1WNO e 2A3E, utilizados para homologia, por PSI-BLAST.

76

Figura 32: Validação do modelo 3D da quitinase demonstrado pelo Gráfico de Ramachandran, que considera as regiões marcadas em vermelho e amarelo como as mais favoráveis e as regiões em branco como desfavoráveis. Esta validação é satisfatória quando pelo menos 90% dos resíduos são localizados em região favorável.

79

Figura 33: Qualidade da cadeia principal dos modelos hqmp0 e hqmp2: A - avaliação do gráfico de Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações desfavoráveis; D - distorção dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

80

Figura 34: Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para os modelos hqmp0 e hqmp2 da região conservada da quitinase: A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

81

Figura 35: Representação gráfica da validação dos modelos do produto gênico da quitinase após a realização do refinamento em Amber. O valor de energia é dado em E/kT, onde k corresponde a constante de Boltzmann (0,582 Kcal/mol) e T corresponde a temperatura absoluta.

82

Figura 36: Dinâmica Molecular da quitinase por threading (A – hqmp3, 300 ciclos, B – hqmp4, 1000 ciclos e C – hqmp5, 3000 ciclos) e por homologia comparativa (D – tqmp3, 300 ciclos, E – tqmp4, 1000 ciclos e F – tqmp5, 3000 ciclos), validados pelo ANOLEA.

83

Figura 37: Modelo 3D da quitinase de M. perniciosa ( hqmp2), após refinamento em 600 ciclos.

84

Figura 38: A: modelo hqmp2 da quitinase de M. perniciosa destacando o sítio catalítico; B: Destaque para o motivo LDGLDVDYEFP, respectivo a Leu98, Asp99, Gly100, Leu101,Asp102, Val103, Asp104, Tyr105, Glu106, Phe107 e Pro108, descrito como sítio catalítico do modelo da quitinase de M. pernciosa.

85

11

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS aa: aminoácidos AE: atividade específica ChitMp: quitinase de Moniliophthora perniciosa cm: centímetro DM: dinâmica molecular GlcNac: N-acetilglicosamina h: hora K: temperatura em Kelvim KDa: Kilodaltons M: molaridade mg: miligramas min: minuto mL: mililitro MM: massa molar mM: milimolar nm: nanômetro p/v: relação em porcentagem entre o peso do soluto e o volume da solução pb: pares de bases pH: potencial hidrogeniônico pI: ponto isoelétrico ps: picossegundos rpm: rotações por minuto seg: segundo TFS: Tampão Fosfato de Sódio U: unidade de atividade enzimática v/v: relação em porcentagem entre o volume do soluto e o volume da solução µg: micrograma µL: microlitro ºC: graus centígrados %: porcentagem CTI: cromatografia de troca iônica CIH: cromatografia de interação hidrofóbica CFG: cromatografia de filtração em gel CAQ: cromatografia de afinidade a quitina

12

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 14

1.1 OBJETIVOS 16

1.1.1 Objetivo Geral 16

1.1.2 Objetivos Específicos

2 REVISÃO DE LITERATURA 17

2.1 MONILIOPHTHORA PERNICIOSA 17

2.1.1 Ciclo de vida 17

2.1.2 Interação planta-patógeno 19

2.2 QUITINA 22

2.2.1 Estrutura e função 22

2.2.2 Mecanismos de hidrólise 26

2.2.3 Metabolismo de quitina 28

2.3 QUITINASES 29

2.3.1 Aplicação de quitinases 34

2.3.1.1 Controle de fungos fitopatogênicos 34

2.3.1.2 Produção de quitooligossacarídeos, glicosamina e N-

acetilglicosamina

35

2.3.1.3 Controle de mosquito Aedes aegypti 36

2.3.1.4 Aplicações médicas 37

2.3.1.5 Importância Industrial de quitinases termoestáveis 37

2.4 METODOLOGIAS EMPREGADAS PARA A PURIFICAÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO DE QUITINASES

38

3 BIOLOGIA COMPUTACIONAL 41

4 MATERIAL E MÉTODOS 43

4.1 MELHOR CONDIÇÃO DE EXTRAÇÃO DA ENZIMA A PARTIR

DOS BASIDIOMAS DO FUNGO M. PERNICIOSA

43

4.2 OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DA QUITINASE NATIVA 44

4.3 DETERMINAÇÃO DA UNIDADE DE ATIVIDADE (UA) DA 45

13

ENZIMA QUITINASE DE M. PERNICIOSA

4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA (AE) E

CONTEÚDO PROTÉICO TOTAL

46

4.5 CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA 46

4.5.1 Otimização dos valores de pH ótimo e temperatura ótima das

enzimas através da metodologia de superfície de resposta

47

4.6 ESTUDO DA TERMOESTABILIDADE DA QUITINASE 48

4.8 BIOLOGIA COMPUTACIONAL 50

4.8.1 Determinação da estrutura 3D 50

4.8.2 Identificação e alinhamento seqüencial das proteínas molde 50

4.8.3 Construção e refinamento do modelo 50

4.8.4 Validação 51

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 53

5.1 CONDIÇÕES DE EXTRAÇÃO DA ENZIMA A PARTIR DOS

BASIDIOMAS DO FUNGO M. PERNICIOSA

53

5.2 PURIFICAÇÃO DA QUITINASE NATIVA 53

5.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE TOTAL (U), ATIVIDADE

ESPECÍFICA (AE) E CONTEÚDO PROTÉICO TOTAL

58

5.4 CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA 60

5.5 ESTUDO DA TERMOESTABILIDADE DA QUITINASE 66

5.6 OBTENÇÃO DO MODELO 3D DA QUITINASE DE M.

PERNICIOSA

69

6 CONCLUSÕES 86

REFERÊNCIAS 88

APÊNDICES 98

14

1. INTRODUÇÃO

A doença conhecida como vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora

perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora, é uma das enfermidades que mais afeta a

produção do cacaueiro, reduzindo drasticamente o rendimento das lavouras nas diferentes

regiões produtoras do Brasil e em outros países do continente americano. A produção

anual de cacau na Bahia, que era em torno de 400.000 toneladas no início da década de

1980, caiu para 120.000 toneladas após a infecção da região produtora pelo fungo.

Atualmente a vassoura de bruxa é considerada a doença de maior relevância da lavoura

cacaueira da Bahia (CEITA et al., 2007).

O processo de infecção do Theobroma cacao (L.) pelo fungo ocorre através da

germinação dos esporos nas superfícies foliares da planta, sendo importante nesta etapa

a degradação de quitina, principal componente da parede celular do fungo, para que

ocorra a germinação (PURDY, SCHMIDT, 1996; GRIFFITH, et al., 2003).

O metabolismo da quitina é de crucial importância para o desenvolvimento e

manutenção da parede celular dos fungos. Portanto, o entendimento e caracterização

bioquímica da rota metabólica da quitina no fungo são uma importante etapa para o

desenvolvimento de possíveis estratégias para controlar M. perniciosa nos sistemas

planta-patógeno.

A quitina é um homopolímero constituído por uma seqüência linear de açúcares

monoméricos β-(1→4) 2-N-acetilamino-2-deoxi-D-glicose (ou N-acetilglicosamina)

(HOWARD, et al., 2003; MERZENDORFER, ZIMOCH 2003; ICHINOMIYA, et al., 2005;

GOHEL, 2006; DUO-CHAN, 2006), assemelhando-se à celulose, que é uma estrutura da

fibra vegetal. A diferença estrutural entre as duas fibras é a substituição do grupo hidroxila

15

localizado no C-2 na glicose da celulose, por um grupo acetamino na N-acetilglicosamina

(GlcN) da quitina, sendo geralmente degradada a N-acetilglicosamina (GlcNac) por

quitinases (E.C. 3.2.1.14) (COVAS, 2006).

Em organismos que produzem quitina, as enzimas quitinolíticas são essenciais para

a manutenção do ciclo de vida, tais como morfogênese de artrópodes ou divisão celular,

em leveduras, desenvolvimento e autólise de hifas, produção e germinação de esporos em

outros fungos (MERZENDORFER, ZIMOCH 2003). Quitinases são também encontradas

em organismos que não sintetizam quitina, mas que a utilizam como fonte de nutrientes,

como é o caso de algumas bactérias e fungos.

A desacetilação da quitina por enzimas desacetilases, para formar quitosana, é

considerada uma via alternativa da degradação da quitina, o qual é finalmente convertido

em resíduos de glicosamina pela ação de quitosanases (DAHIYA et al., 2006). Esta via

alternativa é muito utilizada por fungos que utilizam os produtos de degradação da

quitosana como fontes de nutrientes. Tanto a quitosana como a quitina possuem ampla

utilização em distintas áreas (FELSE, PANDA, 1999a; DAHIYA et al., 2006).

A aplicação de enzimas quitinolíticas na indústria farmacêutica, em pesquisas sobre

entomologia médica e na agricultura aumenta a produção e comercialização de quitinases

por empresas privadas, evidenciando uma grande procura dessa enzima em diversas

áreas de pesquisa (DAHIYA et al., 2006). Na agricultura a aplicação de genes de

quitinases de fungos em plantas aumenta, consideravelmente, a resistência a fungos

fitopatogênicos, sendo essas plantas transgênicas já utilizadas na produção de tabaco

(ROBY et al., 1988).

16

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Objetivo Geral

Purificar, caracterizar e construir um modelo 3D da enzima quitinase, contribuindo,

com isso, para a determinação da função desta enzima produzida por M. perniciosa no

mecanismo de patogenicidade em Theobroma cacao.

1.2.2 Objetivos Específicos

1-Extrair a enzima quitinase de M. perniciosa

2-Purificar a enzima quitinase de M. perniciosa

3-Caracterizar a enzima quitinase de M. perniciosa

4-Construir o modelo 3D da quitinase

17

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 MONILIOPHTHORA PERNICIOSA

2.1.1 Ciclo de vida

A doença vassoura de bruxa foi descrita inicialmente por Ferreira em 1785 como

“lagartão” devido às más formações da planta atacada pelo fungo (SANTOS, 2005).

Stahel, em 1895, o colocou dentro do gênero Marasmius, nomeando-o como Marasmius

perniciosa, (PURDY, SCHMIDT, 1996; GRIFFITH, et al., 2003) ao descrever a doença

vassoura-de-bruxa no Suriname. Em 1942 Singer transferiu este patógeno para o gênero

Crinipellis, família Tricholomataceae, ao revisar o gênero Marasmius, (PURDY, SCHMIDT,

1996; GRIFFITH et al., 2003; AIME, PHILLIPS-MORA, 2005). Estudos de filogenia

molecular realizados por Aime, Phillips-Mora (2005) demonstraram que este fungo

pertence ao gênero Moniliophthora. Atualmente este estudo é tido como válido e o fungo

causador da vassoura-de-bruxa é então conhecido como Moniliophthora perniciosa,

pertencendo ao Filo Basidiomycota, ordem Agaricales (HIBBETT, et al., 2007) família

Marasmiaceae (AIME, PHILLIPS-MORA, 2005).

M. perniciosa é um basidiomiceto hemibiotrófico que apresenta duas fases distintas

em seu ciclo de vida. A primeira fase é biotrófica e ocorre posteriormente à germinação

dos esporos, única estrutura infectiva, e sua penetração nos tecidos meristemáticos ocorre

através dos estômatos de folhas maduras e imaturas, lesão nas superfícies adaxial e

abaxial de Theobroma cacao L., tecidos lesados nas bases de tricomas (PURDY,

SCHMIDT, 1996; KILARU, HASENSTEIN, 2005; MEINHARDT, et al., 2006) e/ou

diretamente nos tecidos (PURDY, SCHMIDT, 1996; ALVES, 2002).

18

As folhas imaturas da planta demonstram sofrer atividade patogênica mesmo tendo

uma produção elevada de cafeína, considerada um forte inibidor de crescimento do M.

perniciosa, porém, a síntese de cafeína induz a formação de células binucleadas no fungo,

contribuindo para a mudança de fase biotrófica para saprofítica (KILARU, HASENSTEIN,

2005).

Ao iniciar a fase biotrófica, o fungo apresenta células monocarióticas, com hifas

irregulares em sua espessura, medindo entre 5 e 20 µm de diâmetro, intercelulares ao

meristema do hospedeiro e com ausência de fíbulas, provocando grandes alterações

morfofisiológicas na planta (LANA, 2004; SANTOS, 2005; MEINHARDT, et al., 2006),

como hiperplasia, hipertrofia e perda do domínio apical e das gemas axilares, provocando

intumescimento e desenvolvimento de grande número de ramos curtos e espessos, dando

a aparência de vassoura verde (GRIFFITH et al., 2003; KILARU, HASENSTEIN, 2005;

SCARPARI, et al., 2005). Outra característica morfofisiológica da planta é a formação de

tecidos necrosados em resposta a dicariotização das hifas, iniciando a segunda fase,

saprofítica/necrotrófica, do ciclo de vida do fungo, o qual apresenta hifas delgadas e

hialinas que medem entre 1,5 e 3,0 µm de diâmetro e com formação de fíbulas que

colonizam os tecidos do hospedeiro intra e intercelularmente (KILARU, HASENSTEIN,

2005; MUSE, et al., 1996).

Na fase biotrófica o fungo necessita dos tecidos vivos do hospedeiro, direcionando

o metabolismo catabólico da planta para as suas necessidades básicas, como nutrição,

crescimento e desenvolvimento do micélio (SCARPARI et al., 2005; KILARU,

HASENSTEIN, 2005). Estudos anteriores realizados por Scarpari et al. (2005) revelam que

carboidratos específicos possuem um papel importante na mudança da fase biotrófica

para a fase saprofítica, pois o fungo, ao impedir o movimento preferencial destes

19

carboidratos das partes saudáveis da planta para as regiões infectadas, leva à necrose

rápida dos tecidos da planta hospedeira, tanto por inanição como por resposta de defesa

da planta, já que esta tende a alterar sua fisiologia liberando, dentro da célula, grande

quantidade de compostos fenólicos, etileno, açúcares solúveis e tanino levando a célula à

morte (ODJAKOVA, HADJÜVANOVA, 2001; SCARPARI et al., 2005). O ciclo de vida de

M. perniciosa completa-se com a formação de basidiomas nos tecidos necrosados após a

fase saprofítica.

