Diagnostik von Legionelleninfektionen und Nachweis von...

Diagnostik von Legionelleninfektionen und Nachweis von Infektionsketten

Wolfsburg, 13.09.2012

Christian LückInstitut für Medizinische Mikrobiologie und HygieneTU DresdenKonsiliarlabor für Legionella am Robert Koch Institut

Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene/ Institut für Virologie

C Lück IMMH TUDLegionella-Labor

Legionellen im Plattenbaugebiet

• Legionellen im Wasser• Keine Erkrankungen• Mieterin wollte Mietschulden

„sparen“• Durch technische Maßnahmen der

Wohnungsgesellschaft Nachweisrate von ca. 30% auf 1% gesenkt

– Nachweisgrenze 10/ 100ml• .

• Alle Legionellen müssen sich in der Umwelt vermehren

• Amöben bestimmen die Kolonisierung eines Endstranges

• Umweltresistenz

• 57 beschrieben Spezies

– L.pneumophila• Serogruppe 1• MAb 3-1

positiv– L.bozemanii– L.micdadei– L.longbeachae

AbuKwaik 2002

Ökologie von Legionellen

C Lück IMMH TU Dresden

Übertragung von Legionella:Protozoen - aerogen

• Protozoen ermöglichen die Replikation von

Legionella

• KEIN extrazelluläres Wachstum an /im Biofilm

• Protozoen setzen teilweise Vesikel <5µm frei,

die virulente Legionellen enthalten

• Intrazellulär gewachsene Legionellen sind

infektiöser für Zellkulturen und Versuchstiere

(ID50 steigt 100 -1000)

• Keine Übertragung von Mensch zu Mensch

• Geringe Manifestationsrate in Epidemien (und

bei sporadischen Fällen)


Übertragung von Legionella:Rolle der Protozoen /Vesicles

• Größe der Vesicle 1-10 µm – aerogen übertragbar– Lungengängig!

• Kann mehre hundert Meter bis Km fliegen–

• Kann mehre 10-100 Bakterien enthalten

• Mechanisch belastbar und resistent gegen Austrocknen

• Legionellae bleiben innerhalb eines Vesicles lange Zeit lebensfähig

Corby + A. castellanii ,3d pi


An RKI gemeldete Legionellosen


Joseph C EWGLI Meeting Stockholm, 2007

Europe: Rate per million population per year


Legionnaires’ disease 2007-2008 (n=11,867)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Einzelfälle n=11.867

Cluster/Outbreaks n=243

Cluster Fälle n=890

Andere/ unbekannt

Reise über die Grenze

Reise innerhalb des Landes

Ambulant erworben

Nosokomial

• Fall-Definitionen bevorteilen CAP

nosokomialambulant erworbenReise-assoziiert

sporadische Einzelerkrankungen

Gruppenerkrankungen(7,5%)

ClusterEpidemien

zeitlich begrenzthyperendemisch

C A Joseph Euro Surveill. 2010;15C Lück IMMH TU Dresden

9

Reise nach ItalienKultur von L. pneumophila Sg1, MAbtyp Philadelphia

• Erkrankungen:– Pneumonie (Legionärskrankheit)– Pontiac-Fieber– Extrarespiratorische

Manifestationen– Klinisch inapparente

Serokonversion• Übertragung:

– Direkte Inhalation – Mikroaspiration – Alimentär Kontakt über

Trinkwassser?

Legionellose


Transmission von Legionellen: little and large particle theory

• little particles• Schlechte Adaptation an

intrazelluläres Milieu• freie Legionellen• viable but not culturable• Pontiac-fever


• large particle = infizierte Amöben

• Gute Adaptation an intrazelluläres Milieu• Legionella-

Pneumonie

Antibiotika-Therapie der LegionellosenProbleme der BewertungIntrazelluläre Erreger (Testsysteme!)Keine repräsentativen prospektiven Studien (geringe Prävalenz)Retrospektive Studien und EinzelbeobachtungenKlinischer Erfolg hängt ab von Grundleiden und AbwehrlageTraditionelle Therapie: Erythromycin /evtl. RifampicinTherapieversager Philadelphia 1976: Erythromycin 11 %

