Digitaalinen kuvaustekniikka optisessa mikroskopiassa
-
Upload
huurretursas -
Category
Documents
-
view
277 -
download
6
description
Transcript of Digitaalinen kuvaustekniikka optisessa mikroskopiassa
Digitaalinen kuvaustekniikka optisessa
mikroskopiassa
LuK-tutkielma
Turun yliopisto
Informaatioteknologian laitos
Elektroniikka ja tietoliikennetekniikka
2005
S. Sormunen
Tarkastaja:
lehtori Risto Punkkinen
Sisällys
1. Johdanto……………………………………………………………………... 1
2. Digitaalikameralla varustetun optisen mikroskoopin toiminta ……………... 2
2.1. Lyhyt kuvaus digitaalikameralla varustetun mikroskooppijärjestelmän
kokoonpanosta…………………………………………………………… 2
2.2. Digitaalikameran ohjaaminen tietokoneohjelmistolla ……………… 3
3. CCD-kenno………………………………………………………………….. 4
3.1. CCD-kennon määritelmä……………………………………………..4
3.2. Tarkempi katsaus ICX205AK:n toimintaan………………………… 7
3.2.1. Interline-tyyppisen CCD-kennon kokoonpano…………………...8
3.2.2. Elektroniset sulkimet……………………………………………...9
3.2.3. Kuvapisteiden yhdistäminen…………………………………...... 10
3.2.4. Tulostustavat…………………………………………………….. 10
3.2.4.1. Peräkkäispyyhkäisytulostus……………………………….. 11
3.2.4.2. Korkeakuvataajuustulostus………………………………... 11
3.2.5. Spektriherkkyys ja kvanttihyötysuhde…………………………...12
3.3. Kohina ja viilennyksen merkitys……………………………………. 15
3.4. CCD-kennon lineaarisuus…………………………………………… 16
4. Koesarja: vääristyneiden näytekuvien yhdistäminen………………………... 17
5. Yhteenveto ja johtopäätökset……………………………………………….. 19
Lähteet…………………………………………………………………………..21
1
1. Johdanto
Muutaman viime vuoden aikana optinen mikroskopia on miltei syrjäyttänyt perinteiset
mikrovalokuvauksen menetelmät. Emulsiokalvoihin perustuvien filmien tilalle ovat tulleet
digitaaliset kuvaustekniikat. Huiman kehityksen myötä 2000-luvun alkuvuosiin mennessä
digitaaliset kuvat ovat kehittyneet melkein perinteisille filmeille otettujen vertaisiksi
erottelukykynsä ja tarkkuutensa puolesta. [1]
Mikroskopiakuvaus on ala, jolla kameroilta vaaditaan suurta erottelukykyä ja värien
toistotarkkuutta hyvin vähävaloisissa olosuhteissa. Tällaiset seikat ovat suuria haasteita
jopa perinteisille filmipohjaisille valokuvauskeinoille. Miksi sitten digitaaliset
kuvaustekniikat ovat saavuttamassa entistä suuremman suosion tällä vaativalla
tieteenalalla? [2]
Verrattuina perinteisiin menetelmiin digitaaliset kuvaustekniikat ovat huomattavasti
helppokäyttöisempiä, nopeampia ja tarjoavat avarammat jälkikäyttömahdollisuudet. Koska
sähköinen tietoliikenne on jo arkipäiväistä, kuvamateriaalikin kulkee yksinkertaisemmin
ykkösinä ja nollina. Digitaalisia kuvia voi esimerkiksi helposti lähettää sähköpostitse
jatkotutkintaan, sisällyttää digitaalisiin dokumentteihin tai siirtää muihin
ohjelmistopohjaisiin kuva-analyysijärjestelmiin. Niitä on myös vaivatonta kopioida ja
arkistoida. Perinteisten valokuvaustekniikoiden haittapuoli on lisäksi se, että niiden
hallintaan tarvitaan rutkasti asiantuntemusta. Käyttäjän täytyy ymmärtää esimerkiksi
erilaisten filmimateriaalien edut ja haitat sekä linssiapertuurien väliset eroavaisuudet.
Tällaista seikkaperäistä tietoa ei tarvita digitaalikuvauksessa, vaan suurin osa
kuvausprosessiin liittyvistä operaatioista on melko yksinkertaisia. [2]
Yksi digitaalikuvauksen eduista on myös kustannusten tasoittuminen pitkällä tähtäimellä.
Ensikäteen digitaalilaitteisto saattaa olla kallis investointi hankkijalle. Ajan mittaan
kuitenkin säästetään: ei ole esimerkiksi lainkaan filminkehityskustannuksia. Kuvaaminen
on myös lähes reaaliaikaista: otokset voidaan hetkessä siirtää tietokoneelle jatkokäsittelyyn
2
tai tarkastukseen. Ei tarvitse odottaa filmin valmistumista, jotta nähtäisiin, onko jokin kuva
onnistunut. [2]
Kuvaamislaite ja sen ominaisuuksien edistyneisyysaste ovat luonnollisesti
mikroskopiakuvauksen ratkaisevimmat tekijät. Laitteen tekniikka yksistään määrää, kuinka
tarkkaan mitattavia näytteitä voidaan kuvata, minkälaisia rakenteita voidaan erottaa ja
millaista dynamiikkaa voidaan kuvantuottamiseen käyttää. Tässä tutkielmassa tarkastellaan
optiseen mikroskopiaan tarkoitettua mikroskooppijärjestelmää, joka on varustettu yhdellä
alan suosituimmista digitaalikameramalleista, Olympuksen DP50:llä. Pääpaino on kameran
CCD-kennon (charge-coupled device eli varauskytketty laite) ominaisuuksien tutkimisessa.