2.1.2 Interação planta-patógeno

Muitas doenças em plantas são causadas por fungos, o que gera grandes

preocupações na produção agrícola (LIU et al., 2005; GOHEL et al., 2006). Estima-se

atualmente que as perdas na agricultura por microrganismos fitopatogênicos sejam de

25% em países desenvolvidos e de 50% em países em desenvolvimento, sendo um terço

dessas perdas causadas por fungos (GOHEL, et al., 2006). Atualmente, estudos mais

aprofundados acerca dos microrganismos fitopatogênicos são requeridos constantemente

para elucidar formas de controle mais eficazes de doenças fúngicas e bacterianas que

acometem as plantas.

Além das formas de controle antrópicas, como a poda sanitizante, rotação de

cultura, produção de cultivares resistentes ao patógeno e a aplicação de fungicidas e

bactericidas (CORNELISSEN, MELCHERS, 1993), as plantas possuem seus próprios

mecanismos de defesa, os quais são cada vez mais específicos. Estudos sobre

coevolução entre patógenos e hospedeiros revelam que quitinases produzidas por plantas

20

são muitas vezes inibidas por bactérias que possuem interação patogênica específica com

essas plantas (BISHOP et al., 2000).

A invasão do patógeno causa diversas alterações fisiológicas na planta, ativando

variadas estratégias de defesa como resposta à hipersensibilidade, indução da biosíntese

de enzimas hidrolíticas e de fitoalexinas. Estas respostas se iniciam após alterações da

membrana plasmática causadas pela ligação de elicitores, proteínas e compostos

excretados pelo patógeno que induzem a resposta de defesa na planta aos receptores

localizados na membrana plasmática das células vegetais (ODJAKOVA, HADJÜVANOVA,

2001; CEITA et al., 2007).

O aumento da permeabilidade da membrana plasmática é uma das primeiras

reações de defesa à invasão de patógenos logo após a produção de elicitores pelo

microrganismo, induzindo o influxo de cálcio e potássio e o efluxo de cloro

(KOLATTUKUDY, et al., 1995; ODJAKOVA, HADJÜVANOVA, 2001). Essas alterações

provocam a produção de óxidos nítricos e oxigênios reativos intermediários formados pela

redução do oxigênio como, por exemplo, o ânion superóxido (O2-), o radical hidroxila (-OH)

e o peróxido de hidrogênio (H2O2) levando à indução da ativação de genes de defesa da

planta (Figura 01) (ODJAKOVA, HADJÜVANOVA, 2001; LAU, et al., 2006), principalmente

os genes R, que detectam elicitores produzidos por patógenos e que induzem a

transcrição de proteínas relacionadas a patogênese conferindo uma resposta local ou

sistêmica (BISHOP, et al., 2000; ODJAKOVA, HADJÜVANOVA, 2001; TAIZ, ZEIGER,

2004; CEITA, et al., 2007).

21

Figura 01: Esquema da relação patógeno-hospedeiro evidenciando as alterações ocorridas na célula da planta em resposta à presença do fitopatógeno (Fonte: a Autora, baseado em TAIZ, ZEIGER, 2004).

A oxidação mediada por H2O2 leva a formação de ligações cruzadas de proteínas

de parede celular da planta hospedeira, reforçando as barreiras físicas contra a entrada de

fitopatógenos (JACH et al., 1995; ODJAKOVA, HADJÜVANOVA, 2001; TAIZ, ZEIGER,

2004), como por exemplo, o espessamento da cutícula (KOLATTUKUDY et al.,1995). A

cutícula pode servir como sinalizador para o fungo M. perniciosa no reconhecimento do

hospedeiro segundo estudos realizados por Scarpari et al., (2005). Wattanalai et al. (2004)

revelam que quitinases podem romper as barreiras da cutícula promovendo a penetração

de tubos germinativos no caso de infecção direta.

Os elicitores ou a própria parede celular do fungo ativam genes relacionados ao

sistema quitinolítico (ODJAKOVA, HADJÜVANOVA, 2001; BISHOP, et al., 2000;

VALUEVA, MASOLOV, 2004). Bishop et al. (2000), porém, relatam que o sistema

quitinolítico de plantas pode ser inibido pelo patógeno. Lopes (2005) ao analisar os genes

Parede celular

EXTRACELULAR

oxigênio reativo intermediário O2

Ligações cruzadas da parede celular

Esporo de M. perniciosa

Membrana plasmática

Fluxo de íons, permeabilidade da membrana

Receptor (ativação dos genes de defesa – R)

Produção de quitinase classe I pelo patógeno

Inibição da síntese da enzima hidrolítica quitinase

Ativação dos genes para: Resposta hipersensibilidade biosíntese de fitoalexinas, lignina, ácido salicílico e enzimas hidrolíticas INTRACELULAR

NADPH oxidase

Cutícula

22

relacionados ao sistema quitinolítico de M. perniciosa, descreve um gene de quitinase que

sintetiza quitinases da classe I, só encontradas em plantas e bactérias. As quitinases da

classe I, produzidas por plantas superiores e, atualmente também identificada em M.

perniciosa (LOPES, 2005), são enzimas essenciais à degradação do polímero de quitina,

componente principal da parede celular de fungos (TAKAYA, et al., 1998a e b; HOWARD,

et al., 2003; ADAMS, 2004; DUO-CHUAN, 2006). Estas plantas possuem genes que

codificam a síntese de quitinases e as utilizam na defesa contra fitopatógenos.

(YAMAOKA, et al., 1999; BISHOP, et al., 2000; GOHEL, et al., 2006).

2.2 QUITINA

2.2.1 Estrutura e função

A cada ano, na biosfera, são produzidas 100 bilhões de toneladas de quitina, o

segundo maior biopolímero no planeta (ANTRANIKIAN et al., 2005; HORN, et al., 2006;

ZHU et al., 2007), perdendo apenas para a celulose que tem uma produção anual

estimada de 500 bilhões de toneladas (MANAHAN, 2006). A quitina é um polímero linear e

insolúvel encontrada em fungos, crustáceos, artrópodes e insetos e em ecossistemas

marinhos e terrestres (VAAJE-KOLSTAD, et al., 2005). Apesar desta produção abundante,

a quitina não é acumulada na biosfera, sugerindo que todos os organismos que possuem

esse polímero como componente estrutural, e até mesmo aqueles que não produzem esse

carboidrato, possuem um sistema quitinolítico eficiente para a degradação da quitina

(VAAJE-KOLSTAD, et al., 2005).

23

A quitina é um homopolímero insolúvel de N-acetilglicosamina (GlcNac) unidos por

ligações glicosídicas β-(1→4) (Figura 02) (KRAMER, MUTHUKRISHNAN, 1997;

HOWARD, et al., 2003; MERZENDORFER, ZIMOCH 2003; ICHINOMIYA, et al., 2005;

GOHEL, 2006; DUO-CHAN, 2006) que formam espontaneamente estruturas cristalinas de

microfibrilas (IMAI, et al., 2003; MERZENDORFER, ZIMOCH 2003; MERZENDORFER,

2006) e medem aproximadamente 3,0 nm de diâmetro, sendo as cadeias de açúcares,

dentro das microfibrilas, estabilizadas por ligações de hidrogênio entre os grupos amino e

carbonil (MERZENDORFER, ZIMOCH, 2003; HOGENKAMP, 2006). Em fungos estas

microfibrilas medem em torno de 20-400 cadeias de açúcares associadas às ligações de

hidrogênio (RUIZ-HERRERA, MARTINES-ESPINOZA, 1999).

n

Figura 02 : Ilustração de um segmento da quitina. Fonte: Trindade (2005).

Análises por difração de raio-X mostram que a quitina é polimórfica e ocorre em três

diferentes formas cristalinas a depender do tipo de empacotamento e da polaridade das

cadeias de GlcNAc: α-quitina, β-quitina e γ-quitina (Figura 03), (LI, et al., 1992; RUIZ-

HERRERA, MARTINES-ESPINOZA, 1999; MERZENDORFER, ZIMOCH, 2003), sendo a

α-quitina a forma mais abundante (DAHIYA et al., 2006).

24

Estas três variações ocorrem devido ao grau de hidratação destas estruturas, ao

tamanho da unidade celular e ao número de cadeias de quitina por unidade de célula. As

α-quitinas exibem uma orientação antiparalela ao longo de todas as cadeias, enquanto

que as β-quitinas exibem uma orientação paralela. Em relação às γ-quitinas a constituição

das estruturas cristalinas se dá pela formação de duas fitas paralelas alternadas com uma

única fita antiparalela (MERZENDORFER, ZIMOCH, 2003).

Figura 03 : Quitina e suas três formas cristalinas encontradas no Reino Animal: α-quitina, β-quitina e γ-quitina (adaptado de Urich, 1993).

Assim como em plantas, muitos organismos apresentam a α-quitina com função

estrutural e de defesa, como por exemplo, em hidrozoários, ovos de nemátodas, rotíferos,

rádulas de crustáceos e em cutículas de insetos. As β-quitinas são encontradas em

cascas de braquiópodos, em exoesqueletos e em membranas peritróficas de insetos

(MUZARELLI, 1999).

A similaridade estrutural entre celulose e quitina leva alguns autores, como

Merzendorfer, Zimoch (2003), Covas et al. (2006), Merzendorfer (2006), a considerar que

a quitina é derivada da celulose, que apresenta um grupo hidroxil na posição C-2 (carbono

2) da glicose da celulose, enquanto que neste mesmo carbono a glicose da quitina possui

um grupo acetamido (Figura 04) (COVAS, 2006; MEZENDORFER, 2006). Os dois

polímeros têm função estrutural na célula.

αααα β γγγγ

25

Figura 04 : Diferença estrutural entre celulose (a) e quitina (b). Em (a) é observado o grupo hidroxil (OH) no carbono 2, característico do polímero de celulose. Em (b) é observado o grupo acetamido (NHCOCH3) no carbono 2, característico do polímero de quitina (adaptado de COVAS, 2006).

A quitina contribui para a força mecânica em paredes celulares de fungos e em

exoesqueleto de artrópodos, enquanto que a celulose contribui para a força e rigidez nas

paredes celulares de plantas (MERZENDORFER, ZIMOCH 2003).

Atualmente as diversas aplicações da quitina e seus derivados, como a quitosana

(quitina com 74% de desacetilação), são alvos freqüentes de pesquisas em distintas áreas

de conhecimento (FELSE, PANDA,1999a). A quitina, quitosana e 5-fluoro uracil,

conjugadas, são alvos recentes como agentes terapêuticos contra o câncer (FELSE,

PANDA,1999a). Outro derivado da quitina, a carboximetil quitina é utilizada como

controladora na liberação contínua de drogas metafetaminas em injeções subcutâneas,

aplicações na antitoxidação dos derivados peptídicos da gliadina em pacientes com

doença celíaca (enteropatia induzida por glúten) latente apresentando aumento de células

aglutinantes K562(S), em cicatrização de feridas e em implantes onde há substituição de

tecidos em humanos, assim como diversas outras aplicações da quitina e seus derivados

(FELSE, PANDA,1999a e FELSE, PANDA,1999b).

26

2.2.2 Mecanismos de hidrólise

A quitina é degradada por quitinases que estão inseridas na superfamília das β-

glicosil hidrolases. A degradação da quitina pelas quitinases ocorre por hidrólise das

ligações glicosídicas entre as moléculas de N-acetilglicosamina (GlcNAc), liberando

oligômeros e/ou monômeros de GlcNAc.

A hidrólise da quitina pode ocorrer através de dois mecanismos: por inversão ou

retenção da configuração anomérica da molécula, conforme é esquematizado na Figura

05 (DAHIYA, et al., 2006). Em ambos os mecanismos, a posição do doador de próton é

idêntica, pois a distância entre a ligação do hidrogênio e o oxigênio glicosídico permanece

a mesma (DAVIES e HENRISSAT, 1995). Uma base catalítica nucleofílica, um carboxilato

da cadeia lateral (WHITE, ROSE, 1997), torna-se próxima ao carbono anomérico (C-1) da

molécula de GlcNAc. A diferença entre os mecanismos de inversão e retenção é também

percebida pela diferença espacial entre o doador de próton Y (Figura 05-a), e o nucleófilo

catalítico Z.

O mecanismo de inversão da configuração anomérica ocorre pela protonação do

oxigênio glicosídico, pelo doador de próton Y, que é acompanhado pela rápida

incorporação da molécula de água no carbono 1 do resíduo de GlcNAc, (Figura 05-b) e

posteriormente ativado pelo segundo nucleófilo catalítico (Zi).

27

Figura 05: a) Esquema do mecanismo de retenção da hidrólise das ligações glicosídicas propostos para a Família 18 das quitinases. A protonação do resíduo de GlcNAc leva a formação do intermediário oxazolina, o qual pode ser hidrolisado para formar um produto com retenção da configuração anomérica. b) Esquema do mecanismo de inversão da hidrólise proposto para a Família 19 das quitinases. Dois resíduos ácidos são requeridos no sítio ativo, mostrando a inversão do produto de hidrólise da configuração anomérica (DAHIYA et al., 2006).

Essa ativação se dá pela ligação de um dos hidrogênios da molécula de água com

a base nucleofílica, permitindo a ligação do oxigênio da molécula da hidroxila recém

formada com o carbono anomérico do resíduo de açúcar (DAVIES, HENRISSAT, 1995;

DAHIYA et al., 2006). A base nucleofílica (Zii) mantém uma distância de cerca de 10 Å

com o próton doador (Y) no final da hidrólise (DAVIES, HENRISSAT, 1995).