Tetracyclin 10 %andere 25 - 40 %

Heute: Chinolone, neue Makrolide, Kombination mit Rifampicin bringt keine VorteileBisher keine Resistenzentwicklung


Diagnostik Legionella-Infektionen

• Kultur

• Antigennachweis im Urin

• Antigennachweis im respiratorischen Material

• Nachweis von DNA

• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum


Kultur von Legionella

11

6

2

43

68

10

39

7

100

11

57

9

13

20

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Koide 2006

Blasquest, 2005 Murcia Outbreak

Ramirez, 1994

Mentasti, 2009 Paris P 38

Lück 2008 CAPNETZ

Lindsay, 2004

Franzin Paris 2009 P33

true pos

false neg

Kultur hat akzeptableSensitivitätEpidemiologischeUntersuchungen

Nested PCR für“direct typing”

Dauer (4-10 Tage)Intensives “Nachuntersuchen” von PCR oder Urinantigen-positiven Fällen


Kultur von Legionellen aus klinischen Proben

•Acid washing (5 min, pH = 2,2)• Hitze (3 min 60 °C)

• Antibiotika

Cefamandol,

Polymyxin B,

Vancomycin, Anisomycin

Vorbehandelte Patienten: Reduzierte Anzuchtrate

Non-pneumophila-spp.: schwieriger

BAL: immer auf Legionella ansetzenBreiter Ansatz bei „positiven“ PatientenC Lück IMMH TU Dresden

Koloniemorphe von LegionellenBAL (03-L315)

1:10 unverdünnt

Legionella Staphylokokken u.a.

L11-54 Doppelinfektion


Knoxville ST 51

Oxford ST1


• Kultur


• Antigennachweis im respirastorischen Material




Nachweis von Legionella-Antigen im Urin

Charakteristik des Urin-Antigens– ca. 10 kDa– Resistent gegenüber

Proteinasen; Hitze-stabil– Hauptkomponente:

Lipopolysaccharid• Beginn und Dauer der Antigen-

Ausscheidung – 1-3 Tage nach Symptome– intermittierend oder

kontinuierlich– 42 Tage und länger nach

Beginn der Antibiotikatherapie- selten

– keine Therapiekontrolle • Problem: Serogruppenspezifität


Urin-Antigen Nachweis

• Urine Antigentest ist hochspezifisch mit ELISA

• Immunochromatographic assays ????

• Hohe Sensitivität bei

– schweren Verläufen Lp1,

– MAb /3-1 positiv

– Travel –associated and CAP

• Geringe/ moderate Sensitivität in nicht schweren Verläufen Lp1

• Geringe/ moderate Sensitivität bei MAb 2 / 3-1 negativen and non Lp1

Fällen

• Sensitivität hoch in Routine Laboratorien



• Kultur






Legionella DFA in der Lunge 10-L124L. pneumophila, Serogruppe 1, MAb Subtyp Benidorm

MAb 8-4

MAb 10-6

• DFA • L. pneumophila

species-spezifisch, nicht genus-

• anti-OmpM Mab

• Falsch-positive:• St. aureus

• Unspezifisch/ Artefakte

• Sensitivität 25-60%• Fixiertes Gewebe



Legionella DFA in der Lunge 10-L124L. pneumophila, Serogruppe 1, MAb Subtyp Benidorm

MAb 3-1 MAb 8-4

MAb 20-1 MAb 10-6

MAb 26-1, MAb3 = negativ


• Kultur






Legionella PCR

• In-house nested mit Sequencing Bestätigung oder Typisierung

• Real-time PCR• Nachweis

– alle Legionella species (16s rRNA, 5s rRNA, mip)– L. pneumophila 16S rRNA gene, mip gene – Sg1 LPS gene– clone specific Paris clone ( IS elements)

• Nchweisgrenze10-50 cfu• Hochspezifisch• Quantifizierung nicht notwendig• Direktes Typisieren aus klinischen Proben


Detection of Legionella DNA in Serum samples

• Detects all species / serogroups• Sensitivity depends on the „ load“ – severity of disease