CCD-kennon tekniikka ensi sijassa määrää, kuinka korkeatasoisia digitaalikuvia saadaan
tuloksena. [1]
2. Digitaalikameralla varustetun optisen mikroskoopin toiminta
2.1. Lyhyt kuvaus digitaalikameralla varustetun mikroskooppijärjestelmän
kokoonpanosta
Optiseen mikroskopiaan tarkoitettu mikroskooppijärjestelmä koostuu useammasta toisiinsa
kytketystä laitetasosta (kuva 1). Alimpana tasona on perinteinen mikroskooppi. Seuraavalla
tasolla on standardimallinen C-mount-adapteri, jolla digitaalikamerayksikkö kiinnitetään
mikroskoopin kuvaputkeen (phototube). C-mount-adapteri on tavallinen mekaaninen
adapteri, joka ei sisällä erityisiä optisia elementtejä. [3], [4]
Ylimmällä tasolla on Olympuksen DP50-kamerayksikkö. Kamera käyttää puolen tuuman ja
1,5 miljoonan kuvapisteen värillistä CCD-kennoa tuottaakseen lähes 5,8 miljoonan
kuvapisteen tasoisia kuvia. Tämä data käsitellään jälkikäteen värinkorjausalgoritmin kautta,
jolloin tulokset ovat lähes 35 millimetrin kameralla otettujen kuvien luokkaa. Efektiivisten
tallennuskuvapisteiden määrä voidaan valita kolmesta eri erottelutarkkuudesta
käyttötarkoituksen mukaan: 2776·2074, 1392·1040 tai 640·480 kuvapistettä. Keskeinen osa
DP50:n hyötysuhdetta on Peltier-laite, joka viilentää CCD-kennoa ja siten vähentää
3
tehokkaasti kohinaa. Täten varmistetaan hyvä kuvanlaatu sekä hehku- että
fluoresenssikentässä. [3]
Kyseistä mikroskooppijärjestelmää ohjataan pääasiallisesti tietokoneavusteisesti. DP50:een
kuuluu oheislaitteena tietokoneen PCI-väylään asennettava liitäntäkortti, johon
kamerayksikkö kiinnitetään sopivalla kaapelilla. Varsinaisen kuvankaappaus tehdään
ohjelmiston välityksellä. [1], [3]
Kuva 1. Optiseen mikroskopiaan tarkoitetun digitaalikamerajärjestelmän kokoonpano.
Alinna vasemmalla on mikroskooppi, jonka päälle asetetaan C-mount-adapteri ja itse
DP50-kamerayksikkö. Oikealla on karkea kaavio tietokoneliitännäisistä oheislaitteista. [5]
2.2. Digitaalikameran ohjaaminen tietokoneohjelmistolla
DP50-kamerayksikön toimintaa ohjataan Viewfinder Lite -nimisellä ohjelmistolla
(valmistaja Pixera Corporation), joka on saatavilla Windows- ja MacOS-
käyttöjärjestelmille. Ohjelmiston pääasiallisiin toimintoihin kuuluvat muun muassa kuvien
kaappaus tietokoneelle, väritasapainon, tasojen ja valotuksen määrittäminen sekä kameran
herkkyyden säätäminen. Kuvankaappauksen jälkeen valmis kuva voidaan ohjata
jälkikäsittelyyn joko perinteiselle kuvankäsittelyohjelmalle (esimerkiksi Adobe Photoshop
4
tai vastaava) tai DP50-ohjelmistopaketin mukana tulevalle Studio Lite -ohjelmalle.
Tarkemmat käyttöohjeet ovat saatavilla valmistajan tarjoamassa käsikirjassa. [1]
3. CCD-kenno
CCD-kenno on digitaalikameran varsinainen ydin. Olympuksen DP50-kamerayksikkö
sisältää Sonyn valmistaman kennon, joka on mallia ICX205AK. Seuraavassa perehdytään
aluksi lyhyesti CCD-kennon toimintaan ja sen jälkeen erikoistutaan pohtimaan
ICX205AK:n ominaisuuksia.
Huomautuksena mainittakoon, että kaikkialla tekstissä käytetään termiä valodiodi
(photodiode) puhuttaessa CCD-kennon sensoriyksiköstä eli kuvapisteestä. Kyseessä ei siis
ole perinteinen LED (Light-Emitting Diode) eli monokromaattista valoa tuottava
puolijohdekomponentti. Tekstissä esiintyvä valodiodi on sen sijaan p-n-liitokseen perustuva
optiselle signaalille herkkä valonilmaisin. [6], [7]
3.1. CCD-kennon yleinen määritelmä ja fysikaalinen toiminta
CCD-kennot ovat piipohjaisia integroituja piirejä. Ne koostuvat tiheästä
valodiodimatriisista, jossa alimmalla tasolla toiminnallisina yksikköinä ovat hyvin
lähekkäin asetellut MOS-kondensaattorit (metal-oxide-silicon capacitor) valodiodien
yhteydessä. Näissä fotonien energiaa muutetaan sähkövaraukseksi. Kennot valmistetaan
piikiekolle hyvin samankaltaisesti kuin muutkin vastaavat puolijohdepiirit.
Valmistusprosessiin kuuluvat esimerkiksi sellaiset vaiheet kuin syövytys, ioni-istutus,
ohutfilmikasvatus, metallointi ja passivointi. Piisubstraatti piristetään p-tyyppiseksi, ja
jokaiselle kiekolle rakennetaan useita maskeja. Tämän jälkeen ne leikataan timanttisahalla,
testataan ja pakataan keraamiseen tai polymeeriseen kuoreen, jossa on lasi- tai kvartsi-
ikkuna. Ikkunan kautta fotonit pääsevät valmiin kennon sisään valottamaan sen pinnalla
olevaa valodiodimatriisia. [8], [9]
5
Kun ultravioletti-, näkyvä tai infrapunafotoni iskeytyy valodiodin uumenissa tai sen
lähistöllä sijaitsevaan piiatomiin, tuloksena yleensä syntyy vapaa elektroni-aukkopari.
