DNA 的 复 制

DNA replication

一、 DNA 复制假说

Watson 和 Crick 提出的 DNA 复制方式为半保留复制方式；

全保留复制：亲代 DNA 分子完整的转移到子代中；

散布式复制：亲代 DNA 片段分散在子代 DNA 分子中。

• Meselson － Stahl 实验

1958 年， Meselson 和 Stahl 首先将大肠杆菌在含重同位素 15N 的培养基中培养约十五代，使所有细菌都被 15N 标记。然后移至只含有轻同位素 14N 的培养基中同步培养一代，二代，三代。分别提取DNA ，作 CsCl 密度梯度离心，观察 DN

A 的位置。

15N-DNA 14N-DNA 混合 1 　　　 2 　　　 3

对 15NDNA 、 14NDNA 杂交分子经加热变性，对于变性前后的 DNA 分别进行CsCl 密度梯度离心。

结果变性前的杂交分子为一条中间密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带（ 15NDNA ）和低密度带（ 14NDNA ）。

＊ 1963 年 Cairns 用放射自显影方法阐明了大肠杆菌 DN

A 的复制是半保留复制且 DNA 是环状分子。

＊ 1957 年 Taylor 用 3H 脱氧胸苷的溶液标记蚕豆，证明了真核生物染色体的复制也是以半保留复制方式进行的。

● DNA 分子是以半保留凡是进行复制，不管是原核还

是真核生物。

二、半保留复制

1 、定义

DNA 在复制时 , 以亲代 DNA 的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代 DNA ，每个子代 DNA 中都含有一股亲代 DNA 链，这种现象称为 DNA 的半保留复制 (semi-cons

ervative replication) 。

• 模板• 原则• 特点

• 亲代的 DNA 双链，每股链都可作为模板• 按碱基配对原则指导新链的合成• 合成的两个子代 DNA 分子碱基顺序与亲

代分子完全一样• 一条链来自于亲代的 DNA 链，另一条链

是新合成的链

规律

亲代 DNA

子代 子代新合成 的链

半保留复制

2 、 DNA 半保留复制的类型

1 ） 线性双链： 双向、多重起始双向

2 ） 环状 DNA ： θ 型（双向、单向）、 D 型、滚筒

θ

型双向

滚筒复制

φX174RF 是一个合成单链病毒圆环的模板

D

型复制

3 、参与 DNA 复制的物质

1 ） 底物：四种脱氧核糖核酸 :

即 dATP ， dGTP ， dCTP ， dTTP

2 ） 模板： 亲代 DNA 链作为模板。

3 ） 引物： RNA 作为引物 (primer) ；原核生物 : 通常为 5

0 ～ 100 个核苷酸、真核生物 : 约为 10 个核苷酸； 其顺序与其模板 DNA 的碱基顺序相配对

4 ） DNA 聚合酶（ DNA Polymerase ）：• 以 dNTP 为前体催化合成 DNA

• 需要模板和引物的存在• 不能起始合成新的 DNA 链• 催化 dNTP 加到生长中的 DNA 链的 3’-OH 末端• 催化 DNA 合成的方向是 5'→3'

A 原核生物聚合酶

• DNA 聚合酶有三种• 具有多种酶活性的多功能酶• 参与 DNA 复制的主要是 polⅢ和 polⅠ。

• Kornberg 酶（ 1956 年）• 400 个酶分子 / 每个细胞• 单链多肽（ 109kD ）• 大小二个片段（枯草杆菌蛋白酶处理）

DNA 聚合酶Ⅰ（ DNA PolymeraseⅠ， PolⅠ ）

3’ 5’ 5’ 3’3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶 聚合酶外切酶 聚合酶

N C

小片段 大片段（ klenow 片段） （常用的工具酶）34kD 76kD

5’ 3’5’ 3’外切酶外切酶

5‘ － 3’ 聚合活性：

♦ 模板；

♦ 3‘ － OH 末端引物；

♦ 方向从 5’ － 3‘ 。

复制方向

DNA 聚合酶Ⅰ的校对功能 (3’-5’ 外切酶活性 )

错配硷基

5´3´

正确

核苷酸

5´3´3´

切除错配核苷酸

5’ － 3‘ 外切酶活性： ♦ 从 5’-P 端依次切除，可连续切除多个核苷酸； ♦ 只切配对的 5’-P 末端核苷酸； ♦ 既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸；