54

4

44

16

1

45

10

36

13

11

27

8

10

13

1

31

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Lindsay 2004, nPCR

Koide 2006, 5S-PCR

Diederen, 2005 Taqman

Mentasi Paris 2009 P38 cultur pos

Mentasi Paris 2009 P38 cultur neg

Lück CAPNETZ, TaqMan 16S

Verdonk, 2009

Diederen, 2007 Taqman

true posfalse neg


• Kultur






Methode: Indirekter Immunfluoreszenztest

(ELISA, Agglutination nur als Screening )

Antigen-Auswahl:

Antigene: L. pneumophla Sg 1 - 15

L. micdadei, L. bozemanii, L. dumoffii,

L. jordanis, L. longbeachae Sg1-2

keine IgG / IgM spezifischen Teste

keine Typisierung des ätiologischen Agens möglich

Kreuzrektionen zu anderen Gram-negativen Erregern möglich

Persistenz von Ak-Titern

Antikörpernachweis bei Legionellose



Pseudocluster von Legionellose

• August 2008: • 6 Erkrankungen nach Rückkehr von Kreuzfahrtschiff• 3 „ Paare“ • alle >50 Jahren• bei einer Patientin hoher Titer gegen L. pneumophila Sg 1-14)

• Alle Patienten Urin –Antigen negativ, PCR negativ

• Kein Ausbruch

• Keine Wasseruntersuchungen auf Schiff

Praktikable Verfahren zum Nachweis von Amöben ?

• Nein• Kultur

– Sensitivität ??– Spezifität

• PCR– Unterscheidung lebend – tot

• Welche Amöben sind mit welchem Stamm infiziert?


Keine Differenzierung aufgrund der KlinikDaran Denken Diagnostik – ist besser als ihr Ruf„ Feedback“

Suchet, so werdet ihr finden.

Matthäus 7,7

Legionella- Infektionen


Infektionsquellen Legionella-PneumonienHäufig Warmwassersysteme in der häuslichen Umgebung,

in Hotels, Bädern, im Krankenhaus, etc. nur dies „verhindert“ TWVoRückkühlwerke mit „feuchter Kühlung“Whirl Pools

Selten ThermalbäderBefeuchter (Lebensmittel)InhalatorenZimmer/ ZierspringbrunnenGeburtswannenMagenspülsonde/ Transoesophageale Echo-Sonde , kontaminiert mit LeitungswasserWundinfektionenDentaleinheiten

(noch) nicht: Autowaschanlagen, ScheibenwischernanlageGewächshäuser, Strassenbefeuchtungsmaschinen


Suche der Infektionsquelle

2- 3 Kolonien mind. 10 Kolonien

Patientenmaterial Wasserproben

1. Serologische Typisierung bei L. pneumophila:Serogruppe, MAb Subtyp

bzw. Speziesbestimmung: MALDI-TOF, DNA-Sequenz (mip, 16S rRNA)

2. Genomisches Fingerprint:, SBT, PFGE, AFLP, RAPD-PCR

Identität > Übertragung aus dem Wassersystem


Was ist eine monoklonaler (MAb) Subtyp ?

• Reaktivität mit einem Panel monoklonaler Antikörper• Bezeichnung eines Typs nach eine Stamm mit diesem Muster z. B.

– 1,2,3 für Knoxville– 1, 2, 5, 7 für Benidorm

Dresden 8/5 3/1 10/6 8/4 20/1Standard panel 1 2 3 4 5 6 7

Type strain (ATCC)Philadelphia 1 (33152) +++ +++ 0 0 +++ +++ 0Allentown 1 (43016) +++ +++ 0 0 +++ 0 0Benidorm 030E (43108) +++ +++ 0 0 +++ 0 +++Knoxville 1 (33153) +++ +++ +++ 0 0 ++ 0France 5811 (43112) +++ +++ 0 0 0 0 0OLDA (43109) +++ 0 0 0 0 +++ ++Oxford 4032E (43110) +++ 0 0 0 0 +++ 0Heysham 1 (43107) +++ 0 +++ 0 0 0 0Camperdown 1 (43113) +++ 0 0 0 0 0 0Bellingham 1 (43111) +++ 0 0 +++ 0 0 ++Denver (Stout ,1988) +++ 0 +++ 0 0 +++ 0


Serologische Typisierung - Legionella-Isolate (nach Ursprung) 1986-2011

• Mab 3-1 positive Stämme sind virulenter

• Molekulare Basis nicht komplett verstanden

• Hydrophobes LPS = bessere Übertragung

• Ausbruchs-Stämme sind MAb2 (3-1) positiv


Ausbrüche Legionnaires´ disease in Europa

In all outbreaks

SG1 MAb2 (3-1) positive

Sarpsborg56 cases,

10 deaths, 2005Air scrubber Lp1 ? ?