Vapaa elektroni kerätään tämän jälkeen potentiaalikaivoon tyhjennysalueelle. Aukko
pakotetaan pois ja syrjäytetään piisubstraattiin. Yksittäiset valodiodit on eristetty
naapureistaan elektronisesti kanavasulun avulla, joka on muodostettu sekoittamalla boori-
ioneja maskin kautta substraattiin. Siten eri valodiodien potentiaalit pidetään erossa
toisistaan. [8], [9]
Eräs CCD-kennon pääasiallisista kokoonpano-ominaisuuksista on valtava matriisi
johtavalla polypiikerroksella muodostettuja sarjasiirtorekistereitä. Jälkimmäisiä kutsutaan
porteiksi. Polypiikerros on erotettu substraatista ohuella ja eristävällä piioksidikalvolla. Sen
jälkeen, kun elektronit on koottu valodiodien kaivoihin, portteihin tuodaan
jännitepotentiaali, jolla muutetaan alla olevan piin sähköstaattista potentiaalia. Tällöin
suoraan porttielektrodien alla olevaan substraattiin muodostuu siirtopotentiaalikaivo, joka
kykenee keräämään paikallisesti muodostettuja elektroneja. Naapuriportit auttavat sitomaan
elektroneja siirtopotentiaalikaivoon muodostamalla korkeamman potentiaalin alueita eli
sulkuja sen ympärille (kuva 2). Moduloimalla portteihin tuotua jännitettä ne voidaan
biasoida joko muodostamaan potentiaalikaivoja tai -sulkuja. [8], [9]
Kuva 2. Karkea kaaviokuva potentiaalikaivojen ja porttien sijainnista CCD:n sisällä. [8]
6
Kennon dynamiikka-alueen ylärajan määrää se, kuinka suuren elektronimäärän jokaisen
valodiodin potentiaalikaivo kykenee sitomaan. Käsitteellä dynamiikka-alue tarkoitetaan
maksimissaan saavutettavaa signaalia jaettuna sillä kohinalla, joka muodostuu signaalia
luettaessa. Tässä kohina on lähtövahvistimen kohinan ja muun laitteiston lämpökohinan
summa. [8], [10], [11]
Sen jälkeen, kun elektronit on koottu potentiaalikaivoihin valotusajan eli integroinnin
aikana, niiden rinnakkaissiirto aloitetaan pystysuorissa rekistereissä. Tämä tapahtuu yksi
rivi kerrallaan pystysuoran siirtorekisterin kellosignaalin tahdistuttamana. Elektronit
kuljetetaan jokaisen valodiodin läpi useampiasteisessa prosessissa. Siirto saadaan aikaan
muuttamalla varausta säilyttävän kaivon potentiaali negatiiviseksi, kun taas samanaikaisesti
kasvatetaan viereisen elektrodin biasointi positiivisarvoiseksi. Tämä tapahtuu sykleissä
vierekkäisten elektrodien jännitteitä vaihdellen, pystysuoran siirtorekisterin kellon
tahdistamana. [8], [9]
Sen jälkeen, kun varaus on matkannut rinnakkaissiirtorekisterin läpi, se saavuttaa
erikoistuneen rivin portteja, jota kutsutaan sarjasiirtorekisteriksi. Siellä jokaista kuvapistettä
edustavat elektronipaketit siirretään vaakasuuntaisesti, peräkkäisessä järjestyksessä, kohti
lähtövahvistinta ja edelleen sirusta pois kellosignaalin tahdistamana.
Vaakasarjasiirtorekisterin koko sisältö siirretään lähtösolmuun, ennen kun se täyttyy jälleen
uudella rinnakkaisrekisteristä saapuvalla varauspakettiryöpsäyksellä. Lähtövahvistimessa
elektronipaketit rekisteröivät sen varauksen määrän, jonka peräkkäiset valodiodit,
vasemmalta oikealle ensimmäisestä rivistä alkaen ja viimeiseen päättyen, ovat tuottaneet.
Edellistä toimitusta voidaan kutsua koko valodiodimatriisin keräytyneen varauksen
analogiseksi viivaskannaukseksi. Analoginen signaali muutetaan lopulta digitaaliseksi
sopivalla muuntimella. Lopputuloksena on digitaalinen kuva. [8], [12], [13]
CCD:itä on olemassa useampaa erilaista mallia. Kolme yleisintä muunnelmaa ovat full-
frame-, frame-tansfer- ja interline-tyyppiset kennot. Full-frame-tyyppisessä kennossa on
hyvin tiheä valodiodimatriisi, jolla voidaan tuottaa kuvia erittäin suurella
7
erottelutarkkuudella. Frame-transfer-tyyppinen CCD on hyvin samankaltainen kuin
edellinen malli, joskin siinä on kahteen identtiseen osaan jaettu rinnakkaisrekisteri. Toista
näitä kutsutaan kuvamatriisiksi ja toista varastomatriisiksi. Interline-tyyppisen kennon
rakenteeseen tutustutaan tarkemmin luvussa 3.2.1. [10]
3.2. Tarkempi katsaus ICX205AK:n toimintaan
Sonyn ICX205AK on luonnollisesti pääpiirteittäin edellä kuvatun yleis-CCD:n kaltainen,
joskin sillä on oma erikoistunut särmikkyytensä (kuva 3). ICX205AK on interline-
tyyppinen kiinteäaine-kuvasensori. Sen valopistematriisi on nelikulmainen, ja siinä on noin
1,5 miljoonaa neliskanttista kuvapistettä. Efektiivisiä kuvapisteitä on noin 1,45 miljoonaa ja
aktiivisia 1,4 miljoonaa. Yhden sellaisen koko on noin 4,65·4,65 neliömikrometriä. [5]
Kuva 3. Sonyn ICX205AK-mallinen CCD. Kenno noudattelee pääpiirteittäin luvun 3.1.
kuvausta. Neliöllä kuvataan yhtä valodiodia (photo sensor). Kuvaan on merkitty
8
rinnakkaissiirtorekisterit (vertical register) ja sarjasiirtorekisteri (horizontal register) sekä
varauksen kulun suunta (parallel charge transfer eli rinnakkainen varauksensiirto ja serial
charge transfer eli sarjavarauksensiirto). Vasemmalla on lähtövahvistin, johon elektronit
ohjataan (output amplifier). [5]
Tämä CCD-kenno tukee kahdentyyppistä tulostusmuotoa eli sekä peräkkäispyyhkäisyä
(progressive scan) että korkeakuvataajuustulostusta (high frame rate scanning).