♦ 对只有 5’ 末端的切口也有活性。

DNA 聚合酶Ⅰ的5‘ － 3’ 外切酶活性和聚合活性同时作用可进行切口翻译，制造放射性探针。

• MW 为 120KD

• 100 个酶分子 / 每个细胞• 聚合作用 : 只有 DNApolⅠ的 5%

• 3’→5’ 外切酶活性• 无 5'→3' 外切酶活性• 对作用底物的选择性较强• 不是复制的主要聚合酶

DNA 聚合酶Ⅱ（ DNA Polymerase Ⅱ ， Pol Ⅱ ）

• pol Ⅲ由十种共 22 个亚基组成• α亚基具有 5’→3’ 聚合 DNA 的酶活性• ε亚基具有 3’→5’ 外切酶的活性• θ亚基具有促进 ε亚基外切酶的活性

DNA 聚合酶Ⅲ（ DNA Polymerase Ⅲ ， Pol Ⅲ ）

• 在复制叉处为一二聚体• 核心酶（ core enzyme ）： α 、 ε 、 θ 。 α ：聚合作用；

ε ： 3’ － 5’ 外切； θ ：与亚基结合有关；• γ 、 δ 、 δ’ 、 χ 、 ψ 提高反应速率和持续性；• β ：使 DNApol 能结合在 DNA上。 β亚基结合于 DNA 时消耗 ATP ；如同一个夹子，使 DNApolⅢ结合于 DNA 。

• τ ：使两个 DNApol 单体形成二聚体，分别在复制叉的两个链上作用。

B 真核生物聚合酶

五种• DNA 聚合酶 α

• DNA 聚合酶 δ 和 PCNA

• DNA 聚合酶 γ

• DNA 聚合酶 β 、 ε 功能：• 参与随从链的合成• 参与前导链的合成• 参与线粒体 DNA 的合成• 参与 DNA 的修复

DNA 聚合酶 α β γ δ ε

蛋白质分子量（ KD > 250 36-38 160-300 170 256

细胞定位 核 核 线粒体 核 核  5’ →3’ 聚合酶 有 有 有 有 有 3’ →5’ 外切酶 无 无 有 有 有 引物酶 有 无 无 无 无

真核细胞几种主要 DNA 聚合酶的性质

5） 解链酶（ unwinding enzyme/ helicase ）

6 ） 引物酶（ Primase ）

♦ 本质：依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 （ DDRP ） Ecoli ： 60kD ， DnaG 编码

♦ 引发体 (primosome) ：引物酶＋引发前体（蛋白

因子 i 、 n 、 n” 、 dnaC 、 n’ 、 dnaB ）

5´ 3

3´ 5´primase

DnaC

primosome

Helicase(DnaB)

• 蛋白因子 i 、 n 、 n” 与蛋白 dnaC跟引物预合成有关；

• 蛋白因子 n’ 和蛋白 dnaB 与识别复制起始点有关，并具有 ATPase 活性。

7 ）单链结合蛋白

• single strand binding protein, SSB

• 能够与单链 DNA 结合的蛋白质因子• 稳定单链 DNA ，不形成发夹结构• 保护单链 DNA ，不受DNA水解酶作用• 可重复使用，在滞后链上不断摆动，冈崎片段

合成

8 ） 拓扑异构酶 (topoisomerase) ： 可使 DNA拓扑异构体互变的酶。

切割 DNA 双链，此时不需 ATP ；尔后由 ATP供能，使 DNA 分子成负超螺旋再连接切口。

不需 ATP ，切割双链 DNA 中的一链，使 DNA松弛后 , 连接切口。

♦ TOPOⅠ:

♦ TOPOⅡ:

TOPO 酶：切割 DNA 链，使其松弛后再连接。

♦ 功能：与 DNA形成共价结合中间体，使 DNA磷酸二酯

键断裂，形成 DNAnick ， DNA 的一条链进行解

旋旋转改变 DNA 分子的拓扑结构。

参与复制、转录、重组。

♦ 效应：可使 DNA发生：连环化（ catenate ）、脱连环化

（ decatenate ）、打结（ knot ）、解结（ unknot ）。

拓扑异构酶Ⅰ：MW＝ 100kD ，单肽链，含 3 － 4 个 Zn

作用：• 每次改变一个连环数；• 结合 DNA ，使该处溶解；• 形成酶－ DNA 复合物；• 切割双链中的一股，使 DNA 中的一股链穿越切割点；• 断裂单链连接