Murcia800 cases,

449 confirmed,4 deaths, 2001Lp1 Phil, ST 36

Bovenkarpsel188 cases, 133 confirmed,

21 deaths, 1999Lp1 Phil ST 46

Kapellen93 cases,

43 confirmed5 deaths, 1999 Lp1 ??

Gloucester15 cases,

3 deaths, 1986Lp1 Phil/Alle ST 47

Lens86 cases

18 deaths, 2003-04Lp1, Beni ST 15

Stafford101 cases,

28 deaths, 1985Lp1 Knox ST 27

Barrow-in-Furness87 cases,

7 deaths, 2002Lp1 Beni ST 78

NRW-Berlin7 cases,

1 deaths, 1981Lp1 Beni ST 184

Armavircases,

confirmed,3 deaths, 1988Lp1 Phil, ST 36

Kreuzfahrtschiff8 cases,

1 deaths, 20051 case 2008

Lp1 Knox ST 35

ULM64 cases,

5 deaths, 2010Lp1 Knox ST 62


Was ist ein Sequenztyp ?

DNA-Sequenz DNA-Sequenz DNA-Sequenz DNA-Sequenz DNA-SequenzGen A Gen B Gen C Gen D Gen E

SequenzA--SequenzB--SequenzC--SequenzD--SequenzE

GCTATCAGT 1GCTATAAGT 2GCGATCAGT 3GCGATCAGT 3

GTCCGTATG 1GTCGGTATG 2GTCCGTATG 1GTCCGTATG 1

GATCGTATGC 1GATAGTATGC 2GATAGTATGC 2GATAGTATGC 2

CAGTCCGTA 1CAGTCCGTA 1CAGTCCCTA 2CAGTCCCTA 2

GGCCGTATG 1GTCCGTATG 2GTCCGTATG 2GTCCGTATG 2

Strain 1 1 1 1 1 1 ST 1Strain 2 2 2 2 1 2 ST 2Strain 3 3 1 2 2 2 ST 3Strain 4 3 1 2 2 5 ST 4

Manche Klone (ST) sind häufigEWGLI Database

(Stand 23.04.2012)

2250 klinische / 3827 Wasserisolate6149 Stämme mit 1211ST

45% der ‘unrelated’ klinischen Fälle durch 6 Klone:

Lokale Klone z.B. ST182, 332, 334


371

169

102

10

69 80

388

12 22

9273

124

415

39

185

3

6530

6824 8

82 229

21

32 6

36

35

24

14

33

5

40

11

78

3

0

3

134

0

100

200

300

400

500

600

ST1

ST1

…

ST1

…

ST8

ST9

ST20

ST23

ST27

ST36

ST37

ST40

ST42

ST47

ST59

ST62

ST79

ST82

ST94

ST14

6

ST18

2

ST33

2

Water Clin


Infektionsquellen Legionella-PneumonienHäufig Warmwassersysteme in der häuslichen Umgebung,

in Hotels, Bädern, im Krankenhaus, etc. >> TWVoRückkühlwerke mit „feuchter Kühlung“

Whirl Pools

Selten Thermalbäder

Befeuchter (Lebensmittel), Inhalatoren

Zimmer/ Zierspringbrunnen

Sehr selten Geburtswannen

Magenspülsonde/ Transoesophageale Echo-Sonde , kontaminiert mit LeitungswasserWundinfektionen

Dentaleinheiten

StrassenbearbeitungsmaschinenScheibenwischernanlage

(noch) nicht: Gewächshäuser, Autowaschanlagen,


• Infektionsquelle– Epidemiologisch keine

gemeinsame „Quelle“• Schwimmbad• Feier• Reisen/ Hotel

– diffus über die Stadt verteilt– >>Rückkühlwerk– 9/30 Kultur Legionella pos– 5x Lp1– 1x Mabtyp Knoxville, ST 62