No mecanismo de retenção (Figura 05-a) da configuração anomérica, a protonação

do oxigênio glicosídico é também realizado por um doador de próton (Y), produzindo

rapidamente o íon intermediário oxocarbênio. A base nucleofílica (Zi) liga-se diretamente e

temporariamente ao resíduo de GlcNAc, sendo o primeiro nucleófilo (DAVIES,

HENRISSAT, 1995; ARONSON-JR et al., 2003). Posteriormente, a molécula de água,

segundo nucleófilo (Zii), interrompe a ligação do GlcNAc com a primeira base nucleofílica

(Zi) e se liga ao resíduo de GlcNAc. Esta captação do resíduo de açúcar realizado pela

a Mecanismo de Retenção

b Mecanismo de Inversão

Zii Y

Zi Zi

Zi

Zii

Zi

Zi Zi

Y Zi

Zii Zii

Y

Y

Zii Y

28

molécula de água deixa o produto com a mesma estrutura química do substrato,

mantendo a base nucleofílica (Zi) com uma distância de 5,5 Å do doador de próton (Y) no

final da hidrólise (DAVIES, HENRISSAT, 1995; WHITE, ROSE, 1997).

2.2.3 Metabolismo de quitina

Apesar da quitina ser um dos mais importantes biopolímeros da natureza, o

conhecimento da sua biossíntese ainda é incompleto. A quitina desempenha funções

importantes na bioquímica de vários processos metabólicos de todos os organismos vivos

que a possui (FELSE e PANDA, 1999a e b). Em microrganismos como as bactérias a

quitina é utilizada principalmente como fonte de carbono. Em eucariontes, como o M.

perniciosa, a quitina é utilizada, além de sua propriedade estrutural, como matéria prima

para o crescimento e alongamento das hifas, além de ser utilizada também como fonte de

carbono em condições de inanição (LOPES, 2005, SCARPARI et al., 2005).

A quitina é sintetizada através de cinco passos consecutivos (Figura 06): (i)

conversão da frutose-6-fosfato em glicosamina-6-fosfato, pela ação da frutose-6-fosfato

aminotransferase (EC 2.6.1.16); (ii) acetilação da glicosamina-6-fosfato formando N-

acetilglicosamina-6-fosfato, catalizada pela glicose-6-fosfato acetiltransferase (EC 2.3.1.4);

(iii) interconversão de N-acetilglicosamina-6-fosfato em N-acetilglicosamina-1-fosfato, pela

ação da N-acetilglicosamina fosfomutase (EC 5.4.2.3); (iv) uridinação da N-

acetilglicosamina-1-fosfato em uridina difosfato-N-acetilglicosamina ativada (UDP-

GlcNAc), catalisada pela ação da UDP-GlcNAc pirofosforilase (EC: 2.7.7.23); (v)

conversão irreversível da UDP-N-acetilglicosamina em quitina através da sintase da

quitina (EC: 2.4.1.16) (MIO et al., 1998; YAMADA-OKABE et al., 2001).

29

A síntese e a degradação da quitina em fungos é também essencial para a

formação de esporos e diferenciação celular (DUO-CHUAN, 2006).

Figura 06: Rota metabólica da quitina evidenciando as suas cinco etapas de formação (Fonte: Lopes, 2005).

2.3 QUITINASES

A quitina é degradada a 2-acetamido-2-deoxi-β-D-glicosamina (N-acetilglicosamina

– GlcNAc) por quitinases (EC 3.2.1.14) (FELSE, PANDA, 1999a; DUO-CHUAN, 2006;

DAHIYA et al., 2006). Enzimas quitinolíticas são amplamente encontradas em uma

variedade de organismos, incluindo bactérias, fungos, plantas, invertebrados

(principalmente nematóides, insetos e crustáceos) e todas as classes de vertebrados

(i)

(ii)

(iii)

(iv)

(v)

30

(WATANABE et al., 1991; PERRAKIS et. al., 1994; MIO et. al., 1998; HOWARD et. al.,

2003).

Inicialmente as enzimas quitinolíticas eram distribuídas dentro das quitinases (EC

3.2.1.14) e N-acetilglicosaminidases (EC 3.2.1.30) (SHUBAKOV, KUCHERYAVYKH,

2004). Porém, Duo-Chuan (2006) e Dahiya et al. (2006) definem enzimas quitinolíticas

como qualquer enzima que catalisa a clivagem da quitina, sendo essas enzimas

quitinolíticas divididas em duas grandes categorias: as endoquitinases e as exoquitinases.

Endoquitinases (EC 3.2.1.14) clivam aleatoriamente em regiões internas do

polímero de quitina liberando multímeros de GlcNac (VEGA et al., 1997; DAHIYA et al.

2006; DUO-CHUAN, 2006) solúveis e de baixa massa molecular, como as quitotetraoses,

quitotrioses e diacetilquitobiose (DUO-CHUAN, 2006).

As exoquitinases podem ser divididas em duas subcategorias: as quitobiosidases

(EC 3.2.1.29), também chamadas de quitina-1,4-β-quitobiosidases, que catalisam a

liberação progressiva de diacetilquitobiose a partir da quebra de extremidades não

reduzidas das cadeias de quitina e as β-(1,4)-N-acetilglicosaminidases (EC 3.2.1.30),

também conhecidas como quitobiases, que clivam os produtos oligoméricos de

endoquitinases e quitobiosidases gerando monômeros de GlcNAc (DUO-CHUAN, 2006).

Uma via alternativa é desacetilação da quitina a quitosana e posteriormente esse produto

é degradado a resíduos de glicosamina por quitosanases (EC 3.2.1.132) (DAHIYA et al.

2006).

As quitinases estão entre as enzimas associadas à parede celular de fungos (PCF),

como Saccharomyces cerevisiae, Meyen ex E.C. Hansen, Candida albicans, (C.P. Robin)

Berkhout, Kluyveromyces spp (RAST et. al., 2003). As funções das quitinases nos

organismos são distintas: digestão da quitina no trato digestivo (vertebrados), necessidade

31

de degradação parcial da cutícula (insetos e crustáceos), defesa (plantas), autólise

(fungos) (RAST et. al., 2003). As quitinases constituem as Famílias 18, 19 e 20 da

superfamília das β-glicohidrolases (DUO-CHUAN, 2006) (Figura 07).

A Família 18 das glicohidrolases é constituída pelas quitinases da classe III,

encontradas em fungos e em plantas e pelas quitinases da classe V, que são encontradas

principalmente em bactérias, podendo também ocorrer em vírus, sendo a família mais

diversificada em termos evolutivos (DUO-CHUAN, 2006). Quitinases da Família 18,

encontradas em fungos, possuem uma estrutura composta basicamente por cinco

motifs/regiões: uma região N-terminal de peptídeo sinal, um domínio catalítico, uma região

rica em treonina/serina, uma região ligada à quitina e uma extensa região C-terminal

(DUO-CHAN, 2006) (Figura 08). Alterações do gene ctr1 (S. cerevisiae) e chi1 (Aspergillus

nidulans - (Eidam) G. Winter, indica que as quitinases da classe da família 18 estão

relacionadas ao crescimento e morfogênese de fungos (JAQUES et. al, 2003).

A Família 19 é altamente conservada e contém quitinases encontradas

principalmente em plantas. As quitinases dessa Família são subdivididas em três classes:

I, II e IV (TANAKA et al., 1999). As quitinases das Famílias 18 e 19 não compartilham

similaridade em suas seqüências de aminoácidos, tendo estruturas 3D e mecanismos

moleculares completamente diferentes, sugerindo que estas famílias possuem ancestrais

distintos (PERRAKIS et al., 1994). A Família 20 é constituída basicamente por β-N-

acetilhexosaminidases ou β-N-acetilglicosaminidases encontradas em bactérias, fungos e

em humanos (DUO-CHUAN, 2006).

32

Figura 07: A - estrutura 3D de quitinase da Família 18 das Glicohidrolases do fungo Streptomyces griseus HUT6037 (KESUKA et al., 2006); B - estrutura 3D de quitinase/lisozima da Família 19 das Glicohidrolases, complexado com o inibidor alosamidina (SCHELTINGA et al., 1995); C - estrutura 3D de uma β-N-acetilhexosaminidase da Família 20 das Glicohidrolases da bactéria Streptomyces plicatus (MARK et al., 2001).

Figura 08: Representação esquemática entre as diferentes estruturas das classes de quitinases. As quitinases das classes I, II e IV compartilham alta similaridade exceto por algumas deleções encontradas nos domínios catalíticos das quitinases da classe II e IV e pela ausência do domínio rico em cisteína nas quitinases da classe II. As quitinases da classe II podem ter múltiplos domínios. (Fonte: Lopes, 2005).

A B C

33

Em fungos, as quitinases desempenham uma variedade de funções como, a

digestão da parede celular, a formação de septos, a germinação e a diferenciação de

esporos, o crescimento e a autólise de hifas (XIA, et al., 2001; KIM et al., 2003;

SELVAGGINI et al., 2004; DUO-CHUAN, 2006). Estudos recentes demonstram que o

gene chi3, que codifica uma quitinase de Rhizopus oligosporus Saito, é transcrito durante

o crescimento de suas hifas (TAKAIA et al., 1998a), enquanto que em A. nidulans a

freqüência na germinação de esporos e o crescimento hifal decai com a disrupção do

gene chiA, que codifica uma quitinase nesse fungo (TAKAIA et al., 1998b). Portanto,

quitinases e seus inibidores são alvos bastante atraentes para o desenvolvimento de

fármacos antifúngicos (HOUSTON et. al., 2002).

Em organismos que produzem quitina, as enzimas quitinolíticas são essenciais para

a manutenção do ciclo de vida, tais como morfogênese em artrópodes ou divisão celular e

esporulação em leveduras e crescimento das extremidades hifais em fungos filamentosos

(MERZENDORFER, ZIMOCH, 2003). Quitinases são também encontradas em organismos

que não sintetizam quitina, mas que a utilizam como fonte de nutrientes, como é o caso

das bactérias (CHRISTODOULOU et al., 2001; HORN et al., 2006). Alguns

microrganismos, principalmente fungos, são capazes de desacetilar quitina pela atividade

das quitina-desacetilases (EC 3.5.1.41) para formar quitosanas, e estas podem, então, ser

degradadas pela quitosanase (EC 3.2.1.132) e metabolizadas (HOWARD et al., 2003).

Tanto as quitosanas como a quitina possem ampla utilização em distintas áreas

(HOWARD et al., 2003).

Fungos possuem um sistema eficiente de despolimerização, transporte e

metabolismo de quitina e quitooligossacarídeos, necessitando da atividade de quitinases,

também conhecidas como poli-[1,4-(N-acetil-β-D-glicosamina)] glicanohidrolases, e outras

34

quitina-despolimerases como as quitodextrinases e N-acetilglicosamidases para o

metabolismo da quitina (HOWARD et. al., 2003).

2.3.1 Aplicação de quitinase

2.3.1.1 Controle de fungos fitopatogênicos

A efetiva degradação de quitina pelas quitinases na natureza revela a importância

dessas enzimas na biosfera, principalmente em organismos que não contém quitina, mas

utilizam essas enzimas em mecanismos de defesa, como é o caso de plantas, e no

consumo de carbono e nitrogênio e sua reciclagem no ambiente, no caso de bactérias

(VAAJE-KOLSTAD, et al., 2005).

A aplicação de enzimas quitinolíticas na indústria farmacêutica, em pesquisas sobre

entomologia médica e na agricultura aumenta a produção e comercialização de quitinases

por empresas privadas, evidenciando uma grande procura dessa enzima em diversas

áreas de pesquisa.

Em plantas a produção de quitinases é efetiva na defesa contra fungos

patogênicos, sendo estas enzimas alvos atraentes na aplicação industrial de fungicidas

agrícolas (DAHIYA et al., 2006). Muitas quitinases de plantas, associadas com β-

glicanases, inibem o crescimento de certos fungos patogênicos em culturas, evidenciando

sua atividade inibitória (BROGLIE, BROGLIE, 1992) e sua capacidade de induzir

naturalmente atividade antifúgica (DAHIYA et al., 2006).

Trabalhos realizados por Roby et al. (1988) indicam o aumento da resistência ao

fungo Colletotrichum lagenarium (Pass.) Ellis & Halst. em meloeiros devido a elevada

atividade quitinolítica produzida por essas plantas ao serem tratadas com elicitores do

35

próprio fungo, sugerindo que o aumento da atividade da quitinase é responsável, em

parte, pela indução da resistência sistêmica contra C. lagenarium. A inibição in vitro de

Trichoderma viride, Schumach., também foi eficiente após a aplicação de quitinases

purificadas (MAUCH et al., 1988).

Diversos trabalhos têm estudado a inserção de genes de quitinases em plantas de

interesse agrícola para que elas tenham uma maior resistência a microrganismos

patogênicos, potencializando as defesas naturais dessas plantas durante o ataque de

fungos (LIU et al., 2005; DAHIYA et al., 2006). Kumar et al. (2003) estudaram os efeitos da

inserção do gene de quitinase chi11 em variedades de arroz inoculados com Rhizoctonia

solani, J.G. Kühn. Tais variedades de plantas apresentaram grande resistência ao

patógeno quando comparadas com plantas controle. Resultados semelhantes foram

obtidos em trabalhos realizados por Roby (1990), os quais obtiveram altas sínteses de

quitinases em tecidos de tabaco infectados com Botrytis cinerea, Pers. Sclerotium rolfsii,

Sacc. e Rhizoctonia solani. Estes resultados evidenciam a aplicação de quitinases na

agricultura para o controle de patógenos de plantas (KARASUDA et al., 2003).

2.3.1.2 Produção de quitooligossacarídeos, glicosamina e N-acetilglicosamina

Além da produção de glicosaminas e N-acetilglicosaminas, as quitinases, em suas

aplicações biotecnológicas podem ser empregadas para a elaboração de

quitooligossacarídeos, atualmente estudados como agentes antibacterianos, elicitores

para indutores de lisozima, agentes imunomoduladores e agentes na atividade antitumor

(DAHIYA, et al., 2006)

36

A produção comercial de quitooligossacarídeos é bem estabelecida para fins

científicos. A Sigma Chemical Co. (E.U.A.) e a RC Bio-Chemical (Coréia do Sul)

comercializam diversos produtos derivados da degradação da quitina como, por exemplo,

quitobiose, quitooligossacarídeos, glicosamina e N-acetilglicosamina para diversas

instituições de pesquisa. A própria enzima quitinase é comercializada pela Sigma

Chemical Co, (USA) por U.S. $ 105,10 U (400-1200 unidades/g).