拓扑异构酶Ⅰ作用机理示意图

作用：• 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。

拓扑异构酶Ⅱ：又称旋转酶。

广泛存在于各种生物中。

拓扑异构酶Ⅱ的作用机制

• Ⅰ 型： MW＝ 95kD ，单体蛋白，不需 ATP ；• Ⅱ型： MW＝ 150 － 180kD ，均为二聚体，需 ATP

和 Mg2+ 。

真核生物拓扑异构酶：

酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的Ⅰ拓扑异构酶的特性相似，但与原核的酶有明显差异。

9 ） 连接酶• DNA 连接酶 (DNA ligase) 可催化两段 DNA 片段之

间磷酸二酯键的形成，而使两段 DNA 连接起来。• 需 3’-OH ， 5’-Pi 基• 碱基互补• 只连 Nick ，不连 Gap

• 需要消耗能量

DNA 连接酶的作用

♦ T4Ligase 特性：

• 可连接 DNA 与 DNA ，也可连接 RNA 与 RNA ；• 可连接 DNA 中的单链切口，也可连接粘性末端切口和平砌末端切口；

• T4Ligase 可作为重组工具酶。

4 、半不连续复制（ semidiscontinuous replication ）

• 半不连续复制： 在 DNA 复制过程中，亲代 DNA 分子中以 3’ 5’

方向的母链作为模板指导新的链以 5’ 3’ 方向连续合成， 另一股以 5’ 3’ 为方向的母链则指导新合成的链以 5’ 3’ 方向合成 1000—2000 个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。

♦ 前导链（ leading strand ）：

DNA 复制时，一股以 3’ 5’ 方向的母链作为模板，指导新合成的链以 5’ 3’ 方向连续合成的链称为前导链。

（复制方向与解链方向一致）

♦ 随从链（ lagging strand):

DNA 复制时，一股以 5’ 3’ 方向的母链作为模板，指导新合成的链沿 5’ 3’ 合成， 1000—2000 个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。

（复制方向与解链方向相反 )

♦ 岗崎片段（ Okazaki ）：

DNA 复制时，一股以 5’ 3’ 方向的母链作为模板，指导新合成的链沿 5’ 3’ 合成 1000—2000 个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。

岗崎片段由 DNA 连接酶连成一条完整的新链。

5、复制的过程

根据反应阶段和所需的不同酶类， DNA 的复制可被分为三个阶段，即复制起始、延伸和终止。

① 复制的起始阶段：包括起始点、复制方向和引发体 的形成 A 起始点（ Ori ） DNA 在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具

有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点。

大肠杆菌中的复制起始点是 OriC ，全长 245Bp ，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。

• 复制起点在复制过程中呈现叉子的形式，被称为复制叉（Replication fork）

• DNA 复制从起点开始进行直到终点为止，每一个这样的 DNA 单位称为复制子或复制单元 (replicon)

• 一个复制子只含有一个复制起点。• 原核生物中只有一个复制起点，一个复制子• 真核生物中可以从许多起始点同时进行，即有多个复

制子

B 复制方向

DNA 复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。这决定于在起始点形成 1

或 2 个复制叉。

C 引发体的形成

结合 Ori 区，具 ATP 酶活性促进 DnaB形成起始复合物

DNA螺旋酶

运输 DnaB

DNA 引发酶

促进起始复合物形成

a. 大约 20 个左右的 DnaA 蛋白首先与 OriC 中的 4 个 9 碱基重

复区相结合； HU 蛋白参与并促进这一过程；b. 识别并使 3 个 13 碱基串联重复区 DNA形成开环结构；c. SSB 和旋转每（拓扑异构酶）参入；

d. DnaB 蛋白在 DnaC 的帮助下与未解链序列结合。每六个 DnaB 蛋白形成一组并与一条 DNA母链结合，可在不方 向同时起始 DNA 的复制。 e. DnaG （引物酶）参入成引发体； f. 引发体合成先导链的 RNA 引物； g. DNApolmerase 组装和复制叉上二聚体形成； h. 在 RNA 引物 3‘ 端 DNA开始聚合