Siruun on rakennettu elektroniset sulkimet, jotka mahdollistavat kokoalaisen pysäytetyn
kuvan muodostuksen ilman mekaanisia sulkimia. Suuri erottelutarkkuus ja runsas
värintuotto saadaan aikaan RGB-mosaiikkisuotimilla (RGB eli red, green ja blue, käytetään
yleisenä väristandardina). Sirussa on myös HAD-sensoreita (Hole-Accumulation Diode),
joilla vähennetään kohinaa ja parannetaan herkkyysastetta. Substraattimateriaalina
käytetään piitä. Kennon dynamiikka-alue on kymmenen bittiä, ja säädettävät valotusajat
vaihtelevat 1/10000 sekunnista minuuttiin. [1], [5]
3.2.1. Interline-tyyppisen CCD-kennon kokoonpano
Interline-tyyppinen CCD suunniteltiin korvaamaan monia frame-transfer-kennon
heikkouksia. Interline-kennot koostuvat hybridirakenteesta, jossa jokaiseen valodiodiin on
liitetty erillinen varastoalue rinnakkaistulostuksen kautta. Näiden kahden eri alueen
toiminnot on eristetty metallimaskirakenteen avulla, joka on kiinnitetty valosuojattujen
rinnakkaistulostuselementtien päälle koko CCD:n pituudelta. Sen jälkeen, kun
valodiodimatriisi on kerännyt mikroskoopin linssiltä projisoidut fotonit ja muuttanut ne
sähköpotentiaaleiksi, varaukset kuljetetaan nopeasti rinnakkaissiirrolla jokaisen
kuvapisteen vieressä sijaitsevaan varastoalueeseen. Tämän jälkeen tulostus tapahtuu
tavallisesti, luvun 3.1. kuvauksen mukaan. [12]
Varastoalue ja kuvapiste muodostavat yhdessä pitkät pystysuorat sarakkeet, jotka alkavat
alhaalta sarjasiirtorekisteristä ja päättyvät matriisin yläosaan (kuva 3). ICX205AK:ssa
kuvapisteet on aseteltu Bayer-järjestelyllä lomittain kunkin valodiodin värisuotimen värin
(sininen, punainen tai vihreä) mukaan. Bayer-järjestely on sellainen värien erottelutapa,
9
jossa kussakin kuvapisteessä on yksivärinen värisuodin. Vihreälle värille on kaksi erilaista
suodinta. Neljän kuvapisteen ryhmä asetellaan niin, että lävistäjän suuntaisesti ryhmässä on
joko sinisiä suodinyksiköitä (B) vastaavan vihreän yksikön (Gb) kanssa tai punaisia (R)
vihreän suotimen kanssa (Gr) (kuva 4). [5], [12], [14]
Kuva 4. Väreille tehty Bayer-järjestely. [5]
3.2.2. Elektroniset sulkimet
Sinä aikana, kun rinnakkaisvarastomatriisia luetaan, varsinainen kuvamatriisi integroi eli
valottaa varausta seuraavaa kuvakehystä varten. Valotusaikaa säädellään sulkimilla.
Interline-arkkitehtuurin pääetu on siinä, että CCD voi mekaanisten sulkimien sijaan
turvautua elektronisiin vastineisiin. Elektronisia sulkimia käytettäessä koko valodiodin
potentiaalikaivon varaus juoksutetaan tyhjiin hetkeksi kokonaisvalotusajan aikana.
Elektroniset sulkimet toimivat yleensä porrastetusti, jolloin kerääntynyt valaistus
puolitetaan joka askeleella. [12], [15], [16]
Elektronien integraatiota valodiodin potentiaalikaivossa kontrolloi valotuksenhallintaportti.
Se kääntää elektronien kulun kohti huuhteludiodia, kun CCD:n kellopiiri on biasoinut
valotuksenhallintaportin ’päällä’-tilaan. Suljinjärjestely sallii sen, että kaikki aktiiviset
valodiodit voidaan samanaikaisesti pyyhkiä vaikuttamatta tummennettuihin
10
siirtorekistereihin. Näin hallitaan diodien potentiaalikaivojen tyhjennyksen ja
tulostusprosessin aloituksen välistä aikaa. [15]
Olosuhteissa, joissa CCD on altistettu hyvin korkeaintensiteettiselle valaistukselle,
potentiaalikaivojen varastointikyky saattaa ehtyä. Kun näin käy, ylijäämävaraus purkautuu
viereisen valodiodin kaivoihin. Tuloksena on kuvakorruptio siinä kohdassa, jossa varaus
purkautuu. Edellä mainittua haittatekijää kutsutaan linssisumentumaksi (blooming).
Sellaisia voidaan tehokkaasti vähentää sulkimien avulla, kuten myös ylivalotusta ja
suttuisuutta, kun kaapataan kuvaa mikroskooppinäytteen liikkuvista kohteista joko
taantuvaa tai täysliikkuvaa videokuvaa käyttäen. [10], [15], [16]
3.2.3. Kuvapisteiden yhdistäminen
Kuvapisteiden yhdistämisellä tarkoitetaan kellotusmenetelmää, jolla kootaan yhteen
useampien viereisten kuvapisteiden keräämä varaus. Tuloksena on vahvistettu signaali.
Menetelmän avulla vähennetään kohinaa ja parannetaan signaali-kohinasuhdetta sekä
kuvataajuutta, joskin avaruuserottelukyvyn kustannuksella. Sillä voidaan myös vähentää
valotusaikaa ja edelleen välttää mikroskooppinäytteestä otetun kuvan nuhruisuutta. CCD:n
kellopiiri kontrolloi kuvapisteiden yhdistämisprosessia. Valittujen sarja- ja
rinnakkaissiirtorekisterien analogista signaalia vahvistetaan synkronisesti.
