21

4. DNA podporządkowany człowiekowi – manipulacje DNA

Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i translacji oraz rozwój

biochemii, genetyki i informatyki doprowadziły do wynalezienia metod

pozwalających na manipulowanie informacją zapisaną w DNA, czyli re-

kombinowanie DNA. Jest ono podstawą inżynierii genetycznej. Tworzenie

rekombinowanych cząsteczek DNA jest możliwe dzięki technikom pozwala-

jącym na wyodrębnienie i powielenie fragmentów DNA, a także odczytanie

zapisanej w nich informacji. Techniki te to przede wszystkim: rozcinanie

DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych, sekwencjonowanie DNA, che-

miczna synteza DNA, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).

Nożyczki i klej w rękach genetyków

Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje DNA i bardzo

precyzyjnie przecinają obie jego nici w określonym miejscu. Występują

u bakterii, które wykorzystują je do rozcinania obcych cząsteczek DNA.

Zostały odkryte w latach sześćdziesiątych XX wieku, a już kilka lat później

wprowadzono je do badań. Dotychczas scharakteryzowano ponad 3000

enzymów restrykcyjnych.

Enzymy restrykcyjne są niezastąpione przy sekwencjonowaniu DNA,

badaniu struktury chromosomów, izolowaniu poszczególnych genów oraz

tworzeniu nowych cząsteczek DNA. Odcinki DNA łatwiej analizować i pod-

dawać manipulacjom niż długi łańcuch. Łączy się je z powrotem za pomocą

enzymów zwanych ligazami, uzyskując rekombinowany DNA.

4

komórki

DNA izolowanie DNA

z komórek

rearanżacjacięciekopiowanie

Ryc. 4.1. Po wyizolowaniu DNA można kopiować, ciąć i zmieniać.

enzymy restrykcyjne

i ich rola

manipulowanie

w DNA

Ciekawe fakty

Nazwy enzymów restrykcyjnych tworzy się od nazw organizmów, z których

zostały wyizolowane (np. Eco – od Escherichia coli). Oznaczenia cyfrowe

(np. HindIII) informują o tym, że z danego organizmu wyizolowano więcej

niż jeden enzym restrykcyjny.

22

Sekwencjonowanie DNA

Do prawdziwej rewolucji w genetyce doprowadziło wynalezienie techniki

sekwencjonowania DNA, czyli określania kolejności ułożenia nukleotydów.

Jest to jedna z podstawowych metod wykorzystywanych między innymi

w biotechnologii, medycynie sądowej czy diagnostyce chorób genetycz-

nych. Najbardziej znaną metodę sekwencjonowania opracował Frederick

Sanger (tzw. metoda Sangera lub metoda terminacji łańcucha).

G

C

G

C

C

G

C

G

C

G

T

A

T

A

T

A

A

T

A

T

G

C

A

T

. . . .

Bam HI

nazwa

enzymu

EcoRI

HaeIII

Hhal

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

G

C

C

G

C

G

G

C

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

G

C

C

G

G

C

C

G

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

Rozdzielanie chromosomów i odcinanie fragmentów DNA

Cięcie fragmentów na mniejsze segmenty

Cięcie każdego segmentu na małe fragmenty

1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8

8

9

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Odczytywanie sekwencji nukleotydów w każdym z małych fragmentów DNA dokonywane

w sposób automatyczny w sekwenatorach DNA

10

Zestawianie odczytanych sekwencji małych fragmentów zgodnie z ich znaną względną kolejnością

1

2

3

4

5

sekwencjonowanie

Ryc. 4.3. Sekwencjonowanie DNA metodą Sangera.

Ryc. 4.2. Miejsca działania wybranych enzymów restrykcyjnych.

23

Enzym Miejsce cięcia Kolor nici

HaeIII GG|CC czerwony

EcoRI G|AATTC zielony

EcoRII |CCTGG żółty

HpaII C|CGG niebieski

etapy

sekwencjonowania

DNA

Pierwszy etap sekwencjonowania DNA obejmuje izolację DNA, rozdzie-

lenie helisy na dwie pojedyncze nici i pocięcie nici na krótkie fragmenty.

Drugi etap polega na kopiowaniu krótkich odcinków DNA, które są kom-

plementarne do nici DNA. Odcinki DNA o różnej długości są odpowiednio

oznaczane (radioaktywnie lub fluorescencyjnie) i segregowane za pomo-

cą elektroforezy. Z wielkości fragmentów wnioskuje się o sekwencji DNA.