② 复制的延伸

• 前导链和滞后链由同一 polⅢ二聚体延伸• 滞后链合成与前导链不同步： ♠ 位于滞后链的引发体，在合成引物后， DnaG （引

物酶）可将模板链提起或成环，使 RNA 引物 3’ 端位于DNApolⅢ处

♠ DNApolⅢ在 RNA 引物 3‘ 端延伸 DNA随从链♠ 解链的滞后模板链被 SSB 结合，保持模板为单链状态，并保护其不被核酸酶水解

♠ 随冈崎片段的延伸， SSB 被 priA 除去，此过程需 A

TP 功能

整个复制过程如下：

在复制叉形成复制体（ DnaB,β亚基与 DNA 结合，引发体形成， 2×pol Ⅲ复合体形成）

主导链 DNApol Ⅲ核心酶沿模板 3′ － 5′ 方向滑动，新链以 5′ － 3′延伸，滞后链上 β亚基结合于 模板上，引发体

（引发酶）合成引物， DNApol Ⅲ合成冈崎片段。

引物酶及引发体脱落，冈崎片段合成， β －亚基脱下。随从链上冈崎片段合成后， DNApol Ⅲ核心酶脱落。

β － clamp 结合在随从链新位点上

③ 复制的终止

当子链延伸达到 terminus region （ ter ，带有多个 20bp 序列）时， DNA 复制就终止了。 Ter 有点像一个陷井（ trap ），使复制叉只能进入，不能出来。 Ter 的功能主要是由 Ter-Tus 复合物（ ter u

tilization substance ）来完成的。

• EcoliDNA 的复制终止终点

AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT

TTAATCATCCAACATTGATTTCA

复制叉可被 tus蛋白识别，并结合于其上

• 终止的调节：在终止点 Forksmeet 两侧各有几个短序列，如： terE. D. A. terC. B 。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在 ter 位点停止，等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个“ replication for

k trap” 。• 二个复制叉相距约 100kb 时速度放慢，通过 ter 来协调两复制叉到达终点的时间。

6、复制的保真性 长期进化过程中，使生物体 DNA 复制过程形成了一系列保真机制，保证复制准确，遗传稳定。♥ DNApolⅠ和 Ⅲ的 3′ － 5′ 活性 DNApolⅠ有两个结构域：⑴ 大结构域含一个荷正电，直径 2nm 的裂缝，是 DNA 结合部分。 D

NA

一旦结合，裂缝即被关闭，这时， DNA 只能在裂缝中前后滑动。⑵ 小结构域含核苷酸结合部位，两结构域相距 3nm 。⑶ 当新合成的 DNA 中含错配核苷酸对时，双螺旋发生变形，因而不能 在裂缝中向前滑动，只能后移，这时 3′ － 5′ 外切酶激活，切除错 配核苷酸。⑷ 错配核苷酸切除后，聚合反应继续进行。

♥ RNA 引物起始复制，引物最终除去， 减少错配。

开始合成错配率高，短核苷酸序列中的 错配不易校正。♥ 修复系统有多种机制和酶。

7 、复制的调控

① 原核生物的调控－－以噬菌体 λ为例。

OL OR cⅡ

N R c Ⅰ PR Cro O P Q

ori

阻遏蛋白引发蛋白

起始复制

② 真核生物的调控

调控发生在 3 个水平：

♥ 细胞生活周期水平调控：也称限制点调控，即决定细胞停留在 G1期还是进入 S期。致癌剂、促细胞分裂剂等都可诱发细胞由 G1期进入 S期；

♥ 染色体水平调控：决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在 S期起始复制；

♥ 复制子水平调控：决定复制的起始与否。

Cdc6 蛋白（ cdc: cell divisio

n cyclegenes) 是一个十分不稳定的短命蛋白，但在 G1 期不断合成。 Cdc6 与 ORC 的结合，形成起始复合物，复制起始。 Cdc6 在 G1 期保护着 Dnas

e 敏感位点，使其不敏感。细胞进入 S 期， Cdc6 合成降低，Cdc6 合成的减少使 Mcm 脱落，DNA 复制。 G2 期 ORC 仍然结合于 ori ，但由于无 Cdc6 和Mcm ，复制不能起始。在这一时期，细胞周期控制着 Cdc6

的合成，而 Cdc6 又控制着复制。