Yhdistämisalueen kokoa säädetään muun muassa kellon ja biasvirtojen avulla, ja sen koon
ylärajana on lähinnä valodiodimatriisin pinta-ala. Jotta ei päädyttäisi kuvavääristymiin, alue
on yleensä neliönmallinen (2·2, 4·4, jne.). [17], [18]
3.2.4. Tulostustavat
Sonyn ICX205AK tukee kahta erilaista tulostustapaa: peräkkäispyyhkäisyä ja
korkeakuvataajuustulostusta. Näin ollen sitä voidaan tarpeen mukaan säätää tuottamaan
joko reaaliaikaista digitaalista videokuvaa tai normaaleja pysäytettyjä kuvia. [1], [5]
11
3.2.4.1. Peräkkäispyyhkäisytulostus
Peräkkäispyyhkäisytulostustilassa valodiodimatriisi pyyhkäistään koko sen pituudelta
jatkuvassa sarjassa. Tämä ei tarkoita sitä, että matriisin alimmat rivit tulostettaisiin ennen
ylempiä. Pikemminkin ensin valotetaan fotonivuo yli koko matriisikentän ja sitten nopeasti
siirretään kertynyt varaus valolta suojatulle varastoalueelle ja edelleen kuljetuskanavaan
(kuva 5). Kaikkien kuvapisteiden signaalit tulostetaan ei-limittäisessä (non-interlace)
muodossa noin 0,13 sekunnissa. Pystysuora erottelutarkkuus on tässä tilassa noin 800 TV-
raitaa. Kaikki valopistesignaalit, joilla on sama valotusaika, luetaan samanaikaisesti. Tämä
tulostustapa on sopiva kuvakaappaukseen, jossa vaaditaan suuri erottelutaajuus. [5], [11]
3.2.4.2. Korkeakuvataajuustulostus
Korkeakuvataajuustulostus vastaa videokuvatasoista tulostusta. Valodiodeihin koottu
varaus luetaan ja tulostetaan noin 16,7 millisekunnin välein, jolloin yhden sekunnin
kuluessa saadaan aikaan 30 videokehystä. Tällainen kuva koostuu kahdesta limitetystä
kuvakentästä. Jokainen kuvakenttä, joka sisältää 50 prosenttia kokonaisen kehyksen
informaatiosta, kaapataan sarjassa. Tällöin perättäisten parillisten ja parittomien
skannauslinjojen välillä kokonaisessa kuvassa on 16,7 millisekunnin ero. [11]
CCD:n kaikkia kuvapisteitä ei siis lueta tässä tulostustilassa, vaan osa on mustattu (kuva 5).
Tulostus alkaa ensimmäiseltä riviltä. Kahdeksaa riviä kohti luetaan vain kaksi
(ensimmäinen, neljäs, yhdeksäs, kahdestoista, jne.). Pystysuora erottelutaajuus on suurin
piirtein 200 TV-raitaa. Tämä lukutila painottaa ennemminkin kuvankäsittelyn nopeutta kuin
erottelutaajuutta. Korkeakuvataajuustulostuksen avulla voidaan tuoda
mikroskooppinäytteestä reaaliaikaista kuvaa tietokoneen näytölle. Maksimissaan
videokuvan ruutunopeus on kymmenen kehystä sekunnissa. [1], [5]
12
Kuva 5. ICX205AK:n tulostustavat. Vasemmalla kuvataan peräkkäispyyhkäisytulostus ja
oikealla korkeakuvataajuustulostus. Oikeanpuoleisessa kuvassa ne kuvapisteet, joita ei lueta,
on mustattu. [5]
3.2.5. Spektriherkkyys ja kvanttihyötysuhde
CCD:n kvanttihyötysuhde (annettu yleensä prosentuaalisina osuuksina) kuvaa kennon
kykyä muuntaa valodiodien keräämät fotonit elektronisiksi varauksiksi. Valojännitteen
vaste määritellään yksittäisen fotonin luomien niiden elektroni-aukkoparien määränä, jotka
laite onnistuneesti lukee. Kvanttihyötysuhteen arvo on erityisen tärkeä sellaisessa
kuvaamisessa, jossa työskennellään vähävaloisessa ympäristössä (Esimerkiksi
fluoresenssikuvaus: näissä olosuhteissa emissiofotonien aallonpituudet ovat yleensä 275–
13
550 nanometrin luokkaa ja niillä on kohtuullisen suuri absorptiokerroin piihin.).
Standardimalliset CCD:t, jotka valaistaan laitteen etuosan elektrodiporttien ja
oksidipeitteiden kautta, ovat herkimpiä vihreille ja punaisille aallonpituuksille 550–900
nanometrin alueella. ICX205AK on herkimmillään punaisen valon alueella 600
nanometristä alkaen aina infrapunataajuuksille asti (kuva 6). [5], [13], [18], [19]
Kuva 6. ICX205AK:n spektriherkkyys suhteellisen vasteen ja aallonpituuden funktiona.