Sekwencje poszczególnych odcinków składa się w cały, wyjściowy DNA. Jest

to możliwe, ponieważ końce poszczególnych odcinków zachodzą na siebie

(podobnie jak elementy puzzli). Obecnie sekwencjonowanie DNA zostało

zautomatyzowane (między innymi dzięki nowoczesnym sekwenatorom).

Aby się przekonać, jak działają enzymy restrykcyjne oraz na czym polega

sekwencjonowanie DNA, przeprowadź proste doświadczenie.

Zostań biochemikiem!

Przygotuj cztery różnokolorowe zestawy tej samej sekwencji DNA (ryc. A).

Z każdego zestawu wytnij poszczególne „nici” (ryc. B, C). Następnie nić

każdego koloru przetnij we wskazanych miejscach według zasad działania

enzymów restrykcyjnych podanych w tabeli (kolor nici wskazuje na rodzaj

enzymu stosowanego przy cięciu danej nici).

Wybierz uzyskane fragmenty z nici dwóch kolorów (np. zielony i nie-

bieski lub zielony i żółty) i je wymieszaj. Wykorzystując nakładające się

sekwencje, ułóż wyjściową nić DNA. Uwaga: Nie tworzysz par zasad, tyl-

ko pojedynczą nić – zasady w każdej z nich muszą pasować do siebie, na

przykład w następujący sposób:

GGATCGGTCAATG

AATGCCTA

A B

24

Przez przesuwanie kolejnych części i próbowanie różnych kombina-

cji można zrekonstruować pierwotną nić. Po zakończeniu rekonstrukcji

sprawdź sekwencję z nauczycielem. Czy rekonstrukcja fragmentów nici

uzyskanych za pomocą enzymów restrykcyjnych HaeIII i EcoRII jest moż-

liwa? Przeprowadź podczas lekcji dyskusję na ten temat.

Odwrócić bieg zdarzeń – cDNA

Aby móc wykorzystać bakterie do produkcji białka (np. Escherichia coli

do wytwarzania ludzkiej insuliny), należy do ich komórek wprowadzić

gen, który je koduje. Ponieważ geny człowieka stanowią mieszaninę eg-

zonów i intronów, a bakterie nie potrafią usuwać intronów, gen kodujący

dane białko musi zostać ich pozbawiony. W tym celu wykorzystuje się tak

zwany cDNA (ang. complementary DNA), komplementarny do dojrzałego

mRNA. Aby uzyskać cDNA, należy najpierw wyizolować z komórki całkowi-

tą pulę RNA. Następnie, wykorzystując startery specyficznie rozpoznające

mRNA, odwrotna transkryptaza przeprowadza syntezę cDNA na matrycy

mRNA. Odwrotna transkryptaza przeprowadza syntezę jednoniciowego

DNA na matrycy mRNA z wykorzystaniem deoksytrifosforanów nukle-

otydów (dNTP), dodając je na

zasadzie komplementarności.

Po zsyntetyzowaniu pierwszej

nici mRNA jest degenerowa-

ny. Syntezę drugiej nici prze-

prowadza polimeraza DNA.

Końcowym produktem jest

dwuniciowa cząsteczka cDNA,

której sekwencja odpowiada

mRNA wyizolowanym z kon-

kretnej komórki. W ten sposób

można uzyskać całą kolekcję

cDNA, czyli bibliotekę cDNA.

odwrotna

transkryptaza

5'

5'

3'

3'

cDNATT…

AA…

AA…

DNA o sekwencji

mRNA

wektor

Nowy DNA jest wprowadzany

do wektora

Nić mRNA ulega zniszczeniu,

a na nici cDNA powstaje

druga nić DNA

Odwrotna transkryptaza

wykorzystuje mRNA

jako matrycę do syntezy

komplementarnej nici DNA (cDNA)

Ryc. 4.4. W czasie odwrotnej transkrypcji informacja z mRNA jest

przepisywana na DNA przez enzym – odwrotną transkryptazę.

C D

25

PCR – rewolucja w badaniach genetycznych

W 1984 roku została wynaleziona metoda pozwalająca na powielanie wybra-

nych odcinków DNA. To tak zwana reakcja łańcuchowa polimerazy (w skró-

cie PCR; z ang. Polymerase Chain Reaction). Warunkiem przeprowadzenia

PCR jest znajomość sekwencji nukleotydów sąsiadujących z odcinkiem DNA,

który chcemy powielić (nie musimy znać sekwencji nukleotydów odcinka

powielanego).

