核酸分子杂交（ DNA/DNA or DNA/RNA ）

核酸分子杂交技术： 具一定同源性的两条 (DNA 或 RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下 , 可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。

探针 ( 已知核酸片断，单链 )

待测核苷酸序列 ( 单链 )

核酸分子杂交技术，是在 1968 年由华盛顿卡内基学院（ Carnegie Institute of Washington ）的 Roy Britten 及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA ，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理 DNADNA 变性变性

• 方法方法 热变性：热变性： 90~100℃90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等

• 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度解温度 (melting temperature,Tm)(melting temperature,Tm)

DNADNA 复性或杂交复性或杂交 (hybridization)(hybridization)• DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNADNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA 等等

影响杂交的因素影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度

• 浓度大，复性快；分子量大，复性慢浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度温度 离子强度离子强度 杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应非特异性杂交反应

• 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子 DNADNA

分子杂交的基本方法分子杂交的基本方法 Southern Southern 印迹法印迹法 Northern Northern 印迹法印迹法 Western Western 印迹法印迹法 原位杂交原位杂交 斑点印迹杂交斑点印迹杂交 液相杂交液相杂交

Southern DNA 印迹杂交

Southern DNA 印迹杂交 使在电泳凝胶中分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA 或 RNA 探针的杂交作用检测这些被转移的 DNA 片段，这种实验方法叫做 DNA 印迹杂交技术。由于它是由英国人 Edwin Mellor Southern 于 1975 年首先设计出来的，故又叫 Southern blot 。

Southern Southern 杂交杂交 (Southern bloting)(Southern bloting) 的主要步骤的主要步骤 待测待测 DNADNA 样品的制备、酶切样品的制备、酶切 待测待测 DNA DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中凝胶中 DNADNA 的变性：碱变性的变性：碱变性 SouthernSouthern 转膜：转膜：

• 硝酸纤维素硝酸纤维素 (NC)(NC) 膜、尼龙膜膜、尼龙膜• 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法

探针的制备探针的制备 SouthernSouthern 杂交杂交 杂交结果的检测杂交结果的检测

（ a ）

（ b ）

（ c ）

（ d ）

（ e ）

基因组 DNA

DNA 限制片段

硝酸纤维素滤膜

同探针同源杂交的基因 DNA 片段

X 光底片

DNA 凝胶电泳

Southern DNA 印迹杂交之 X 光显像图片 水稻（ Oryza sativa L.) 的叶绿体 DNA 分别用核酸内切限制酶 BglⅡ(A-C) 、 BamHⅠ（ D-F ）、 EcoRⅠ（ G-I ）、和 HindⅢ（ J-L ）消化，加样在含有 EtBr 染料的 1% 的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同 32P 标记的玉米 psbA 探针作 Southern 杂交。 X 光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的 psbA 基因序列

利用非放射性探针检测核苷酸

主要应用主要应用• 1.1. 遗传病诊断 　　遗传病诊断 　　• 2.DNA2.DNA 图谱分析 　　图谱分析 　　• 3.PCR3.PCR 产物分析产物分析

Northern blot

NorthernNorthern 杂交杂交

* 1979* 1979 年，年， J. C. AlwineJ. C. Alwine 等人发展而来，是将等人发展而来，是将 RNARNA 分子从分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。

也称为也称为 NorthernNorthern 印迹（印迹（ Northern BlotNorthern Blot ），用以检测某），用以检测某一特定的一特定的 RNARNA （通常是（通常是 mRNAmRNA ）片段的存在及表达）片段的存在及表达量。量。

* * 因因这种方法与 Southern blot 杂交技术十分类似，与与 DNADNA的杂交（的杂交（ Southern Southern 杂交）相对应，被趣称为杂交）相对应，被趣称为 NortheNorthernrn 杂交。杂交。

Northern 印迹杂交

1 、基本原理和基本过程与 Southern blot 基本相同

2 、鉴别 RNA

3 、探针可用 DNA 或 RNA 片段

4 、待测样品为总 RNA 或 mRNA

Northern 印迹与 Southern 印迹的不同点

1 、变性： RNA 电泳前加热变性、电泳时加变性剂保

持 RNA 处于变性状态， DNA 电泳前和电泳

中不变性与 Southern 印迹杂交不同之处：

RNA 电泳

避免单链 RNA 自身形成高级结构和自身降解

变性凝胶电泳 ( 甲醛、尿素、甲酰胺等 )

RNase 抑制环境

2 、转膜： RNA 转膜前不需变性和中和处理 ,Southern

印迹时， DNA 转膜前需进行碱变性及中和处理

3 、靶核酸为 RNA

WesternWestern 杂交印迹法杂交印迹法 (Western bloting)(Western bloting)

检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法清对蛋白质进行鉴定及定量的方法

主要步骤：主要步骤：•蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备• SDS-SDS- 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)(PAGE) 电泳电泳•蛋白质的电转移：蛋白质的电转移： NCNC 膜膜•靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测

靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应

In Situ HybridizationIn Situ Hybridization

原位杂交原位杂交

原位杂交 (in situ hybridization)

* * 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 * * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。

将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分： DNA/DNA/DNADNA 、、 RNA/DNARNA/DNA 、、 RNA/RNA RNA/RNA 杂交。杂交。

特点特点• 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究• 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序

列灵敏度高列灵敏度高• 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态

原位杂交

1 、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分： DNA/DNA 、 RNA/DNA 、 RNA/R

NA 杂交

• 保持组织细胞的形态• 对核酸无抽提，修饰与降解作用• 不改变核酸在组织细胞内的定位• 不阻碍核酸与探针的杂交过程• 对杂交信号无遮蔽作用• 理化性质稳定

2 、杂交过程：（ 1 ）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：

（ 2 ）组织细胞杂交前的预处理

• 去垢剂（如 Triton x-100 和 SDS ）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白质