CCD on herkimmillään punaisen valon alueella ja heikoimmillaan sinisen valon
aallonpituuksilla. [5]
CCD:n spektriherkkyys eroaa tavallisen piivalodiodi-ilmaisimen vastaavasta
ominaisuudesta. Näin on siksi, että CCD:n pinnalla on varausten siirtoon tarkoitettuja
kanavia, jotka on suojattu polypii-porttielektrodeilla, ohuilla piidioksidikalvoilla ja
piinitridipassivointikerroksella. Nämä rakenteet, joita käytetään varauksen kuljettamiseen
kuvausalueelta sekä suojaamaan kennoa kosteudelta ja sähköstaattisilta purkauksilta,
absorboivat lyhyempiä aallonpituuksia (450 nanometriä ja sitä pienemmät aallonpituudet)
ja huonontavat laitteen siniväriherkkyyttä. Polypiin läpäisysuhde alkaa heiketä 600
nanometrin aallonpituustason alapuolella. Absorptio riippuu kuitenkin myös porttien
14
paksuudesta ja CCD:n pinnalla olevien ohuiden kalvojen läpi kulkevan valon
interferenssistä. Interline-CCD sisältää normaalista polypii-porttirakenteesta eroavia
valodiodeja. Tämä seikka vähentää interferenssiä sekä tuottaa ihanteellisemman ja
yhtenäisemmän spektrivasteen. Tämäntyyppisissä kennoissa on yleensä pystysuoria
linssisumentumien estoon tarkoitettuja juoksutuskanavia, jotka alentavat pidemmän
aallonpituuden fotonien vastetta. Sellaiset fotonit, joiden aallonpituus on yli 700
nanometriä, porautuvat syvälle substraattiin lähelle haudattua juoksutuskanavaa. Näillä on
suuri todennäköisyys vapauttaa elektroneja, jotka hajaantuvat juoksutuskanavaan ja tulevat
siten heti poistetuiksi. Kvanttihyötysuhde riippuu myös porttijännitteestä. Pienet jännitteet
tuottavat pieniä tyhjennysalueita ja päinvastoin. [13], [19]
Päinvastoin kuin CCD:t, tavanomaiset kalvoemulsiot ovat yliherkkiä siniselle valolle. Tämä
johtaa usein väri-eroavaisuuksiin filmille tallennettujen ja CCD:llä kaapattujen kuvien
välillä. Kuvasensorin sinisen valon herkkyysvaste heikkenee nopeasti valodiodin koon
pienentyessä. Siten sininen valokin absorboituu entistä huonommin. Tämä on tietyssä
määrin havaittavissa ICX205AK:nkin rakenteessa, jonka kuvapistekoko on muutaman
neliömikrometrin kertaluokkaa. Sinisen värin spektrialueella laite havaitsee herkimmin
noin 460 nanometrin aallonpituuden. Tämän arvon alapuolella oleville aallonpituuksille
spektriherkkyyskäyrä alkaa dramaattisesti laskea. Jo 400 nanometrin kohdalla vaste on
melko huono. Ekstrapoloimalla lineaarisesti käyrää nähdään, että ICX205AK kykenee
havaitsemaan jonkin verran ultraviolettialueen säteilyä, joskin vaste näillä paikoin on jo
surkea (kuva 6). [5], [19]
Tavanomaisen CCD:n spektriherkkyyskäyrää luettaessa havaitaan, että sen
kvanttihyötysuhteen huippuarvo on huomattavasti yksittäisen valodiodin
huippuarvolukemaa pienempi. Spektrikäyrässä tapahtuu aaltoilua CCD:n pinnan ohuiden
kalvojen interferenssi-ilmiöiden takia. Suurin osa fotoneista, joiden aallonpituus on 450–
700 nanometrin luokkaa, absorboituvat joko tyhjennysalueelle tai substraattiin. Näillä
tyhjennysalueelle absorboituneilla fotoneilla on lähes sadan prosentin kvanttihyötysuhde.
Sitä vastoin niillä elektroneilla, joiden diffuusiopituus on pieni, kvanttihyötysuhde on miltei
15
mitätön. Varauskaivon saavuttavat sellaiset elektronit, joiden vastaavat pituudet ovat suuria.
[19]
CCD-kennot on yleensä pakattu kuorimateriaaliin, jolloin sisään syöksähtävien fotonien
täytyy tunkeutua lasi- tai kvartsi-ikkunan läpi saavuttaakseen substraatin. Kaikilla
aallonpituuksilla tapahtuu heijastumishäviöitä ikkunoiden pinnasta, ja fotonien
läpäisysuhde laskee räjähdysmäisesti 400 nanometrin alapuolella. Siksi tieteelliseen
käyttöön tarkoitetuissa CCD:issä käytetään kvartsipeitteitä heijastusongelmien
vähentämiseksi. [19]
3.3. Kohina ja viilennyksen merkitys
Digitaalikamerassa ja CCD-kennossa syntyy monentyyppistä kohinaa, joka luonnollisesti
huonontaa laitteiston herkkyyttä. Digitaalisen kuvan kohina sisältää sekä signaalin että
kameran tekniikan aiheuttamaa kohinaa. Näistä jälkimmäinen koostuu edelleen
pimeäkohinasta (dark noise) ja tulostuksen kohinasta. Signaalin kohina on valon luontaista
kohinaa, joka johtuu fotonivuon stokastisesta luonteesta ja on suoraan verrannollinen
intensiteetin neliöjuureen. Signaalin kohinaa voidaan vähentää kuvapisteitä yhdistämällä
(ks. luku 3.2.3.). [13], [18]
Pimeäkohina eli terminen kohina johtuu valodiodien virranvaihtelusta valottomassa tilassa.