Processos de transglicosilações em Mucor hiemalis, Wehmer são também

realizados por endoquitinases e N-acetilglicosaminidases para gerar longas cadeias de

quitooligômeros. Esses processos foram utilizados na preparação de derivados de

açúcares modificados no C-1 e no C-2 para posterior síntese de glicopeptídeos (YAMANOI

et al; 2004).

2.3.1.3 Controle do mosquito Aedes aegypti

Além do que já foi discutido, diversos outros aspectos socioeconômicos envolvem a

aplicação de quitinases de fungos. Um exemplo estudado por Shaikh e Desphande (1993)

é em relação ao fungo saprofítico Myrothecium verrucaria (Alb. & Schwein.) Ditmar que

produz um complexo enzimático de degradação da cutícula de insetos. Este complexo

enzimático, composto principalmente por quitinases, foi utilizado por Mendonsa et al.

(1996) para avaliar a morte de larvas de A. aegypti. O Tempo Letal (TL50) chega a 100%

dentro de 48 e 120 h para o primeiro e quarto, respectivamente, estágios larvar do

mosquito.

37

2.3.1.4 Aplicações médicas

Algumas preparações oftálmicas, como em manipulações farmacêuticas de colírios

para infecções fúngicas, são suplementadas com quitinases e antibióticos, potencializando

o efeito inibitório e destrutivo dos fungos patogênicos (DAHIYA et al., 2006). A aplicação

terapêutica de quitinases em fármacos, loções e cremes de uso tópico como antifúngicos

foram estudados por Pope, Davis (1979) e por Orunsi e Trinci (1985). Estes produtos

farmacêuticos suplementados com quitinases e/ou as enzimas que degradam parede

celular de fungos, como as quitinases, são atualmente comercializados em farmácias de

manipulação, melhorando o efeito dessas drogas em doenças fúngicas (POPE, DAVIS,

1979).

2.3.1.5 Importância industrial de quitinases termoestáveis

A aplicação de quitinases para a produção e comercialização de quitina é cada vez

maior na indústria privada (HAKI, RAKSHIT, 2003). Quitina e quitosana são muito

utilizadas no clareamento de águas residuais, na indústria têxtil e de cosméticos

(HOWARD et al., 2003), em produtos fotográficos, em agentes quelantes de metais

pesados, em aplicações médicas e veterinárias (HAKI, RAKSHIT, 2003).

A produção de quitosana a partir da desacetilação da quitina na indústrias necessita

de 40% de solução de hidróxido de sódio, diminuindo a qualidade do produto fabricado.

Porém, o custo para a degradação do polímero de quitosana e do polímero de quitina por

quitinases mesotérmicas nas indústrias ainda é muito alto (HAKI, RAKSHIT, 2003), uma

vez que a hidrólise das ligações glicosídicas não é tão facilmente realizada pelas

38

quitinases, pois a quitina é encontrada em suas formas cristalinas α, β e γ que são

insolúveis em água (ROBERTS, 1992). Essa propriedade de cristalização, e

conseqüentemente, insolubilidade da quitina necessita de quitinases termoestáveis, uma

vez que elevadas temperaturas (aproximadamente 80 a 90 ºC) diminuem a viscosidade e

aumentam a solubilidade da quitina e seus produtos e de favorecer o equilíbrio e o

deslocamento em reações endotérmicas, possibilitando a ação de quitinases

termoestáveis no processo de hidrólise (KRAHE et al., 1996; HAKI, RAKSHIT, 2003).

2.4 METODOLOGIAS EMPREGADAS PARA A PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE

QUITINASES

A separação e posterior caracterização de enzimas quitinolíticas em muitos fungos

têm sido propostas em diversos trabalhos. Quitinases de fungos são purificadas por

diferentes métodos: fracionamento por precipitação com sulfato de amônio (NH4)2SO4,

sendo a concentração deste sal variável entre 30 e 100% de saturação (DUO-CHUAN,

2006), cromatografia de troca iônica (CTI) (TAKAYA et al., 1998a; XIA et al., 2001; LU et

al., 2002; WANG et al., 2002; DAHIYA et al., 2005; VAAJE-KOLSTAD et al., 2005),

cromatografia de interação hidrofóbica (CIH) (BRUBERG et al., 1996; SYNSTAD et al.,

2004; VAAJE-KOLSTAD et al., 2005), cromatografia de filtração em gel (CFG)

(SAKURADA et al., 1997; SAKURADA et al., 1998; KAWACHI et al., 2001; WANG et al.,

2002; DAHIYA et al., 2005) após aplicação em outras colunas cromatográficas,

cromatografia de afinidade a quitina (CAQ) e ponto isoelétrico (pI) (DUO-CHUAN, 2006).

39

A determinação da atividade enzimática e a dosagem protéica são procedimentos

aplicados em praticamente todas as etapas da purificação e caracterização de enzimas.

Todos os produtos de degradação da quitina, como por exemplo, quitooligômeros,

quitobiose e GlcNAc, possuem um açúcar redutor final, desta forma diversos métodos

para analisar a quantidade de açúcar redutor final liberados no processo de degradação

da quitina pelas quitinases podem ser empregados (HOWARD et al., 2003).

Alguns protocolos, como o de Garcia et al. (1993) utilizam o ácido bicinconínico

(disodium-2-2´-bicinchoninate, Sigma® D 8284) para a detecção de açúcar redutor, porém

este ácido pode se ligar também a proteínas existentes na amostra e produzir um

resultado falso positivo (HOWARD et al., 2003).

Outro método também empregado é por marcador radioativo fluorescente com

subseqüente HPLC (Hight Performance Liquid Cromatography). O composto fluorescente

ao reagir com o açúcar redutor é posteriormente separado por HPLC e quantificado. Os

resultados obtidos por este método são excelentes, pois se pode determinar a atividade de

degradação por enzimas específicas (HOWARD et al., 2003), entretanto, o custo para a

aplicação deste método é muito alto.

Uma alternativa a estes dois protocolos é o método otimizado por Miller (1959).

Neste método o reagente de detecção é o ácido dinitrosalicílico (DNS) que reage

especificamente com o açúcar redutor, não tendo interferências com proteínas e

aminoácidos que estejam presentes na solução (HOWARD et al., 2003).

Para a dosagem protéica, diversos métodos são utilizados no meio científico, sendo

os mais empregados os espectrofotométricos no ultravioleta e no visível (ZAIA et al.,

1998). Os métodos de determinação de proteínas por espectrofotometria mais utilizados

são o do biureto (GORNAL et al., 1949) e o método de Smith et al. (1985), que se baseiam

40

na ligação do cobre com as proteínas, sendo aplicado com cautela, pois o cobre reage

com diversas substâncias empregadas em algumas etapas de purificação, além de

diversos outros interferentes (ZAIA et al., 1998). O método por absorção de proteínas na

luz ultravioleta (STOSCHECK et al., 1990) é bem aplicado quando se tem uma quantidade

limitada de amostra para o estudo. O método de Lowry et al. (1951) se baseia na mistura

de determinadas substâncias que sofrem redução na presença do cobre (II). Porém,

apesar da alta sensibilidade, este método possui algumas desvantagens como: ter uma

absortividade específica muito variável para as diferentes proteínas e estar sujeito a

muitos interferentes, como o sulfato de amônio, além de apresentar um longo tempo de

análise (ZAIA et al., 1998).

Atualmente o método de Bradford (1976) é o método mais rápido e mais sensível

do que o método de Lowry, pois o método de Bradford é baseado na ligação do corante

Azul Brilhante de Coomasie BG-250 em proteínas que contém aminoácidos de cadeias

laterais básicas ou aromáticas (ZAIA et al., 1998). Esta reação é fortemente absorvida em

595 nm, tornando-se excelente pelo número reduzido de interferentes quando comparados

aos outros métodos (ZAIA et al., 1998).

41

3 BIOLOGIA COMPUTACIONAL

A elucidação de estruturas tridimensionais de proteínas sempre foi alvo para o

conhecimento detalhado sobre o modo de ação de enzimas e produção de fármacos

(SANTOS-FILHO, ALENCASTRO, 2003). Para isso, algumas técnicas podem ser

aplicadas para a obtenção dessas estruturas, como a cristalografia de raio-X, os métodos

por difração de nêutrons e por ressonância magnética nuclear (RMN). Porém, apesar

destes métodos serem consideravelmente bem sucedidos, eles não são empregados a

todos os tipos de proteínas, sendo seu tempo de realização freqüentemente longo

(SCHWEDE et al., 2003; SANTOS-FILHO e ALENCASTRO, 2003). Proteínas de

membrana, por exemplo, ou proteínas que possuem regiões muito glicosiladas dificilmente

se cristalizam e raramente podem ser tratadas de forma satisfatória por RMN (SANTOS-

FILHO, ALENCASTRO, 2003).

No entanto, estruturas tridimensionais de diversas proteínas são atualmente

elucidadas a partir de métodos computacionais, que utilizam apenas seqüências

aminoacídicas da proteína de interesse para a predição de modelos tridimensional. A

predição de estrutura 3D de muitas proteínas pode ser realizada por modelagem

comparativa (GOLDSMITH-FISCHMAN, HONG, 2003; SANTOS-FILHO, ALENCASTRO,

2003) utilizando métodos computacionais como as ferramentas do Deep PDB Viewer

(3.7), que permite a submissão de uma seqüência problema alinhada a uma ou mais

estruturas 3D que servem de molde. As respostas são geradas por processos

automatizados, como na modelagem por homologia descrita por Gibas e Jambeck (2001)

e por threading, descrito por Panchenko et al. (2000). A homologia baseia-se na

42

localização de estruturas 3D existentes que serão os moldes. Para isso devem apresentar

pelo menos 25% de similaridade com a estrutura problema (SANTOS-FILHO,

ALENCASTRO, 2003). Para o threading a similaridade pode ser menor e pode haver

diferenças estruturais e no tamanho da seqüência. Uma outra ferramenta para a predição

de estruturas é o método ab initio que constrói o modelo sem informação prévia,

procurando encontrar uma região de mínimo de energia potencial de superfície através da

exploração de várias conformações protéicas possíveis de existir.

Embora existam três distintas metodologias disponíveis para a geração de

estruturas 3D de proteínas, a confiabilidade dos métodos ab initio e threading é muito

pequena para problemas que requerem boa qualidade de informação estrutural como, por

exemplo, o design de fármacos baseado na estrutura do alvo. A modelagem por

homologia é mais bem sucedida em relação às demais (HÖLTJE et al., 2001)

43

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MELHOR CONDIÇÃO DE EXTRAÇÃO DA ENZIMA A PARTIR DOS BASIDIOMAS

DO FUNGO M. PERNICIOSA

Para avaliar a melhor condição de extração da enzima, foram testadas quatro

diferentes condições experimentais, utilizando-se tampão fosfato de sódio como tampão

de extração (Tabela 01). Aos basidiomas foram adicionados tampão extrator na razão de

1:4 (g de biomassa/mL de Tampão Fosfato de Sódio (TFS) 50 mM, e homogeneizado

lentamente sob controle de temperatura (próximo a 5°C) durante 15 min., sendo

posteriormente filtrado em duas camadas de gaze e centrifugado a 10.000 g x 10 min. a 4

˚C em centrífuga 5804 R (Eppendorff®). Foi definido como o tampão extrator aquele que

apresentou melhor poder de rompimento de parede celular e ou maior atividade

enzimática.

Tabela 01 : Suplementações do Tampão Fosfato de Sódio (TFS), 50 mM, pH 7,0, para obtenção do melhor método de extração.

Tampão utilizado (volume final - 50 mL) Suplemento

Fosfato de Sódio, 50 mM, pH 7,0 -

Fosfato de Sódio, 50 mM, pH 7,0 Lisozima 100 mM

Fosfato de Sódio, 50 mM, pH 7,0 NaCl 2 M

Fosfato de Sódio, 50 mM, pH 7,0 Lisozima 100 mM + NaCl 2 M

Fonte: Dados experimentais

44

4. 2 OBTENÇÃO E PURIFICAÇÃO DA QUITINASE NATIVA

Aos basidiomas foram adicionados tampão extrator na razão de 1:4 (g de

biomassa/mL de Tampão Fosfato de Sódio (TFS) 50 mM, pH 7,0) na presença de NaCl

1M, uma vez que a concentração a 2 M de NaCl, apesar de obter boas condições de

extração, dificultou o processo de purificação das amostras. A mistura foi homogeneizada

lentamente sob controle de temperatura (próximo a 5°C) durante 15 min., sendo

posteriormente filtrada em duas camadas de gaze. O filtrado foi centrifugado a 10.000 g x

10 min a 4 ˚C em centrífuga 5804 R (Eppendorff®).

O sobrenadante foi então levado a 70% de saturação, segundo o nomograma de

Dixon e Webb (1979), com sulfato de amônio na forma cristalina, devidamente triturado,

permanecendo em repouso durante 60 min. a 4 ºC. Após este tempo a solução foi

novamente centrifugada a 10.000 g x 10 min a 4 ˚C em centrífuga 5804 R (Eppendorff®),

sendo o sobrenadante descartado e o precipitado, contendo a enzima, ressuspenso com o

tampão (TFS 50 mM, pH 7,0) (Figura 09).

A solução enzimática (1 mL), após dessalinação em Sephadex G-25, foi purificada

através de cromatografia de permeação em gel em coluna Sephacryl – S100 (1,1 x 20 cm)

utilizando-se o sistema Akta prime (Amersham Bioscience®). As frações obtidas (2,0 mL)

foram eluídas na presença de TFS 50 mM (pH 7,0) e de NaCl 0,01 M. As frações (1,5 mL)

que apresentaram maior atividade específica foram então recromatografadas em coluna

Sephacryl S-100, com o mesmo tampão de eluição.