W mieszaninie reakcyjnej znajdują się: krótkie odcinki DNA, czyli starte-

ry, zwane też primerami (czyt. prajmerami), które są komplementarne do

sekwencji otaczających kopiowaną sekwencję, nukleotydy (A, T, G, C) oraz

enzym – najczęściej polimeraza Taq. Jeden

cykl reakcji PCR obejmuje następujące etapy:

1. Oddzielenie nici DNA – dwie nici DNA

rozdzielane są przez podgrzanie roztworu

do temperatury 95°C przez 15 sekund.

2. Dołączenie starterów – w wyniku gwał-

townego schłodzenia mieszaniny reakcyjnej

do temperatury 50–65°C startery przyłącza-

ją się do nici DNA.

3. Synteza DNA – mieszaninę reakcyjną

ponownie podgrzewa się do temperatury

72°C. Jest to temperatura odpowiednia do

działania polimerazy Taq, która dołącza

kolejne nukleotydy równocześnie do obu

nici DNA.

Cały cykl jest wielo-

krotnie powtarzany. Po

20 cyklach DNA jest po-

wielony milion razy, a po

30 – miliard i to w czasie

krótszym niż godzina! Co

więcej, metoda PCR jest

obecnie całkowicie zauto-

matyzowana. Urządzenie

służące do przeprowadza-

nia PCR to termocykler.

Ciekawe fakty

Reakcja PCR zachodzi dzięki unikalnym

cechom polimerazy Taq, która jest aktyw-

na w wysokich temperaturach. Enzym ten

wyizolowano z bakterii Thermus aquaticus

(stąd jego nazwa).

Ryc. 4.5. Termocykler.

Ryc. 4.6. Bakterie Thermus aquaticus, z których pocho-

dzi polimeraza Taq, żyją w gorących źródłach (odkryto

je w gorących źródłach Yellowstone).

polimerazy

Podsumowanie

1. Wśród stosowanych w genetyce metod pozwalających na analizę i modyfikacje DNA naj-

powszechniejsze są: rozcinanie DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych, sekwencjono-

wanie DNA, chemiczna synteza DNA, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).

2. Enzymy restrykcyjne umożliwiają rozcięcie DNA w określonym miejscu. Poprzez połącze-

nie otrzymanych odcinków za pomocą ligaz uzyskuje się rekombinowany DNA.

3. Sekwencjonowanie obejmuje: izolację DNA, pocięcie go na krótkie fragmenty, oznakowanie

ich i posegregowanie oraz poskładanie sekwencji w wyjściową cząsteczkę.

4. Dzięki odwrotnej transkryptazie można sekwencję nukleotydów w mRNA przepisać na

DNA. Uzyskuje się w ten sposób cDNA komplementarny do mRNA.

5. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) pozwala na uzyskanie wielu kopii wybranego od-

cinka DNA. Znalazła ona wiele zastosowań (np. w medycynie, kryminalistyce).

Metoda PCR umożliwia powielenie nawet bardzo małych fragmentów

DNA (stanowiących mniej niż milionową część cząsteczki DNA). Pozwala

to na uzyskanie takiej ilości materiału genetycznego, która umożliwia

jego analizę. Dlatego PCR wykorzystuje się w medycynie (do wykrywa-

nia bakterii i wirusów, np. HIV) oraz w sądownictwie (np. do ustalania

ojcostwa) i kryminalistyce (do znajdowania winnych w sprawach o gwałt

czy zabójstwo). Ponieważ DNA jest cząsteczką bardzo stabilną i może

przetrwać wiele tysięcy lat, PCR wykorzystuje się też do odtwarzania DNA

muzealnego lub znajdowanego w skamieniałościach.

Ciekawe fakty

Odmianą reakcji PCR jest reakcja RT-PCR. W trakcie tej reakcji używa się odwrotnej transkryp-

tazy, a wyjściowym kwasem jest mRNA. Najpierw, na podstawie sekwencji zapisanej w mRNA,

wytwarzany jest cDNA, który następnie jest powielany w trakcie reakcji PCR. Jest to możliwe

dzięki enzymom, na przykład enzymowi wyizolowanemu z bakterii Thermus thermophilus, któ-

ry ma właściwości zarówno polimerazy Taq, jak i odwrotnej traksktyptazy. Enzym ten nazwano

polimerazą Tth. RT-PCR znalazło wiele zastosowań w diagnostyce.