Pimeäkohina on pimeävirran ja valotusajan geometrinen keskiarvo. Koska se on
riippuvainen lämpötilasta, sitä on helppo eliminoida viilennyksen avulla. Jo 8-10 asteen
pudotus lämpötilassa vähentää pimeäkohinaa puolella. DP50:ssä viilennykseen käytetään
Peltier-elementtejä. Pidemmät valotusajat ovat nyt mahdollisia, koska pimeäkohina ei
valloita varauksen varastointiin tarkoitettuja alueita integrointijakson aikana. Viilennettyjä
kameroita kutsutaan hidastulosteisiksi, koska niiden kuvataajuus on tavanomaista
videokameraa hitaampi. [11], [13], [18]
Tulostuskohina aiheutuu yksistään kameran elektroniikasta. Yleensä sirun esivahvistin
tuottaa sitä kvantisoidessaan signaalia. Tulostuskohinalla on merkitystä
16
mikroskopiakuvauksessa, koska valaistus on näissä olosuhteissa niukka. Nykytekniikalla
tulostuskohina on vähennetty noin kymmeneen elektroniin kuvapistettä kohden. [11], [18]
3.4. CCD-kennon lineaarisuus
Tärkeä ominaisuus tieteellisessä kuvausjärjestelmässä on lineaarisuus, eritoten kun on
kyseessä kvantitatiivinen valonmittausanalyysi. CCD-kennon pääasiallinen toiminto on
muuttaa fotonien kantamaa kuvainformaatiota sähköiseksi signaaliksi. Digitoinnin jälkeen
signaalin lähdön tulisi olla lineaarisesti verrannollinen sensorin havaitsemaan valoon. [20]
Siirtofunktio, joka käsittää sensorin havaitsemien fotonien määrän ja vastaavan digitaalisen
ulostulon arvon, määritellään monivaiheisessa prosessissa. Se alkaa varaustenkuljettajien
luonnista ja siirrosta aktiivisilla kuvapistealueilla. Tätä seuraa varausten muuntaminen
vahvistetuiksi jännitesignaaleiksi. Tuloksena saatu analoginen signaali käy läpi useita
prosessointiaskeleita, ja sitä vahvistetaan edelleen, ennen kuin se digitoidaan näyttöä,
kuvaprosessointia ja varastointia varten. Huolellisella laitesuunnittelulla siirtofunktio
tuottaa lineaarisen muunnoksen. CCD:n lineaarisuuden mittaustavassa on huomattavia
eroja riippuen laitevalmistajasta. Yleisin tapa on esittää lähtösignaali valotusajan funktiona
graafisesti. Käyrä jatkuu potentiaalikaivon kapasiteetin huippuarvoon asti. Spesifikaatiossa
saatetaan verrata lineaarisuuspoikkeaman prosentuaalista osuutta signaalin maksimi-
intensiteettiin kaivopotentiaalin täyskapasiteettia käytettäessä. [20]
Kamerasysteemin lineaarisuus määräytyy sekä CCD:n että muiden
signaaliprosessointiketjussa olevien osien mukaan. Käytännössä mikä tahansa
epälineaarisuus aiheuttaa poikkeaman laitteen vahvistusvakioon. Kvantitatiiviset
kuvankäsittelyoperaatiot, kuten aritmeettiset suhdemittaukset, lineaarimuunnokset,
varjostuskorjaukset ja muut prosessointialgoritmit, pohjautuvat absoluuttisiin
signaalimittauksiin ja vaativat, ettei kameran vahvistuksen ja signaalin intensiteetin välillä
saa olla merkittävää riippuvuussuhdetta. Suurihyötysuhteiset CCD:t ovat huomattavasti
lineaarisempia verrattuna tavanomaisiin kuvauslaitteisiin. Tieteelliseen käyttöön
17
tarkoitetuilla CCD:illä on yleensä vain noin muutaman kymmenesosaprosentin
epälineaarisuusarvoja yli neli- tai viisinkertaisen signaalialueen. [20]
Vaikka CCD:t toimivat hyvin lineaarisesti leveällä dynamiikka-alueella, epälineaarinen
vaste yleensä havaitaan, kun keskimääräinen valaistusintensiteetti on korkea käytettäessä
potentiaalikaivon täyskapasiteettia. Jos valaistus on tarpeeksi kirkas, värikyllästystä ja
linssisumentumia ilmenee koko valodiodimatriisin alueella. Värikyllästystä esiintyy, kun
intensiteetin kasvu ei tuota enää lisää muutosta tallennettuun signaaliin. Epälineaarisuutta
voi myös tapahtua hyvin alhaisilla valaistustasoilla sensoritekniikasta riippuen, joskin
epälineaaristen alueiden vaste voidaan tällöin yleensä kalibroida. Paras keino on kuitenkin
rajoittaa valotus lineaariselle alueelle kunkin sensorimallin mukaan, koska
värikyllästysasteeseen loikkaus voi olla nopeaa ja ennustamatonta. Yksi keino välttää
värikyllästystä kirkkaalla valaistuksella on kaapata sarja kuvia lyhyemmällä valotusajalla.
Lyhyempien valotusaikojen summa vastaisi kestoltaan haluttua pidempää integraatioaikaa.
Nämä lyhyen valotusajan kuvat voidaan yhdistää prosessin aikana. [20]
4. Koesarja: vääristyneiden näytekuvien yhdistäminen
Huolimatta CCD:hen kehitetyistä teknisistä parannuksista käytännössä koenäytteistä
otetuissa kuvissa ilmenee aina tietty määrä vääristymiä; luvussa 3.4. käsiteltiin lyhyesti
epälineaarisuudesta johtuvaa värikyllästystä ja luvussa 3.2.5. sinisen värin
absorboitumisongelmaa. Jotta päädyttäisiin mahdollisimman virheettömään lopputulokseen,
mikroskooppinäytteistä kehitettyjä otoksia täytyy usein jälkikäsitellä jollakin
kuvankäsittelyohjelmalla. Seuraavassa lyhyessä koesarjassa esitetään, kuinka kahdesta
vääristyneestä näytekuvasta tehdään kaikki kuvapisteet oikealta näyttävä versio pienellä
kuvanmuokkauksella.
Koesarjassa käytettiin mikroskopoitavana näytteenä valaistua, kiekosta w511 otettua
puolijohdepalaa. Siitä otettiin kaksi kuvaa: toinen kirkaskentässä (kuva 7) ja toinen
pimeäkentässä (kuva 8). Käytetty linssisuurennos oli 5x ja herkkyys ISO 400. Valotusaika
18
oli sama molemmilla. Kuvassa 7 havaitaan taustalla joukko tummia pisteitä, joiden
periaatteessa pitäisi olla identtisiä kuvan 8 vaaleiden pisteiden kanssa. Kuitenkin voidaan
havaita, että osa kuvan 7 kriittisistä pisteistä ei ole näkyvissä kuvassa 8 ja päinvastoin.
Kuva 9 on uudelleenkerrostettu muokkaus kuvista 7 ja 8. Alempana kerroksena on käytetty
kuvaa 7 normaaliasetuksin (normal layer) ja ylempänä kuvaa 8 käännetyin värein
sulautettuna alempaan (exclusion layer). Molempien kuvien tärkeät pisteet näkyvät nyt
lopputuloksessa.
Kuva 7. Näyte puolijohdepalasta (kiekko w511) kirkaskentässä (brightfield).