45

4.3 DETERMINAÇÃO DA UNIDADE DE ATIVIDADE (UA) DA ENZIMA QUITINASE DE M.

PERNICIOSA

A atividade enzimática da quitinase foi realizada segundo Wang et al. (2002). Cada

triplicata continha alíquotas de 100 µL de solução contendo a enzima que foi incubada em

200 µL de TFS 50 mM (pH 7,0) e quitina ultrapura, Sigma®, (1% p/v) em 50 ºC por 30min.

aa quantidade de açúcar redutor (N-acetilglicosamina) produzida no sobrenadante foi

determinada utilizando 300 µL de ácido dinitrosalicílico (DNS), Sigma®.

Esta solução foi aquecida a 100 ºC por 5 min e posteriormente resfriada em banho

de gelo. A estas amostras foram adicionados 3 mL de água destilada e deionizada. A

absorbância foi medida em 540 nm em espectrofotômetro UV/VIS (Varian, Cary 50 Probe,

Amersham Bioscience®) e a quantidade de açúcar redutor produzida foi determinada

utilizando uma curva de calibração com N-acetilglicosamina pura (Sigma®).

Uma unidade de atividade de quitinase foi definida como a quantidade de enzima

necessária para catalisar a formação de um µmol de N-acetilglicosamina por minuto,

sendo todas as análises cinéticas realizadas em triplicata. Foram considerados os

resultados que diferiam entre si menos que 5%.

A Unidade de Atividade da quitinase foi calculada pela razão:

Sendo: UAChit = unidade de atividade da quitinase; α = coeficiente angular determinado a

partir da média do resultado da equação quadrada do gráfico segundo uma curva padrão

de N-acetilglicosamina; MM = massa molar da quitina ultrapura (Sigma®); v = volume, em

UAChit = ([GlcNac mg.mL -1] x 103 / MM) 106 / v / t)

46

mililitros, da amostra enzimática utilizada no ensaio; t = tempo da reação enzimática em

minutos.

4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA (AE) E CONTEÚDO PROTÉICO

TOTAL

A proteína total foi determinada pelo método de Bradford (1976): 50 µL de solução

contendo a enzima foram incubadas em 2,5 mL de reagente de Bradford por 5 min em

temperatura ambiente. As amostras foram submetidas à absorbância de 595 nm em

espectrofotômetro UV/VIS (Varian, Cary 50 Probe, Amersham Bioscience®). A quantidade

de proteína, em mg, foi determinada utilizando-se uma curva padrão com albumina de

soro bovina.

A atividade específica da quitinase foi então calculada pela razão:

Sendo:

AE = µmol de N-acetilglicosamina liberado por min/mg de proteína

4.5 CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA

4.5.1 Otimização dos valores de pH ótimo e temperatura ótima das enzimas através da

metodologia de superfície de resposta

AE = UAChit / mg proteína

47

A interação dos efeitos do pH (5,0; 5,6; 7,0; 8,4; e 9,0) e da temperatura (30; 38,7;

60; 81,3 e 90 oC) sobre a atividade da enzima foi obtida através de 11 ensaios de

atividade que foram realizados em temperaturas e pHs diferentes como segue a tabela 02.

Esses ensaios foram desenhados segundo o software Statistica 6.0:

Sendo:

- α e + α correspondem aos valores -1,41 e +1,41, respectivamente, determinados a partir

do número de variantes (T ºC e pH); -1 e +1 correspondem aos valores máximos e

mínimos de T ºC e pH empregados para atividade enzimática; 0 corresponde ao valor de T

ºC ou pH descrito como valores ótimos

Para cada ensaio foram utilizados três repetições: em cada tubo foram adicionados

50 µL de amostra enzimática, 200 µL de TFS 0,2 M no pH determinado por cada ensaio e

1% de quitina ultrapura, Sigma®, (p/v). Esta solução foi aquecida em temperaturas

indicadas na Tabela 02 por 30 min e a quantificação da GlcNac liberada neste ensaio foi

determinada através do ensaio de atividade enzimática utilizando DNS. É importante

salientar que foram considerados os resultados que diferiam entre si menos que 5%. Os

dados experimentais foram plotados e ajustados em modelos e a significância estatística

de cada um dos termos foi avaliada através de análise de variância (ANOVA) feito pelo

software Statistica 6.0.

-α -1 0 +1 + α

48

Tabela 02: Tabela de ensaios sem codificação utilizada para a interação entre pH e temperatura.

Ensaio pH Temperatura (ºC)

1 5,6 38,7

2 5,6 81,3

3 8,4 38,7

4 8,4 81,3

5 5,0 60

6 9,0 60

7 7,0 30

8 7,0 90

9 7,0 60

10 7,0 60

11 7,0 60

Fonte: Dados experimentais

4.6 ESTUDO DA TERMOESTABILIDADE DA QUITINASE

Foi analisada a estabilidade térmica da quitinase, determinando-se a atividade em

80 e 90 ºC após diferentes tempos de estocagem (10, 20, 30, 40, 50 e 60 min.).

Para a temperatura de 80 ºC foram utilizados seis tubos de ensaio contendo 200 µL

de amostras enzimáticas de cada fração obtida, ChitMp I, ChitMp II, ChitMp III e ChitMp

IV. Os tubos contendo as amostras foram aquecidos a 80ºC por 10, 20, 30, 40, 50 e 60

min. Após o aquecimento a 80ºC, as amostras foram resfriadas em banho de gelo e 50 µL

de amostra de cada tubo foram transferidos para outro tubo de ensaio, em triplicata.

Foram adicionados em cada tubo 200 µL de TFS 50 mM (pH 7,0) e 1% de quitina

ultrapura, Sigma®, (p/v) e posteriormente aquecidos a 50ºC por 30min. A atividade residual

foi calculada em porcentagem a partir da amostra controle (amostra enzimática sem

aquecimento a 80 e 90 ºC). Para a temperatura de 90˚C foi realizado o mesmo

49

procedimento, sendo que os tempos de estocagem da amostra foram também realizados

em 2, 4, 6, 8, 10 e 12 min.

Figura 09 : Esquema das etapas de obtenção de quitinases purificadas de M. perniciosa.

Obtenção do melhor método de extração

Basidiomas de M. perniciosa

Filtração em gaze

Ressuspensão com Tampão

Fosfato de Sódio 50mM

Sobrenadante Precipitado

Descarte

Adição de TFS 50mM, pH 7,0 suplementado

com NaCl (2 M), Lisozima (100 mM),

Lisozima (100 mM) + NaCl (2M) ou apenas TFS (50mM, pH 7,0)

Extração Adição de Tampão Fosfato de Sódio 50mM,

pH 7,0, NaCl 1 M

Filtrado Precipitado

Centrifugação 10.000 g x10 min

Descarte

Centrifugação 10.000 g x 10min

Repouso (1h-4ºC)

Adição de (NH4)2SO4 (70%)

Purificação em coluna Sephacryl

S-100 (1,1 x 20 cm)

Descarte

Sobrenadante Precipitado

Precipitação

Ensaios de Atividade

Dosagem Protéica

Análises cinéticas

50

4.7 BIOLOGIA COMPUTACIONAL

4.7.1 Determinação da estrutura 3D

A predição da estrutura 3D da quitinase de M. perniciosa foi realizada por

modelagem comparativa segundo Goldsmith-Fischman, Honig (2003) e Santos-Filho,

Alencastro (2003) utilizando métodos computacionais disponíveis no Deep PDB Viewer

(3.7) como ferramentas. Este programa permite a submissão de uma seqüência problema

alinhada a uma ou mais estruturas 3D que servem de molde ao Swiss Institute of

Bioinformatics, que é um servidor de modelagem por homologia. As respostas retornam

por processos automatizados. Outra metodologia empregada para obter um modelo foi o

threading (PACHENKO et al., 2000), feito pelo Modeller, disponível no servidor Max-

Planck Institute.

4.8.2 Identificação e alinhamento seqüencial das proteínas molde

Os moldes foram selecionados por BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),

utilizando a base de dados do Protein Data Bank (PDB). Foram selecionadas estruturas de

proteínas conhecidas como moldes, que apresentaram grau de homologia igual ou

superior a 49%, sendo que o mínimo recomendado é de 25% (GOLDSMITH-FISCHMAN,

HONIG, 2003). Os moldes e as sequências alvo foram alinhadas pelas ferramentas

disponíveis no Deep PDB Viewer (v3.7) e, em seguida, foram submetidos ao Swiss

Institute of Bioinformatics (SIB).

4.8.3 Construção e refinamento do modelo

51

O modelo 3D da proteína-problema foi construído através da metodologia de corpos

rígidos (SANTOS-FILHO, ALENCASTRO, 2003). Para o refinamento utilizou-se os

cálculos realizados pelo Amber 8.0 (CASE et al., 2004; PEARLMAN et al., 1995),

utilizando a estação de trabalho RedWood, presente no Mississipi Center for

Supercomputing Research (MCSR) da University of Mississipi via acesso remoto. A

proteína foi previamente preparada pelo programa tLEaP, que gerou uma proteína com

carga neutra (CASE et al., 2004). Para o refinamento do modelo foram feitas minimizações

por 600 ciclos através dos algorítmos Steepest Descent e, posteriormente, Gradiente

Conjugado (HÖLTJE et al., 2003). A seguir, a estrutura construída foi submetida às

simulações de dinâmica molecular, por 300, 1000, e 3000 picossegundos (ps) a 300 Kelvin

(K).

4.8.4 Validação

Os modelos foram validados através dos programas PROCHECK 3.0 e ANOLEA

(Atomic Non-Local Environment Assessment), os quais avaliam a qualidade da

esteroquiímica da cadeia principal e a energia de interação de cada átomo da cadeia

lateral, respectivamente. O PROCHEK gera, sobretudo, o gráfico de Ramachandran, além

dos gráficos Ch1 e Ch2 (os quais analisam o ângulo de torção da molécula), enquanto que

o ANOLEA calcula o somatório da energia de interação dos átomos. As etapas de

construção da estrutura 3D da quitinase estão esquematizadas na Figua 10.

52

Figura 10: Esquema das etapas de construção da estrutura 3D da quitinase de M. perniciosa.

Estrutura Primária

Identificação dos moldesHomologia

Swiss Model

Threading

Modeller

Obtenção do modelo inicial

Neutralização da molécula

Refinamento

Dinâmica molecular

Validação Modelo Final

Obtenção do modelo inicial

Amber 8.0

Steepest Descent

Gradiente Conjugado

10 íons Na+ (tLeap)

300 e 600 ciclos

300, 1000 e 3000 ps

53

5 RESULTADOS E DISCUSSÂO

5.1 CONDIÇÕES DE EXTRAÇÃO DA ENZIMA A PARTIR DOS BASIDIOMAS DO

FUNGO M. PERNICIOSA

As melhores condições de extração da enzima a partir dos basidiomas do fungo M.

perniciosa foram na presença de NaCl 2 M (Tabela 03). A atividade específica da enzima

nesta solução foi de 185,37 (UA/mg de proteína), sendo a maior atividade específica

encontrada em relação às outras soluções de extração.

A amostra extraída a partir da solução contendo lisozima e NaCl 2 M (Tabela 03)

também obteve índices altos de atividade específica (175,42 UA/mg de proteína), mas a

presença de lisozima na solução de extração se torna inconveniente na medida em que a

mesma terá de ser separada da enzima quitinase no momento da purificação em coluna

Sephadex G-100.

Tabela 03: Soluções utilizadas para a obtenção do extrato celular bruto (ECB) de basidiomas de M. perniciosa

Condições de Extração UA (mmoles/min)

Proteína (mg/mL)

Atividade Específica

Tampão fosfato 62,91 0,45 139,8

Tampão fosfato + NaCl 2 M 70,44 0,38 185,37

Tampão fosfato + lisozima 49,29 0,33 151,21

Tampão fosfato + NaCl 2 M + lisozima 57,89 0,33 175,42

Fonte: Resultados experimentais realizados com base no Método de Tukey (α = 0,05 ou 5% de

probabilidade).

5.2 PURIFICAÇÃO DA QUITINASE NATIVA

54

Diversos métodos cromatográficos já foram aplicados para a purificação de

quitinases de muitos microrganismos. Em Moniliophthora pernciosa o sistema

cromatográfico utilizado foi o de permeação em gel empregando-se coluna Sephacryl S-

100, que apresentou bons resultados no processo de purificação quando as amostras

enzimáticas foram recromatografadas nas mesmas condições da primeira passagem pela

coluna. Na primeira passagem pela coluna foram escolhidas as amostras entre as frações

15 a 38 para análise de ensaio de atividade e quantificação protéica. Esse intervalo de

frações (2,0 mL cada fração) foi escolhido devido ao aumento de absorbância a 280nm. Os

resultados do ensaio de atividade e quantificação protéica mostraram atividades

específicas elevadas em quatro intervalos (Figura 11, frações 15-21, 22-25, 28-31 e 33-35)

os quais foram recromatografados em frações de 1,5 mL cada.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58

Frações (1,5 mL)

A 2

80 n

m

0

50

100

150

200

250

300

350

AE

das

qui

tinas

es (

UA

/mg

de

prot

eína

)

A 280 nm

AE das quitinases (UA/mgde proteína)

Figura 11: Cromatografia de permeação em gel da quitinase utilizando coluna Sephacryl S-100 eluídas com Tampão Fosfato de Sódio 50 nM, pH 7,0 e suas respectivas atividades específicas.