• 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体

• 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻

片上脱落

（ 3 ）探针的选择与标记

• 以获得最好杂交效果为依据选择探针

• 探针的长度一般为 50~300bp ,有时达 1.5kb

• 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定

检测结果分辨率高，但信号检测时间长

• 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易

于观察

（ 4 ）杂交

• 杂交液体积小： 10~20μl

• cDNA 和 RNA 探针杂交温度约为 50℃

• 杂交时间 :DNA 探针杂交为 2~4h.RNA 探针杂交过夜

• 杂交前一般将组织切片置 95 5~15℃ 分钟使 DNA 变性

• 冲洗温度一般 不超过 50 ℃

（ 5 ）杂交结果检测

• 所用探针为核素标记 , 放射自显影检测

• 所用探针为非核素标记 ,比色或化学发光检测

斑点及狭缝印迹杂交 1 、斑点印迹为圆形

2 、狭缝印迹为线状

3 、鉴别 DNA 、 RNA

4 、简单、快速，同一张膜可检测多个样品

5 、特异性不高、不能鉴别核酸分子量

斑点印迹杂交斑点印迹杂交 (dot bloting)(dot bloting)

将将 RNARNA 或或 DNADNA 变性后直接点样于变性后直接点样于 NCNC 膜或膜或尼龙膜上尼龙膜上

优点：简单、快速、可同时检测多个样品优点：简单、快速、可同时检测多个样品

液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。

（一） RNA酶保护分析法

1 、 RNA酶保护分析法原理

RNaseA 和 RNaseT1专一水解杂交体系中的单链 RNA ，不水解探针 RNA 与待测 RNA 互补形成的双链 RNA ，使杂交分子得到保护，称 RN

A酶保护分析法。

2 、杂交过程• 制备待测 RNA

• RNA 探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记 RNA 探针• 杂交：待测 RNA 与 RNA 探针在液相中杂交• RNaseA 和 RNaseTI除去单链 RNA

• 电泳分离 RNA

• 放射自显性检测杂交结果

（二）核酸酶 S1 保护分析法

1 、原理

核酸酶 S1 在一定条件下专一水解杂交体系中的单链 DNA 和单链 RNA ，不水解 DNA 探针与待测 RNA 杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶 S1 保护分析法

2 、杂交过程

• 制备待测 RNA ：总 RNA 或 mRNA均可• 单链 DNA 探针的制备与标记• 杂交：单链 DNA 探针与待测 RNA 在液相中杂交• 核酸酶 S1除去单链 DNA 和单链 RNA

• 电泳分离 DNA/RNA 杂交体分子• 放射自显影检测杂交结果

核酸杂交的探针

(1) 常用探针类型： ①人工合成寡核苷酸探针 ②基因组 DNA 探针 ③cDNA 探针 ④RNA 探针

(2) 探针标记物

①放射性标记物 32P 高放射性 半衰期 14.3 d 35S 放射性较弱 半衰期 87.1 d

3H 放射性弱 半衰期 12.35 a

②非放射性标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光， 如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光

BiotinAvidin

(2) 探针标记物

理想标记物应具备的特性：

• 高度灵敏性• 不影响碱基配对的特异性• 不影响探针分子的主要理化性质• 对酶促反应活性无影响或影响不大• 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性

BCIP/NBT 紫蓝色沉淀

Dig

抗 Dig抗体

碱性磷酸酶

(3) 探针标记方法

– 切口平移法 (nick translation)– 随机引物法 (random primer) ：六核苷酸残基

的引物– PCR 标记法– 末端标记法

1 、利用 DNase I 在 DNA 双链上造成单链切口

2 、利用大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的 53 核酸外切酶活性在切口处将旧链从 5末端逐步切除

3 、在 DNA聚合酶 I 的 53聚合酶催化下，以互补的 DNA 单链为模板依次将 dNTP连接到切口的 3末端 -OH 上，合成新的 DNA 链，同时将标记的核苷酸掺入到新的 DNA 链中

①切口平移法（ nick translation)

①切口平移法 (nick translation labeling)

5’5’3’

3’

3’3’3’5’ 5’ 5’5’ 5’ 5’3’ 3’ 3’

3’5’ 5’ 5’5’ 5’ 5’3’

DNA酶 I

DNA聚合酶 I + 标记的 dNTP

5’ 3’

变性

探针平均长度 600bp

②随机引物法

其原理是随机引物能与各种单链 DNA模板结合，作为合成新链的引物，在 DNA聚合酶的催化下，按 53 方向合成一新的 DNA 链，其核苷酸序列与模板 DNA完全互补。另一单链 DNA模板同样合成一条新的完全互补的 DNA 链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的 DNA

分子中

随机引物法所具有的优点：

1 、能进行双链 DNA 、单链 DNA 或 RNA 探针的标记

2 、操作简单方便，避免因 DNaseI 处理浓度掌握不当所带来的一系列问题

3 、标记活性高，标记活性可达 108cpm/µgDNA 以上

4 、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记

②随机引物法 (random primed DNA labeling)

5’3’5’ 3’

5’3’

5’ 3’

随机 6-12bp 单核苷酸引物

变性

一般探针长度在 400-600bp之间

③末端标记法 (terminal labeling)

3’末端

5’末端

④PCR 标记法

⑤光敏标记法

生物素、地高辛等光敏基团与生物素结合

⑥化学衍生结合标记法

转氨标记法等

(4) 探针的纯化

1 、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀 DNA 片段，可去除 dNTP 和蛋白质

2 、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子 DNA 和小分子 dNTP 、磷酸根离子及寡核苷酸（ <80bp) 等物质分离，常用凝胶基质是 Sephadex G-50

3 、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针