19
Kuva 8. Sama näyte kuvattuna pimeäkentässä (darkfield) samalla valotusajalla. Osa niistä
pisteistä, jotka näkyvät tummana kuvassa 7, eivät ole havaittavissa. Sama pätee päinvastoin
tässä otoksessa havaittuihin vaaleampiin pisteisiin.
Kuva 9. Kirkas- ja pimeäkenttäotokset yhdistettyinä. Kaikki tärkeät pisteet ovat nyt
näkyvissä.
5. Yhteenveto ja johtopäätökset
Nykyaikana digitaalikuvaustekniikat ovat syrjäyttäneet perinteiset filmipohjaiset
kuvausmenetelmät mikroskopiassa. Mikroskopoitavia näytteitä on pystyttävä kuvaamaan
tarkasti hyvin vähävaloisissa olosuhteissa, joten digitaalikameralta vaaditaan hyvin tarkkaa
erottelukykyä ja lineaarisuutta. Kameran hyötysuhde on suoraan verrannollinen sen
sisältämän CCD-kennon toimintaan. Jotta voitaisiin tuottaa tarkkoja digitaalikuvia,
kuvapisteen koon on oltava tarpeeksi pieni ja kuvamatriisin pyyhkäisytavan tehokas.
Lisäksi on huomioitava kohinan, ylivalotuksen ja tahattomien heijastusten aiheuttamat
ongelmat. Linssisumentumia, ylivalotusta ja suttuisuutta voidaan tehokkaasti vähentää
elektronisilla sulkimilla. Kuvapisteitä yhdistämällä voidaan vahvistaa signaalia ja parantaa
signaali-kohinasuhdetta. Peltier-viilennyksellä voidaan eliminoida pimeäkohinaa ja
pidentää valotusaikoja. Interline-tyyppisen CCD-kennon sisältävä digitaalikamera on
20
rakenteeltaan erinomainen tarkkaan kuvaukseen, sillä se ottaa huomioon edellä mainitut
optimointiominaisuudet.
Kaikkia ongelmia ei siltikään voida poistaa. Näistä ovat muun muassa CCD-kennon huono
siniväriherkkyys ja epälineaarinen vaste käytettäessä yhtä aikaa suurta
valaistusintensiteettiä ja potentiaalikaivojen täyskapasiteettia. Tuloksena saatavissa kuvissa
voi esiintyä epämieluisaa värikyllästystä ja linssisumentumia. Yksi värivääristymistä
aiheutuva ongelma on esimerkiksi tärkeiden yksityiskohtien puuttuminen näytekuvista.
Tämän vuoksi näytekuvasarjoja täytyy usein jälkikäsitellä jollakin kuvankäsittelyohjelmalla,
jotta lopputuloksesta saataisiin oikeanlainen. Tässä nähdään digitaalisen kuvamateriaalin
etu filmipohjaiseen nähden: materiaalin uudelleenkäsittely ja varastointi on melko
vaivatonta.
21
Lähteet
[1] DP50 Microscope Digital Camera System, Instruction Manual, Pixera Corporation
(2001).
[2] P. Drent, Digital Imaging - New Opportunities for Microscopy, Nikon Microscopy
(2000–2005)
http://www.microscopyu.com/articles/digitalimaging/drentdigital.html. Luettu 22.1.2005.
[3] Olympus DP50 Brochure
http://resources.olympus-
europa.com//micro/catalogs/C12567B6003775C70958BCE87E4DBBD4412568DC005C1
B52_DP50.pdf. Luettu 18.10.2004.
[4] Camera Adapters for Photomicrography
http://www.geologynet.com/micro/adaptors.htm. Luettu 10.11.2004.
[5] SONY ICX205AK Specification Sheet, WfineCCD, Sony
http://www.eureca.de/pdf/sony/ICX205AK.pdf. Luettu 18.10.2004.
[6] LED, Wikipedia (2005)
http://en.wikipedia.org/wiki/LED. Luettu 10.11.2004.
[7] Photodiode, Wikipedia (2005)
http://en.wikipedia.org/wiki/Photodiode. Luettu 10.11.2004.
[8] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology:
Anatomy of a Charge-Coupled Device, (2004)
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/ccdanatomy.html.
Luettu 7.11.2004.
22
[9] R. S. Muller and T. I. Kamins, Device Electronics for Integrated Circuits, Second
Edition (Singapore, 1986), p. 409–417.
[10] M. Abramowitz et al, Concepts in Digital Imaging Technology (2000-2004)
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/concepts.html.
Luettu 10.11.2004.
[11] K. R. Spring and M. W. Davidson, Electronic Imaging Detectors (2004)
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/digitalimagingdetectors.html.
Luettu 18.10.2004.
[12] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology:
Interline Transfer CCD Architecture, (2004)
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/interline.html.
Luettu 7.11.2004.
[13] P. Magnan, Detection of Visible Photons in CCD and CMOS: A Comparative View,
Elsevier Science B. V. 2003.
[14] D. L. Gilblom, S. K. Yoo, and P. Ventura, in Proceedings of SPIE, Orlando, FL, USA,
21 April 2003, edited by B. F. Andresen and G. F. Fulop, September 2003, pp. 318–331.
[15] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology:
Electronic Shutters
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/electronicshutter.ht
ml. Luettu 10.11.2004.
[16] T. Engdahl, Digikameroiden sirutekniikat: Elektroniikkaa tosi tiukasti, Prosessori 6–7
2004, p. 26–31.
23
[17] M. Abramowitz and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology: Pixel
Binning
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/binning.html. Luettu
10.11.2004.
[18] Olympus BioSystems Glossary, Olympus BioSystems (2003–2004)
http://www.olympus-biosystems.com/templates_eng/bio_imaging/glossary.html. Luettu
10.11.2004.
[19] K. R. Spring and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology: Quantum
Efficiency (2004)
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/quantumefficiency.h
tml. Luettu 11.11.2004.
[20] T. J. Fellers and M. W. Davidson, Concepts in Digital Imaging Technology: Charge-
Coupled Device (CCD) Linearity, (2004)
http://www.molecularexpressions.com/primer/digitalimaging/concepts/ccdlinearity.html.
Luettu 10.11.2004.