55

Nessa condição foi possível obter um pico cromatográfico para cada amostra

recromatografada, como podem ser visualizados nas figuras 12 a 15. Nos dois processos

cromatográficos as enzimas foram eluídas em TFS 50 mM, pH 7,0 e os picos foram

selecionados para o ensaio de atividade após leitura em espectrofotômetro a 280 nm.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57

Frações (1,5 mL)

Ab

sorb

ânci

a (2

80 n

m)

0

100

200

300

400

500

600

700

AE

de

Ch

itMp

I (U

A/m

g

de

pro

teín

a)

A 280 nm

AE de ChitMp I (UA/mg deproteína)

Figura 12 : Cromatografia de permeação em gel da quitinase 1 (ChitMp I) em coluna de Sephacryl S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57

Frações (1,5 mL)

Abs

orbâ

ncia

(280

nm)

0

100

200

300

400

500

600

700

AE

de

Chi

tMp

II (U

A/m

g de

pr

oteí

na)

Absorbância (280nm)

AE de ChitMp II (UA/mg deproteína)

Figura 13 : Cromatografia de permeação em gel da quitinase 2 (ChitMp II) em coluna de Sephacryl S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0.

56

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57

Frações (1,5 mL)

Abs

orb

ânci

a (2

80 n

m)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

AE

de

Ch

itMp

III (

UA

/mg

de

prot

eína

)

A 280 nm

AE de ChitMp I (UA/mg deproteína)

Figura 14 : Cromatografia de permeação em gel da quitinase 3 (ChitMp III) em coluna de Sephacryl S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57

Frações (1,5 mL)

Abs

orbâ

ncia

(28

0nm

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

AE

de

Chi

tMp

IV (

UA

/mg

de p

rote

ína)

Absorbância (280nm)

Ae de ChitMp IV (UA/mg deproteína)

Figura 15 : Cromatografia de permeação em gel quitinase 4 (ChitMp IV) em coluna de Sephacrey S-100, utilizando-se tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7,0,

57

A alteração dos volumes das frações eluídas é um dos primeiros procedimentos

padrão quando o método cromatográfico aplicado ainda não é suficiente para a purificação

da amostra enzimática (PROTEIN, 1999). Em literatura não houve registro de alterações

dos volumes das frações eluídas, pois as etapas aplicadas para a purificação de

quitinases consistiam de mais de um método cromatográfico, por exemplo, purificação de

quitinases por cromatografia de troca iônica com posterior cromatografia de interação

hidrofóbica e filtração em gel (DUO-CHUAN et al., 2005); cromatografia de afinidade

(coluna DEAE-Sepharose – 1 cm x 20 cm, Pharmacia, Suécia) e posterior cromatografia

de troca iônica (coluna Phenyl-Sepharose – 1cm x 20 cm) (TAKAYA et al., 1998a);

cromatografia de afinidade (coluna com quitina regenerada – 1,6 cm x 7 cm) e de troca

iônica (coluna DEAE-Sephadex A50 – 1 cm x 10 cm, Pharmacia) (SAKURADA et al.,

1998); cromatografia de troca iônica (coluna DEAE-Sephadex – 1,5 cm x 12 cm) e

cromatografia de filtração em gel (coluna Sephadex G-200, 2,2 cm x 90 cm) para

determinar a massa molecular da quitinase estudada (DAHIYA et al., 2005)

De La Cruz et al. (1992) empregaram a cromatografia de filtração em gel (coluna

Sephacryl S-200 RH – 1,6 cm x 40 cm) para determinar a massa molar das quitinases de

Trichoderma harzianum. Neste estudo De La Cruz et al. (1992) purificaram as três

quitinases deste fungo utilizando precipitação com sulfato de amônio (80%), adsorção das

frações contendo as enzimas com quitina coloidal (digestão da quitina) e cromatofocus.

Cromatografia de filtração em gel (coluna Sepahcryl S-300 – dimensão na

especificada, Pharmacia LKB Biotechnology® Uppsala Sweden) também foi utilizada por

Lorito et al. (1993) para purificar uma quitinase de T. harzianum.

Scott et al. (1998) utilizou somente a cromatografia de afinidade para a purificação

de quitinase de Aspergillus fumigatus, sendo este método cromatográfico empregado duas

58

vezes para a obtenção de uma enzima com alta pureza. Neste trabalho, a qualidade do

procedimento de purificação por cromatografia de filtração em gel usando uma coluna

Sephacryl S-100 (1,1 x 20 cm, Amersham Bioscience®) pode ser considerada alta.

5.3 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE TOTAL (U), ATIVIDADE ESPECÍFICA (AE) E

CONTEÚDO PROTÉICO TOTAL

Após a leitura em espectrofotômetro a 280 nm e seleção das frações, foram

realizados os ensaios de atividade, a dosagem protéica e calculadas as atividades

específicas das quatro frações contendo as quitinases, assim como o fator de cada etapa

de purificação (Tabela 04).

As amostras selecionadas após recromatografia denominadas de ChitMp I2, ChitM

II2, ChitMp III2 e ChitMp IV2 apresentaram alta atividade específica para as enzimas

quitinases ao serem comparadas com as amostras da primeira passagem pela coluna

(Tabela 04) e com Tsujibu et al. (1993), os quais obtiveram bons resultados com coluna de

permeação em gel, apesar de utilizar, posteriormente, outros métodos cromatográficos.

Dahyia et al. (2005) também obtiveram bons resultados utilizando coluna de permeação

em gel após precipitação com sulfato de amônio (35 a 70%).

As análises referentes aos fatores de purificação de cada enzima indicam que a

coluna utilizada para a purificação das amostras foi capaz de refletir os resultados

esperados, tornando a enzima mais pura nas amostras recromatografadas. O substancial

aumento na atividade enzimática especifica em todas as amostras, principalmente, em

ChitMp III2 (3.087,0030 UA/mg de proteína) revela uma purificação precisa, sobretudo,

quando se analisa a quantidade de proteína na amostra (0,0001 mg/mL).

59

Tabela 04: Esquema de purificação da quitinase de M. perniciosa em coluna de permeação em gel.

1 Primeira passagem das amostras em coluna Sephacryl S-100 (Figura 10);

2 Recromatografia das amostras em coluna Sephacryl S-100 (Figuras 11 a 14).

Fonte: Resultados experimentais.

A existência de um sistema quitinolítico composto por quatro formas isoméricas de

quitinases em M. perniciosa, possivelmente é atribuída à função patogênica do fungo ao

infectar o Theobroma cacao. Estes resultados corroboram os encontrados por Lopes

(2005), que detectou quatro genes de quitinase, das classes I, III e V, além de uma

hexosaminidase, para M. perniciosa, presentes na fase saprofítica do fungo.

Estudos desenvolvidos por Miyashita et al. (1991) identificaram um sistema

quitinolítico composto por quatro quitinases em Streptomyces lividans e Romaguera et al.

(1992), estudando a espécie Streptomyces olivaceoviridis, encontraram um sistema

quitinolítico similar composto por cinco enzimas. De La Cruz et al. (1992) reconheceram

Etapas de Purificação Proteína (mg/mL)

Atividade Total (UA)

Atividade Específica (UA/mg

de proteína) Fator de

Purificação

Recuperação (%)

Extrato Bruto1 0,0241 0,8691 36,0631 1,0000 100

Extrato Bruto2 0,0241 0,6082 25,2387 1,0000 100

Extrato Bruto com (NH4)2SO4 0,0030 0,9137 296,0903 8,2103 195,1317

Sephacryl S-100 em ChitMp I1 0,0023 0,4247 144,3571 4,0030 48,8700

Sephacryl S-100 em ChitMp I2 0,0010 0,0926 624,4408 24,7414 15,2252

Sephacryl S-100 em ChitMp II1 0,0024 0,8920 360,0422 9,9836 102,0100

Sephacryl S-100 em ChitMp II2 0,0002 0,1772 618,0090 24,4865 29,1351

Sephacryl S-100 em ChitMp III1 0,0011 0,8807 777,6737 21,5642 101,0000

Sephacryl S-100 em ChitMp III2 0,0001 0,3969 3.087,0030 122,3122 65,2581

Sephacryl S-100 em ChitMp IV1 0,0031 0,7802 248,4518 6,8899 89,7710

Sephacryl S-100 em ChitMp IV2 0,0003 0,0948 304,5245 12,0657 15,5869

60

três quitinases ao estudar o fungo Trichoderma harzianum agindo diferentemente no

processo de degradação da parede celular, crescimento e autólise de hifas, germinação e

patogenicidade.

5.4 CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA

A partir da construção dos gráficos dos ensaios de temperatura e pH ótimos das

frações contendo as quitinases pelo software Statistica 6.0, podem-se analisar as

diferenças cinéticas existentes entre cada enzima. O efeito do pH na atividade catalítica da

enzima ChitMp I foi obtido. Os dados indicam boa atividade entre o pH 7,0 e 8,3, como

mostram as figuras 16 e 17. A atividade enzimática (3,23 UA/mg de proteína) da quitinase

também foi ótima em temperaturas entre 44 e 73 ºC. As significâncias dos dados obtidos

estão anexados no Apêndice B.

.

0,323 0,647 0,970 1,294 1,617 1,941 2,264 2,588 2,911 3,235 above

Figura 16: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp I de M. perniciosa (Tabela 01)

61

3D Contour Plot (QUIT1 3v*11c)

2 0 -2 -4 -6

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5

pH

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tem

p°C

Figura 17: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp I. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (44 a 73 ºC) e pH ótimo (7,0 a 8,3) da enzima.

Para ChitMp II, os dados indicam que ChitMp I e ChitMp II possuem as mesmas

características cinéticas: atividade entre o pH 7,0 e 8,4 (Figura 17 e 18) e atividade

enzimática (8,84 UA/mg de proteína) ótimas em temperaturas entre 45 e 73 ºC (Figuras

16 a 19).

Em relação aos dados obtidos para ChitMp III, a figura 20 indica que a atividade

catalítica específica máxima da enzima foi de 70,56 UA/mg de proteína. A atividade foi

considerada ótima entre as temperaturas de 54 e 67 ºC e na faixa de pH 7,3, a 7,8 (Figura

21).

62

0,884 1,768 2,652 3,536 4,420 5,305 6,189 7,073 7,957 8,841 above

Figura 18: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp II de M. perniciosa (Tabela 01).

3D Contour Plot (QUIT1 3v*11c)

2 0 -2 -4 -6

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5

pH

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tem

p°C

Figura 19: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp II. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (45 a 73 ºC) e pH ótimo (7,0 a 8,3) da enzima.

63

7,056 14,112 21,168 28,224 35,280 42,336 49,392 56,448 63,504 70,560 above

Figura 20: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp III de M. perniciosa (Tabela 01).

3D Contour Plot (QUIT3 3v*11c)

60 20 -20 -60 -100 -140

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5

pH

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tem

p°C

Figura 21: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp III. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (54 a 67 ºC) e pH ótimo (7,3 a 7,8) da enzima.

64

ChitMp IV obteve um resultado diferente em relação as demais enzimas

quitinolíticas. A atividade específica da enzima é bem alta (158,28 UA/mg de proteína) nos

valores de pH e temperatura apresentados (Figura 22). A faixa de temperatura ótima da

enzima está na faixa de 58 a 70 ºC e pH ótimo na faixa de 7,3 a 8,2 conforme é

apresentado na figura 23.

A partir dos estudos cinéticos do sistema quitinolítico de M. perniciosa pode-se

avaliar as similaridades e discrepâncias entre ChitMp I, II, III e IV.

ChitMp I a IV possuem semelhanças em seus modos de ação, indicando um

sinergismo entre essas enzimas. As diferenças encontradas entre as enzimas foram

decorrentes às diferenças de grau de pureza das amostras, comum em amostras

biológicas.

15,829 31,658 47,487 63,316 79,144 94,973 110,802 126,631 142,460 158,289 above

Figura 22: Temperatura ótima e pH ótimo de ChitMp IV de M. perniciosa (Tabela 01).

65

3D Contour Plot (QUIT4 3v*11c)

150 50 -50 -150 -250

5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5

pH

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tem

p°C

Figura 23: Efeitos da temperatura e do pH ótimo de ChitMp IV. O círculo central, em vinho, indica a faixa de temperatura ótima (58 a 70 ºC) e pH ótimo (7,4 a 8,2) da enzima.

Miyashita et al. (1991) analisaram as diferenças entre as enzimas que compõem o

sistema quitinolítico de S. lividans e concluíram que as quitinases C e D possuíam

semelhanças na estrutura gênica e no modo de ação enzimática, enquanto que as

quitinases A, B e C apresentam discrepâncias consideráveis na estrutura gênica e no

modo de ação.

Felse e Panda (1999b) ao revisarem algumas clonagens de genes de quitinases em

fungos filamentosos e leveduras relatam a existência de três genes de quitinases para T.

harzianum originando três enzimas com características cinéticas diferentes.

Duo-Chuan et al. (2005) obtiveram características similares, tanto para a

temperatura, ativas entre 30 e 40 ºC, quanto para o pH, de 4,0 a 8,0, entre as duas

enzimas quitinolíticas do fungo Talaromyces flavus (Klöcker) Stolk & Samson..

66

A temperatura ótima das enzimas quitinolíticas de muitos fungos é em torno de 20 a

40 ºC, exceto para alguns fungos termofílicos, que possuem atividade máxima em torno

de 55 a 70 ºC, como é o caso de Thermomyces lanuginosus Tsikl. (GUO et al., 2005) e

Talaromyces emersonii Stolk (McCORMACK et al., 1991). Uma quitinase de A. fumigatus

YJ-407 possui uma temperatura ótima de 60 ºC em pH 5,0 (XIA, et al., 2001).

Liu et al. (2002) identificaram a atividade de secreção de quitinases em pH 7,0 a

10,0 em 17 linhagens de Bacillus thurigiensis. Todas as quitinases encontradas possuíam

ação sinérgica na patogenicidade de larvas.

5.5 ESTUDO DA TERMOESTABILIDADE DA QUITINASE

O efeito da temperatura sobre a estabilidade as enzima foi analisado com base nos

resultados obtidos. A ChitMp I apresentou estabilidade térmica nas temperaturas de 80 e

90 ºC, perdendo 10% de atividade em 20 min de ensaio, na temperatura de 80 ºC, e 80%

de atividade enzimática em 30 min de incubação. A enzima foi totalmente inativada em 60

min de incubação (Figura 24).