Elektroforeza

Analiza fragmentów DNA uzyskanych w wyniku reakcji PCR czy cięcia en-

zymami restrykcyjnymi opiera się na różnicy w ich wielkości. Standardową

metodą rozdziału cząsteczek DNA o różnych długościach jest elektroforeza.

Metoda ta polega na przemieszczaniu się naładowanych cząsteczek w polu

elektrycznym. Cząsteczki naładowane dodatnio wędrują do elektrody ujemnej,

zaś cząsteczki naładowane ujemnie – do elektrody dodatniej. Elektroforezę

przeprowadza się w żelu będącym siecią porów, przez które cząsteczki DNA

muszą się „przeciskać”. Krótsze (mniejsze) cząsteczki przeciskają się szybciej,

natomiast dłuższe (większe) wędrują przez żel znacznie dłużej. Cząsteczki

o różnej wielkości tworzą na żelu prążki. Prążki DNA uwidacznia się poprzez

dodanie do żelu barwnika, najczęściej bromku etydyny, który wnika pomiędzy

pary zasad DNA i fluoryzuje pod wpływem promieniowania ultrafioletowego.

26

Zadania

1. Wyjaśnij, co oznacza pojęcie rekombinowanie DNA.

2. Wymień metody pozwalające na rekombinowanie DNA.

3. Odpowiedz, w jaki sposób powstaje cDNA i na czym polega jego rola.

4. Przedstaw znaczenie polimerazy Taq w reakcji PCR.

5. Wyjaśnij, do czego służą enzymy restrykcyjne.

6. Przeczytaj poniższy fragment artykułu. Przepisz zamieszczone pod nim zdania do zeszytu.

Obok każdego z nich napisz, czy może być wnioskiem z tekstu (TAK lub NIE).

„Wprowadzenie nowych, bardziej czułych metod diagnostycznych (PCR) pozwoliło wyka-

zać, że zarówno w populacji osób zdrowych, jak i chorych z zakażeniami dróg oddecho-

wych rzeczywisty odsetek osób zakażonych drobnoustrojem Chlamydophila pneumoniae

może być wyższy niż oceniany na podstawie dodatnich wyników badań serologicznych”.

Źródło: R. Krenke, Zakażenia górnych dróg oddechowych wywołane przez drobnoustroje atypowe, „Magazyn otorynolaryngologiczny”, V(20), 2006.

a) Za pomocą PCR możemy wykryć obecność drobnoustrojów, które jeszcze nie zdążyły

wywołać objawów choroby.

b) Dotychczasowe badania dawały wynik dodatni, jeśli drobnoustrój zakaził organizm.

c) Wczesne wykrycie obecności patogenów w organizmie daje ludziom szansę na wyzdro-

wienie lub zastosowanie odpowiedniej terapii.

7. Przedstaw zalety reakcji łańcuchowej polimerazy. Wyjaśnij, dlaczego uznaje się technikę

manipulowania DNA za przełomową w badaniach genetycznych.

8. Przeprowadźcie w klasie burzę mózgów na temat: „Rekombinowanie DNA. Możliwości

wykorzystania”. Sporządźcie notatkę w zeszycie.

9. Spośród podanych poniżej nazw urządzeń wskaż to, które służy do przeprowadzania

reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

a) sekwenator b) ultrawirówka c) termocykler

10. Przeczytaj poniższy tekst.

„W 2004 roku zaprezentowano pierwszy poznany genom ptasi – genom kury. Liczy on 1 mld

par zasad i został zsekwencjonowany podobnie jak poprzednio: DNA losowo pocięto na

kawałki, sekwencjonowano je z osobna, a następnie komputer dopasował końce kawałków

do siebie, składając z nich cały genom. Dzięki temu została wypełniona istotna luka, jeśli

chodzi o strunowce – do tamtej pory znano bowiem genomy człowieka (3 mld par zasad),

myszy, szczura, psa, ryb: rozdymki i fugu (350 i 360 mln) oraz prymitywnego strunowca –

żachwy (180 mln). Dzięki poznaniu genomów zwierząt należących do tak odległych gromad

możliwe będzie prześledzenie przebiegu ewolucji i odpowiedź na tak podstawowe pytania,

jak skąd się wzięła żyworodność, stałocieplność czy zdolność latania”.

Źródło: Genomy, genomy, „Świat Nauki”, Nr 2 (162)/2005.

Na podstawie tekstu omów, jakie znaczenie ma rozwój technik inżynierii genetycznej dla:

a) systematyków i taksonomów,

b) naukowców zajmujących się problemami ewolucji.

27