• Intermittierender Betrieb seit Sommer 2009

• Wetterlage: – Relativ warm– Dichte Wolkenschicht

Von Baum et al. Euro Surveill. 2010;15(4):1-2

2010 Ausbruch Ulm

Outbreak Lens, France Nov.2003- Jan.04

• 86 Fälle

• Letalität 21%

• Winterzeit

• Transmission > 6km

• Strains Lens einmalig: MAb 3-1 positiv, ST 15

– >2000 Stämme in Frankreich

– >150 lokal Stämme

• Ein Stamm mit gleichem ST aus Deutschland

• Seit 2008 weitere Fälle aus F

Ngyen et al. JID, 2006 40

17 cases of travel-associated Lazise, It, notified by ELDSNet as of 21.09.2011 (n=17)


Lp1 ST 23 detected in 2 patients and 2 campsites

Rota et al. Eurosurv 2011

Ausbruch London 2005

Lock et al. Epidemiology and Infection 2007


IQ = (Warm)wasserversorgung – Legionella Menge initial bis 200/ml (20 000/100ml), – Danach bis 15 /ml– Warmwasserinstallation nah am Kaltwasser ( bis 28,7°C): >200/ml

• Epidemiestamm selten aber bis 2009 nachweisbar– Lp1 Knoxville ST182– Lp 1 Philadelphia/OLDA ST1– Lp 6– L. gormanis, L. anisa

• Ab August 2003 keine Erkrankungen mehr

Nosokomialer Ausbruch Frankfurt/O


Ausbruch auf Kreuzfahrtschiff

2003 8 Patienten• 2x Kultur

– Lp1 Knoxville, ST35 – bisher nur je 1x in D, NL,

Can• Urin Ag positiv 5x• Antikörper positiv 3x

39 Personen ohne Symptome waren nach 6 Wochen Antikörper negativ

2008 erneuter Fall gleicher Stamm

K. BEYRER et al. Epidemiol. Infect. (2007), 135, 802–810.


LD-Ausbruch Kreuzfahrtschiff

Kaltwasserproben: 46% positivWarmwasserproben: 36% positiv

2003L. Spezies

L. pneumophila Sg 1 (7x MAbtyp Oxford)

Sg 1 (2x MAbtyp Knoxville, ST35)Whirlpool

Dusche beim Friseur Sg 3, 5, 10 (54x)

20089/10 Wasserproben <100/100ml

Der „Verursacher“ kann selten sein


Nosokomiale Legionellose Rückkühlwerk in Klinik, Deutschland, 2003

• Einzelfall im KH:• Ambulant übertragbar• L. pneumophila Sg1, Mabtyp Knoxville, ST 31 einmalig bisher• Abstand Balkon – RKW ca 70m• Die Übertragung vermutlich durch Inversionswetterlage gefördert• Im KH Wasser andere Stämme: Lp 2-14

Engelhart et al. IJHEM 2008

© Prof M. Exner


Entstehung von Legionella-Infektionen

Legionellose

Stamm-spezifische Virulenz

L.pneumophila Sg 1

MAb 2 (3/1)-Typ

Anzahl der Bakterien

WirtsfaktorenTransplantation,Kortikosteroide,

TNF alpha AntagonistenSchluckstörungen

Alter, Raucher

Amöben


Legionella Kontrolle

• Epidemiologie beginnt mit der Diagnose – 600-700 gemeldete versus 20 000 geschätzte Fälle

• Aufmerksamkeit • Legionellen im Wasser

– Infektion - Kann sein – muss aber nicht– Ist es wichtiger Infektionen zu detektieren als Legionellen im Wasser ?

• Routine Wasserkontrollen – Im KH ja– Sonstiges Umfeld ??

Nationales Konsiliarlabor für Legionellen

• Technische Universität Dresden• Institut f. Medizinische Mikrobiologie u. Hygiene• Dr. Christian Lück• Fiedlerstr. 42• 01307 Dresden

• Tel.: 0351- 458- 6580/ 6213 Fax: 0351- 458- 6310

• e-mail: [email protected]• http://www.konsiliarlabor-legionella.de


mailto:[email protected]

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