Na temperatura de 90 ºC a enzima perdeu 100% de sua atividade enzimática

exatamente nos dez primeiros minutos de incubação (Figura 24). Para todas as amostras

na temperatura de 90 C foi realizada também incubações a cada dois minutos em um

tempo total de doze minutos de incubação. Em todas as amostras, exceto para ChitMp III,

ocorreram perda de 100% nos primeiros dois minutos de incubação.

Resultados diferentes são observados em ChitMp II (Figura 25) a qual perde 80%

de sua atividade enzimática em 20 min de incubação e mais de 95% em 40 min de ensaio.

67

Na temperatura de 90 ºC a enzima perde completamente sua atividade catalítica logo nos

10 primeiros minutos de incubação.

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%) 80 ºC

90 ºC

Figura 24: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp I a 80 ºC e a 90 ºC

Em relação à ChitMp III, a atividade residual da enzima é de 40% em 20 min de

incubação, sendo posteriormente inativada em 30 min de ensaio, conforme é demonstrado

na figura 26. A enzima perde sua atividade (em 100%) em 10 min de reação.

Características diferentes obteve-se para a ChitMp IV quando submetida aos

ensaios de termoestabilidade. A enzima possui uma atividade residual de

aproximadamente 10% entre 10 e 20 min, baixando-se para 5,81% entre 30 e 40 min de

incubação, sendo inativada em 50 min. Em 90 ºC perde mais de 95% de atividade

catalítica, tornando-se inativa somente com 40 min de incubação (Figura 27).

68

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%)

80 ºC

90 ºC

Figura 25: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp II, a 80 ºC e a 90 ºC.

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%) 80 ºC

90 ºC

Figura 26: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp III, a 80 ºC e a 90 ºC.

69

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

0 10 20 30 40 50 60 70

Tempo (min)

Ativ

idad

e R

esid

ual (

%) 80 ºC

90 ºC

Figura 27: Efeitos da temperatura na estabilidade catalítica de ChitMp IV, a 80 ºC e a 90 ºC

Wang et al. (2002) obtiveram perda maior que 90% da atividade da quitinase

quando esta foi submetida a 90 ºC e perda de 100% de atividade nos dois primeiros

minutos na temperatura de 100 ºC em Monascus purpureus.

Em Isaria japonica uma quitinase foi 100% estável em 50 ºC (KAWACHI et al.,

2001), 70 % de atividade em 55 ºC em Aspergillus fumigatus, (XIA et al., 2001) e inativada

a 60 ºC em Trichoderma harzianum (DE LA CRUZ et al., 1992).

5.6 OBTENÇÃO DO MODELO 3D DA QUITINASE DE M. PERNICIOSA

A seqüência da quitinase do fungo causador da vassoura-de-bruxa foi obtida

através da análise in silico de reads (Figura 28, Tabela 05) depositados no Projeto

Genoma do M. perniciosa e montagem de um contig, composto por 982 pb. Não foi

70

possível a obteção do gene completo, mas a sequência utilizada para a construção do

modelo 3D, composta por 564 bp e 188 aa (Figura 29), apresentou a região conservada

descrita em literatura como sendo a região catalíca da enzima (SYNSTAD et al., 2004;

CEDERKVIST et al., 2007). Esta região compreende os nucleotídeos 311 e 343 (Figura

29).

Figura 28: Reads retirados do banco de dados do Projeto Genoma de M. perniciosa alinhados pelo Seqman/Lasergene (BURLAND, 2000), com destaque para a região que compreende a região catalítica da quitinase. Em a é visualisada a seqüência consenso; b corresponde ao read CP02-S2-041-309-B06-EM.F; em c encontra-se o read CP02-S2-039-551-C11-UC.F e em d o read CP02-S3-033-414-B07-UC.F. As setas em verde se referem ao sentido direto e a seta em vermelho representa o sentido reverso. Em destaque está o nucleotídeo não identificado pelo programa.

A repetição de uma mesma seqüência nos três reads (Figura 28b, c e d) confirma

os dados apresentados e, em todos eles, nota-se a resolução dos picos cromatográficos.

A baixa resolução dos picos interfere na identificação dos nucleotídeos, sendo substituídos

por N, como demonstrado pelo read CP02-S3-033-414-B07-UC.F (Figura 28d) na posição

329. Nesta mesma posição, os reads b e c apresentam o nucleotídeo guanina com picos

de qualidade satisfatória.

a

b

c

d

71

Tabela 05: Reads retirados do banco de dados do Projeto Genoma de M. perniciosa para a formação do contig evidanciando os valores negativos de energia e suas respectivas fases de leitura.

Reads Valor-E em BLASTx com

Grifola umbellata Fase de leitura Nucleotídeos

CP02-S2-039-551-C11-UC.F 1e-64 -3/-2/-1 870

CP02-S2-041-309-B06-EM.F 2e-40 +2 853

CP02-S3-033-414-B07-UC.F 3e-52 +3 683 Fonte: Projeto Genoma de Moniliophthora perniciosa: <http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura/>

Esta seqüência foi alinhada a seqüências protéicas de alguns fungos

filogeneticamente relacionados ao M. perniciosa (LOPES, 2005) apresentando alta

identidade, principalmente, na região do sítio catalítico (Figura 30).

No programa Editseq, o fragmento da seqüência de quitinase modelada apresenta

massa molecular de 21,62 KDa, e ponto isoelétrico igual a 4,9, refletindo similaridade com

as quitinases de outros fungos (DUO-CHUAN, 2006) e plantas (WANG et al., 2002). O pI

encontrado foi idêntico aos encontrados nos fungos Verticillium lecanii (Zimm.) Viégas e

Piromyces communis J.J. Gold, I.B. Heath & Bauchop (WANG et al., 2002) e similar ao

referido por Haki e Rakshit (2003).

No fragmento modelado encontram-se os domínios conservados SXGG

(WATTANALAI, et al., 2004) e DXDXE (WATANABE, et al., 1992; SYNSTAD et al., 2004;

CEDERKVIST et al., 2007), esta última região é encontrada somente em quitinases da

Família 18 (OKAZAKI et al., 2004; CEDERKVIST et al., 2007). Em Nomuraea rileyi (Farl.)

Samson, esta seqüência corresponde a EDGIDIDWE (WATTANALAI, et al., 2004), em

Rhizopus oligosporus Saito, DGFDFDIE (TAKAYA et al., 1998b), em Trichoderma

harzianum LDGFDLDNE (HOELL et al., 2005) e em Moniliophthora perniciosa

72

LDGLDVDYEFP, sendo encontrados, adicionalmente, outros domínios conservados como

SIGG (resíduos 62 a 65). Em todos esses microrganismos o motif LXXLDXDXE é citado

como sendo o sítio catalítico desta enzima (LU et al., 2002).

DNA: TCGCCCTTTTCCTTTGCAAGCATTAATCCCGAAACGGGCGAGGTCCAGCTT +1: S P F S F A S I N P E T G E V Q L DNA: TCTGATAAATGGGCTGATCAAGAAATCCACTACGACGGTGATACATGGGAT +1: S D K W A D Q E I H Y D G D T W D DNA: GAAGAAGGAAATAACCTATACGGGAATTTGAAGGCTCTCTACAACTTGAAG +1: E E G N N L Y G N L K A L Y N L K DNA: AAGGAACATCGTCATTTGAAGGTTATGATCTCTATTGGTGGATGGTCATAT +1: K E H R H L K V M I S I G G W S Y DNA: TCCTCTTCCCTTCACCCTGTCGTTGTCTCTCCTGAGCGCAGGAGAAAGTTT +1: S S S L H P V V V S P E R R R K F DNA: GTGGAGAGCGCAGTGGCCCTATTGGAAGATTACGGTCTAGATGGCCTCGAT +1: V E S A V A L L E D Y G L D G L D DNA: GTCGACTATGAATTTCCTCAGGATGATGAACAGGCGTTGGGATATGTACAG +1: V D Y E F P Q D D E Q A L G Y V Q DNA: CTACTCAAAGAGCTCAGAGAGGCTTTGGACGAGCATGCGAGAACCAAGGAA +1: L L K E L R E A L D E H A R T K E DNA: ATCGACTATCGCTTTTTGCTCACGGTTGGTTTCCCTTCCCAAAGGTTAGTA +1: I D Y R F L L T V G F P S Q R L V DNA: TTTGGTTCGTCTCAATATCTTTACAGATCGCTGCACCGTGCGGTTCAGACA +1: F G S S Q Y L Y R S L H R A V Q T DNA: ATTATAATCGACTTCGTATCAGCGAGATGGATCAGTATCTCGATTTTTGGA +1: I I I D F V S A R W I S I S I F G DNA: ACA +1: T

Figura 29: Conversão de da seqüência nucleotídica de quitinase de M. perniciosa em seqüência de aminoácidos (aa) através da ferramenta Six Frame Translator of Sequence, obtido através do site <http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/cgi-bin/seq-util/sixframe.pl>. Em destaque estão os aa que compõem o sítio catalítico da enzima.

Estudos realizados por Lu et al. (2002) com quitinase de Manduca sexta revelam a

essencialidade dos resíduos Glu146 equivalente ao Glu106 na quitinase de M. perniciosa,

Asp144 e Asp142 (respectivamente, Asp104 e 102 em M. perniciosa) para a atividade

73

catalítica da enzima. Esses resultados sugerem que esses aminoácidos são essenciais no

mecanismo de hidrólise do substrato. Segundo Synstad et al. (2004) uma mutação em

Asp142 é altamente deletéria para a atividade catalítica da enzima, e de acordo com Lu et

al. (2002) uma mutação em Asp144 representa perda da atividade enzimática em 70%.

Os modelos da quitinase foram construídos por threading, através do programa

Modeller, utilizando-se quatro estruturas como moldes (Tabela 06), e por homologia

comparativa, utilizando-se o programa Deep View v3.7 (HUMPHREY et al., 1996) , tendo

os modelos PDB 1WNO (HU et al., 2005) e 2A3E (RAO et al., 2005) como moldes (Tabela

06), os quais foram obtidos do PDB (Protein Data Bank), com 49 e 50% de identidade,

respectivamente, com a seqüência problema. A similaridade dos dois moldes e a

seqüência foi de 72% (Figura 31).

Os resultados obtidos pela construção do modelo tridimensional, gerados pelo VMD

1.8.6 (HUMPHREY et al., 1996) revelam que o modelo molecular de quitinase possui 188

resíduos, 3023 átomos com 3051 ligações. Utilizando cutoff padrão de 3,2 Å foram

encontradas 03 pontes salinas (Asp31 - Lys45, Asp99 - Lys51 e Glu130 - Arg133). Dentre

os aminoácidos encontrados, 68 são hidrofóbicos, 47 são polares, 19 são básicos e 29

são ácidos.

O modelo inicial da quitinase apresentava resultados satisfatórios nas validações,

porém, algumas das simulações de refinamento e dinâmica molecular resultaram na

melhoria do modelo proposto, como pode ser observado na tabela 07, e na analise

comparativa dos gráficos de Ramachandran e das cadeias principal e lateral gerados pelo

Procheck 3.0.

74

Figura 30: Alinhamento das seqüências do produto gênico das quitinases de M. perniciosa, Grifola umbelata (AAO42981.1), Coprinopsis cinerea (EAU80760.1) e Aspergilus fumigatus (AAO61686.1) através do programa TCoffee 5.56, disponível no site <http://www.tcoffee.org/> (NOTREDAME et al., 2000). Destaque, em preto, para a região do sítio catalítico.

75

Tabela 06: Identificação dos moldes utilizados para a construção do modelo PDB da quitinase de M. perniciosa.

Os modelos da quitinase, construído por homologia e por threading, foram

neutralizados no Amber 8.0 (CASE et al., 2004) com 10 íons sódio, através da ferramenta

tLeap. Posteriormente, os modelos foram submetidos à refinamento por 300 e 600 ciclos

e, em seguida, foi feita uma simulação por dinâmica molecular (DM) em 300, 1000 e 3000

picossegundos.

Os resultados da validação demonstram não haver diferença significativa entre os

modelos da quitinase gerados por threading e por homologia. O modelo obtido por

homologia, submetido ao refinamento de 600 ciclos e denominado de hqmp2, foi o que

gerou os melhores resultados nas validações pelo Procheck (Figura 32, 33 e 34), com um

RMS de 0,48 Å com o molde 1WNO. Na figura 32a, gerado pelo Procheck, o gráfico de

Ramachandran apresenta 98,2% de resíduos em locais favoráveis (região vermelha do

gráfico). Neste gráfico, apenas os aminoácidos Ile137 e Ala178 encontram-se em regiões

desfavoráveis (região branca) e o aminoácido Tyr41 em uma região pouco favorável, o

Método de construção Molde Identidade

(%) Valor-E Estrutura

Homologia 2A3E

(RAO et al., 2005) 50 7e-42 Quitinase

Homologia 1WNO

(HU et al., 2005) 49 2e-41 Quitinase

Threading 1W9P

(RAO et al., 2005) 50 1e-41 Quitinase

Threading 1ITX

(MATSUMOTO et al. 1999) 33 5e-19

Glicosil

Hidrolase

Threading 1KFW

(AYATI et al. 2002) 27 5e-11 Quitinase

Threading 1LL7

(BORTONE et al. 2002) 47 2e-37 Quitinase

76

>pdb|1WNO|A Chain A, Crystal Structure Of A Native Chitinase From Aspergillus

Fumigatus Yj-407

Length=395

Score = 163 bits (413), Expect = 2e-41, Method: Composition-based stats. Identities = 73/147 (49%), Positives = 107/147 (72%), Gaps = 0/147 (0%)

Query 3 FSFASINPETGEVQLSDKWADQEIHYDGDTWDEEGNNLYGNLKALYNLKKEHRHLKVMIS 62

++FA++ PETGEV ++D WAD E HY GD+W + GNN+YG +K LY LKK++R+LKV++S

Sbjct 36 YAFANVRPETGEVYMTDSWADIEKHYPGDSWSDTGNNVYGCIKQLYLLKKQNRNLKVLLS 95

Query 63 IGGWSYSSSLHPVVVSPERRRKFVESAVALLEDYGLDGLDVDYEFPQDDEQALGYVQLLK 122

IGGW+YS + P + R+ F ++AV LL+D G DGLD+D+E+P++D+QA +V LL+

Sbjct 96 IGGWTYSPNFAPAASTDAGRKNFAKTAVKLLQDLGFDGLDIDWEYPENDQQANDFVLLLR 155

Query 123 ELREALDEHARTKEIDYRFLLTVGFPS 149

E+R ALD ++ FLLTV P+

Sbjct 156 EVRTALDSYSAANAGGQHFLLTVASPA 182

>pdb|2A3E|B Chain B, Crystal Structure Of Aspergillus Fumigatus Chitinase

B1 In Complex With Allosamidin

Length=433

Score = 165 bits (417), Expect = 7e-42, Method: Composition-based stats. Identities = 74/147 (50%), Positives = 107/147 (72%), Gaps = 0/147 (0%)

Query 3 FSFASINPETGEVQLSDKWADQEIHYDGDTWDEEGNNLYGNLKALYNLKKEHRHLKVMIS 62

++FA++ PETGEV ++D WAD E HY GD+W + GNN+YG +K LY LKK++R+LKV++S

Sbjct 74 YAFANVRPETGEVYMTDSWADIEKHYPGDSWSDTGNNVYGCIKQLYLLKKQNRNLKVLLS 133

Query 63 IGGWSYSSSLHPVVVSPERRRKFVESAVALLEDYGLDGLDVDYEFPQDDEQALGYVQLLK 122

IGGW+YS + P + R+ F ++AV LL+D G DGLD+D+E+P++D+QA +V LLK

Sbjct 134 IGGWTYSPNFAPAASTDAGRKNFAKTAVKLLQDLGFDGLDIDWEYPENDQQANDFVLLLK 193

Query 123 ELREALDEHARTKEIDYRFLLTVGFPS 149

E+R ALD ++ FLLTV P+

Sbjct 194 EVRTALDSYSAANAGGQHFLLTVASPA 220

Figura 31: Alinhamento da seqüência problema com os moldes 1WNO e 2A3E, utilizados para homologia, por PSI-BLAST.

77

Tabela 07: Sumário dos modelos gerados para a região do sítio catalítico da quitinase de M. perniciosa, destacando o resultado da validação representada pelo gráfico de Ramachandran realizada pelo Procheck 3.0

que não compromete a qualidade do modelo, pois os aminoácidos citados não participam

da região catalítica da enzima. Após refinamento em 600 ciclos o gráfico de

Ramachandran apresenta 99,4% de resíduos em locais favoráveis, tendo apenas o

aminoácido Ile137 localizado em uma região pouco favorável do gráfico.

Posição dos resíduos (%)

Modelo Metodologia aplicada Favorável Não

favorável

hqmp0 Modelo inicial gerado por homologia

Neutralizado 98,2 1,8

hqmp1 Modelo gerado por homologia

Otimização por 300 ciclos/300 K 98,5 1,5

hqmp2 Modelo gerado por homologia

Otimização por 600 ciclos/300 K 99,4 0,7

hqmp3 Modelo gerado por homologia

Dinâmica Molecular 300 ps/300 K 95,8 4,2

hqmp4 Modelo gerado por homologia

Dinâmica Molecular 1000 ps/300 K 89,3 10,7

hqmp5 Modelo gerado por homologia

Dinâmica Molecular 3000 ps/300 K 87,5 13,5

tqmp0 Modelo inicial gerado por threading

Neutralizado 97,6 2,4

tqmp1 Modelo gerado por threading

Otimização por 300 ciclos/300 K 98,1 1,9

tqmp2 Modelo gerado por threading

Otimização por 600 ciclos/300 K 98,0 2,0

tqmp3 Modelo gerado por threading

Dinâmica Molecular 300 ps/300 K 95,8 4,2

tqmp4 Modelo gerado por threading

Dinâmica Molecular 1000 ps/300 K 91,1 8,9

tqmp5 Modelo gerado por threading

Dinâmica Molecular 3000 ps/300 K 65,8 34,2

78

A melhoria na qualidade do modelo hqmp2 torna-se visível ao analisar a cadeia

principal (Figura 33) e, sobretudo, a cadeia lateral (Figura 34), em que todos os

parâmetros analisados pelo Procheck revelam uma melhor qualidade do modelo hqmp2

ao demonstrar a diminuição do desvio padrão em cada parâmetro. A análise de superfície

da força atômica (Atomic Mean Force Potential – AMPF), realizada pelo ANOLEA (Figura

35), também validou o modelo, apresentando uma AMPF, energia total mais negativa, de

-1021,890 E/kT, corroborando a validação realizada pelo Procheck. Os modelos grados

por DM de 300, 1000 e 3000 ps (Figura 36), ao serem validados pelo ANOLEA, não

apresentaram resultados satisfatórios, demonstrando uma energia positiva como

demonstrado nas figuras 36a, b, c, d, e e f. Por esses motivos o modelo hqmp2 tornou-se

o melhor modelo proposto para a quitinase de M. perniciosa (Figura 37).

O motivo LDGLDVDYEFP, respectivo a Leu98, Asp99, Gly100, Leu101, Asp102,

Val103, Asp104, Tyr105, Glu106, Phe107 e Pro108, descrito como sítio catalítico,

corresponde aos resíduos 98-108 (Figura 38b) que participam da formação de uma folha-β

(Figura 38a e b). A estrutura final do modelo possui sete α-hélices, sete folhas-β e

quatorze turns. As folhas-β antiparalelas podem ser compostas por várias cadeias que

podem se distribuir por várias partes da seqüência, podendo ser compostas por

aminoácidos hidrofílicos (Tyr107, Asp99, Asp102 e Asp104 e Glu106) ou hidrofóbicos

(Val103, Trp105 e Pro108) (HÖLTJE et al., 2003).

79

hqmp0 hqmp2

Modelo Favorável Desfavorável

hqmp0 98,2% 1,8%

hqmp2 99,4% 0,6%

Figura 32: Validação do modelo 3D da quitinase demonstrado pelo Gráfico de Ramachandran, que considera as regiões marcadas em vermelho

e amarelo como as mais favoráveis e as regiões em branco como desfavoráveis. Esta validação é satisfatória quando pelo menos 90% dos

resíduos são localizados em região favorável.

Psi

(G

rau)

Psi

(G

rau)

Phi (Grau) Phi (Grau)

80

Figura 33: Qualidade da cadeia principal dos modelos hqmp0 e hqmp2: A - avaliação do gráfico de Ramachandran; B - planaridade da ligação peptídica; C - interações desfavoráveis; D - distorção dos carbonos alfa; E - energia das ligações de hidrogênio.O eixo das abscissas está descrito em graus, e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

A B

C D

E

A B

C D

E

81

Figura 34: Desvio padrão para os ângulos diedros Chi1 para os modelos hqmp0 e hqmp2 da região conservada da quitinase: A: Conformação gauche menos; B: Conformação trans; C: Conformação gauche mais; D: Somatório de todos os desvios padrões para Chi1; E: Conformação trans para o ângulo torcional Chi2. O eixo das abscissas está descrito em graus e o das coordenadas está descrito em Å (Fonte: Procheck 3.0).

A B

C D

E

A B

C D

E

82

hqmp0

hqmp2

Figura 35: Representação gráfica da validação dos modelos do produto gênico da quitinase após a realização do refinamento em Amber. O valor de energia é dado em E/kT, onde k corresponde a constante de Boltzmann (0,582 Kcal/mol) e T corresponde a temperatura absoluta.

Ene

rgia

(E

/kT

) E

nerg

ia (

E/k

T)

Número de Resíduos

Número de Resíduos

83

Figura 36: Dinâmica Molecular da quitinase por threading (A – hqmp3, 300 ciclos, B – hqmp4, 1000 ciclos e C – hqmp5, 3000 ciclos) e por homologia comparativa (D – tqmp3, 300 ciclos, E – tqmp4, 1000 ciclos e F – tqmp5, 3000 ciclos), validados pelo ANOLEA.

C D

E F

A B

84

Figura 37: Modelo 3D da quitinase de M. perniciosa ( hqmp2), após refinamento em 600 ciclos.

85

B

Figura 38: A: modelo hqmp2 da quitinase de M. perniciosa destacando o sítio catalítico; B: Destaque para o motivo LDGLDVDYEFP, respectivo a Leu98, Asp99, Gly100, Leu101,Asp102, Val103, Asp104, Tyr105, Glu106, Phe107 e Pro108, descrito como sítio catalítico do modelo da quitinase de M. pernciosa.

A

86

6 CONCLUSÕES

Moniliophthora perniciosa possui um sistema quitinolítico composto por quatro

enzimas, das quais, duas possuem características cinéticas semelhantes. Todas as

quitinases encontradas em M. perniciosa demonstraram atividade específica elevada,

principalmente após a recromatografia das amostras, cujo fator de purificação chegou a

ser 122 vezes mais elevado quando comparado com o fator de purificação do extrato

bruto. Estes resultados demonstram que a coluna Sephacryl S-100, empregada para a

purificação das amostras, apesar de ser de baixo custo financeiro mostrou-se eficiente

no processo de purificação.

A partir dos dados gerados in vitro, todas as enzimas possuem atividade máxima

entre 50 e 70 °C, o que as tornam termoestáveis, já que as quitinases encontradas em

fungos e em bactérias termofílicos possuem atividade máxima também em

temperaturas entre 50 e 70 ºC. ChitMp I é a única enzima do sistema de quitinases de

M. perniciosa que possui atividade quitinolítica superior a 100% em 80 ºC nos 10 min

de reação, caindo essa porcentagem para 80% em 20 min. Todas as enzimas foram

consideradas termoestáveis por possuírem atividade quitinolítica máxima em

temperaturas maiores que 50 º C. A perda da atividade enzimática em 90 ºC é um fator

considerado comum dentre as quitinases, já que, atualmente, não há registro em

literatura de quitinases com atividade quitinolítica elevada em temperaturas igual ou

maiores que 90 ºC.

Em relação aos resultados encontrados em modelagem, os dados obtidos in

silico, no banco de dados do Projeto Genoma de Moniliophthora perniciosa, forneceram

87

uma região da seqüência nucleotídica da quitinase a qual está inserida todo o sítio

catalítico da enzima. Esta região compreende de 564 pb e 188 aminoácidos. Estes

resultados foram suficientes para gerar um modelo 3D da enzima com 72% de

similaridade com um modelo, o qual foi obtido a partir do programa Deep View v3.7,

obtendo um RMS de 0,48 Å.

A partir do modelo 3D da quitinase, da obtenção de toda a seqüência

nucleotídica através de técnicas de PCR, seqüenciamento e clonagem, a construção de

um inibidor específico a partir de docking da enzima é uma das perspectivas futuras da

continuação do trabalho.

88

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APÊNDICE A

1 – Curva padrão obtida com N-acetilglicosamina pel o método do DNS (MILLER, 1959), para determinação da atividade da q uitinase .

CERVA PADRÃO DE N -ACETILGLICOSAMINA

y = 0,8767x + 0,0058

R2 = 0,9978

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Concentração (mg/mL)

Abs

orbâ

ncia

(54

0nm

)

Concentração

(mg/mL) Absorbância 1 Absorbância 2 Absorbância 3

Média da

Absorbância (540nm)

0,5 0,0448 0,0433 0,0458 0,0446

1 0,0935 0,0954 0,0951 0,0947

1,5 0,1492 0,1419 0,1516 0,1476

2 0,1988 0,1943 0,1909 0,1947

3 0,2673 0,2619 0,2553 0,2615

4 0,3501 0,3387 0,3410 0,3433

5 0,4446 0,4475 0,4491 0,4471

6 0,5345 0,5374 0,5324 0,5348

CURVA PADRÃO DE N-ACETILGLICOSAMINA

99

2– Curva padrão obtida com albumina de soro bovino (BSA) usando o método de Bradfort (1976), para determinação da pro teína total .

Concentração

(mg/mL) Absorbância 1 Absorbância 2

Média da

Absorbância (540nm)

1 0,1310 0,1322 0,1266

2 0,3013 0,3025 0,3019

3 0,4591 0,4503 0,4547

4 0,6409 0,6343 0,6376

5 0,7652 0,6767 0,7209

6 0,8679 0,8465 0,8572

7 0,9379 0,9686 0,9532

8 1,1407 1,0478 1,0942

CURVA PADRÃO DE ALBUMINA DE SORO BOVINA

Abs

orbâ

ncia

(28

0nm

)

Concentração (mg/mL)

100

APÊNDICE B

- Cálculos estatísticos, ANOVA, para os ensaios de termoestabilidade

ChitMp I

Anova – R² = 0,9295

SQ GL MQ Fcalc Ftab

Regressão 18,2804 5 3,6560 13,19284 1% - 10,97

Resíduo 1,3865 5 0,2771 5% - 5,05

Falta de Ajuste 1,3859 3 10% - 3,45

Erro puro 0,0005 2

Total 19,6669 10

ChitMp II

Anova – R² = 0,83076

SQ GL MQ Fcalc Ftab

Regressão 105,2400 5 21,048 4,908 1% - 10,97

Resíduo 21,4405 5 4,2881 5% - 5,05

Falta de Ajuste 21,0224 3 10% - 3,45

Erro puro 0,4181 2

Total 126,6849 10

Quit fração 3

Anova – R² = 0,97109

SQ GL MQ Fcalc Ftab

Regressão 6968,359 5 1393,672 33,63 1% - 10,97

Resíduo 207,469 5 41,438 5% - 5,05

Falta de Ajuste 207,402 3 10% - 3,45

Erro puro 0,067 2

Total 10

101

Quit fração 4

Anova – R² = 0,77132

SQ GL MQ Fcalc Ftab

Regressão 27175,15 5 5435,03 3,3755 1% - 10,97

Resíduo 8056,69 5 1610,14 5% - 5,05

Falta de Ajuste 8050,35 3 10% - 3,45

Erro puro 6,34 2

Total 35231,84 10